Nghiên cứu phương pháp định lượng rotundin trong viên bao sen vông r

Bộ Giáo dục và đào tạo
bộ y tế
Trường Đại học Dược Hà Nội

Võ thị Quế

Nghiên cứu phương pháp định lượng
rotundin trong Viên Bao sen vông r
Luận văn thạc sĩ dược học

Hà Nội - 2008


Bộ giáo dục và đào tạo
bộ y tế
Trường Đại học Dược Hà Nội

Võ thị quế

Nghiên cứu phương pháp định lượng
rotundin trong viên Bao sen vông r
Luận văn thạc sĩ dược học
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã số: 60.73.15

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Thái Nguyễn Hùng Thu

Hà Nội - 2008


Lời cảm ơn

Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự chỉ
bảo tận tình của các thầy cô, sự quan tâm của gia đình và bạn bè. Những sự giúp
đỡ quý báu ấy đã giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này, đồng thời cũng cho tôi
hiểu biết thêm nhiều điều về tư duy trong công việc và ứng xử trong cuộc sống .
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
tới PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu người thầy đã giành nhiều thời gian, công
sức tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Các thầy cô giáo, anh chị em
kỹ thuật viên Bộ môn Hoá phân tích, Phòng Thí nghiệm Trung tâm, các đồng
nghiệp và lãnh đạo của Công ty Cổ phần Dược phẩm Trung ương II đã tạo điều
kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khoá luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã
động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say mê trong
nghiên cứu khoa học.

Hà Nội Tháng 09- 2008
Dược sĩ

Võ Thị Quế


Mục Lục

Đặt vấn đề ................................................................................................. 01
ChươngI - Tổng quan ............................................................................ 02
1.1. RoTUNDIN. ............................................................................................ 02
1.1.1.Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý ....................... 02
1.1.1. Các phương pháp định tính ................................................................... 03
1.1.2. Các phương pháp định lượng ................................................................ 03

1.2. Viên Sen Vông R .......................................................................... 06
1.2.1.Thành phần và tác dụng của viên Sen vông R ................................... 06
1.2.2. Thành phần và tác dụng của lá Sen ....................................................... 06
1.2.3. Thành phần và tác dụng của lá Vông .................................................... 07
1.3. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................. 08
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng........................................................... 09
1.3.2. Hệ số di chuyển R f ................................................................................ 10
R

R

1.3.3. Pha tĩnh - Chất hấp phụ ......................................................................... 11
1.3.4. Pha động ................................................................................................ 11
1.3.5. Kỹ thuật tiến hành sắc ký lớp mỏng ...................................................... 12
1.3.6. ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm .............. 15
1.3.7. Các chú ý khi chuẩn bị bản mỏng cho định lượng ................................ 18
1.3.8. Các biện pháp xử lý vết trên bản mỏng trong định lượng ..................... 19
1.4. Sơ lược về sắc ký lỏng hiệu năng cao .............................. 21
Chương II - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu .............. 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................... 23


2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................. 23
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng nhanh bằng SKLM và
so sánh với HPTLC................................................................................ 23
2.2.2. áp dụng các phương pháp đã xác định được trên một số mẫu viên
Sen vông R ...................................................................................... 24
2.2.3. So sánh một số phương pháp định lượng Rotundin
trong viên Sen vông R ...................................................................... 24
2.3. Điều kiện nghiên cứu .................................................................... 24

2.3.1. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm .......................................................... 24
2.3.2. Hoá chất................................................................................................. 25
2.4. Xử lý kết quả.................................................................................... 25
Chương III- Kết quả Thực nghiệm và Bàn luận....................... 26
3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký ......................................................... 26
3.1.1. Bản mỏng............................................................................................... 26
3.1.2. Chọn hệ dung môi khai triển ................................................................. 26
3.1.3. Khảo sát cách đưa mẫu lên bản mỏng ................................................... 30
3.1.4. Hiện màu các vết trên bản mỏng .......................................................... 30
3.2. Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu ................................................. 31
3.2.1. Khảo sát chọn dung môi xử lý mẫu....................................................... 31
3.2.2. Kiểm tra tính chọn lọc của phương pháp .............................................. 34
3.2.3. Chuẩn bị mẫu......................................................................................... 35
3.3. Xử lý bản mỏng trên HPTLC ..................................................... 36
3.4. Khảo sát khả năng định lượng bằng
SKLM phối hợp với máy quét văn phòng và xử lý ảnh ..... 37


3.4.1. Lý do phối hợp ...................................................................................... 37
3.4.2. Quét ảnh bản mỏng và xử lý vết trên ảnh thu được............................... 37
3.4.3. Khảo sát sự tương quan giữa các kích thước vết
và nồng độ mẫu ..................................................................................... 40
3.4.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp..................................................... 43
3.4.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp ..................................................... 44
3.4.6. ứng dụng phương pháp định lượng bằng SKLM để
định lượng chế phẩm ............................................................................ 45
3.5. So sánh một số phương pháp định lượng Rotundin
trong viên nén Sen vông R ......................................................... 47
3.5.1. Định lượng Rotundin trong viên nén Sen vông R bằng HPLC ....... 47
3.5.2. So sánh một số phương pháp định lượng Rotundin trong viên

Sen vông R ........................................................................................ 51
3.6. Bàn Luận .............................................................................................. 54
3.6.1. Sự cần thiết phải có phương pháp định lượng nhanh trong sản xuất ..... 54
3.6.2. Về cách pha mẫu ................................................................................... 55
3.6.3. Về chọn lựa tương quan diện tích vết và nồng độ mẫu ......................... 55
3.6.4. Về cách thu hình ảnh bản mỏng ............................................................ 55
3.6.5. So sánh kết quả của phương pháp HPTLC, HPLC và đo bạc ................ 57
3.6.6. ý nghĩa của đề tài.................................................................................. 58
Chương IV-Kết luận .............................................................................. 59
4.1.Kết luận ............................................................................................... 59
4.2. KIến nghị ............................................................................................. 60
Tài liệu tham khảo ............................................................................... 61


Những chữ viết tắt trong luận văn

chữ viết tắt
1. CCD camera (Charge coupled device

ý nghĩa
Hệ thống camera kết hợp

camera)
2. DĐVN

Dược điển Việt Nam
Quang phổ hồng ngoại chuyển

3. FTIR

dạng Fourier

4. HPLC ( High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography)
5. HPTLC ( High performance thin layer

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Chromatography)
6. KTCL

Kiểm tra chất lượng

7. KTS

Kỹ thuật số

8. MS

Khối phổ

9.TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

10.TT

Thuốc thử

11.TNTT

Thí nghiệm trung tâm

12. SKLM

Sắc ký lớp mỏng

13. UV

Tử ngoại

14. UV/vis

Tử ngoại - khả kiến


Danh mục các Bảng
Bảng
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9

Nội dung
Kết quả khảo sát một số hệ dung môi khai triển
Kết quả khảo sát tương quan giữa diện tích vết với nồng
độ mẫu và logarit nồng độ mẫu
Tương quan giữa chiều cao pic trong HPTLC với nồng
độ mẫu
Kết quả khảo sát độ lặp lại chiều cao pic trong HPTLC
và diện tích vết.
Khảo sát độ đúng của phương pháp SKLM với kết hợp
xử lý ảnh
Kết quả định lượng các mẫu chế phẩm theo 2 phương
pháp HPTLC và SKLM với kết hợp xử lý ảnh
Kết quả định lượng một số mẫu chế phẩm theo 2
phương pháp HPLC và HPTLC
Kết quả định lượng Rotundin trong viên Sen vông R
(lô 20208) bằng phương pháp HPLC
So sánh kết quả định lượng viên Sen vông R (lô
20208) bằng 3 phương pháp HPLC, HPTLC và đo bạc.

Trang
29
41
41
44
45
47
52
53
53

So sánh việc xử lý ảnh trong SKLM với kết hợp xử lý
Bảng 3.10

ảnh dùng máy ảnh kỹ thuật số, máy quét và trong
HPTLC

56


Danh mục các hình
Hình
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5

Nội dung
Sắc ký đồ triển khai với hệ 1 của dung dịch Rotundin
chuẩn
Sắc ký đồ triển khai với hệ 9 của dung dịch Rotundin
chuẩn
Sắc ký đồ triển khai với hệ 9 của mẫu Rotundin trong
viên Sen vông - R
Bàn chấm mẫu sắc ký CAMAG
Bản mỏng với các mẫu thử được xử lý khác nhau chụp
ảnh dưới bước sóng 366nm trong HPTLC

Trang

28
28
29
30
33

Hình 3.6

Sắc ký đồ HPTLC của các mẫu trong cồn

34

Hình 3.7

Bản mỏng với mẫu thử có thêm và không thêm palmatin

35

Hình 3.8

Chọn công cụ điều chỉnh độ sáng và độ tương phản

38

Hình 3.9

Chỉnh độ sáng và độ tương phản để có được vết rõ hơn

38

Hình3.10
Hình 3.11
Hình 3.12
Hình 3.13
Hình 3.14
Hình 3.15

Chọn công cụ Measure Tool từ thanh công cụ của
Photoshop
Chọn công cụ Color Range từ menu select của
Photoshop
Chọn mầu khoanh vùng trong hộp thoại Color Range
Xác định kích thước các vết sau khi sử dụng Color
Range
Đường chuẩn Rotundin trong HPTLC
Đường chuẩn Rotundin trong sắc ký lớp mỏng kết hợp
máy tính

39
39
39
40
42
43


Hình
Hình 3.16

Nội dung

ảnh chụp định lượng viên Sen vông R trên HPTLC
bằng phương pháp so sánh

Trang
46

Hình 3.17

Sắc ký đồ mẫu thử được pha trong methanol

48

Hình 3.18

Sắc ký đồ mẫu thử được pha trong pha động

49

Hình 3.19

Sắc ký đồ mẫu thử được chiết bằng chloroform

49

Hình 3.20

Sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn Rotundin

51

Hình 3.21

Sắc ký đồ mẫu thử Rotundin trong viên Sen vông - R

51

Phổ hấp thụ UV-VIS của mẫu Rotundin chuẩn và thử
Hình 3.22

trong pha động

57


-1-

Đặt vấn đề
Rotundin (L- tetrahydropalmatin) l mt alcaloid chit t củ bình vôi có
tác dụng an thần gây ngủ, gim au. Hin nay trên thị trường có nhiều chế
phẩm cha duy nht mt thnh phn Rotundin vi các hàm lượng khác nhau
dùng lm thuc ng. Phng pháp nh lng Rotundin trong chế phẩm c
quy nh trong mt s dc in có thể là: phng pháp o quang [4], [30],
phng pháp kt ta vi AgNO 3 [29], [30]. Một số phương pháp khác như:
R

R

định lượng trong môi trường khan [30], bằng HPLC [10] cũng được nghiên
R

R

cứu ứng dụng.
Đ tng tác dng an thn gây ng, viên bao Sen vông- R ca Công ty
Cổ phần dược phẩm Trung ng II sn xut phi hp Rotundin vi cao lá sen
v cao lá vông. Vì vy trong thnh phn có thêm nhiều alcaloid khác, vic
nh lng bng các phương pháp trên không tránh khỏi sai số.
Theo tiêu chuẩn cơ sở [999], Rotundin trong viên Sen vông R được
định lượng bằng phương pháp kết tủa với AgNO 3 . Việc áp dụng phương pháp
R

R

R

R

này cho kết quả có sai số lớn và đặc biệt mất nhiều thời gian không phù hợp
với yêu cầu kiểm tra bán thành phẩm trong quá trình sản xuất. Do vậy, đòi hỏi
phải có một phương pháp định lượng nhanh hơn, phù hợp với điều kiện cơ sở.
Xuất phát từ yêu cầu đó chúng tôi thực hiện đề tài "Xây dựng phương pháp
định lượng Rotundin trong viên bao Sen vông- R" với 3 mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp định lượng nhanh Rotundin trong bán thành
phẩm viên Sen vông-R bằng sắc ký lớp mỏng.
2. áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng Rotundin trong chế
phẩm Sen vông-R và so sánh kết quả với phương pháp HPTLC.
3. So sánh một số phương pháp có thể định lượng được Rotundin trong
chế phẩm Sen vông R.

-2-

ChươngI

Tổng quan
1.1. RoTUNDIN:
1.1.1. Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý:
1.1.1.1. Biệt dược: Rotunda , stilux, Roxen
1.1.1.2. Tên khoa học: L- Tetrahydropalmatin
1.1.1.3. Công thức phân tử:
H3CO
N

H3CO

OCH3
OCH3

C 21 H 25 NO 4 ;
Khối lượng phân tử: 355,43 [1], [4], [29], [28], [31].
1.1.1.4. Tính chất:
Rotundin dạng base là tinh thể trắng hay hơi vàng, không mùi, không
vị. Bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt. Tan trong
cloroform, tan ít hơn trong ethanol và ether, không tan trong nước, tan rất tốt
trong acid sulfuric loãng.
Điểm chảy: 141 1440C.
Góc quay cực riêng: Từ 2900 đến -3000 tính theo chất khan, xác định
trên dung dịch 8mg/ml trong ethanol 950 và đo ở 250C.
Độ hấp thụ ánh sáng: Rotundin có cực hấp thụ ở 281 nm với giá trị
A(1%,1cm) là 155 [4], [30], [31].

1.1.1.5. Tác dụng dược lý:
Từ lâu tác dụng dược lý của Rotundin đã được nghiên cứu, dưới đây là
một số kết quả:
R

R

R

R

R

R

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P


-3-

- Rotundin rất ít độc: Tiêm vào mạch máu thỏ với liều cao hơn 30mg/kg
thể trọng, thỏ chỉ mệt 1-2 ngày, đồng tử chỉ bị liệt nhất thời rồi lại hết.
- Tác dụng trấn kinh rõ rệt trên nhu động vị tràng. Trên mẩu ruột lấy riêng,
nó gây hiện tượng giảm nhu động rõ rệt mà vẫn duy trì sự co bóp điều hoà và
kéo dài. Có thể dùng chữa những trường hợp tăng nhu động và ống tiêu hoá bị
giật.
- Có tác dụng điều hoà đối với tim và bổ tim nhẹ.
- Có tác dụng an thần, gây ngủ và chống co quắp, hạ huyết áp.
- Ngoài ra còn có tác dụng điều hoà hô hấp có thể dùng chữa hen hay chữa
nấc [7], [14].
1.1.2. Các phương pháp định tính:[4]
- Phương pháp hồng ngoại:
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ của Rotundin
chuẩn.
- Phương pháp hoá học:
Hoà tan 0,1g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 10mL nước và 1mL dung
dịch acid sulfuric loãng (TT) để được dung dịch S.
Thêm 1 giọt dung dịch kali dicromat 5% (TT) vào 2mL dung dịch S, tủa
vàng xuất hiện.
Thêm 1 giọt dung dịch natri clorid bão hoà (TT) vào 2mL dung dịch S
tủa trắng xuất hiện.
Thêm 1 giọt dung dịch Kali fericyanid 5% (TT) vào 2mL dung dịch S,

tủa vàng xuất hiện, tủa này dần dần chuyển sang màu xanh lá rồi cuối cùng là
màu xanh lam khi đun nóng nhẹ.
1.1.3. Các phương pháp định lượng:
1.1.3.1. Phương pháp kết tủa với AgNO 3 : [9], [29], [30]
Tiến hành: Trong một bình định mức 50mL, hoà tan một lượng chế phẩm
khoảng 0,3g Rotundin trong 2mL acid acetic, thêm 15mL nước cất, đun nóng
nhẹ cho tan hết, trộn đều. Thêm chính xác 25,0 mL dung dịch kali iodid
1,7%, pha loãng với nước cất đến vạch, lọc qua giấy lọc thô, hút chính xác 25
ml trộn thêm 3-5 giọt chỉ thị natri eosinat, chuẩn độ bằng dung dịch AgNO 3
R

R

R

R


-4-

0,05M cho đến khi xuất hiện tủa mầu hồng. Song song tiến hành chuẩn độ
một mẫu trắng.
1mL dung dịch AgNO 3 0,05M tương ứng với 17,77mg C 21 H 25 NO 4
Phương pháp này được Dược điển Trung Quốc năm 2000 áp dụng để định
lượng Rotundin nguyên liệu. Tiêu chuẩn cơ sở của viên bao Sen vông - R cũng
dùng phương pháp này để định lượng Rotundin nhưng trước đó phải chiết
riêng Rotundin ra khỏi các chất khác, đòi hỏi phải tốn rất nhiều thời gian và
công sức. Cụ thể như sau:
Tiến hành theo tiêu chuẩn cơ sở: cân chính xác một lượng bột viên tương
đương với 20 viên Sen vông R vào một cốc có mỏ khô sạch. Thấm ướt với

cloroform. Khuâý kỹ, để lắng, lọc dịch chiết qua giấy lọc khô (đã tráng với
cloroform) vào cốc thuỷ tinh sạch. Chiết tiếp với 20ml, 20ml, 10ml, 10ml
cloroform đến hết Rotundin trong cắn còn lại. Dùng cloroform để tráng phễu
và giấy lọc, tập chung dịch tráng vào với dịch lọc và làm bay hơi trên cách
thuỷ đến khô. Lấy 3 ml cloroform tráng thành cốc thuỷ tinh, tiếp tục làm bay
hơi dung môi, cuối cùng dùng quả bóp làm cho khô kiệt. Hoà tan cắn trong 2
ml dung dịch acid acetic 36 37%, để nóng trên nồi cách thuỷ (700 -800C)
và khuấy kỹ bằng đũa thuỷ tinh. Thêm 10 ml nước, khuấy đều trong khi vẫn
để cách thuỷ nóng. Lấy ra, ngâm trong nước lạnh để cho lớp váng nổi trên bề
mặt đặc lại dính vào thành cốc. Gạn phần dung dịch vào bình định mức 50 ml,
tráng cốc và phễu lọc với 3 ml nước. Tiếp theo tiến hành giống như dược điển
Trung Quốc qui định, bắt đầu từ thêm chính xác 25ml dung dịch kali iodid.
1.1.3.2. Phương pháp chuẩn độ môi trường khan: [30]
Chuẩn độ môi trường khan là phương pháp chuẩn độ các acid và base yếu
hoặc những muối của chúng trong môi trường không phải là nước. Rotundin là
một base yếu, nên Dược điển Trung Quốc năm 2000 đã áp dụng phương pháp
này để định lượng Rotundin hydroclorid nguyên liệu.
Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,35g Rotundin hydroclorid chế
phẩm, thêm 25mL acid acetic khan, 2mL anhydrid acetic và 5mL dung dịch
thủy ngân (II) acetat, lắc cho tan hết, thêm 1 giọt dung dịch tím tinh thể làm
chỉ thị và chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M cho đến khi dung dịch
chuyển sang mầu xanh lục. Song song tiến hành chuẩn độ một mẫu trắng.
R

R

R

R

R

R

R

P

P

P

P


-5-

1mL dung dịch acid percloric 0,1M tương đương với 39,19mg
C 21 H 25 NO 4 .HCl.
1.1.3.3. Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến: [4] [11] [29] [30]
Phương pháp này dựa trên định luật Lambert - Beer.
Cách tiến hành: Hoà tan một lượng chế phẩm Rotundin với nồng độ
khoảng 0,003% trong dung dịch acid sulfuric 0,5%. Rồi đo độ hấp thụ của
dung dịch thu được ở bước sóng 281 nm, mẫu trắng là acid sulfuric 0,5%.
Tính hàm lượng Rotundin trong chế phẩm theo trị số A (1%,1cm) ở bước sóng
cực đại 281 nm là 155.
Dược điển Trung Quốc áp dụng phương pháp này để định lượng
Rotundin trong các chế phẩm viên nén và thuốc tiêm.
1.1.3.4. Phương pháp sắc ký lớp mỏng:
Đưa dung dịch chuẩn Rotundin và dung dịch thử lên cùng một bản mỏng.

Tiến hành triển khai bằng dung môi thích hợp để tách Rotundin ra khỏi các
alcaloid khác. Phun thuốc thử hiện mầu hay soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng
254nm để xác định vết Rotundin trong dung dịch thử tương ứng với vết
Rotundin của dung dịch chuẩn.
Xử lý bản mỏng để xác định hàm lượng Rotundin trong vết dựa trên các
vết của dung dịch chuẩn. [13]
1.1.3.5. Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao: [11]
* Điều kiện sắc ký:
R

R

R

R

R

R

- Cột RP18 (250 x 4,0 mm; 5àm)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Detector UV với bước sóng phát hiện 283 nm
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng.
- Thể tích tiêm: 20àl
* Pha động: Hỗn hợp gồm dung dịch KH 2 PO 4 0,05M( 62,5 mL), acetonitril
(37,5mL) và triethylamin (0,5 mL). Dùng dung dịch acid phosphoric đặc
R

R

R

R

để điều chỉnh pH đến 4,0. Lọc qua màng lọc mịn cỡ 0,45àm, lắc siêu âm
trong 5 phút để loại bọt khí.


-6-

* Chuẩn bị mẫu: pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử có nồng độ tương
đương khoảng 0,04 mg Rotundin khan trong 1mL pha động.
Thời gian lưu của Rotundin là 4,32 phút. So sánh diện tích của pic
Rotundin chuẩn với diện tích của mẫu thử từ đó tính ra kết quả.
1.2.Viên sen vông- R:
1.2.1. Thành phần và tác dụng của viên Sen vông - R:
Sen vông - R là một trong những mặt hàng truyền thống của Công ty cổ
phần Dược phẩm Trung Ương II đã được sản xuất trong nước và xuất khẩu.
Sen vông - R có tác dụng an thần, gây ngủ và có thành phần bao gồm: cao lá
sen, cao lá vông và Rotundin 0,015g.
1.2.2. Thành phần và tác dụng của lá Sen:
Từ trước đến nay, người ta chỉ chú ý đến tác dụng an thần của hạt sen
và tâm sen, ít người lại nghĩ rằng lá sen lại có nhiều tác dụng quí để chữa
bệnh. Về hoá học, lá sen chứa 0,2 0,3% tannin, 0,77 0,84% alcaloid
toàn phần trong đó có tới 15 alcaloid. Alcaloid chính là nuciferin 0,15%,
ngoài ra còn có nor - nuciferin, roemetin (alcaloid A), pro nuciferin,
anonain, liriodenin, amepavin, N nor armepavin, methyl corlaurin,
nepherin, dehydroemetin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N
methyllisocourlaurin v mt s cht nh vitamin C, acid citric, tatric,

succinic, quercetin, isoquercitrin, nelumbosid, leucocyanidin, leuco
delphinidin. Tỷ lệ hoạt chất có trong lá sen bánh tẻ cao hơn trong lá non và lá
già [1], [4], [15], [14], [21].
H3CO
H3CO

Nuciferin

HO
N CH3

H3CO

N CH3

Nor - nuciferin


-7-

H3CO

H3CO
H3CO

N

H

N CH3

H3CO

HO

N nornuciferin

Amepavin

Nhiều thành phần trong lá sen có công thức cấu tạo cùng chứa khung
isoquinolin tương tự như cấu trúc của của l tetrahydropalmatin. Đây có thể
là nguyên nhân dẫn đến sai số khi định lượng l tetrahydropalmatin bằng
phương pháp đo bạc.
Về dược lý, lá sen đã được nghiên cứu chứng minh có tác dụng an thần,
chống co thắt cơ trơn, chống choáng phản vệ, ức chế loạn nhịp tim, hạ huyết
áp nhẹ. Tác dụng an thần của lá sen mạnh hơn tâm sen. Nuciferin chiết từ lá
sen có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não
cảm giác vận động và thể lưới nhân não, trên thỏ thí nghiệm có tác dụng an
thần kéo dài giấc ngủ, ít độc.
Lá sen được dùng sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 20g/ngày. Lá
sen kết hợp với một số vị dược liệu khác có tác dụng an thần [1], [7], [14],
[15].
1.2.3. Thành phần và tác dụng của lá Vông:
Lá vông còn có tên khác Vông nem (vì lá được dùng để gói nem), Hải
đồng, Thích đồng Tên khoa học là Erythrina orientalis (L.) Murr. Họ đậu
(Fabaceae)
Lá, vỏ thân và hạt đều chứa alcaloid. Hàm lượng alcaloid toàn phần
trong lá khoảng 0,77 0,84%. Lá và vỏ thân đều chứa alcaloid erysotrin,
erysodin, erysovin, erysonin, erysopin, erythrinin, erythralin, trong đó
nuciferin là alcaloid chính. Có tác giả còn tách được chất saponin gọi là

migarrhin có tính chất làm giãn đồng tử. Công thức cấu tạo của một số
alcaloid có trong lá sen như sau:


-8-

R 1O
N

R 2O
R3O

R1
H
H
H
CH 3
CH 3
R

Erysopin
Erysonin
Erysodin
Erysovin
Erysotrin

R

R

R2
H
CH 3
CH 3
H
CH 3

R3
CH 3
H
CH 3
CH 3
CH 3

R

R

R

R

R

R

R

R

R

Alcaloid toàn phần trong lá vông nem ít độc, LD 50 là 306,4mg/kg chuột
thí nghiệm. Alcaloid toàn phần trong lá vông nem có tác dụng ức chế hoạt tính
điện của vùng vỏ não và cấu trúc dưới vỏ, thể hiện sóng chậm chiếm ưu thế
trên hình ảnh điện não đồ và biên độ diện não giảm, có tác dụng kéo dài giấc
ngủ của hexobacbital đối với chuột thí nghiệm... Nhân dân ta dùng lá vông
nem sắc uống hoặc luộc ăn chữa mất ngủ, dịu thần kinh hay thần kinh suy
nhược kém ăn, kém ngủ. Ngày dùng 8 16g [1], [14], [19], [21].
R

R

1.3. Sắc ký lớp mỏng:
Trong các sắc ký, kỹ thuật sắc ký trên lớp mỏng là phương pháp ít đòi hỏi
thiết bị phức tạp nhất và cách tiến hành cũng thuộc loại đơn giản nhất. Nhờ có
nhiều ưu điểm trong khả năng tách các hỗn hợp phức tạp bao gồm nhiều cấu
tử khác nhau mà sắc ký lớp mỏng ngày càng được sử dụng rộng rãi. Có thể kể
ra các lợi thế của sắc ký lớp mỏng là:
- Yêu cầu trang thiết bị cần thiết đơn giản.
- Cho kết quả nhanh, rất thuận tiện cho theo dõi phản ứng, dự đoán nhanh
các chất... Thời gian thực hiện ngắn hơn so với sắc ký cột và sắc ký giấy.
- Khá kinh tế nên rất hiệu quả trong thăm dò kết quả của nhiều quá trình
khác nhau.
- Vết nhỏ và gọn hơn vết của sắc ký giấy.


-9-

- Trong nhiều trường hợp tác dụng phân tách được rõ rệt hơn các phương

pháp sắc ký giấy.
- Có giới hạn tách các chất mạnh hơn sắc ký giấy nhiều lần.
- Có thể dùng được các thuốc thử mạnh.
ứng dụng chủ yếu của SKLM là định tính và thử độ tinh khiết. Cùng với
sự phát triển của kỹ thuật xử lý hình ảnh bản mỏng và tiêu chuẩn hoá bản
mỏng ngày nay SKLM đang dần tham gia vào việc bán định lượng và định
lượng các chất trong hỗn hợp.[17]
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng:
Cũng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp các
chất bằng SKLM xẩy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh. Trong
SKLM, pha tĩnh được rải thành lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng. Dưới tác
dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát
- nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng. Trong quá trình
di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh), nhờ các quá
trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác
nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha
động với các tốc độ khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích
có thể sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng.
Cơ chế tách hỗn hợp các chất trong SKLM về nguyên tắc tương tự như
sắc ký cột. Trong SKLM có thể có các cơ chế chủ yếu sau:
- sắc ký hấp phụ dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau đối với pha tĩnh của
các chất, đặc trưng bởi hằng số hấp phụ.
- sắc ký phân bố dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha
tĩnh và pha động, đặc trưng bởi hệ số phân bố.
- sắc ký trao đổi ion dựa trên sự trao đổi ion giữa dung dịch và ionit, đặc
trưng bởi hằng số trao đổi ion.
- sắc ký rây phân tử dựa trên sự xâm nhập của các chất tan vào các hốc
trên pha tĩnh, phụ thuộc kích thước phân tử các chất.
- ngoài ra còn có thể có các cơ chế khác như kết tủa, tạo phức, oxy hoá
khử....

-10-

Trong mỗi quá trình sắc ký có một cơ chế chủ yếu nhưng đồng thời có thể
xẩy ra các cơ chế khác [14], [17].
1.3.2. Hệ số di chuyển R f :
R

R

Trong SKLM, đại lượng đặc trưng
quan trọng về mức độ tách là hệ số di
chuyển R f . R f là tỉ số giữa đoạn
đường mà chất tan đi được (z) và
đoạn đường mà dung môi đi được (l):
R

R

R

Tuyến dung môi

R

m

z
Rf =

l

l

Đoạn đường chất tan đi được là
khoảng cách từ tuyến xuất phát đến
z
n
tâm của vết sắc ký. Còn đoạn đường
dung môi (chất lý tưởng không bị hấp
phụ) đi được là khoảng cách từ tuyến
xuất phát đến tuyến dung môi. R f
Điểm xuất phát
cũng là tỷ số giữa tốc độ di chuyển
của chất tan và của dung môi trên bản
mỏng.
Như vậy đại lượng R f chỉ có giá trị từ 0 đến 1. Nếu R f = 0 có nghĩa là
chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm nguyên tại điểm xuất phát. Nếu R f
= 1 nghĩa là chất tan di chuyển cùng tốc độ với dung môi hay là không bị chất
hấp phụ hấp phụ.
Có rất nhiều yếu ảnh hưởng đến R f đó là:
- Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ
- Bề dầy của lớp mỏng
- Tính chất, thành phần và độ tinh khiết của pha động
R

R

R

R

R

R

R

R

R

- độ bão hoà dung môi trong bình sắc ký
- Phương pháp khai triển sắc ký
- Tốc độ di chuyển của pha động
- đoạn đường pha động đi được

R


-11-

- Vị trí đưa chất tan lên bản mỏng
- Lượng mẫu đưa lên bản mỏng
- ảnh hưởng của các chất tan khác, chất tạo phức, pH, nhiệt độ, độ
chính xác của phép đo khoảng cách [6], [20].
1.3.3. Pha tĩnh-Chất hấp phụ:
Trong SKLM người ta sử dụng nhiều loại chất hấp phụ khác nhau. Các chất
hấp phụ được sử dụng phổ biến là silicagel, nhôm oxid, kieselgur, cellulose,
nhựa trao đổi ion... Ngoài ra người ta còn dùng các chất hấp phụ biến tính là

các chất hấp phụ thông thường nhưng được tẩm các chất lỏng hữu cơ như các
amin cao phân tử, acid diethylhexyl phosphoric, tributyl -phosphat.... Cơ chế
tách của các chất hấp phụ trên rất khác nhau một số dựa trên khả năng hấp
phụ là chủ yếu số khác lại có tính trao đổi ion là chủ yếu.
Các chất hấp phụ pha đảo trong SKLM cũng được điều chế chủ yếu từ
silicagel. Nguyên liệu thường được dùng là loại silicagel có kích thước lỗ cỡ
6nm. Những nhóm chức hữu cơ liên kết thường được dùng là methyl (RP-2),
octyl (RP-8), dodecyl (RP-12), octadecyl (RP-18). Đặc tính kỵ nước của
những nhóm alkyl này giảm từ RP-18 đến RP-2.
1.3.4. Pha động:
Trong sắc ký hấp phụ việc chọn đúng dung môi ý nghĩa rất quan trọng. Khi
chọn dung môi phải chú ý đến các yếu tố sau:
- phải hoà tan tương đối tốt tất cả các cấu tử cần phân tích.
- bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh (chất hấp phụ)
- khả năng xẩy ra phản ứng hoá học với chất tan cũng như chất hấp phụ
- độ bay hơi, sự phân lớp khi dùng hỗn hợp dung môi.
- sự tinh khiết của dung môi nhất là các dung môi không phân cực phải
không được chứa các dung môi phân cực, đặc biệt là nước.
Để nhanh chóng chọn dung môi có thể dựa vào dãy elutrop của Trappe.
Đây là dãy các dung môi sắp xếp theo thứ tự giảm khả năng giải hấp phụ đối
với các chất bị hấp phụ trên các chất hấp phụ phân cực. Trừ một số trường hợp
ngoại lệ, khả năng giải hấp phụ của các dung môi phụ thuộc vào hằng số điện
môi của chúng. Đối với chất hấp phụ không phân cực khả năng giải hấp phụ


-12-

theo thứ tự ngược lại. Với SKLM, để chọn dung môi cho pha động thường
phải tiến hành thí nghiệm thăm dò và điều chỉnh.
Quan hệ giữa pha tĩnh, pha động và hỗn hợp tách:

Một qui tắc được rút ra trên cơ sở lý thuyết và thực nghiệm để chọn gần
đúng chất hấp phụ (pha tĩnh) và dung môi khai triển (pha động) khi tiến hành
tách các hỗn hợp các chất có độ phân cực khác nhau bằng SKLM. Qui tắc đó
được gọi là qui tắc tam giác: Quay tam giác ở tâm sao cho một đỉnh chỉ vào
một yếu tố đã biết thì 2 đỉnh còn lại sẽ chỉ vào 2 yếu tố còn lại.
Hoạt tính hấp phụ
(Silicagel G III
Nhôm oxid G)

II

I

Phân cực
(ưa nước)

IV
Độ phân cực
của dung môi

V
Không phân cực
(ưa dầu)

Hỗn hợp tách

Phân cực
(ưa nước)

Không phân cực

(ưa dầu)

Qui tắc này áp dụng khá tốt với các hợp chất hữu cơ khi sử dụng các chất
hấp phụ phổ biến là silicagel G và nhôm oxid G [20].
1.3.5. Kỹ thuật tiến hành sắc ký lớp mỏng:
Có thể chia quá trình SKLM thành các giai đoạn: chuẩn bị bản mỏng,
đưa mẫu lên bản mỏng, khai triển bản mỏng với pha động thích hợp và xử lý
bản mỏng để thu kết quả.
1.3.5.1. Chuẩn bị bản mỏng:
Hiện nay các bản mỏng thường được các hãng tráng sẵn và bán dưới các
dạng chất hấp phụ khác nhau và có thể tẩm chất phát huỳnh quang hay không.
Việc dùng các bản tráng sẵn khá phổ biến hiện nay vì hiệu lực tách của các
bản tráng sẵn thường rất cao so với bản tự tráng hơn nữa do kinh tế phát triển
nên kinh phí cho học tập và nghiên cứu có phần nới rộng tạo điều kiện cho


-13-

việc áp dụng những thành tựu của công nghệ thuận lợi hơn. Tuy nhiên trong
một số trường hợp người dùng vẫn có thể phải tự tráng lấy bản mỏng đáp ứng
cho yêu cầu riêng của họ.
Hoạt hoá bản mỏng: Các bản mỏng tráng sẵn hay tự tráng trước khi sử
dụng phải được hoạt hoá. Thông thường các bản mỏng được hoạt hoá trong
khoảng 30 phút ở 110oC.
Những tấm đã có hoạt năng sẽ mất hoạt năng của nó khi để ở không khí
ẩm, cho nên ta nên bảo quản nó trong bình hút ẩm có silicagel, canxi clorid
khan. Chú ý khi để bản mỏng là kính nóng vào bình hút ẩm phải mở khoá đến
nguội mới đóng khoá lại.
1.3.5.2. Đưa mẫu lên bản mỏng:
Lượng và thể tích mẫu:

Lượng hỗn hợp chất đưa lên bản có ý nghĩa quan trọng đối với kết quả tách
sắc ký, đặc biệt là ảnh hưởng đến giá trị R f . Lượng chất quá lớn làm cho vết
chất sắc ký lớn và thường kéo dài. Việc kéo đuôi làm cho các vết có R f bị
chồng chập nên không tách được khỏi nhau. Lượng chất quá nhỏ có thể không
phát hiện được vết trên sắc đồ. Nói chung lượng mẫu đưa lên bản mỏng
P

P

R

R

R

R

khoảng 0,1-50àg, trong SKLM điều chế lượng chất có thể lên đến 10-50mg.
Tuỳ theo kiểu đưa mẫu lên bản mỏng mà thể tích mẫu cũng khác nhau.
Trường hợp mẫu đưa dưới dạng điểm thể tích mẫu khoảng 1-5 àl, còn trường
hợp đưa mẫu lên bản dưới dạng vạch (chấm này cạnh chấm kia) là khoảng
0,1- 0,2mL.
Trường hợp mẫu quá loãng cần làm giàu mẫu phân tích trước khi chấm hay
chấm mẫu nhiều lần kết hợp với chờ khô hay sấy nhẹ giữa các lần chấm.
Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng:
Tuyến xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng và mép của dung môi
pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi khi bắt đầu đến điểm đưa
mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định. Tốt nhất là cách mép dưới của bản 1,5cm
và cách mép dung môi từ 0,8-1,0cm.
Nếu mẫu đưa lên bản dưới dạng nhiều chấm thì các điểm chấm phải cách

nhau và cách mép bản mỏng đủ xa để tránh hiệu ứng bờ. Khoảng cách này tốt


-14-

nhất là 1 cm.
Các khoảng cách trên là áp dụng với bản mỏng tự tráng còn đối với bản
mỏng tráng sẵn với bề dầy lớp mỏng có độ đồng đều cao và số đĩa lý thuyết
lớn, chúng có thể được thu hẹp hơn nhằm tiết kiệm hơn về bản mỏng mà vẫn
đạt được yêu cầu.
Một vấn đề cần được lưu ý là kích thước các vết chấm phải bằng nhau vì
kích thước của vết chấm sẽ ảnh hưởng đến diện tích vết và do đó làm sai lệch
kết quả phân tích. Do vậy số lần chấm và thể tích mỗi lần chấm phải như nhau
giữa các mẫu chuẩn và mẫu thử.
1.3.5.3. Khai triển sắc đồ và các kỹ thuật khai triển:
Quá trình cho pha động di chuyển qua pha tĩnh để tách hỗn hợp phân tích
thành các cấu tử nằm ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng được gọi là khai
triển sắc đồ. Tuỳ theo hướng chuyển động của pha động mà có thể có các cách
khai triển khác nhau. Ngoài kiểu sắc ký đi lên ra còn có các kiểu sắc ký khác
như: sắc ký đi xuống, sắc ký liên tục, sắc ký lặp, sắc ký đa bậc, sắc ký hai
chiều, sắc ký tròn, sắc ký hình quạt Mathias, sắc ký gradien.....
1.3.5.4. Hiện sắc đồ:
Không phải tất cả các vết tách ra từ hỗn hợp mẫu phân tích đều có mầu nên
sau khi khai triển có thể chưa có ngay sắc đồ. Đối với những chất được sắc ký
không màu hay màu rất nhạt thì sau khi khai triển cần phải hiện sắc đồ bằng
phương pháp hoá học hay quang học, đôi khi bằng phóng xạ với các đông vị
phóng xạ.
Hiện sắc đồ bằng phương pháp hoá học:
Đây là phương pháp phổ biến nhất. Sắc đồ có thể được hiện lên sau phun
lên bản mỏng một hoặc một vài thuốc thử có khả năng tạo màu đặc trưng với

chất cần tách. Các dung dịch này được gọi là dung dịch hiện màu. Sắc đồ có
thể hiện lên ngay sau khi phun hay sau khi sấy nóng ở 80-100oC.
P

P

Các thuốc thử phun của sắc ký giấy đều có thể áp dụng cho lớp mỏng
được. Với SKLM còn có thể sử dụng thêm các thuốc thử mạnh như acid
sulfuric đặc, acid sulfo-cromic, hỗn hợp acid sulfuric và nitric... hoặc hơ kính
ở nhiệt độ cao để làm cháy các hợp chất hữu cơ. Nếu ta thêm vào acid sulfuric
0,5% một aldehyd như là: p-dimetylaminobenzaldehyd, vanilin, anisaldehyd,


-15-

aldehyd salixylic, furfuron hay aldehyd formic... ta sẽ được những chất màu
đậm. Khi sấy giữa 100-300oC ta còn thấy rõ những chất khác.
Một số chất hữu cơ có thể hiện màu bằng thuốc phun có iod. Dung dịch
phun iod: phun trên lớp mỏng dung dịch iod 0,5% trong cloroform.
Một thuốc thử chung cho các chất hữu cơ là dung dịch kali - permanganat
trong acid sulfuric đặc. Cần chú ý chỉ pha chế lượng ít thuốc thử vì aldehyd
permanganic hợp thành có thể nổ khi bị phân huỷ. Những vết sẽ hiện màu
trắng trên nền hồng.
Nhiều trường hợp có thể hiện màu bằng hơi iod bằng cách cho vào bình kín
có iod, sau 15-20 phút lấy bản mỏng ra để bay hơi hết iod trong không khí.
Cũng có trường hợp người ta hiện màu bằng cách nhúng (hay tẩm) bản mỏng
bằng acid sulfuric đặc theo hướng vuông góc với chiều khai triển.
P

P

Phương pháp quang học:
Với các chất có khả năng hấp thụ tử ngoại nhờ dùng các lớp mỏng có chứa
các chất huỳnh quang hay đã phun thuốc hiện huỳnh quang. Khi soi dưới đèn
tử ngoại sẽ thấy các vết tối ứng với vết của chất đã được tách trên bản sắc ký.
Với các chất có khả năng huỳnh quang, khi chiếu tia tử ngoại lên bản
mỏng sẽ thu được các vết phát sáng màu khác nhau. Các đèn tử ngoại thường
dùng là các đèn 254nm và 366nm [12], [16], [20], [22].
1.3.6. ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm: [33]
Định tính và thử tinh khiết là ứng dụng phổ biến và chủ yếu của SKLM.
Ngày nay với các tiến bộ của kỹ thuật và thiết bị xử lý bản mỏng sau khai
triển và các phương tiện lượng hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng định lượng
ngày càng được áp dụng một cách phổ biến hơn.
1.3.6.1. Phân tích định tính:
Để nhận biết các chất trên sắc đồ có thể bằng 2 cách: nhận biết theo
màu sắc đặc trưng của các vết trên sắc đồ và dựa vào giá trị R f .
R

R

Nhận biết theo màu đặc trưng của vết sắc ký:
Trong trường hợp này không cần thật sự quan tâm đến giá trị R f mà chỉ
cần biết thứ tự chuyển động của các vết trong hỗn hợp. Phương pháp này
R

R