CÁC kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử TRONG CHẨN đoán VI KHUẨN LAO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BỘ MÔN LAO VÀ BỆNH PHỔI

CHUYÊN ĐỀ

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO

`

Họ và tên: Nguyễn Ngọc Trường Thi
Lớp: NT khóa 40

Chuyên ngành: Lao và Bệnh phổi

Hà Nội – 2018


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
(+)
(-)
AFB
DNA
dNTP
RNA
EMB
Gene Xpert,

Dương tính
Âm tính
Acid fast bacilli (Trực khuẩn kháng cồn toan)

Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleotide triphosphate
Ribonucleic acid
Ethambutol
Gene Xpert MTB/RIF (Xét nghiệm chẩn đoán Mycobacteria

Xpert MTB
INH
HIV

tuberculosis và đột biến kháng RMP)
Isoniazid
Human Immunodeficiency Virus

LPA
MTB
MGIT

(Virút gây suy giảm miễn dịch ở người)
Line Probe Assay (thí nghiệm lai với các đoạn dò)
Mycobacterium Tuberculosis
Mycobacterial Growth Indicator Tube

PCR
RMP, RIF
VKL
WHO
Se
Sp
PPV

NPV

(Nuôi cấy vi khuẩn lao trong ống chỉ thị)
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)
Rifampicin
Vi khuẩn lao
World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
Sensitive (Độ nhạy)
Specific (Độ đặc hiệu)
Positive Predictive Value (Giá trị dự đoán dương tính)
Negative Predictive Value (Giá trị dự đoán âm tính)


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
1. PCR (Polymerase chain reaction)...........................................................2
1.1. Đại cương.............................................................................................2
1.2. Nguyên lý của PCR..............................................................................2
1.3. Giá trị của PRC trong chẩn đoán vi khuẩn lao.....................................3
2. Gene Xpert MTB/RIF.............................................................................5
2.1. Đại cương.............................................................................................5
2.2. Nguyên lý.............................................................................................5
2.3. Giá trị của Xpert MTB trong chẩn đoán vi khuẩn lao..........................7
2.4. Tập hợp bằng chứng khoa học.............................................................8
2.5. Các khuyến cáo hiện nay....................................................................10
3. Line probe assay........................................................................................11
3.1. Đại cương...........................................................................................11
3.2. Nguyên lý...........................................................................................11
3.3. Các băng tín hiệu trên màng lai và nhận định kết quả.................13
3.4. Giá trị của xét nghiệm Line probe assay............................................13

3.5. Bằng chứng khoa học.........................................................................14
3.6. Khuyến cáo hiện nay..........................................................................15
4. TB LAMP..............................................................................................16
4.1. Đại cương...........................................................................................16
4.2. Nguyên lý của phản ứng LAMP........................................................17
4.3. Phát hiện sản phẩm của phản ứng TB-LAMP:...................................19
4.4. Bằng chứng khoa học.........................................................................20
4.5. Khuyến cáo.........................................................................................22
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Giá trị chẩn đoán của PCR trên các bệnh phẩm khác nhau..............4

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Phản ứng PCR................................................................................3

Hình 2.1. Nguyên lý phát hiện đột biến kháng RIF trên gene rpoB và quá
trình gắn các đầu dò phát quang với các DNA đích........................6
Hình 3.1. Nguyên lý phản ứng lai DNA và hiển thị kết quả trên thanh tín
hiệu................................................................................................12
Hình 3.2. Hiển thị kết quả trên thanh tín hiệu...............................................13
Hình 4.1

Gene đích và các cặp mồi trong phản ứng LAMP........................17

Hình 4.2. Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu trong phản ứng LAMP................18
Hình 4.3. Giai đoạn lặp lại chu kỳ trong phản ứng LAMP...........................19
Hình 4.4. Nguyên lý phát quang trong phản ứng LAMP..............................20


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lao hiện vẫn còn là một gánh nặng trên thế giới cũng như ở Việt
Nam. Để đẩy lùi và tiến tới thanh toán bệnh lao, điều quan trọng là phát hiện
được nhiều nhất số người mắc lao trong cộng đồng và điều trị khỏi để giảm
dần nguồn lây nhiễm.
Chẩn đoán lao là một thách thức vì các triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán
hình ảnh thường không điển hình, trong khi đó các kỹ thuật chẩn đoán lao truyền
thống đều có những hạn chế nhất định. Kỹ thuật soi đờm trực tiếp tìm AFB có
khả năng chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao tuy nhiên tỉ lệ dương tính chỉ đạt khoảng
50%, không xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn lao, ngoài ra kết quả còn
phụ thuộc vào chất lượng lấy đờm và khả năng đọc kết quả [1], [2]. Kỹ thuật
nuôi cấy là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán lao nhưng thời gian cho kết quả lâu
không đáp ứng được yêu cầu chẩn đoán và điều trị sớm [3], [4].
Trong hoàn cảnh đó, với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử
nói chung, các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán lao có rất
nhiều hứa hẹn khi trên phương diện lý thuyết có thể phát hiện ra vật chất di
truyền của một vài vi khuẩn trong điều kiện phòng xét nghiệm, điều này đặc
biệt có ý nghĩa với các thể lao soi đờm trực tiếp âm tính, lao ở người nhiễm
HIV, lao trẻ em, lao ngoài phổi hoặc phát hiện sớm lao kháng thuốc.
Nội dung chuyên đề trình bày về nguyên lý cũng như giá trị chẩn đoán
của các kỹ thuật mới này góp phần giúp thầy thuốc chẩn đoán chính xác và
hiệu quả bệnh lao.

2

1. PCR (Polymerase chain reaction)
1.1. Đại cương
PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa
học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này. Kỹ thuật PCR cho phép xác
định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biết và
sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đích (target region)
đặc hiệu trên genome của vi khuẩn [5].
1.2. Nguyên lý của PCR
PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào
các chu kỳ nhiệt. Thành phần chính trong dung dịch phản ứng (PCR mix) bao
gồm: (1) enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), (2) DNA
đích chứa đoạn trình tự đích cần được nhân lên trong phản ứng, (3) các đoạn
mồi (primer) là các oligonucleotide có trình tự bổ sung đặc hiệu với đoạn
trình tự đích và (4) 4 loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP) gồm Adenin,
Thymine, Guanine và Cytosine (dATP, dTTP, dGTP và dCTP).
Một chu kì nhiệt gồm 3 giai đoạn: biến tính, bắt cặp và kéo dài với 3
mức nhiệt khác nhau (hình 1). Ở giai đoạn biến tính, nhiệt độ được đưa lên
94oC khiến các liên kết hydro giữa 2 mạch đôi DNA trở lên lỏng lẻo do đó
DNA bị biến tính thành các mạch đơn. Tiếp đến giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ hạ
xuống 55-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung
vào đoạn DNA đích. Cuối cùng nhiệt độ được đưa lên 72 oC là nhiệt độ phù
hợp cho hoạt động của enzym Taq polymerase để nối các dNTP vào các đoạn
mồi theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA đích để tổng hợp đoạn DNA bản
sao [5].


3

Hình 1.1 Phản ứng PCR
Ứng dụng PCR trong chẩn đoán vi khuẩn lao thường dựa trên việc phát
hiện đoạn gen IS6110 [6]. IS6110 là trình tự gắn (insert sequence) đặc hiệu
trong genome vi khuẩn thuộc nhóm Mycobacter tuberculosis bao gồm M.
tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. cannetti, M. caprae, M. microti,
and M. pinnipedi. Kỹ thuật PCR cũng đã được cải tiến thêm như sử dụng đa
mồi (multiplex PCR) phát hiện 3 gene đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA
hoặc PCR tổ (nested PCR) để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng.
1.3. Giá trị của PRC trong chẩn đoán vi khuẩn lao
Trong điều kiện phòng xét nghiệm chỉ cần một lượng nhỏ vi khuẩn (1-3
vi khuẩn/1mm3 bệnh phẩm) đã cho kết quả dương tính. PCR không cho biết vi
khuẩn còn sống hay đã chết.
Tỷ lệ dương tính giả cao do lây nhiễm trong quy trình xử lý và phân tích
bệnh phẩm. Âm tính giả có thể do sự có mặt của nhiều chất ức chế DNA
polymerase trong bệnh phẩm hoặc những vi khuẩn không có đoạn IS6110. Chủng
vi khuẩn lao ở Việt Nam có tỉ lệ khuyết gen đích IS6110 khoảng 3-5% [7].
Noordhoek (1994) tổng hợp kết quả từ 7 phòng xét nghiệm khác nhau,
nhận xét PCR trong chẩn đoán lao phổi có tỉ lệ dương tính giả cao từ 43-77%,
nguy cơ lây nhiễm chéo rất cao [8]. Nguyễn Thu Hà (2006) nghiên cứu trên


4

nhóm bệnh nhân lao phổi AFB âm tính, nhận thấy PCR đờm có Se 57,1%, Sp
93,33%, PPV 85,7%, NPV 75,7%.
Kỹ thuật PCR phát hiện đoạn gene IS6110 để chẩn đoán lao ngoài phổi
cũng đã được đánh giá trong nhiều nghiên cứu trên thế giới. Nhìn chung xét
nghiệm có độ nhạy rất dao động từ 31 – 100%, độ đặc hiệu tương đối cao [6].
Kết quả này có thể giải thích do tỷ lệ ngoại nhiễm cao cũng như sử dụng các

bộ kit PCR khác nhau trong các nghiên cứu này. Chính vì vậy, kỹ thuật PCR
không được WHO khuyến cáo sử dụng trong chẩn đoán Mycobacter
tuberculosis.
Bảng 1.1. Giá trị chẩn đoán của PCR trên các bệnh phẩm khác nhau [6]
Tác giả

Bệnh phẩm

Độ nhạy (Se%) Độ đặc hiệu (Sp%)

Nopvichai (2009)

Hạch

67

100

Sharma (2010)

Hạch

100

92

Cortez (2011)

Hạch

63

87

Villegas (2000)

Dịch màng phổi

61

90

Lima (2003)

Dịch màng phổi

31

96

Chakravorty (2005) Dịch màng phổi

76

94

Liu (2007)

Dịch màng phổi

43

95

Baba (2008)

Dịch màng phổi

68

73

Rosso (2001)

Dịch màng phổi

43

94

Quan (2006)

Dịch não tủy

75

94

Rafi (2007)

Dịch não tủy

98

100

Haldar (2010)

Dịch não tủy

40

93

2. Gene Xpert MTB/RIF
2.1. Đại cương
Hệ thống Gene Xpert đã được giới thiệu từ năm 2004, Gene Xpert là
một kỹ thuật mang tính đột phá, tích hợp của 3 công nghệ (tách gen, nhân gen


5

và nhận biết gen) đã được phát triển trong khuôn khổ hợp tác của tổ chức
FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics), Cepheid Inc và trường
Đại học Y - Nha khoa New Jersey. Kỹ thuật nhằm xác định đoạn acid nucleic
đích từ bệnh phẩm lâm sàng chưa cần qua xử lý dựa trên nguyên lý của kỹ
thuật PCR. Khả năng phát hiện các vi khuẩn gây bệnh khác nhau có được dựa
trên các hộp xét nghiệm (cartridge) đặc hiệu cho từng căn nguyên ví dụ:
Staphylococcus aureus kháng methicllin (MRSA), Streptococcus agalactia,
Mycobacteria tuberculosis [9].

Xpert MTB/RIF (viết tắt là Xpert MTB) là một xét nghiệm sinh học
phân tử phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao cũng như đột biến kháng RMP
bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu và 5 đầu dò (probes) có gắn chỉ thị
huỳnh quang khác nhau để đảm bảo độ đặc hiệu cao.
Cho đến hiện nay Xpert đã được phát triển qua 4 phiên bản phần mềm
nâng cấp, G1, G2, G3 và G4. Mỗi phiên bản là sự điều chỉnh về giá trị
ngưỡng chu kỳ nhân bản để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu Xpert MTB
trong khả năng phát hiện kháng RMP. Từ năm 2013, toàn bộ hệ thống sinh
phẩm sử dụng cho chẩn đoán là thế hệ G4 [10].
2.2. Nguyên lý
Trong DNA vi khuẩn lao, gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho
tiểu phần β của RNA polymerase. Đột biến kháng RMP thường xảy ra trên
đoạn gen rpoB, đặc biệt là ở đoạn nằm trung tâm của gen dài 81 bp được giới
hạn từ bộ ba 507 đến 533 (vùng “nóng” – hot-spot region). Đột biến ở các vị
trí khác nhau có mức độ kháng thuốc khác nhau. Đột biến tại vị trí bộ ba thứ
516, 526, 531, cho kết quả đề kháng với RMP cao; đột biến ở bộ ba 510, 515
và 512 kháng RMP ở mức độ thấp hơn. 45% các chủng có các đột biến mất ở
codon 531 (S531) trong khi 35% các chủng kháng thuốc có sự thay đổi codon
526 (H526) dẫn đến thay thế acid amin [9], [10], [11]. Từ 90 - 97% các chủng
M. tuberculosis kháng RMP được xác định là do các đột biến trên vùng gen


6

ngắn 81 bp này của rpoB, còn 5 - 10% đột biến kháng RMP khác được xác
định ở đoạn tận N hoặc ở vùng II của gen rpoB, hoặc liên quan tới có chế
kháng thuốc khác [11], [12], [13].
Xét nghiệm được thiết kế để nhân đoạn trình tự 192bp của gen rpoB trên
vi khuẩn lao bằng phản ứng PCR. Xét nghiệm sử dụng 5 mẫu dò riêng biệt
gắn chỉ thị huỳnh quanh, chứa trình tự có thể cặp đôi với DNA của chủng vi

khuẩn lao hoang dại. Các trình tự của 5 mẫu dò được thiết kế đặc biệt để có
khả năng phát hiện đột biến cao nhất và đảm bảo chắc chắn xác định được
vùng thường xuyên xảy ra đột biến chứa 81bp. Xác định có vi khuẩn lao khi
có ít nhất 2 mẫu dò bắt cặp. Xác định có đột biến kháng RMP dựa trên có một
mẫu dò không bắt cặp [10], [12], [13], [14].

Hình 2.1. Nguyên lý phát hiện đột biến kháng RIF trên gene rpoB và quá
trình gắn các đầu dò phát quang với các DNA đích.
2.3. Giá trị của Xpert MTB trong chẩn đoán vi khuẩn lao
Xpert MTB có khả năng chẩn đoán lao và phát hiện lao kháng RIF với
nhiều ưu điểm: khép kín, tự động, dễ thao tác, trả kết quả sớm. Chỉ thị phân tử
nhắm vào gen rpoB đã bao trùm được tất cả những đột biến tìm thấy trong
hơn 85% các chủng kháng RMP. Không có phản ứng chéo với các vi khuẩn


7

mycobacteria không phải vi khuẩn lao; M. tuberculosis và kháng RMP được
phát hiện chính xác cả khi có mặt DNA không phải của vi khuẩn lao hoặc trộn
lẫn các chủng nhạy cảm và chủng đề kháng. Kỹ thuật xác định kháng RMP
qua phát hiện đột biến gen rpoB có độ tin cậy cao hơn xác định đột biến trên
gen katG gây kháng INH hoặc các thuốc khác. Ngoài ra trên 85% đột biến
trên rpoB kèm theo kháng INH, trong khi đó chỉ có 15% đột biến trên gen
katG dẫn đến kháng đồng thời INH và RMP [11]. Chính vì lý do đó mà phát
hiện đột biến gen rpoB được sử dụng trong kỹ thuật Xpert MTB nhằm phát
hiện vi khuẩn lao M. tuberculosis cũng như phát hiện sớm lao đa kháng thuốc
[10], [11], [14].
Thử nghiệm Xpert MTB có độ nhạy phân tích với 5 bản sao của bộ gen
(genom) - DNA được tinh chế và 131 cfu/ml vi khuẩn lao M. tuberculosis có
trong mẫu đờm. Hiện nay, phiên bản Xpert MTB/RIF Ultra với các hộp xét

nghiệm với kích thước lớn có khả năng phát hiện vi khuẩn lao ở nồng độ 10
cfu/ml – được coi là tương đương với kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng [15],
[16]. Quy trình xử lý bệnh phẩm trong quá trình chuẩn bị bệnh phẩm và chạy
máy Gene Xpert không tạo ra các hạt chứa vi khuẩn sống có khả năng lây
nhiễm ở mức có thể phát hiện được so với các kỹ thuật như soi trực tiếp hay
nuôi cấy. Đồng thời, hệ thống này có hai đối chứng nội tại bao gồm: SPC (đối
chứng của quá trình xử lý mẫu) có thành phần là nha bào của vi khuẩn
Bacillus globigii. SPC nhằm đảm bảo quá trình xử lý mẫu trong hộp xét
nghiệm. Một đối chứng khác là các đối chứng kiểm tra mẫu dò xác định các
chất đã được hydrat hoá, tuýp PCR trong xét nghiệm, mẫu dò toàn vẹn và
thuốc nhuộm ổn định. Hai đối chứng này sẽ làm tăng độ tin cậy của kết quả
[12], [10], [13], [14].
2.4. Tập hợp bằng chứng khoa học
Xpert MTB phát hiện vi khuẩn lao trong bệnh phẩm đờm soi dương -


8

nuôi cấy dương và soi âm - nuôi cấy dương.
Boehme (2011) nghiên cứu tiến cứu 6648 bệnh nhân khu vực Nam Phi,
Peru, Ấn Độ, Philippin, Uganda, so sánh Xpert MTB với soi trực tiếp, nuôi
cấy. Kết quả Xpert MTB/RIF phát hiện 90,3% (933/1033) số trường hợp nuôi
cấy dương tính, so với phát hiện 67,1% (699/1041) soi kính. Những trường
hợp soi trực tiếp âm tính, nuôi cấy dương tính, độ nhạy của Xpert MTB đạt
76,9% (296/385), độ đặc hiệu 99,0% (2846/2876) [17]. Mavenyengwa (2017)
đánh giá 1842 bệnh phẩm ở những bệnh nhân có triệu chứng lao phổi, Xpert
MTB dương tính 32,20% (594/1842), trong số đó 24,05%(443/1842) soi trực
tiếp AFB(+). Nghiên cứu gộp từ 24 nghiên cứu (33 trung tâm với 7247 người
tham gia) cho kết quả với bệnh phẩm soi trực tiếp âm tính nhưng nuôi cấy
dương, Xpert MTB có độ nhạy từ 43% tới 100%, độ nhạy chung 68%, độ đặc

hiệu ít thay đổi hơn trong khoảng từ 86%-100% [18].
Genne Xpert phát hiện kháng RMP
Boehme (2011) nghiên cứu tiến cứu 6648 bệnh nhân nhận xét độ nhạy
phát hiện kháng RMP là Se 94,4% (236/250) độ đặc hiệu Sp 98,3% (796/810)
[17]. Carriquiry (2012) nhận xét 131 bệnh nhân nhiễm HIV, có triệu chứng
nghi lao rõ bao gồm ho, có hình ảnh tổn thương nghi lao trên Xquang ngực.
Độ nhạy Xpert MTB phát hiện vi khuẩn lao Se 97,8% (44/45), độ đặc hiệu Sp
97,7% (84/86), độ nhạy phát hiện kháng RMP là 100%, độ đặc hiệu 91,0%
(30/33) [19]. Steingart (2013) tổng kết từ 27 nghiên cứu (33 trung tâm, 2969
người tham gia) về khả năng phát hiện kháng RMP của Xpert MTB, độ nhạy
trong giới hạn từ 33-100%, độ nhạy thấp ở những nơi có số lượng người tham
gia nghiên cứu thấp, độ đặc hiệu giá trị giao động ít hơn (83%-100%), độ
nhạy chung là 95%, độ đặc hiệu là 98% [20].
Nghiên cứu đánh giá giá trị của Xpert MTB tại Việt Nam
Mai Thanh Tú (2013) nghiên cứu 98 bệnh nhân nghi lao phổi điều trị


9

tại Trung tâm Hô hấp bệnh viện Bạch Mai được nội soi phế quản lấy dịch rửa
phế quản phế nang làm xét nghiệm Gene Xpert cho thấy: 24 bệnh nhân có kết
quả Xpert MTB dương tính chiếm 24,5%, độ nhạy của xét nghiệm Xpert
MTB là Se 77,4%, độ đặc hiệu Sp 100%, giá trị dự đoán dương tính 100%,
giá trị dự đoán âm tính 91%. Những trường hợp bệnh nhân nuôi cấy vi khuẩn
lao dương tính, độ nhạy của Gene Xpert Se 92,9%, độ đặc hiệu Sp 85,1%
[21]. Hoàng Hà (2014), nghiên cứu 151 bệnh nhân nghi lao, kết quả Xpert
MTB có vi khuẩn lao dương tính chiếm 31,6%, vi khuẩn lao có kháng RMP là
4,5%, trong số vi khuẩn lao kháng RMP: tái phát phác đồ 2 chiếm 42,9%; các
thể tái phát phác đồ 1, thất bại phác đồ 2, lao/HIV AFB (+), lao AFB(-) đều
gặp ít dưới 14,3% [22].

Lưu Bội Khanh (2014) sàng lọc 43.212 người trưởng thành tại 53
khóm/ấp tại Cà Mau. Trong đó 19.644 người đã khạc đờm đủ tiêu chuẩn làm
xét nghiệm Xpert. Có 155 người có kết quả dương tính với vi khuẩn lao bằng
Xpert MTB, tỉ lệ ước tính 425/100.000. Trong những người có kết quả dương
tính với vi khuẩn lao bằng xét nghiệm Xpert, 54% có kết quả “Số lượng vi
khuẩn lao rất thấp”, 2,7% có vi khuẩn lao kháng RMP [23].
Nguyễn Kim Cương (2017) nghiên cứu giá trị của Xpert MTB trên 123
bệnh nhân lao phổi AFB (-) có HIV. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ phát
hiện vi khuẩn lao là 49,6%; so với xét nghiệm tiêu chuẩn là MGIT, có độ
nhậy Se 66,7%, độ đặc hiệu Sp 77,1%, giá trị dự đoán dương tính PPV
82,0%, giá trị dự đoán âm tính NPV 59,7%. Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lao
kháng RMP là 18% (9/50), so với xét nghiệm tiêu chuẩn là kháng sinh đồ với
RMP; độ nhậy Se 62,5%, độ đặc hiệu Sp 90,5%, giá trị dự đoán dương tính
PPV 55,6%, giá trị dự đoán âm tính NPV 92,7% [24].
2.5. Các khuyến cáo hiện nay
Tháng 12 năm 2010, WHO đã đưa ra khuyến cáo đầu tiên về sử dụng


10

Xpert MTB cho năm 2011, hỗ trợ và khuyến cáo việc triển khai nhanh kỹ
thuật xét nghiệm này.Trong đó, Xpert MTB có thể áp dụng cho các bệnh
phẩm đờm, dịch não tủy, dịch hút dạ dày (trẻ em), và mảnh sinh thiết
hạch.WHO khuyến cáo Xpert MTB nên được sử dụng như là xét nghiệm chẩn
đoán đầu tiên cho người nghi ngờ có lao đa kháng thuốc hoặc lao đồng nhiễm
HIV (khuyến cáo mạnh mẽ). Xpert MTB có thể được coi là một xét nghiệm
tiếp theo nhuộm soi đờm trực tiếp ở các cơ sở ít có lao đa kháng thuốc hoặc
HIV, hoặc sử dụng tiếp sau các mẫu nhuộm soi - âm tính (Khuyến cáo liên
quan đến yếu tố điều kiện về nguồn lực) [9].
Năm 2013, WHO khuyến cáo Xpert MTB nên được sử dụng như xét

nghiệm ban đầu thay cho soi thường quy, nuôi cấy, xét nghiệm nhạy cảm
thuốc ở những trường hợp người lớn nghi MDR-TB hoặc lao nhiễm HIV
(Khuyến cáo mạnh, bằng chứng tốt). Xpert MTB có thể sử dụng tiếp sau xét
nghiệm soi trực tiếp những trường hợp người lớn nghi lao không có nguy cơ
MDR-TB, lao nhiễm HIV, đặc biệt khi xét nghiệm soi âm tính (Khuyến cáo
xem xét điều kiện triển khai, bằng chứng tốt) [25].
Chương trình chống lao quốc gia Việt Nam (2015) hướng dẫn các đối
tượng áp dụng Xpert MTB bao gồm người bệnh lao thất bại phác đồ I hoặc II,
lao tái phát, lao bỏ trị, lao mới ở bệnh nhân HIV (+), lao mới có xét nghiệm
soi đờm trực tiếp (+) và người bệnh nghi lao hoặc lao mới có tiếp xúc với
người bệnh mắc lao đa kháng [26].

3. Line probe assay
3.1. Đại cương
Line probe assay (LPA) là sử dụng nguyên lý của PCR và phương pháp
lai ghép ngược. Một đoạn gen đích đặc hiệu sẽ được khuếch đại và đưa vào
màng nitrocellulose. Đoạn dò DNA đặc hiệu trên màng lai cùng với đoạn gen


11

được khuếch đại sẽ gắn lên màng, sau đó chuỗi gen khuếch đại được gắn màu
và xuất hiện trên băng hiển thị. Những xét nghiệm này được thiết kế để xác
định MTB và phát hiện những đột biến gen liên quan đến kháng thuốc ở cả
bệnh phẩm trên lâm sàng cũng như bệnh phẩm phân lập từ nuôi cấy [27]. LPA
được WHO khuyến cáo là xét nghiệm sàng lọc nhanh các bệnh nhân có nguy
cơ MDR-TB [28]. Các kit LPA thương mại hiện nay bao gồm: INNOLiPA
RifTB), Genotype MTBDRplus, Genotype MTBDRsl (version 1 và 2).
3.2. Nguyên lý
Xét nghiệm LPA dựa trên công nghệ DNA-STRIP. Quy trình gồm 3

giai đoạn: (1) chiết xuất DNA từ mẫu đờm đã qua xử lý hoặc chủng nuôi cấy
(trên môi trường đặc hoặc lỏng), (2) phản ứng khuếch đại đa chuỗi các đoạn
trình tự đích thông qua các đoạn mồi được gắn biotin, và (3) phản ứng lai
ghép ngược [29].
Trên bề mặt màng lai (membrane strip) có các đầu dò đặc hiệu theo
nguyên tắc bổ sung với các đoạn trình tự DNA được khuếch đại. Sau khi biến
tính các đoạn DNA khuếch đại thành các sợi đơn, các sợi đơn này sẽ gắn vào
các đầu dò (phản ứng lai ghép). Sự gắn đặc hiệu của đoạn DNA bổ sung dựa
trên các điều kiện nghiêm ngặt về nhiệt độ và hóa chất đệm. Vì vậy các đầu
dò có thể phân biệt được các trình tự khác nhau trên các vùng gen thử
nghiệm. Enzyme alkaline phosphatase gắn vào đoạn DNA trên màng lai thông
qua cầu nối streptavidin-biotin. Streptavidin là một protein vi khuẩn có khả
năng liên kết với biotin với ái lực và độ đặc hiệu rất cao. Cuối cùng, alkaline
phosphatase sẽ chuyển hóa cơ chất không màu thêm vào thành cơ chất có màu
và có thể quan sát được trên màng lai [29].


12

Hình 3.1. Nguyên lý phản ứng lai DNA và hiển thị kết quả
trên thanh tín hiệu.
Phân tích kết quả:
 Locus đối chứng (rpoB, katG, inhA): vùng locus đối chứng xác định
vùng gen đặc hiệu cho locus tương ứng và có giá trị màu dương tính khi có vi
khuẩn lao. Nếu cả 2 locus đối chứng cũng như kiểu chủng dại và chủng đột
biến của 1 trong 3 gen không hiện màu thì kết quả không thể lượng giá.
 Mẫu dò chủng dại (Wildtyp): Khi mà tất cả các mẫu dò chủng dại của
gen đều dương tính (lên vạch) thí nghiệm được coi là nhạy với loại kháng
sinh tương ứng. Khi một băng tín hiệu không xuất hiện đối với ít nhất một
trong các mẫu chủng dại nghĩa là có vi khuẩn lao kháng với loại kháng sinh

tương ứng [29].
 Các mẫu đột biến (Mutation): các mẫu đột biến sẽ được phát hiện khi các
băng tín hiệu dương tính của các mẫu đột biến MUT xuất hiện trên một băng tín
hiệu. Kỹ thuật Genotype MTBDRplus xác định kháng RIF khi có đột biến xảy ra
trên gene rpoB, kháng INH ở mức độ cao khi có đột biến trên gene katG và
kháng INH ở mức độ thấp khi có đột biến trên gene inhA. Kỹ thuật Genotype
MTBDRsl phát hiện kháng nhóm fluoroquinolone dựa trên đột biến gene gyrA


13

và gyrB, phát hiện kháng nhóm aminoglycosid dựa trên đột biến gene rrs, đột
biến kháng thuốc kanamycin mức độ thấp trên gene eis [29].

Hình 3.2. Hiển thị kết quả trên thanh tín hiệu
3.3. Các băng tín hiệu trên màng lai Genotype MTBDRplus và nhận
định kết quả
3.4. Giá trị của xét nghiệm Line probe assay
Thế hệ LPA thứ nhất, INNOLiPA Rif TB (Innogenetics NV): Có thể
nhận biết sự thiếu hụt hoặc sự xuất hiện của vùng đột biến liên quan đến tính
kháng thuốc của vi khuẩn lao, từ đó có thể kết luận chủng đó kháng hay nhạy
với RMP. Tuy nhiên vẫn xuất hiện âm tính giả khi có yếu tố ức chế quá trình
nhân bản trong bệnh phẩm, không có chứng nội tại [30].
Thế hệ LPA thứ hai, GenoType MTBDRplus (Hain Lifesciene): Xác
định được tính kháng của RMP qua các đột biến quan trọng của gen rpoB (mã
hoá cho tiểu phần β của RNA polymerase), kháng INH ở mức độ cao độ liên
quan đột biến gen katG (mã hoá cho enzyme catalase - peroxidase), kháng


14

INH ở mức độ thấp liên quan đột biến gen inhA. Hạn chế của xét nghiệm
GenoType MTBDRplus là chỉ xác định được những đột biến kháng RMP và
INH đã biết, tuy nhiên đây là những đột biến hay gặp nhất trong các chủng
lao kháng thuốc. Thời gian trả kết quả chỉ từ 2 - 3 ngày khiến GenoType
MTBDRplus trở thành một xét nghiệm chẩn đoán nhanh, hiệu quả trong quản
lý MDR-TB [28], [29].
GenoType MTBDRsl (ver.1 và ver.2) có thể chẩn đoán lao phổi siêu
kháng thuốc thông qua phát hiện các đột biến liên quan đến kháng các thuốc
lao hàng hai như fluoroquinolone, aminoglyocoside. GenoType CM/AS chẩn
đoán định danh các loài của Mycobacteria Tuberculosis complex và 30 loài
Mycobacterium khác [29].
3.5. Bằng chứng khoa học
Lacoma (2008) nghiên cứu kỹ thuật GenoType đánh giá khả năng phát
hiện kháng RMP và INH trên 62 chủng lâm sàng so sánh với hệ thống Bactec
460TB, độ nhạy phát hiện RMP Se 98,3% (61/62), độ nhạy phát hiện INH
Se79% (49/62), 27 chủng có mức độ kháng INH thấp độ nhạy Se 62,9%
(17/27), 21 chủng độ kháng INH cao độ nhạy Se 85,71% (18/21). Độ nhạy
phát hiện kháng RMP 98% (50/51), kháng INH 96,2% (49/51) [31].
Hillemann và cộng sự (2007) nhận thấy tỉ lệ phát hiện kháng RIF từ chủng
nuôi cấy trên môi trường lỏng/đặc và từ bệnh phẩm đờm nhuộm soi dương tính là
98,7% và 96,8%. Tỉ lệ kháng INH từ chủng nuôi cấy trên môi trường lỏng/đặc và
từ bệnh phẩm đờm nhuộm soi dương tính là 92% và 90% [32].
Barnard và cộng sự (2008) nghiên cứu trên 536 bệnh phẩm đờm nhuộm
soi dương tính với độ nhạy phát hiện kháng RIF là 98,9% và phát hiện kháng
INH là 94,2% khi so sánh với phương pháp nuôi cấy [33].
Một phân tích gộp tập trung tất cả các nghiên cứu đã đưa ra độ nhạy
chung đối với kháng RMP là 96% (95-97%), độ đặc hiệu chung 98% (97-

15

99%), đối với kháng INH độ nhạy chung 91% (88-94%) và độ đặc hiệu chung
99% (98-99%), đối với kháng đa thuốc độ nhạy chung 91% (86-94%), độ đặc
hiệu chung 99% (99-100%) [34].
Nguyễn Thu Hà (2013) nghiên cứu kỹ thuật Genotype MTBDRplus
thấy độ nhạy, đặc hiệu của chẩn đoán kháng RMP lần lượt là Se 91,8%; Sp
100%, kháng INH là Se 88,5%; Sp 93,8%, và đa kháng thuốc là Se 76,8%; Sp
100% [35].
Nguyễn Mạnh Thế (2017) đánh giá giá trị của Genotype MTBDRplus
trên 165 bệnh nhân có kết quả nuôi cấy môi trường lỏng dương tính, nhận
thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm trong chẩn đoán lao phổi kháng
RMP so với kháng sinh đồ môi trường lỏng lần lượt là 86,36% và 98,60%;
trong chẩn đoán lao phổi kháng INH là 76,92% và 92,03%, đột biến trên katG
chiếm chủ yếu (91,84%); trong chẩn đoán lao phổi đa kháng là 80% và
97,93% [36].
WHO (2008) phân tích gộp các nghiên cứu có giá trị đánh giá giá trị
của Genotype MTBDRplus so với kháng sinh đồ truyền thống trên bệnh phẩm
đờm AFB (+) hoặc mẫu nuôi cấy M. Tuberculosis (+). Kết quả cho thấy LPA
có độ nhạy ≥ 97% và độ đặc hiệu ≥ 99% trong phát hiện kháng RMP và trong
phát hiện lao đa kháng có độ nhạy ≥ 90% và độ đặc hiệu ≥ 99% [28].
3.6. Khuyến cáo hiện nay


Genotype MTBDRplus[28]:

WHO (2008) khuyến cáo Genotype MTBDRplus nên được sử dụng
phù hợp theo hoàn cảnh từng quốc gia có gánh nặng về lao đa kháng.
Genotype MTBDRplus là xét nghiệm đầu tiên để chẩn đoán lao phổi đa
kháng đối với bệnh phẩm đờm AFB (+) hoặc mẫu nuôi cấy M. tuberculosis

complex (+) từ bệnh phẩm đờm hoặc ngoài phổi, thay thế cho xét nghiệm
kháng sinh đồ. Xét nghiệm không được khuyến cáo sử dụng trực tiếp trên các
bệnh phẩm AFB (-).


16

Trong trường hợp, Genotype MTBDRplus cho kết quả kháng thuốc
không xác định, cần phải làm xét nghiệm kháng sinh đồ.
 Genotype MTBDRsl [37]:
Genotype MTBDRsl được WHO (2016) khuyến cáo là xét nghiệm đầu
tiên cho những bệnh nhân có lao kháng RMP hoặc đa kháng để phát hiện
kháng thuốc nhóm fluoroquinolone và các thuốc tiêm hàng hai, thay thế cho
kháng sinh đồ.
Các đột biến kháng thuốc tiêm hàng hai phát hiện bởi Genotype
MTBDRsl có tương quan chặt với kết quả kháng sinh đồ. Trong với nhóm
fluoroquinolone, đột biến kháng ofloxacin/levofloxacin có tương quan với kết
quả kháng sinh đồ tốt hơn so với đột biến kháng moxifloxacin. Vì vậy, cần
làm xét nghiệm kháng sinh đồ đối vói moxifloxacin trong điều trị lao kháng
RMP hoặc đa kháng.
4. TB LAMP
4.1. Đại cương
Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplifcation ) được nghiên
cứu và phát triển bởi công ty Eiken Chemical Co. Ltd. Đây một phương pháp
nhân bản gene mới, có thể tổng hợp một đoạn DNA lớn mà không cần các chu
trình biến nhiệt. Thành phần phản ứng gồm có mẫu, mồi, enzyme DNA
polymerase, hỗn hợp phản ứng được ủ ở 65oC [38].
LAMP là phản ứng nhân bản DNA hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi có
điều kiện cần và đủ cho phản ứng, đó là chỉ khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm các
mồi đơn F3, B3, các mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám được vào 6 chuỗi

đích của khuôn, thì sản phẩm DNA vòng mới được tạo ra và phát hiện được.
Chỉ một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm
DNA vòng sẽ không được tạo ra. Sản phẩm của phản ứng có thể quan sát
bằng mắt thường do sự kết tủa của phản ứng tạo muối pyrophotphate
(Mg2P2O7) hoặc phát quang khi nhuộm bằng thuốc nhuộm [39], [40].
TB-LAMP sử dụng nguyên lý của LAMP để phát hiện đoạn gen đích
IS6110 đặc hiệu cho Mycobacteria tuberculosis complex [41].


17

4.2. Nguyên lý của phản ứng LAMP
Trên gen đích có 6 vùng bao gồm vùng F3/F3c, F2/F2c, F1/F1c ở đầu
3’ và vùng B1/B1c, B2/B2c, B3/B3c ở đầu 5’. Những trình tự này là cơ sở
cho việc thiết kế 4 cặp mồi đặc biệt: FIP, BIP, F3, B3. Trong đó mồi FIP
(Forward Inner Primer) gồm 2 phần: vùng F2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho
F2c và được nối với vùng F1c ở đầu 5’; mồi BIP (Backward Outer Primer)
gồm 2 phần: vùng B2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho B2c được nối với vùng
B1c (ở đầu 5’); mồi F3 (Forward Outer Primer) chứa vùng F3, là trình tự bổ
sung cho vùng F3c; mồi B3 (Backward Outer Primer) chứa vùng B3, là trình
tự bổ sung cho vùng B3c [38].

Hình 4.1 Gene đích và các cặp mồi trong phản ứng LAMP
Nguyên lý của phản ứng LAMP gồm 3 giai đoạn: (1) Tạo vật liệu khởi
đầu, (2) tái bản và kéo dài chuỗi, cuối cùng là (3) lặp lại chu kỳ.
Tạo vật liệu khởi đầu: Một trong những mồi LAMP sẽ bám vào trình tự
DNA đích, sau đó dưới tác dụng của enzyme DNA polymerase có hoạt tính
tách sợi và kéo dài sợi mới theo chiều 3’-5’. Ví dụ mồi FIP sẽ bám vào vị trí
F2c (Hình 1). Thông qua tác dụng của DNA polymerase, đoạn DNA bổ sung
được kéo dài từ đầu 3’ của vùng F2 trên mồi FIP (hình 2).Đoạn mồi F3, nằm

18

ngoài FIP, được gắn vào vùng F3c làm ngừng quá trình tổng hợp DNA và giải
phóng đoạn DNA bổ sung (hình 3).Một đoạn mạch kép được tổng hợp từ mồi
F3 và đoạn DNA bổ sung (hình 4). Đoạn mạch bổ sung gắn FIP được giải
phóng từ vị trí mồi F3 và hình thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ do vùng F1 và
F1c bắt cặp bổ sung (hình 5). Đoạn DNA đơn ở bước 5 trở thành khuôn mẫu
để tổng hợp DNA tử đầu 3’ của mồi BIP (hình 6). Tương tự mồi BIP và B3 sẽ
bám vào và tổng hợp sợi DNA mới theo nguyên tắc bổ sung (hình 7). Kết quả
thu được sản phẩm DNA đơn có giới hạn bởi 2 mồi là FIP và BIP (hình 8).
Sợi DNA này có 2 đầu cuộn lại hình thành cấu trúc gốc vòng (stem-loop
DNA) (do trình tự bắt cặp bổ sung F1- F1c và B1-B1c). Cấu trúc này sẽ là cấu
trúc khởi đầu cho quá trình tái bản của phương pháp LAMP (chu kỳ lặp lại
LAMP) [38].

Hình 4.2. Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu trong phản ứng LAMP
Tái bản và kéo dài chuỗi: mồi FIP gắn với vòng trong cấu trúc DNA
gốc vòng ở vùng F2/F2c và tổng hợp sợi DNA bổ sung, đồng thời do cấu trúc
vòng ở đầu 3’ (do trình tự FIP tạo thành) sẽ được kéo dài và hình thành cấu


19

trúc vòng ở vị trí kết thúc của trình tự BIP. Cấu trúc vòng của trình tự BIP lại
được kéo dài hình thành nên cấu trúc sợi kép được gấp khúc ở giữa và một sợi
đơn có cấu trúc vòng ở hai đầu. Cả hai sản phẩm này đều là DNA mẫu cho
các chu kỳ tái bản tiếp theo. Sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp DNA gốc vòng
với cấu trúc gấp khúc và độ dài khác nhau của cùng một trình tự [38].

Hình 4.3. Giai đoạn lặp lại chu kỳ trong phản ứng LAMP
Lặp lại chu kỳ: Cứ như vậy, các mồi FIP và BIP của cả hai sợi khuôn thay
phiên nhau tổng hợp DNA bổ sung và tạo gốc vòng ở cuối mỗi sợi. Phản ứng
cứ vậy tiếp tục và có thể tạo nên 10 9-1010 bản sao trong vòng khoảng 15 phút
đến 1 giờ.
4.3. Phát hiện sản phẩm của phản ứng TB-LAMP:
Các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) tham gia quá trình tổng hợp
DNA sẽ giải phòng các gốc phosphate. Khi thêm thuốc nhuộm huỳnh quang
FDR (fluorescent detection reagent) ví dụ như SYBR green. Calcein trong
FDR kết hợp với ion manganese (Mn

++

) và không phát quang. Ion


20

pyrophosphate được tạo ra như sản phẩm phụ của phản ứng LAMP, chúng sẽ
kết hợp và loại manganese từ calcein, và kết quả là chỉ nhận dạng được các
gen đích phát quang. Ống phản ứng có thể quan sát dưới đèn UV thông
thường hoặc bằng kính hiển vi huỳnh quang [42].

Hình 4.4. Nguyên lý phát quang trong phản ứng LAMP
4.4. Bằng chứng khoa học
K. N’guessan so sánh giá trị của soi AFB, TB-LAMP, và Xpert MTB
trong chẩn đoán lao phổi trên 469 bệnh nhân sử dụng nuôi cấy là tiêu chuẩn
vàng. Kết quả cho thấy thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của soi AFB lần lượt là
86% (95% CI : 81–91) và 96% (95% CI : 94–98); đối với TB-LAMP là 92%

(95% CI: 0.88–0.96) và 94% (95% CI: 91–97); đối với Xpert MTB là 96%
(95% CI : 0.93–0.99) 90% (95% CI: 87–93). Tính tổng, có 157 (33,5%) bệnh
nhân có kết quả nuôi cấy dương tính, kết quả này đối với nhuộm soi AFB,
TB-LAMP, Xpert MTB lần lượt là 147 (31.3%), 162 (34.5%), 183 (39%).
Nghiên cứu cho thấy sử dụng kỹ thuật TB-LAMP có thể làm tăng số trường
hợp được chẩn đoán lao lên 3,2% so với kỹ thuật nhuộm soi AFB [42].


21

Mbarouk Seif Khalief (2014) nghiên cứu trên 550 bệnh nhân nghi lao lấy
đờm đủ tiêu chuẩn, nhận xét kỹ thuật TB-LAMP có độ nhạy và độ đặc hiệu
lần lượt là 67.4% và 97.5%; Xpert MTB có độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là
80% và 90.3%; soi AFB huỳnh quang có độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là
61.4% and 96.3%. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu khi soi AFB huỳnh
quang 2 lần liên tiếp là 71.43% and 95.47%. Kết quả này cho thấy mặc dù
TB-LAMP có độ nhạy cao hơn soi AFB huỳnh quang 1 lần nhưng xét nghiệm
này không cho thấy lợi ích trong chẩn đoán lao phổi so với phương pháp soi
AFB huỳnh quang hiện tại [42].
Trần Thị Thanh Hoa (2014) nghiên cứu trên 498 mẫu đờm của bệnh
nhân có triệu chứng nghi lao so sánh giá trị của TB-LAMP, Xpert MTB, và
soi đờm trực tiếp 3 lần, sử dụng nuôi cấy là tiêu chuẩn vàng. Kết quả cho thấy
độ nhạy của TB-LAMP trên bệnh phẩm nuôi cấy dương, soi trực tiếp dương
là 80% (51,9 – 95,7), trên bệnh phẩm nuôi cấy dương, soi trực tiếp âm là
15,8% (33,8 – 39,6), độ nhạy chung là 44.1% (27,2 – 62,1%) và độ đặc hiệu
chung là 95.0% (94.2–97.9%). Xpert MTB có độ nhạy và độ đặc hiệu đều tốt
hơn so với TB-LAMP. Tuy nhiên, TB-LAMP có độ nhạy tương đương với soi
đờm trực tiếp 3 lần, và đều lớn hơn các lần soi trực tiếp riêng rẽ [42].
WHO (2016) đánh giá hiệu quả chẩn đoán lao của TB-LAMP so với soi
đờm trực tiếp ở người lớn nghi lao. Phân tích gộp bao gồm 7 nghiên cứu

(1810 bệnh nhân) sử dụng nuôi cấy là tiêu chuẩn vàng. Kết quả nghiên cứu
cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của TB-LAMP là 78% (71% - 83%) và 98%
(96% - 99%), độ nhạy và độ đặc hiệu của soi đờm trực tiếp là 63% (56% - 69)
và 100% (97% -100%). Trong quần thể bệnh nhân nhiễm HIV nghi lao, phân
tích gộp gồm 4 nghiên cứu (271 bệnh nhân) không cho thấy lợi ích của việc
sử dụng TB-LAMP (độ nhạy 64%, độ đặc hiệu 99%) so với soi đờm trực tiếp
(độ nhạy 62%, độ đặc hiệu 99%). 7 nghiên cứu (1349 bệnh nhân) đánh giá giá