ẢNH HƯỞNG của CRILIN t lên sự BIỂU lộ của một số GEN SINH UNG THƯ và ức CHẾ UNG THƯ TRÊN DÒNG tế bào UNG THƯ PHỔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ NGA

¶NH H¦ëNG CñA CRILIN T L£N Sù BIÓU Lé
CñA MéT Sè GEN SINH UNG TH¦ Vµ øC CHÕ
UNG TH¦ TR£N DßNG TÕ BµO UNG TH¦ PHæI

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ NGA

¶NH H¦ëNG CñA CRILIN T L£N Sù BIÓU Lé
CñA MéT Sè GEN SINH UNG TH¦ Vµ øC CHÕ
UNG TH¦ TR£N DßNG TÕ BµO UNG TH¦ PHæI
Chuyên ngành : Miễn dịch
Mã số

: 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Nguyễn Văn Đô
2. TS. Nguyễn Thanh Bình

HÀ NỘI – 2019
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


Chữ viết tắt

Tên tiếng anh

Tên tiếng việt


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3
1.1 Những hiểu biết cơ bản và bệnh ung thư................................................3
1.1.1 Khái niệm cơ bản về bệnh ung thư....................................................3
1.1.2 Gen học và ung thư...........................................................................3
1.1.3 Quá tình chết theo chương trình........................................................5
1.1.4 Một số gen liên quan.........................................................................9
1.2 Bệnh ung thư phổi.................................................................................16
1.2.1 Những yếu tố nguy cơ của ung thư phổi.........................................17
1.2.2 Triệu chứng, chẩn đoán và điều trị ung thư phổi.............................18
1.3 Tổng quan về trinh nữ hoàng cung.......................................................19

1.3.1 Giới thiệu về cây trinh nữ hoàng cung............................................20
1.3.2 Các công trình nghiên cứu về cây TNHC trên thế giới và trong nước. . .21
1.3.3 Giới thiệu về Crilin T......................................................................22
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............24
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................24
2.2. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................24
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................24
2.4. Vật liệu nghiên cứu...............................................................................24
2.5. Quy trình và kỹ thuật nghiên cứu.........................................................25
2.5.1. Quy trình nghiên cứu......................................................................25
2.5.2. Kỹ thuật nghiên cứu.......................................................................26
Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ.................................................................35
3.1. Kiểm tra chất lượng ARN chiết tách được............................................35
3.2. Mức độ biểu lộ các gen Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bak ở tế bào dòng phổi
bình thường bằng phản ứng RT-PCR đơn mồi......................................35


3.3. Sự biểu lộ Bcl-2, Bcl-xl, Bax, và Bak ở mức độ mARN của tế bào phổi
người bình thường nuôi cấy in vitro bằng phương pháp RT-PCR đa mồi..35
3.4. So sánh sự biểu lộ Bcl-2, Bcl-xl, Bax và Bak ở mức độ mARN của tế bào
ung thư ở khối u chuột BALB/c nude ở các nhóm điều trị Crilin T..........35
3.5. So sánh sự biểu lộ Bcl-2, Bcl-xl, Bax và Bak ở mức độ mARN của tế
bào ung thư ở khối u chuột BALB/c nude ở các nhóm điều trị Crilin T
được xác định bởi Western Blot............................................................35
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN..............................................................36
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi........................................29
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR đa mồi..........................................30

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Sơ đồ các con đường hoạt hoá chết tế bào theo chương trình............6
Hình 1.2 Cơ chế tham gia trốn tránh chết tế bào theo chương trình và ung thư...8
Hình 1.3 Các thành viên họ Bcl-2.....................................................................9
Hình 1.4 Sự chuyển vị của gen Bcl-2..............................................................10
Hình 1.5. Cấu trúc của gen Bak......................................................................13
Hình 1.6. Sự tương tác chức năng của các thành viên họ protein Bcl-2 ở màng
ty thể................................................................................................13
Hình 1.7. Cây và hoa TNHC...........................................................................20
Hình 1.8. Chế phẩm viên nang Crila...............................................................23


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đồng thời là
nguyên nhân chính gây tử vong do các bệnh ung thư, đặc biệt ở nam giới. Số
các trường hợp UTP đã tăng nhanh chóng trong những năm gần đây. Năm
2016, khoảng 1,8 triệu trường hợp UTP mới được chẩn đoán, chiếm 12,9 %
tổng tỷ lệ mắc ung thư trên toàn thế giới và tử vong 1,59 triệu ca, chiếm
19,4% tử vong do ung thư [1]. Đến nay, phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu là
những chiến lược điều trị chủ yếu dành cho ung thư phổi. Tuy nhiên, hiệu quả
của các phương pháp điều trị bị hạn chế và có thể dẫn đến một số tác dụng
phụ. Tiến triển của bệnh, mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng và tác
dụng phụ làm giảm đáng kể chất lượng cuộc sống ở những bệnh nhân đó.
Theo Zappa C. và cs. (2016) hơn một nửa bệnh nhân ung thư phổi tử vong

trong năm đầu sau khi được chẩn đoán và tỷ lệ sống 5 năm < 18 %[2]. Do đó,
việc nghiên cứu phương pháp trị liệu mới là một hướng quan trọng, nhằm
nâng cao chất lượng và thời gian sống cho bệnh nhân.
Việc nghiên cứu các loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư có nguồn gốc từ
các cây thảo dược ngày càng thu hút được chú ý của các nhà khoa học trong
nhiều lĩnh vực với mục tiêu nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế các tác dụng
phụ và giảm bớt gánh nặng về kinh tế. Từ năm 1990, Nguyễn Thị Ngọc Trâm
đã phát hiện một mẫu cây chứa nhiều hợp chất hoá học khác với các mẫu còn
lại cùng thuộc loài Crinum latifolium L trong quần thể crinum ở Việt Nam và
chọn giống dự trên kết quả nghiên cứu gen (AND), cây này được đặt tên là
Trinh nữ Crila Crinum latifolium L. var. crilae Tram & Khanh, var. n. Hiện
nay, người ta đã phát hiện có khoảng 130 loài khác nhau phân bố ở vùng nhiệt
đới với hơn 150 alkaloid được chiết tách từ loài cây này [3]. Kết quả của


2

chùm các công trình nghiên cứu in vivo và in vitro của các tác giả đã chứng
minh một số phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid được chiết xuất từ
cây là có tác dụng chống oxy hóa và tăng cường miễn dịch chống khối u gián
tiếp hay có tác dụng gây độc tế bào ung thư trực tiếp.
Viên nang Trinh nữ Crila được chiết từ lá cây trinh nữ hoàng cung và tạo
nên viên nang Crila. Thuốc đã được đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi ở Việt
Nam để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt, u xơ tử cung. Ngoài ra, viên
Crila còn được nghiên cứu sử dụng để điều trị thực nghiệm các tế bào dòng
ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi, tuyến tiền liệt và trên một số bệnh nhân ung
thư tự nguyện.
Viên nang Crilin T, là một sản phẩm mới của cây Trinh nữ Crila có chứa
các alcaloid và các flavonoid. Crilin T có tác dụng tăng cường chức năng
miễn dịch chuyên nhiệm chống ung thư in vitro [4] và cũng làm tăng chế tiết

các cytokin IL-2 và TNFα in vitro của tế bào lympho người bình thường về
lâm sàng và của người bệnh ung thư phổi giai đoạn muộn [5]. Tiếp nối kết
quả này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng in vitro của Crilin
T lên các lympho bào được tách từ máu ngoại vi của người bình thường và
bệnh nhân ung thư phổi, thử các nồng độ thuốc khác nhau, ở các thời điểm
khác nhau và theo dõi sự biểu lộ của hai nhóm gen sinh ung thư (Bcl-2, Bclxl) và nhóm gen ức chế ung thư (Bax và Bak) ở mức độ mARN và protein
bằng phương pháp RT-PCR và Western Blot tương ứng. Đề tài này nhằm mục
tiêu:
1.

Xác định biểu lộ của Bcl-2, Bcl-xl, Bax và Bak ở mức độ mARN và
protein của tế bào dòng phổi người bình thường nuôi cấy in vitro.

2.

So sánh biểu lộ của Bcl-2, Bcl-xl, Bax và Bak ở mức độ mARN và
protein của tế bào dòng ung thư phổi ở các nhóm sử dụng Crilin T.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Những hiểu biết cơ bản và bệnh ung thư
1.1.1 Khái niệm cơ bản về bệnh ung thư
Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào dưới tác động của một số tác nhân
gây ung thư làm tế bào tăng sinh vô hạn, không có tổ chức và không tuân theo
các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể. Người ta đã biết được có hơn
200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người [6]
1.1.2 Gen học và ung thư

Quá trình sinh bệnh ung thư liên quan chặt chẽ đến tổn thương 2 nhóm
gen, đó là gen sinh ung thư và gen ức chế ung thư. Bình thường hai loại gen
này có vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản, biệt hóa và chết
theo chương trình của tế bào, giúp cho sự ổn định sinh học của cơ thể.
1.1.2.1 Gen sinh ung thư (oncogene)
Năm 1911 Peyton Rous đã phát hiện ra virus sinh sarcom ở cơ gà và đến
những năm 60 người ta mới tìm thấy gen sinh u đó trong virus Rous và được
đặt tên là src. Sau đó hàng chục gen sinh u khác ở nhiều virus khác được phát
hiện. Giữa những năm 1970, các nhà vi sinh Mỹ John Michael Bishop và
Harold Varmus thử nghiệm giả thuyết cho rằng các tế bào cơ thể khỏe mạnh
có chứa gen gây ung thư của virus không hoạt động, khi được kích hoạt sẽ
gây ung thư. Họ đã cho thấy rằng gen sinh ung thư được bắt nguồn từ gen tiền
ung thư (proto-oncogene) trong các tế bào cơ thể vật chủ của chúng. Ở người,
gen tiền ung thư có thể được chuyển đổi thành gen sinh ung thư bởi đột biến,
khuếch đại gen và sắp xếp lại nhiễm sắc thể [7]. Người ta cho rằng đột biến ở


4

các gen này có thể là nguyên nhân làm mất khả năng khiểm soát quá trình
phân bào và do đó mà sinh u, chính đó là lí do tại sao lại có tên là oncogen
[8]. Có 3 giả thuyết cho việc hình thành oncogen [9].
- Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăng
trưởng (growth factor). Do rối loạn cơ chế điều hòa, yếu tố tăng trưởng hoạt
hóa mạnh kích thích oncogen sinh ung thư.
- Oncogen là những đoạn DNA bị tổn thương bởi các tác nhân gây bệnh
như: hóa học, sinh họcc, vật lý. Cơ chế đã sửa chữa những ADN này nhưng
không hoàn hảo nên cùng một tác nhân ung thư nhưng có người bị ung thư có
người lại không bị ung thư.
- Oncogen là do các genom của virus sinh ra trong tế bào nhiễm, vì

người ta thấy các oncogen này giống với ADN của virus. Ví dụ: HPV (cổ tử
cung, dương vật), EBV (Burkitt) và HBV (ung thư gan) [10].
1.1.2.2 Gen ức chế sinh ung thư (tumor suppressor)
Gen ức chế ung thư là gen điều hòa sự phân chia tế bào bằng cách làm
chậm sự phân bào, sữa chữa các sai sót của ADN, lệnh cho tế bào chết đi
(chết tế bào theo chương trình). Khi gen này hoạt động không bình thường
hay bị bất hoạt, làm các tế bào phát triển không kiểm soát được và có thể dẫn
đến ung thư. Các nghiên cứu về ung thư đã xác định và mô tả đặc điểm của
nhiều gen ức chế khối u. Năm 1971, nhà nghiên cứu người Mỹ Alfred
Knudson mặc nhiên công nhận rằng một dạng hiếm của ung thư mắt là
nguyên bào võng mạc gây ra bởi đột biến ở một gen Rb [11],[12]. Nghiên cứu
tiếp theo cho thấy các đột biến ở gen này cũng đóng một vai trò trong bệnh
ung thư xương, phổi, vú, cổ tử cung, tuyến tiền liệt và bàng quang. Một số
gen ức chế khối u khác (chẳng hạn như TP53, mã hóa một protein gọi là p53)
đã được xác định. Các dạng đột biến của TP53 đã được liên quan đến hơn 50
phần trăm của tất cả các bệnh ung thư. Các đột biến trong hai gen ức chế khối


5

u khác là BRCA1 và BRCA2 trong ung thư vú, chúng được tìm thấy trong 510% của tất cả các trường hợp và trong khoảng 85% của tất cả các trường hợp
ung thư vú di truyền [13].
1.1.3 Quá tình chết theo chương trình (Apoptosis)
Apoptosis là một quá trình chết tế bào được lập trình xảy ra trong
sinh vật đa bào. Đây cũng là một trong những chủ đề được nghiên cứu
nhiều nhất trong các vấn đề về sinh học tế bào. Trong thập kỷ qua, những
nghiên cứu ung thư cơ bản đã cho thấy sự tiến bộ đáng kể trong sự hiểu
biết của chúng ta về sinh học ung thư và ung thư di truyền. Trong số
những điểm quan trọng nhất của những tiến bộ này là sự nhận thức rằng
quá trình chết tế bào theo chương trình và các gen kiểm soát nó có ảnh

hưởng sâu sắc đến kiểu hình ác tính [14].
Chết tế bào theo chương trình là một hiện tượng có tính di truyền của các
tế bào có nhân. Chết tế bào theo chương trình được Kerr, Wyllie và Curie mô
tả năm 1972 để nêu lên một hiện tượng phổ biến và cần thiết cho cuộc sống.
Từ sự phát triển bình thường của cơ thể, sự hằng định của các mô cho đến
việc loại trừ các tế bào bị viêm nhiễm hay sự dung nạp về miễn dịch học [15].
Nếu hoạt động có sự thiếu hụt thì sẽ phát sinh ung thư và các dị tật trong cơ
thể. Ngược lại, hoạt động quá mức sẽ gây ra các biến đổi thoái hóa cơ và thần
kinh cũng như những rối loạn khác nữa. Chết tế bào theo chương trình có thể
được xem như một rào cản quan trọng để phát triển bệnh ung thư, chống lại
chết tế bào theo chương trình là một đặc tính của tế bào ung thư và là một
nguyên nhân chính của thất bại trong điều trị.
Quá trình chết tế bào theo chương trình diễn ra theo 2 con đường chính,
bao gồm con đường ngoại sinh hay con đường thông qua thụ thể chết và con
đường nội sinh con đường qua trung gian ty thể.


6

Hình 1.1 Sơ đồ các con đường hoạt hoá chết tế bào theo chương trình
(Nguồn />Con đường thông qua thụ thể chết (the death receptor pathway) hay con
đường ngoại sinh, khác với con đường của ty thể. Con đường này được khởi
động bởi các kích thích ngoại bào, chẳng hạn như phóng thích các yếu tố tăng
trưởng kích thích sự gắn của thụ thể chết xuyên màng (một tập hợp thụ thể
TNF bao gồm cả TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL-1 và 2) với các phân tử tín
hiệu (ligand) cùng nguồn gốc với chúng. Các phức hợp ligand/receptor sẽ được
trimer hóa và các domain receptor chết sẽ gắn với các protein FADD nhờ sự
tương tác với các domain tương đồng trong bộ chuyển đổi này. Ngoài ra, các
FADD còn chứa một domain hiệu ứng chết tương đồng với nó trong caspase
khởi đầu. Do gắn với receptor chết nên domain này được phơi bày và được gắn

được với tiền caspase khởi đầu, thường là với tiền caspase 8 hoặc tiền caspase
10, phức hợp này còn có tên gọi là “phức hợp tín hiệu cảm ứng chết” (DISC).


7

Chức năng của nó trong chết tế bào theo chương trình là chuyển các phân tử
tiền caspase tới trạng thái dimer hóa và kích hoạt lẫn nhau. Các caspase 8 hoặc
10 kích hoạt khởi đầu sau đó sẽ kích hoạt caspase thực hiện như caspase 3, 6, 7
làm cho phức hợp thực hiện hoạt động ly giải protein chất nền và chết tế bào.
Con đường ty thể (mitochondria pathway) là con đường nội sinh liên
quan đến tính toàn vẹn của màng ti thể, được kích hoạt bởi các yếu tố như bức
xạ, thiếu yếu tố tăng trưởng, thiếu cytokin, thuốc gây độc tế bào. Tiến triển
thông qua con đường này dẫn đến sự ra đời của cytochrom c từ ty thể bị tổn
thương, sau đó liên kết với các phân tử chuyển đổi Apaf-1( yếu tố cảm ứng
chết tế bào theo chương trình) và caspase “khởi động” chưa hoạt động, tiền
caspase 9, trong một phức tạp multiprotein gọi là apoptosom. Điều này dẫn
đến việc kích hoạt các caspase 9, sau đó khởi phát một chuỗi các caspases
kích hoạt (caspases 3 và 7) dẫn đến những thay đổi về hình thái và sinh hóa
gắn liền với quá trình chết tế bào theo chương trình. Cơ chế điều hòa con
đường này rất tinh vi thông qua các hệ thống kích thích và ức chế phức tạp
mà hiện nay y học phân tử đang khám phá. Đây là một cơ chế bị chi phối bởi
2 nhóm protein: Một nhóm chống lại quá trình chết tế bào theo chương trình
như Bcl-2, Bcl-xl và Mcl-1 và một nhóm protein làm tăng hiệu ứng chết tế
bào theo chương trình như Bax và Bak. Ngoài ra còn có một số các protein có
liên quan như Bim, Bad, puma và noxa.
Mối liên quan giữa sự tránh chết tế bào theo chương trình và sự phát
triển của tăng sinh tế bào và cuối cùng là ung thư là mặc nhiên rõ ràng nếu ta
xem xét có bao nhiêu tế bào được sản xuất mỗi ngày, và do đó có bao nhiêu tế
bào phải chết để nhường chỗ cho những tế bào mới [16]. Vào đầu những năm

70, Kerr và cộng sự đã tìm thấy sự liên quan của chết tế bào theo chương trình
với sự tiêu diệt các tế bào có khả năng trở thành tế bào ác tính, sự tăng sản và
tiến triển của khối u [17]. Do đó, cho rằng sự tránh chết tế bào theo chương


8

trình là một điều kiện tất yếu cho sự thay đổi và tăng trưởng bền vững của các
tế bào ung thư đã được chấp nhận rộng rãi [18]. Có rất nhiều cách để một tế
bào ác tính có thể có được giảm quá trình chết hoặc kháng chết tế bào theo
chương trình. Nhìn chung, cơ chế để tránh chết tế bào theo chương trình bao
gồm: Sự mất cân bằng của các protein chống chết tế bào theo chương trình và
kích thích chết tế bào theo chương trình, sự giảm chức năng caspase và suy
giảm thụ thể chết báo hiệu.)

Hình 1.2 Cơ chế tham gia trốn tránh chết tế bào theo chương trình và ung
thư
(Nguồn />

9

Do vậy, một sự hiểu biết chi tiết về cái chết của tế bào theo chương trình sẽ
giúp hiểu rõ hơn về sự phức tạp của khối u và cải tiến phương pháp điều trị ung
thư dựa trên sự hoạt hóa các thành phần của chết tế bào theo chương trình.
1.1.4 Một số gen liên quan
Các thành viên của họ Bcl-2 tham gia vào quá trình điều hoà và kiểm
soát quá trình apoptosis, đến nay đã xác định có 25 gen khác nhau. Gia đình
Bcl-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chết tế bào theo chương trình.
Thành viên của Bcl-2 có thể được phân thành 2 nhóm là các protein chống chết
tế bào theo chương trình và kích thích chết tế bào theo chương trình và giữa

chúng có sự tương tác với nhau trong việc tăng hiệu ứng hay ức chế chết tế bào
theo chương trình. Protein chống chết tế bào theo chương trình như Bcl-2, Bclxl, và Bcl-W, nhóm protein làm tăng hiệu ứng chết tế bào theo chương trình
như Bax và Bak. Dựa trên chức năng của chúng và các miền tương đồng Bcl2 (BH), các thành viên của gia đình Bcl-2 được chia thành 3 nhóm. Nhóm đầu
tiên là các protein chống apoptotic có chứa cả 4 miền BH (BH1-4) và chúng
bảo vệ tế bào khỏi các kích thích apoptosis như Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, Bcl-w,...
Nhóm thứ hai là các protein chỉ thuộc miền BH-3, là yếu tố khởi đầu và kích
hoạt apoptosis. Nhóm thứ ba chứa tất cả bốn miền BH và cũng là yếu tố kích
hoạt apoptosis như Bax, Bak và Bok/Mtd [19].