Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI
HỌC
DƯỢC
HÀ NỘI
•
•
•
•

— oOo—

v ũ ĐỨC LỢI

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
ETORICOXIB TRONG CHÉ PHẨM
VÀ TRONG HUYỂT TƯƠNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
LUẶN
VÃN THẠC
SỸ D ư ợc
HỌC
•
•
•
•

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60 73 15
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐOÀN CAO SƠN

HÀ NỘI - 2010
9

TRƯỜNG ĐH ĐƯỢC HÀ NỘI

T H Ư VS ỆN
,

10

. {QJuUQý\ỹuym

Qffimcj' ĨQÁu

Ngày

Số

tháng

năm 20 J l


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đoàn Cao Sơn

là

người thầy đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
suốt quả trình thực hiện ỉuận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS. TS. Trần Đức Hậu là
người đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Phòng D ược lý - Viện Kiểm
Nghiệm Thuốc Trung Ương, cùng các cản bộ Bộ môn Hóa Dược- Trường Đ H
Dược Hà N ội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình tôi làm thực nghiệm
tại đây.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn khích lệ, động viên, giúp đỡ
tôi trong thời gian qua.

Hà Nội ngày 8 tháng 09 năm 2010
Học viên

Vũ Đức Lọi


MỤC LỤC
Danh muc các chữ viết tắt
Danh mục các bảng số liệu
Danh mục các hình vẽ
ĐẶT VẤN Đ È ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................... 3
1.1. Tổng quan về etoricoxib ............................................................................3
1.1.1. Công thức cấu tạo của Etoricoxib...................................................... 3
1.1.2.
1.1.3.
1.1.4.

1.1.5.
1.1.6.

Tính chất lý hóa.................................................................................... 3
Dược động h ọ c.................................................................................... 3
Tác dụng và cơ chế tác dụng...............................................................4
Chỉ định................................................................................................ 4
Chống chỉ định.................................................................................... 4

1.1.7. Tác dụng không mong muốn...............................................................4
1.1.8. Tương tác thuốc................................................................................... 5
1.1.9. Chế phẩm.............................................................................................. 5
1.2. Một số phương pháp định lượng etoricoxib..............................................5
1.2.1. Định lượng Etoricoxib bằng phương pháp HPLC............................ 5
1.2.2. Định lượng Etoricoxib trong huyết tương bằng phương pháp
L C/MS/M S ...................................... .7.................. ...............................................6
1.2.3. Phương pháp đo quang để định lượng etoricoxib trong chế phẩm
viên nén........................................................................................................... 7
1.2.4. Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) định lượng etorỉcoxib
trong chế phẩm ............................................................................................... 7
1.3. Tổng quan về HPLC .................................................................................. 8
1.3.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng c a o ........................................... 8
1.3.2. Nguyên tắc của quá trình sắc k ý ........................................................ 8
1.3.3. Cơ sở ỉý thuyết của quá trình sắc k ỷ .................................................. 9
1.3.4. Cấu tạo của hệ thống HPL C ...............................................................9
1.3.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc k ý ..................................10
1.3.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký......................... 12


1.3.7. ửng dụng của H PLC .......................................................................14

1.4. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương...................................................... 15
1.4.1. Phương pháp tủa protein................................................................ 16
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng- lỏng........................................................ 16
1.5. Thẩm định phương pháp phân tíc h ......................................................... 16
1.5.1. Thẩm định phương pháp phân tích thuốc dạng chế phẩm ...........16
1.5.2. Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương...... 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .......... 20
2.1. Nguyên vật liệu và thiết b ị....................................................................... 20
2.1.1. Nguyên vật liệu................................................................................ 20
2.1.2. Trang thiết bị, dụng cụ.................................................................... 20
2.2. Nội dung nghiên cứ u ................................................................................20
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib trong chế phẩm và
trong huyết tương.......................................................................................21
2.2.2. Thẩm định phương pháp vừa xây dựng......................................... 21
2.2.3. ửng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Etoricoxib
trong chế phẩm viên nén............................................................................21
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................21

CHƯƠNG 3. KỂT QUẢ NGHIÊN c ứ u .....................................................23
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib trong chế phẩm bằng
HPLC ... ............... ...7........ ..................................................7........ ..................... 23
3.1.1. Lựa chọn bước sóng thích hợp....................................................... 23
3.1.2. Khảo sát chọn thành phần pha động..............................................24
3.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng..................................................................... 25
3.2. Thẩm định phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm......... 25
3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống..............................................................26
3.2.2. Độ đặc hiệu ..................................................................................... 27
3.2.3. Độ tuyến tính................................................................................... 29
3.2.4. Độ chính xác.................................................................................... 30
3.2.5. Độ đúng............................................................................................31

3.3. ứ ng dụng định lượng etoricoxib trong chế phẩm...................................32
3.4. Xây dựng phương pháp định lượng etoricoxib trong huyết tương....... 34
3.4.1. Chọn chuẩn nội và điều kiện sắc k ý ...............................................34


3.5.2. Độ tuyến tỉnh......................................................................................47
3.5.3. Giới hạn định lượng dưới.................................................................48
3.5.4. Độ đúng và độ lặp lại....................................................................... 49
3.5.5. Hiệu suất chiết................................................................................... 52
3.5.6. Độ ổn định..........................................................................................53
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN................................................................................59
KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ.......................................................................... 63
Kết luận............................................................................................................. 63
Kiến nghị..........................................................................................................64

TÀI LIỆU
THAM KHẢO
1


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

: Acetonitril.

A ưc

: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian.

COX- 2

: Cyclooxygenase- 2.

Ctnax

: Nồng độ cực đại.

Eto

: Etoricoxib.

FDA

: Cục quản lý thuốc và thực phẩm
Administration).
: Hạn dùng.

HD
HPLC

(Food and

Drug

HT

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography).
: Mầu kiểm soát có nồng độ cao (Hight Quanlity Control
Sample).

: Huyết tương.

IS

: Chất chuẩn nội (Internal Standard).

KNTTW

: Kiểm nghiệm thuốc trung ương.

LC/MS

: Sắc ký lỏng khối phổ.

LOQ

: Gới hạn định lượng (Limit of Quantitation).

LQC

: Mau kiểm soát có nồng độ thấp (Lower Quanlity Control
Sample).
: Methanol.

HQC

MeOH
MQC
NSX

: Mầu kiểm soát có nồng độ trung bình (Middle Quanlity
Control Sample).
: Ngày sản xuất.

NSAIDS

: Thuốc chống viêm giảm đau hạ sốt không steroid.

PA

: Tinh khiết phân tích.

QC

: Mầu kiểm soát (Quanlity Control Sample).

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard deviation),

s

: Diện tích pic.


SD

: Độ lệch chuẩn (Relative Standard).

SDK

: Số đăng ký.

ti /2

: Thời gian bán thải của thuốc (h a lf- life).

tmax

: Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong máu.

TB

: Trung bình.

ULOQ: Giới hạn định lượng trên (upper limit of quantification).
ƯV-VIS

: Tử ngoại - khả kiến.


DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU
Trang
Bảng 1.1. Các chương trình HPLC

5

Bảng 3.1. Kêt quả khảo sát độ thích hợp của hệ thông săc ký

26

Bảng 3.2. Kêt quả khảo sát độ tuyên tính

29

Bảng 3.3. Kêt quả khảo sát độ chính xác

31

Bảng 3.4. Kêt quả khảo sát độ đúng

32

Bảng 3.5. Kêt quả định lượng etoricoxib trong viên nén Etotab-60

34

Bảng 3.6. Cách pha các mẫu huyết tương

37

Bảng 3.7. Kêt quả khảo sát độ tuyên tính của Etoricoxib trong HT

47

Bảng 3.8. Kêt quả xác định LLOQ

49

Bảng 3.9. Kêt quả xác định độ đúng độ lặp lại trong ngày

49

Bảng 3.10. Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày

51

Bảng 3.11. Kết quả xác định hiệu suất chiết etoricoxib

52

Bảng 3.12. Kết quả xác định hiệu suất chiết aspirin (IS)

53

Bảng 3.13. Kết quả xác định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và
nội chuẩn gốc

54

Bảng 3.14. Kết quả xác định độ ổn định mẫu huyết tương qua 3
chu kỳ đông - rã đông

55

Bảng 3.15. Kết quả xác định độ ổn định dài ngày của mẫu huyết

56

tương

Bảng 3.16. Kết quả xác định độ ổn định autosampler

57

Bảng 3.17. Kết quả xác định độ ổn định trong thời gian ngắn của
mẫu huyết tương

58


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 3.1. Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Etoricoxib 10 |ig/ml

24

Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu trắng (pha động)

27

Hình 3.3. Săc ký đô mâu chuân Etoricoxib
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib có thêm Etoricoxib chuẩn
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

28
28
28
29

diện tích pic
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu chuẩn Etoricoxib định lượng

33

Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib định lượng

34

Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp Celecoxib và Etoricoxib

35

Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch hỗn họp Paracetamol và Etoricoxib

36

Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch hỗn họp Aspirin và Etoricoxib

36

Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được

39

acid hoá
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS không

39

được acid hoá
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được
acid hoá và cô cạn

40


Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được

41

acid hoá và cô cạn
Hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib và IS

41

Hình 3.17. Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib và IS, chiết bằng

42

ethylacetat
Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu huyểt tương etoricoxib và IS, chiết bằng

43

diethylether/dichloromethane
Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng của người

44

Hình 3.20. sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn Eto 100ng/ml

44

Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn nội aspirin

45

1000ng/ml

Hình 3.22. sắc ký đồ mẫu huyết tương có cả chuẩn Eto và chuẩn

45

nội aspirin
Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng của chó

46

Hình 3.24. sắc ký đồ mẫu huyết tương thử của chó

46

Hình 3.25. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ
và tỷ lệ diện tích pic Eto/IS

47


ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhóm thuốc NSAID là một nhóm thuốc hiện nay đang được sử dụng khá
phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Nhóm thuốc được dừng với tác
dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt rất hiệu quả và không gây nghiện như
nhóm thuốc Opiat, những tác dụng này đã được biết đến chính thức ngay từ
những năm 1838 khi Raffaelle Piria (Italia) tinh chế được acid acetylsalicylic
từ vỏ cây liễu. Hiện nay nhiều nước đã đưa một số thuốc thuộc nhóm NSAID
vào danh mục thuốc thiết yếu của quốc gia. Tuy nhiên nhóm thuốc này cũng
có tác dụng phụ nguy hiểm trên tiêu hoá như gây loét dạ dày, xuất huyết tiêu
hoá do cơ chế tác dụng của thuốc gây ra. Do đó các nhà khoa học đã và đang
tiếp tục nghiên cứu để tìm ra những thuốc mới có tác dụng tốt hơn nhưng hạn
chế tối đa các tác dụng phụ này. Đó là các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 như
nhóm coxib và phải kể đến thuốc gần đây nhất là etoricoxib.
Etoricoxib được nghiên cứu thành công và đưa vào sử dụng trong điều trị
vài năm gần đây nhưng hiện nay thuốc đã có mặt trên 60 quốc gia trong đó có
Việt Nam và ngày càng được sử dụng rộng rãi hơn. Vì vậy, việc kiểm soát
chất lượng của thuốc nhập khẩu và tiến tới là thuốc sản xuất trong nước là
điều quan trọng. Mặt khác bên cạnh những ưu điểm của thuốc trên đường tiêu
hoá thì thuốc lại có những nhược điểm trên một số cơ quan khác như tim
mạch. Vì thế để hạn chế tác dụng phụ và tăng cường hiệu quả sử dụng thuốc
thì việc có liệu trình điều trị cho từng bệnh nhân là điều cần thiết. Bởi vậy
việc nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương
sẽ góp phần giải quyết khâu kiểm soát chất lượng thuốc và có được liệu trình
điều trị hiệu quả nhất. Mặt khác, việc nghiên cứu này cũng giúp cho việc đánh
giá sinh khả dụng và thử tương đương sinh học của thuốc.

1


Hiện nay, trong và ngoài nước mới chỉ có một vài nghiên cứu về định
lượng etoricoxib, Dược điển các nước như Dược điển Anh, Mỹ, Việt Nam...

cũng chưa có chuyên luận về etoricoxib. Một số tác giả có nghiên cứu định
lượng etoricoxib bằng phương pháp LC/MS, HPLC, CZE, quang phổ ƯV-VIS
[6 ], [17], [18], [24], [30]. Tuy nhiên các phương pháp này sử dụng dung môi
đắt tiền hoặc khó áp dụng với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam.
Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng
etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC”
với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lưựng etorỉcoxỉb trong chế
phẩm bằng HPLC.
2. Áp dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng chế phẩm chứa
etoricoxib trên thị trường.
3. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng etoricoxib trong
huyết tương bằng HPLC.

2


CHƯƠNG 1. TỐNG QUAN
1.1. Tổng quan về etoricoxib [7], [8], [11], [19], [26]
1.1.1. Công thức cấu tạo của Etoricoxib
CH
0= s = 0

Tên khoa học:
5-chloro -2-(6-methylpyridin-3-yl)-3-(4-methylsulfonylphenyl)pyridine
Công thức phân tử: C 18H 15CIN2O2S
Phân tử lượng: 358.8
1.1.2. Tính chất lý hoá
Bột mịn, màu trắng. Tan ít trong nước và tan tốt trong dung môi hữu cơ
phân cực như methanol, acetonitril, hấp thụ ánh sáng tử ngoại.

1.1.3. Dược động học
- Hấp thu: Thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hoá, sinh khả dụng theo đường
uống xấp xỉ 100%. Sau khi uống liều 60mg/lần/ngày đạt nồng độ tối đa trong
huyết tương là cm
ax«1,36 |!g/ml với Tmax« lh, nếu uống liều 120mg/lần/ ngày
nồng độ tối đa trong huyết tương cm
ax«2,2|ig/ml YỚi Tmax« 1-1,5h.
- Phân bố: Thuốc liên kết với protein huyết tương là 92%, thuốc phân bố rộng
qua được nhau thai và hàng rào máu não.
- Chuyển hoá: Thuốc chuyển hoá chủ yếu ở gan tạo thành dẫn xuất 6 hydroxymethyl-etoricoxib nhờ phản ứng oxy hoá khử dưới sự xúc tác của

3


enzym CYP (chủ yếu là CYP3A4) và chỉ một phần nhỏ (<1%) của liều dùng
được thải trừ ở dạng không chuyển hoá.
- Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu khoảng 70% và qua phân khoảng
20 %, thời gian bán thải là ti /2 « 22 h.

1.1.4. Tác dụng và cơ chế tác dụng
- Tác dụng: giảm đau, chống viêm.
- Cơ chế tác dụng: do thuốc ức chế chọn lọc enzym COX-2, ngăn cản
tổng họp prostaglandin là chất trung gian hóa học gây viêm, do đó làm giảm
quá trình viêm. Do thuốc không ức chế COX-1 nên không gây ra các tác dụng
phụ trên đường tiêu hoá.
1.1.5. Chỉ định
- Viêm xương khớp 60mg/ngày.
- Cơn gout cấp 120mg/ngày.
- Viêm khớp dạng thấp 90mg/ngày.
- Đau cấp do phẫu thuật răng 120mg/ngày.

- Thống kinh nguyên phát 60mg/ngày.
- Đau cơ xương mãn tính 60mg/ngày, liều 120mg/ngày chỉ dùng trong
giai đoạn cấp.
1.1.6. Chống chỉ định
Quá mẫn với các thành phần của thuốc, suy gan nặng, suy thận Clcr <
30ml/phút, phụ nữ có thai hoặc cho con bú, tiền sử hen, viêm mũi cấp.
1.1.7. Tác dụng không mong muốn
- Chóng mặt, đau đầu, rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, khó tiêu, đau thượng
vị, suy nhược, giống bệnh cúm, tăng men gan.

4


-

Không thường gặp: Phù, tăng trọng, lo lắng, trầm cảm, mất ngủ, dị

cảm, ngủ gà, nhìn mờ, ù tai, suy tim, tăng huyết áp.
1.1.8. Tương tác thuốc: Tương tác với các thuốc chống đông, lợi tiểu, thuốc
ức chế men chuyển như: acetazolamid, furosemid...
1.1.9. Một số chế phẩm
- Lykarecox: viên bao film chứa 120mg etoricoxib, nhà sản xuất: Lyka Labs,
Ltd - Ấn Độ.
- Etorica: viên nén bao film chứa 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nhà sản
xuất: Micro Labs, Ltd - Ẩn Độ.
- Etotab: viên nén bao film chứa 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nhà sản
xuất: Micro Labs, Ltd - Án Độ.
- Arcoxia: viên nén chứa 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nhà sản xuất Merck
(Mỹ).
- Tauxib; Algix; Nucoxia: viên nén chứa 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nhà

sản xuất Zydus.
1.2. Một số phương pháp định lượng etoricoxib
1.2.1. Định lưọng Etoricoxib bằng phương pháp HPLC
Danh mục các chương trình HPLC tham khảo được trình bày ở bảng 1.1
Bảng 1.1. Các chương trình HPLC
Tài
liệu

Mẩu
thử

[29]
Chế
phẩm
viên
nén

Cột sắc ký

Điều kiện sắc ký

- Pha động: acetonitrile: methanol: dung dịch
đệm KH2PO 4 10 inM, pH 3,0 (35:35:30 v/v)
Cột
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút..
Kromasil
- Detector u v ở bước sóng 234 nm.
100 Ci8
(250x4,6 mm, - Thể tích tiêm: 20 Jil.
- Nhiệt độ cột: 25°c.

5|im)
- Chất chuẩn nội: rofecoxib
- Nồng độ làm việc là: 10 ng/ml

5


[6 ]

[30]

Chế
phẩm
viên
nén

Huyết
tương

Cột
- Pha động: acetonitrile: amoni acetat 0,05
Phenomenex mM; (50: 50 v/v).
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
Luna Ci 8
(250x4,6 mm, - Detector u v ở bước sóng 235 nm.
5|im)
- Thể tích tiêm: 20 |il.
- Pha động: acid formic 0,05 M (pH3)acetonitrile-methanol- nước ( 10 : 60: 20 : 10,
Cột Kromasil v/v) chạy theo chương trình gradient - time
KR 100-5Ci8 - Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

(4.6 X 250 - Detector u v ở bước sóng 235 nm.
mm, 5(im)
- Thể tích tiêm: 100 [0.1.
- Chuẩn nội là DRF-4367 (2-Hydroxymethyl-4-[5(4-methoxyphenyl)-3-trìfluoromethyl-l//-l-pyrazolyl]-l-

[34]

[27]

Huyết
tương

Huyết
tương

Cột Waters
symmetry®
Ci 8 (150x4,6
mm, 5(im)

Cột Hypersil
BDS Ci8 (150
X 4,6 mm, 5
Jim)

benzenesulfonamide)
- Mầu huyết tương xử lý bằng phương pháp
tủa protein với dung môi ACN và cô cạn
dưới dòng khí nitơ ở dưới 40°c
- Pha động: nước/acetonitrile (58/42, v/v)

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
- Detector ƯV ở bước sóng 284 nm.
- Thể tích tiêm: 100 |xl.
- Nhiệt độ cột: 25°c.
- Chuẩn nội là Zelaplon
- Mầu huyết tương được chiết bằng dung
môi diethyl ether/dichloromethane (70/30,
v/v).
- Pha động: acetonitril: dung dịch amoni
acetat lOmM, pH 4,0 (65: 35, v/v)
- Tốc độ dòng: 1 ml / phút.
- Detector ƯV ở bước sóng 235 nm.
- Thể tích tiêm: 20 |4,1.
- Nhiệt độ cột: 30°c.
- Chuẩn nội là valdecoxib
- Mầu huyết tương được chiết bằng dung
môi ethylacetat, cô cạn dưới dòng khí nitơ.

1.2.2.Định lượng Etoricoxib trong huyết tương bằng phương pháp
LC/MS/MS [17]

6


- Cột phonomenex Luna Ci8 (50 X 3 mm, 3|Am).
- Pha động: acetonitril: dung dịch amoni acetat lOmM, pH 4,0 (95: 5, v/v).
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 20 |J.1.

- Nhiệt độ cột: 25°c.

Điều kiện khối phổ:
lon hoá bằng hoá học ở áp suất thường (APCI): dùng luồng khí nitơ.
- Điện áp điện hoá: 2,5 kV; điện áp RF: 0,5V
- Nhiệt độ nguồn APCI là: 120 và 450°c
- Điện áp đỉnh là 65V và năng lượng bắn phá là 35eV.
- Phân tích dữ liệu bằng phần mềm Masslynx.
1.2.3. Phương pháp đo quang để định lượng etoricoxib trong chế phẩm
viên nén [24], [35]
Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử trong dung dịch HC1 0 , 1N [35 ]
hoặc methanol [24], lọc qua giấy lọc rồi đem đo quang. Dung dịch đem đo
quang có nồng độ khoảng 6 |ig/ml, đo ở bước sóng cực đại là X

= 233nm

[35] trên máy Shimadzu ƯV-Visible Spectrophotometer (UV-1700), hoặc X
= 284nm trên máy u v 1601 [24], xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc
tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của etoricoxib trong dãy nồng độ từ: 2 24|ig/m l. Căn cứ vào đồ thị và độ hấp thụ đo được để tính kết quả hàm lượng
etoricoxib trong chế phẩm .
1.2.4. Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) định lượng etoricoxib
trong chế phẩm [18]
- Sử dụng mao quản chiều dài 40cm, đường kính trong 50|im.
- Hệ đệm: dung dịch tris - phosphat 25mM, pH 2,5
- Nhiệt độ mao quản: 35°c.

7


- Điện thế đặt vào 2 đầu mao quản: 25kV
- Tiêm mẫu 50mbar trong thời gian 5s.
- Bước sóng phát hiện: 234nm với detector PDA.

Nhận xét: Phương pháp định lượng etoricoxib bằng sắc ký lỏng khối phổ khá
phức tạp, tốn kém và chưa phù hợp với đa số phòng kiểm nghiệm của Việt
Nam. Phương pháp đo quang và điện di mao quản vùng có độ chính xác
không cao và mới áp dụng định lượng etoricoxib dạng chế phẩm, chưa có
nghiên cứu áp dụng phương pháp này để định lượng etoricoxib trong huyết
tương. Phương pháp HPLC ở trên sử dụng hệ dung môi còn phức tạp và đắt
tiền. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề

nghiên cứu xây dựng phương phápđịnh

lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng HPLC đơn giản,
có độ đúng, chính xác cao và kinh tế, phù họfp với đa số điều kiện của các
phòng kiểm nghiệm ở Việt Nam.
1.3. Tổng quan về HPLC [2], [3], [4], [5], [10], [22], [31]
1.3.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ
sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
1.3.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu
tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:
- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay
pha đảo.
- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì

ta có sắc ký phân bố.

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi

ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.

8


1.3.3. Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký
Quá trình phân tách trong phương pháp HPLC là do quá trình vận
chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau. Khi pha động di chuyển
với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra
khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải

tách được các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và
ghi lạidưới dạng pic. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ.
Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiều
thành phần.
1.3.4. Cấu tạo của hệ thống HPLC
1.3.4.1. Hệ thống bơm
Bơm có tác dụng đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ nhất định.
Có hai loại bơm: - Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng.
- Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại bơm này
được áp dụng cho phân tích HPLC thông thường.
1.3.4.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi.
Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh, đôi khi bằng thép không gỉ.
Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 |im) và
đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí). Trong
phương pháp thông thường chỉ càn một bình dung môi, trong phương pháp
gradient cần phải có nhiều bình.
1.3.4.3. Bộ phận tiêm mẫu

9

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu
bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa
mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.
1.3.4.4. Cột sắc ký
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở
cột xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt
trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar. Trong cột nhồi pha
tĩnh của hệ sắc ký. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục
đích của quá trình sắc ký. Một cột phân tích thông thường dài 10-30cm,
đường kính trong 2-5mm.
1.3.4.5. Bộ phận phát hiện (Detector)
Là bộ phận phát hiện chất phân tách. Tuỳ theo bản chất của các chất
cần phân tách mà sử dụng detector thích hợp. Thường có các loại sau:
Detector hấp thụ ƯV-VIS; Detector khối phổ; Detector huỳnh quang;
Detector điện hoá; Detector tán xạ bay hơi; Detector đo chỉ số khúc xạ;
Detector đo độ dẫn điện....
1.3.4.6. Bộ phận hiển thị kết quả: Computer
1.3.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
I.3.5.I. Thời gian lưu tRvà thể tích lưu VR
-

tR là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc

ký tới detector và cho pic trên sắc ký đồ.
Thời gian lưu thực t’Rcủa một chất:

t’R= tR- to

to là thời gian chết (thời gian không lưu giữ).

10


-

VR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm

mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ.
V r = Ír X Fc
Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian
I.3.5.2. Hệ số phân bố K
Là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độcủa nó trong
pha động, thể hiện tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh.

cs và CMlà nồng

độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng. K phụ

thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm.
1.3.5.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của
một chất qua cột.

k’ phụ thuộc : bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm
cột, thể tích của pha động và pha tĩnh.
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích
sao cho: 1< k ’< 8 .

1.3.5.4. Hệ số chọn lọc a: là biểu hiện về mức độ tách giữa hai đỉnh

11


(X=

K

B

=

•^,4

k'

B

k'A

=

t
I ra

Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05- 2,0
I.3.5.5. Độ phân giải Rs: Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một
cột sắc ký (ví dụ A và B)
Í r a ) _ 1,18(ím

WB + WA

tM )

4

^1/2B + W \ ị Ĩ A

f a - H í k'B
I

a J

ì

Rs phụ thuộc vào: hiệu lực cột, hệ số chọn lọc a, hệ số dung lượng k’B
Yêu cầu Rs > 1. Giá trị tối ưu Rs= 1,5.
1.3.5.6. Hệ số bất đối của pic (AF)
Ap— w
"1/20
2a

Trong đó: W 1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic.
a : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu AF nằm trong khoảng 0 ,9 -2 .
1.3.5.7. Số đĩa lý thuyết N
2
[

r_ hay N= 5,54
N=16

w

Ír
-w \n_

Trong đó:
W: là chiều rộng đo ở đáy pic
w 1/2 : là chiều rộng đo ở 1/2 chiều cao pic.
Số đĩa ỉý thuyết cho biết hiệu lực tách của cột sắc ký.
1.3.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

12


1.3.6.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh)
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có
nhiều thành phần. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ
và đường kính cỡ hạt từ 3-10 um. Quá trình sắc ký có thể được thực hiện bởi
nhiều kỹ thuật khác nhau như: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi
ion...
Yêu cầu của pha tĩnh: phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có
khả năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng
động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt, cỡ hạt phải đồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (S i0 2), nền oxyd nhôm

(AI2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch cacbon. Pha
tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và được sử dụng nhiều nhất.

1.3.6.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột
tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định
hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp. Pha động có thể là nước, dung môi
hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định
theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít
phân cực như: n- hexan, n-heptan, benzen...
Trong sắc ký pha đảo thì pha động thường là hệ dung môi phân cực
như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng.

13


1.3.6.3. Chọn hệ đệm
Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất
tan có tính acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định
pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách.
Thông thường với các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid
nhưng cũng có những trường hợp ngoại lệ, còn sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy
từng trường họp.
1.3.6.4. Tốc độ dòng
Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì cần phải lựa chọn tốc
độ dòng cho pha động để quá trình tách tốt hơn.
1.3.7. ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính:
1.3.7.1. Định tính
Thời gian lưu của chất thử trên sắc ký đồ phải tương ứng với thời gian
lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ.

1.3.7.2. Sắc ký điều chế
Trong quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng
riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chất.
1.3.7.3. Định lượng và xác định tạp chất
Trong sắc ký chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và
được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích pic so với chất chuẩn. Một
số phương pháp định lượng hay dùng:

14


• Phương pháp chuẩn ngoại: cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến
hành sắc ký trong cùng một điều kiện. Sau đó so sánh trực trực tiếp chiều cao
hay diện tích pic của mẫu thử với mẫu chuẩn. Kết quả có thể tính theo cách
chuẩn hóa một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính. Công thức tính theo cách
chuẩn hoá 1 điểm: Cx = Sx —
Ss
Trong đó: Cs, Cx là nồng độ mẫu chuẩn và mẫu thử
Ss, Sx là diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử.
• Phương pháp chuẩn nội: là phương pháp cho thêm những lượng giống
nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử
vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là
chuẩn nội.
• Phương pháp thêm chuẩn: dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của
chất hấp phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mầu thử được thêm một
lượng chính xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa
trên sự chênh lệch nồng độ và độ tăng của diện tích. Với phương pháp thêm

nhiều lần ta có phương pháp thêm chuẩn.
• Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic:

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều
cấu tử được tính bằng tỉ ỉệ phần trăm diện tích pic của nó so YỚi tổng diện tích
của các pic thành phần.
1.4. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương [1], [27], [30]
Để xử lý mẫu huyết tương, thường sử dụng 1 trong 3 phương pháp là: chiết
pha rắn, kết tủa protein và chiết lỏng - lỏng. Tuy nhiên phương pháp chiết pha
rắn thường phức tạp, tốn thời gian và không kinh tế so với 2 phương pháp còn

15