SÀNG lọc và PHÁT HIỆN đột BIẾN GEN LDL RECEPTOR gây BỆNH TĂNG CHOLESTEROL máu TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH MẠCH VÀNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHẠM THỊ MINH HUYỀN

SµNG LäC Vµ PH¸T HIÖN §éT BIÕN GEN
LDL RECEPTOR G¢Y BÖNH T¡NG
CHOLESTEROL M¸U
TR£N BÖNH NH¢N BÖNH M¹CH VµNH

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHẠM THỊ MINH HUYỀN

SµNG LäC Vµ PH¸T HIÖN §éT BIÕN GEN
LDL RECEPTOR G¢Y BÖNH T¡NG
CHOLESTEROL M¸U
TR£N BÖNH NH¢N BÖNH M¹CH VµNH
Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số: 60720106
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung


HÀ NỘI - 2015

MỤC LỤC


4

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh mạch vành là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong 10 năm
trở lại đây. Ước tính tử vong do bệnh mạch vành trên toàn cầu năm 2002 là
7,1 triệu người và sẽ tăng lên 11,1 triệu người vào năm 202{Wang Z1, 2014
#56}. Ở Mỹ cứ 40 giây lại có một người tử vong do bệnh tim mạch, quá nửa
trong số đó là do bệnh mạch vành. Ở khu vực châu Á...ở các nước đang phát
triển... Trong khi đó bệnh lại có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển
như Việt Nam {Gaziano TA, 2010 #58}. Tại Việt Nam tỷ lệ bệnh mạch vành
ngày càng tăng: năm 1994: 3,4%, năm 2003: 11,2% và năm 2007 lên đến
24%{Tuân, 2008 #59}.
Nguyên nhân gây bệnh động mạch vành là do các mảng vữa xơ gây
hẹp lòng động mạch làm giảm cung cấp máu cung cấp máu và oxy cho tim
(National center for Biotechnology Information, 2010). Mảng vữa xơ gây nên
triệu chứng thiếu máu cơ tim cục bộ hoặc có thể nứt vỡ tạo nên huyết khối
gây tắc mạch dẫn tới NMCT cấp với tỷ lệ tử vong cao. Trong quá trình hình
thành, phát triển và nứt vỡ của mảng vữa xơ, tăng cholesterol máu đóng một
vai trò chìa khóa. Tăng cholesterol máu thường được quy cho là do chế độ ăn

giàu cholesterol, ít vận động, hậu quả của một số bệnh rối loạn chuyển hóa...
Tuy nhiên với sự phát triển của công nghệ di truyền và công nghệ gen đã cho
thấy rằng một nguyên nhân quan trọng gây tăng cholesterol máu là do gen
trong đó có bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial
hypercholesterolemia FH).
FH là bệnh rối loạn chuyển hóa do di truyền phổ biến nhất. Tỷ lệ mắc
ước tính toàn cầu là 1:500 đến 1:300 ở một vài quần thể tỷ lệ còn cao hơn.
Đây là một bệnh di truyền đơn gen, nguyên nhân là do đột biến ở: LDL
receptor, apoB, PCSK9, LDLRAP1, trong đó đa số là đột biến ở LDL-R


5

(chiếm trên 80%) [23]. Người bị bệnh FH liên quan với nồng độ cao LDL-C
từ khi mới sinh nên tác động của nó nên hệ tim mạch đặc biệt nguy hiểm hơn
so với người tăng cholesterol máu mắc phải. Trung bình bệnh nhân FH không
điều trị có nguy cơ bị bệnh mạch vành cao gấp 20 lần so với nhóm chứng
[28]. Bệnh nhân FH không được điều trị xuất hiện triệu chứng bệnh mạch
vành từ rất sớm, trung bình là từ khi 20-60 tuổi tùy thể bệnh [22, 29]. Ngược
lại nếu được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời tình trạng này hoàn toàn có
thể ngăn ngừa được hay ít nhất là có thể trì hoãn. Chẩn đoán về gen đóng vai
trò quan trọng giúp chẩn đoán chính xác, nhất là ở giai đoạn sớm khi bệnh
nhân chưa có triệu chứng lâm sàng nhờ đó bệnh nhân có cơ hội điều trị sớm
để dự phòng các biến chứng tim mạch một cách có hiệu quả.
Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về chẩn đoán sớm FH dựa trên
phân tích gen, vì vậy còn nhiều bệnh nhân trẻ xuất hiện bệnh mạch vành thậm
chí đột tử do bệnh mạch vành mà không tìm thấy nguyên nhân. Xuất phát từ
thực tế đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Sàng lọc và phát hiện đột biến gen
LDL receptor gây bệnh tăng cholesterol máu trên bệnh nhân bệnh mạch
vành” với 2 mục tiêu:

1-

Sàng lọc bệnh nhân FH từ những bệnh nhân bị bệnh mạch vành ≤ 60 tuổi.

2-

Xác định đột biến gen LDL receptor ở những bệnh nhân FH được phát hiện
và mối tương quan giữa kiểu gen và một số yếu tố bệnh sinh khác.


6

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Bệnh mạch vành
Năm 1768, lần đầu tiên thuật ngữ đau thắt ngực được William Heberden
đưa ra để mô tả những trường hợp đau ngực nghi do thắt và loét. Những nhận
xét kinh điển của Heberden được xem như là khởi đầu của việc nghiên cứu về
bệnh mạch vành. Đến nay bệnh mạch vành được xem là nguyên nhân hàng đầu
gây tử vong ở người trưởng thành. Ước tính tử vong do bệnh mạch vành trên
toàn cầu năm 2002 là 7,1 triệu người và sẽ tăng lên 11,1 triệu người vào năm
2020 [1]. Ở Mỹ cứ 40 giây lại có một người tử vong do bệnh tim mạch, quá
nửa trong số đó là do bệnh mạch vành. Nước Mỹ chi phí khoảng 108,9 tỷ USD
mỗi năm cho dịch vụ chăm sóc sức khỏe liên quan đến bệnh mạch vành [2].
Điều này làm giảm tỷ lệ mắc bệnh động mạch vành ở hầu hết các nước phát
triển . Trong khi đó bệnh lại có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển
[3]. Theo thống kê của Viện tim mạch Việt Nam tỷ lệ bệnh mạch vành tăng dần
trong những năm gần đây. Trong năm 1994 tỷ lệ này là 3,4%, đến năm 2003 tỷ
lệ này là 11,2% và đến năm 2007 lên đến 24% [4].
1.1.1. Đại cương

Bệnh mạch vành (BMV) là bệnh của sự tổn thương các thành động mạch
vành tim, mà nguyên nhân của tổn thương ấy > 90% là do các mảng xơ vữa huyết khối tại các động mạch vành (thường chỉ ở các mạch vành lớn bề mặt).
Các mảng xơ vữa - huyết khối nói trên làm cho động mạch vành nào bị
bệnh như thế sẽ không hoàn thành tốt chức năng chuyển máu, y học gọi là suy
vành hoặc thiểu năng vành. Hậu quả là từng vùng cơ tim tương ứng (do nhánh
MV đó phụ trách nuôi) rơi vào trạng thái thiếu máu cục bộ: cụ thể là bị giảm
sự tưới máu, giảm cung khi tĩnh và nhất là khi hoạt động. Vì vậy còn được gọi


7

là bệnh tim thiếu máu cục bộ. Thuật ngữ hội chứng mạch vành cấp là danh từ
chung để chỉ một trạng thái thiếu máu cơ tim cấp tính [5].
1.1.2. Phân loại:
Bệnh mạch vành gồm có hội chứng vành cấp và bệnh mạch vành mạn.
1.1.2.1. Hội chứng vành cấp gồm 4 thể bệnh:
- ĐTN không ổn định
- NMCT không ST chênh lên
- NMCT có ST chênh lên
- Đột tử do mạch vành
1.1.2.2. BMV mạn gồm 4 thể lâm sàng:
- Bệnh mạch vành mạn ổn định hoặc đau thắt ngực mạn ổn định
Triệu chứng nổi bật là đau ngực từng cơn ngắn, phát sinh khi gắng sức,
mức độ đau không tăng lên hoặc giảm đi mà rất ổn định trong cả giai đoạn dài nên
được gọi là ĐTN mạn ổn định. Là thể bệnh ĐTN kinh điển và thường gặp nhất.
- Đau thắt ngực biến thái.
Do Prinzmetal xác lập từ năm 1959, đặc điểm là các cơn đau ngực
thường kéo dài hơn, thường liên quan đến một khung cảnh hoặc một thời
điểm cụ thể nào đó không do gắng sức thể lực mà do co thắt động mạch vành
lớn bề mặt. Trong cơn đau điện tim thấy đoạn ST chênh hẳn lên nhưng lại

nhanh chóng trở về đẳng điện lúc qua cơn đau.
- Hội chứng X (ẩn số x):
Đau ngực không phải do co thắt động mạch vành lớn bề mặt như trong
ĐTN biến thái mà do co thắt ở các nhánh typ B (xuyên bề dày cơ tim).
- Thiếu máu cơ tim thầm lặng:
Hoàn toàn không đau nhưng cũng gồm những cơn TMCB cơ tim,
thường kéo dài 5-7 phút với đoạn ST chênh xuống trên điện tim Holter 24h
hoặc trên điện tim.


8

1.1.3. Sinh lý bệnh mạch vành
1.1.3.1. Hội chứng mạch vành cấp xảy ra khi mất cân bằng giữa cung và cầu
về oxy cho cơ tim. Năm quá trình sinh lý bệnh dẫn đến hội chứng vành cấp đã
được nêu ra:
- Bào mòn, rạn nứt và vỡ mảng xơ vữa.
- Tắc mạch.
- Quá trình viêm hoặc nhiễm trùng.
- Tắc nghẽn cơ học tiến triển.
- Thiếu máu cơ tim cấp tính thứ phát do tăng nhu cầu oxy của cơ tim ở
những bệnh nhân bệnh động mạch vành mạn tính.
Nguyên nhân thường gặp nhất khiến bệnh mạch vành đang ổn định tiến
triển là do mảng xơ vữa của mạch vành không ổn định, nứt và vỡ ra (những
mảng xơ vữa này được gọi là những mảng xơ vữa dễ bị tổn thương).
Mảng xơ vữa bị vỡ ra làm lộ lớp dưới nội mạc tích điện khác dấu nên
khởi phát quá trình kết vón tiểu cầu, lõi của mảng xơ vữa phòi ra theo chỗ vỡ
sẽ cùng mảnh vỏ của mảng xơ vữa đã bị viêm rồi rạn nứt, gãy đứt, bứt đi đều
bị tiểu cầu kết vón kín xung quanh hình thành những huyết khối trắng (toàn
tiểu cầu) và một số sẽ thành huyết khối đỏ (hỗn hợp) theo dòng máu làm bít

hẹp thêm lòng động mạch vành, thậm chí thành cục thuyên tắc bít tịt lòng
ĐMV. Chỗ MV mới bị bít thường ở động mạch liên thất trước (70%) và ở
thân chung ĐMV trái (10%).
Cùng bản chất là huyết khối mới sinh nhưng các thể bệnh trên có mức
độ bít tịt hay bít hẹp khác nhau:
ĐTNKÔĐ: thường do huyết khối trắng không gây bít hoàn toàn, chỉ bít
hẹp mức độ nhẹ.
NMCT không ST chênh lên:thường do huyết khối trắng gây bít hẹp
(không hoàn toàn) mức độ vừa.
NMCT có ST chênh lên: thường do huyết khối hỗn hợp gây bít tịt lòng ĐMV.


9

1.1.3.2. Sinh lý bệnh mạch vành mạn:
Do lòng động mạch vành bị hẹp do mảng xơ vữa + huyết khối cũ từ lâu
(dễ sinh ra ở tâm và rìa mảng xơ vữa) đôi khi còn có xuất huyết những tân
mạch ở phía dưới mảng xơ vữa đội nó lên làm hẹp thêm lòng động mạch này.
Trên nền hẹp về giải phẫu đó lại diễn ra sự hẹp thêm cơ năng do co thắt mạch
khi có tác nhân thể dịch - thần kinh gây co thắt. Nhưng tình hình tưới máu tại
vùng cơ tim tương ứng luôn luôn động nhằm giữ thăng bằng cán cân cungcầu. Tình trạng TMCB chỉ xảy ra khi mất thăng bằng cán cân cung cầu ấy. Cụ
thể có thể gặp 1 trong 3 kiểu sau: chỉ giảm cung, chỉ tăng cầu, vừa giảm cung
vừa tăng cầu.
- Các hoàn cảnh làm giảm cung: cơn co thắt mạch máu do (thường do
tăng tiết adrenalin trong stress), do giảm thể tích máu lưu thông: mất máu
hoặc mất nước nhanh và nhiều, ít thành phần mang oxy: thiếu máu, suy thất
trái, hạ huyết áp đột ngột dẫn tới hạ áp suất tưới máu MV từ gốc động mạch
chủ, rút ngắn thời gian tâm trương (do nhịp quá nhanh).
- Các hoàn cảnh tăng cầu: gắng sức thể lực, cơn tăng vọt huyết áp, đợt
cường giáp, tăng tải thể tích...

Các biến đổi chuyển hóa: TMCB chuyển hóa yếm khí toan hóa tế
bào, phóng thích lactat, adenosin. Các biến đổi chuyển hóa này xảy ra trước
lúc đoạn ST trên ĐTĐ chênh xuống. Không có các biến đổi thực thể cho cơ
tim (kiểu hoại tử mô) xảy ra trong BMV mạn.
1.1.4. Chẩn đoán
1.1.4.1. Hội chứng vành cấp
Chẩn đoán xác định NMCT khi có 2 trong 3 tiêu chuẩn sau:
- Triệu chứng đau ngực kiểu mạch vành.
- Động học thay đổi điện tim:đoạn ST của tổn thương chênh lên >1mm,
riêng với các chuyển đạo trước tim> 2mm. Sóng T vành: cân,nhọn,âm.Sóng Q
hoại tử: rộng dần và sâu dần.


10

- Động học các thay đổi men tim:TNT,CK-MB,LDH1 và các chất đánh
dấu sinh học về hoại tử mô cơ tim khác.
1.1.4.2. Chẩn đoán bệnh mạch vành mạn:
Triệu chứng lâm sàng của cơn đau thắt ngực ổn định:
- Vị trí: thường ở sau xương ức và là một vùng (chứ không phải một
điểm), đau có thể lan lên cổ, vai, tay, hàm, thượng vị, sau lưng. Hay gặp hơn
cả là hướng lan lên vai trái rồi lan xuống mặt trong tay trái, có khi xuống tận
các ngón tay 4,5.
- Hoàn cảnh xuất hiện: thường xuất hiện khi gắng sức, xúc cảm mạnh,
gặp lạnh, sau bữa ăn nhiều hoặc hút thuốc lá. Một số trường hợp cơn đau thắt
ngực có thể xuất hiện về đêm, khi thay đổi tư thế, hoặc khi kèm cơn nhịp nhanh.
- Tính chất: hầu hết các bệnh nhân mô tả cơn đau thắt ngực như thắt
lại, bó nghẹt, hoặc bị đè nặng trước ngực và đôi khi cảm giác buốt giá. Một số
bệnh nhân có khó thở, mệt lả, đau đầu, buồn nôn, vã mồ hôi ....
- Cơn đau: thường kéo dài khoảng vài phút(3-5 phút), có thể dài hơn

nhưng không quá 20 phút (nếu đau kéo dài hơn và xuất hiện ngay cả khi nghỉ
thì cần nghĩ đến Cơn đau thắt ngực không ổn định hoặc Nhồi máu cơ tim).
Những cơn đau xảy ra do xúc cảm thường kéo dài hơn là đau do gắng sức.
Những cơn đau mà chỉ kéo dài dưới 1 phút thì nên tìm những nguyên nhân
khác ngoài tim.
Đau ngực có thể do nhiều nguyên nhân khác gây ra và do đó cần xác
định khả năng đau thắt ngực kiểu ĐMV. Theo AHA/ACC xác định cơn đau
thắt ngực điển hình do bệnh ĐMV dựa trên các yếu tố sau: Đau thắt ngực điển
hình: bao gồm 3 yếu tố (1) đau thắt chẹn sau xương ức với tính chất và thời
gian điển hình; (2) xuất hiện khi gắng sức hoặc xúc cảm; và (3) đỡ đau khi
nghỉ hoặc dùng nitrates. Đau thắt ngực không điển hình: chỉ gồm hai yếu tố
trên. Không phải đau thắt ngực: chỉ có một hoặc không có yếu tố nào nói trên


11

- Triệu chứng cận lâm sàng:
Điện tâm đồ: ST chênh/ T vành hoặc loạn nhịp tim.
Siêu âm tim: xét rối loạn vận động vùng, dày thất trái, hở van tim chức
năng, tăng áp động mạch phổi, phân suất tống máu EF.
Điện tim Holter: tầm soát TMCB cơ tim thầm lặng, ĐTN Prinzmetal,
tầm soát loạn nhịp tim đi kèm.
Điện tim của nghiệm pháp gắng sức (NPGS) được coi là dương tính
mạnh khi:
ST chênh lên hoặc chênh xuống, xuất hiện nhịp nhanh thất.
Chụp cắt lớp vi tính nhiều lát cắt (MSCT): xét tổn thương và độ hẹp
từng động mạch vành rất rõ nét, nhưng chỉ là chẩn đoán hình thái và bị ảnh
hưởng bởi vôi hóa nhiều hoặc loạn nhịp nhanh.
Chụp mạch vành cản quang: là tiêu chuẩn vàng cho BMV, xác định độ
bít hẹp lòng mạch. Theo tiêu chuẩn của Hội Tim mạch Mỹ (AHA) và Hội Tim

mạch Pháp (SFC) một trường hợp được coi là có tổn thương hẹp ĐMV khi
ĐMV hẹp trên 50% trở lên. Và phải can thiệp tái tuần hoàn vành như nong
vành hay phẫu thuật bắc cầu vành với mức hẹp > 70% ở các nhánh chính và >
50% ở thân chung ĐMV trái.
1.1.5. Điều trị bệnh mạch vành
1.1.5.1. Điều trị hội chứng vành cấp
Nguyên tắc là phải điều trị khẩn trương vì tỉ lệ tử vong cao và 20-30%
tử vong trong giờ đầu tiên của đau ngực với NMCT có ST chênh.
- Giảm đau: ngậm Nitroglycerin 0,4mg hoặc isosorbid dinitrat 5mg.
- Truyền sớm tiêu sợi huyết.
- Xử lý một số tình trạng khác: nhịp chậm, ngoại tâm thu ,điều chỉnh
huyết áp, thở oxy...
- Điều trị lâu dài: ngừa huyết khối, thuốc chẹn bêta, ƯCMC, nong mạch vành.


12

1.1.5.2. Điều trị bệnh mạch vành mạn:
- Trong cơn:
Ngưng gắng sức thể lực và trí óc.
Dùng ngay nitrat loại tác dụng nhanh và ngắn: nitroglycerin, dinitrat
isosorbid.
- Sau cơn, ngoài cơn:
Là điều trị cơ bản gồm: dùng thuốc, xử trí các yếu tố nguy cơ, can thiệp
tái phân bố mạch nếu cần thiết.
Thuốc: Thuốc chống kết vón tiểu cầu: nhằm phòng ngừa biến chứng
huyết khối. Gồm: Aspirin, clopidogrel
Thuốc mạch vành kinh điển gồm 3 nhóm: chẹn beeta (làm giảm tiêu
thụ oxy cơ tim),nitrat (tác dụng chậm, dài: trinitrat, dinitrat, mononitrat
isosorbid) , đối kháng calci (Diltiazem, verapamil...)

Ngoài ra: ƯCMC liều nhỏ: cải thiện chức năng hệ nội mạc trong đó có
chức năng tiêu sợi huyết, chức năng tự củng cố và duy trì sự bền vững của
mảng vữa xơ...Giãn vành: Molsidomin, Nicorandil, Amiodaron...
Ngăn các yếu tố nguy cơ:
Biện pháp không dùng thuốc:
+ Giáo dục sức khỏe.
+ Buộc thay đổi một số nếp sống: ăn thừa calo, nhiều mỡ, uống rượu
bia, lười vận động, hút thuốc lá.
Biện pháp dùng thuốc: điều trị tích cực những bệnh lý là yếu tố nguy cơ
gây TMCB cơ tim: tăng huyết áp, tiểu đường, thiếu máu, bệnh tuyến giáp,
loạn nhịp tim.
Can thiệp tái phân bố mạch: nong mạch vành (tạo hình MV theo lòng
mạch qua da), phẫu thuật bắc cầu chủ - vành.


13

1.1.6. Vai trò của tăng lipid máu trong bệnh mạch vành:
Bệnh động mạch vành (coronary artery disease CAD) cũng được biết là
bệnh tim mạch vành (coronary heart disease CHD) là do hẹp dòng máu cung
cấp máu và oxy cho tim, là kết quả của vữa xơ (National center for
Biotechnology Information, 2010).
1.1.6.1. Vai trò của tăng lipid với sự hình thành mảng vữa xơ:
Cholesterol đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển vữa xơ.
Bước đầu tiên của bệnh học vữa xơ là sự bẫy của LDL huyết thanh, VLDL, và
VLDL tàn dư vào lớp áo động mạch. Những mảnh này rời dòng máu và đi
qua lớp nội mạc của động mạch tích tụ ở lớp áo trong của động mạch [6]. Khi
những mảnh này bị bẫy, chúng bị biến đổi bởi enzym thành các mảnh tiền
viêm. Những mảnh tiền viêm này khởi đầu một đáp ứng viêm [7], chemokine
được tiết bởi cơ trơn, tiểu cầu, và mô mỡ làm tế bào mono, lympho,tế bào

mast và bạch cầu đa nhân trung tính tới thành động mạch. Cùng lúc, tế bào cơ
trơn tiết collagen và xơ elastic vào chất nền ngoại bào [6]. Khi trong thành
động mạch, tế bào mono được chuyển dạng thành đại thực bào [8] (Hegele
2009). LDL tồn tại lâu trong huyết tương, thời gian bán hủy của chúng kéo
dài, chúng bị biến đổi (oxy hóa, acetyl hóa, glycosyl hóa...) và được nhận biết
bởi một loại receptor đặc hiệu ở đại thực bào. Đai thực bào bị ứ đọng
cholesterolester sẽ trở thành “tế bào bọt” [9]. Những sự thay đổi này là vi thể
và có thể đảo ngược và vẫn chưa được xem là vữa xơ. Sự tiếp tục tích lũy của
tế bào bọt, từ vi thể thành những thay đổi có thể nhìn thấy rõ, dẫn đến sự hình
thành những vệt chất béo, mà được xem là giai đoạn đầu của vữa xơ.
Trong giai đoạn 2 của vữa xơ, tế bào bọt tiếp tục tích lũy bằng cách
hoạt hóa các tế bào viêm khác. Lipid bên ngoài tế bào kết hợp vào gây ra hoại
tử tế bào [6]. Thậm chí, những lõi giàu lipid này phát triển đến khi chúng
chiếm giữ 30-50% đường kính thành động mạch. Tiếp theo, mô xơ được thêm
vào phía trên lõi giàu lipid, phía dưới nội mạc, làm hình thành 1 cái mũ xơ.


14

Giai đoạn thứ 3 và là giai đoạn cuối cùng của vữa xơ là tổn thương phát
triển hoàn thiện. Trong giai đoạn này, một cái mũ xơ mỏng phát triển và có
thể vỡ. Cái mũ xơ trở nên mỏng và yếu hơn khi hoạt động của enzyme làm
cho mô xơ phân hủy. Nếu nó phân hủy, khởi động quá trình đông máu tạo ra
huyết khối gây bít tắc có khả năng đe dọa tính mạng [8]. Tuy nhiên, nhiều
mảnh vỡ im lặng về lâm sàng. Chúng được làm lành bằng cách hình thành mô
xơ kết dính các tế bào, sợi collagen, và không gian ngoại bào. Nhưng chúng
có thể vỡ lại gây ra vòng vỡ-đông-lành. Mỗi bước này kết quả là lắng đọng
calci. Sự tăng kích thước của mảng có thể dẫn tới hẹp nghiêm trọng đủ để gây
ra thiếu máu gây chết do sự hạn chế của dòng máu [8].
1.1.6.2. Vai trò của tăng lipid với tính ổn định của mảng vữa xơ:

Sự tích tụ lipid trong hệ tuần hoàn không chỉ làm hình thành mảng vữa
xơ mà nó còn đóng vai trò quan trọng gây nên tính không ổn định của mảng
vữa xơ hay tạo nên nguy cơ vỡ mảng xơ vữa. Người ta thấy rằng nguy cơ vỡ
mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là phụ thuộc vào kích
thước. Các mảng xơ vữa mềm và giàu lớp lipid dễ bị tổn thương và nhạy cảm
với sự vỡ hơn so với mảng xơ vữa cứng giàu collagen.
Các nghiên cứu giải phẫu bệnh đã xác định có 3 yếu tố chính của khả
năng dễ bị vỡ của mảng xơ vữa:
- Kích thước của lõi giàu lipid.
- Tình trạng viêm làm phá hủy mảng xơ vữa.
- Thiếu các tế bào cơ trơn làm lành các chỗ vỡ.
Sự tích tụ lipid, thâm nhiễm đại thực bào và thiếu các tế bào cơ trơn
làm giảm tính bền vững của mảng xơ vữa, làm cho nó dễ bị vỡ. Ngược lại, sự
lành qua trung gian các tế bào cơ trơn và tiến trình sửa chữa làm ổn định các
mảng xơ vữa, bảo vệ mảng xơ vữa, chống lại sự vỡ.
Lõi của mảng xơ vữa là thành phần không có mạch máu, nghèo tế bào,
giàu lipid, mềm nhão và hoàn toàn không có collagen nâng đỡ. Kích thước


15

của lõi mềm này quyết định tính ổn định của mảng xơ vữa. Các nghiên cứu
miễn dịch đã chỉ ra rằng, các lipid và những thành phần tế bào khác được
phóng thích từ các tế bào bọt chết có thể góp phần làm tăng trưởng lõi vữa.
Trong lúc sinh thiết tử thi, Gertz và Roberts thấy lõi vữa của những mảng xơ
vữa bị vỡ lớn hơn so với các mảng không vỡ. Davies và cộng sự cũng tìm
thấy mối tương quan chặt chẽ giữa kích thước lõi vữa và tình trạng vỡ mảng
xơ vữa ở động mạch chủ [10, 11].
Vậy tăng LDL-C máu là yếu tố nguy cơ của vữa xơ và CHD:
Một số nghiên cứu dịch tễ học quan sát, bao gồm Framingham Heart

Study, đã tìm ra mối liên quan giữa tăng nồng độ LDL-C với sự tăng tỷ lệ mắc
CHD ở cả nam và nữ. Mối liên quan cũng tương tự cho những biến cố về
bệnh tim mạch lặp đi lặp lại trong số người CHD [12].
Để đánh giá nguy cơ CHD bên cạnh nồng độ LDL-C huyết thanh, nồng
độ apoB huyết thanh được xem là marker sinh học mới mà có thể đo lường
tốt hơn nồng độ của các mảnh LDL tuần hoàn và chỉ ra nguy cơ tốt hơn
LDL-C [13, 14]. Apo B là 1 thành phần của tất cả các mảnh vữa xơ hoặc các
mảnh vữa xơ tiềm năng bao gồm: VLDL/IDL, LDL,và lipoprotein. Vì vậy,
apoB cung cấp một sự đo lường trực tiếp số lượng những mảnh lipoprotein
vữa xơ trong hệ tuần hoàn. Nồng độ apoB bị giảm thông qua luyện tập, thay
đổi chế độ ăn . The Copenhagen City Heart Study đã kiểm tra tính dự đoán
bệnh tim thiếu máu và NMCT ở cộng đồng, cả nam và nữ sử dụng nồng độ
apoB. Nữ với nồng độ apoB cao trên 95mg/dL có tỷ lệ cao nguy cơ bệnh tim
thiếu máu là 1,8 và NMCT là 2,6 so với nữ apoB< 75. Nam tương ứng là 1,9
và 2,4 so với nam apoBL< 76. Hơn nữa, apoB thì tốt hơn LDL-C trong tiên
đoán bệnh tim thiếu máu và NMCT ỏ cả 2 giới [12]. Vài nghiên cứu khác
cũng cho kết quả tương tự với kỳ vọng khả năng dự đoán của apoB cho bệnh
tim thiếu máu [15, 16].


16

1.2. Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (familial
hypercholesterolemia FH)
1.2.1. Lịch sử phát hiện bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình
Vào năm 1938, nhà khoa học Norwegian Dr Carl Muller nhận ra sự liên
hệ giữa tăng nồng độ cholesterol huyết thanh, u vàng ở gân và vữa xơ động
mạch ở các thành viên của một nhóm gia đình và đưa ra giả thuyết đây là một
bệnh di truyền đơn gen. Vào năm 1960, Khachadurian khi nghiên cứu trên
một dòng họ ở Libăng đã mô tả sự khác biệt về kiểu hình giữa dạng đồng hợp

tử và dị hợp tử và khẳng định rằng cấu trúc phả hệ phù hợp với di truyền trội
đơn gen. Cụ thể ông chỉ ra rằng dựa vào nồng độ cholesterol huyết thanh có
thể chia các cá nhân trong dòng họ này thành 3 nhóm: nhóm đồng hợp tử có
nồng độ cholesterol cao gấp 4 lần bình thường, nhóm dị hợp tử cao gấp 2 lần
bình thường và nhóm không bị ảnh hưởng có nồng độ cholesterol bình thường
[17] Vào năm 1964, FH được xác định như là một bệnh di truyền trội trên
NST thường (ADH), và mô tả sự khác biệt về lâm sàng giữa dạng đồng hợp
tử và dị hợp tử [18]. Cùng thời điểm này Fredrickson và cộng sự đã đưa ra giả
thuyết kiểu hình của FH có liên quan với rối loạn chuyển hóa LDL-C. Năm
1970 với sự phối hợp làm việc của Ott và cộng sự, Elston và cộng sự, Berg và
Heiberg đã chỉ ra gen liên quan với kiểu hình FH nằm trên NST 19 [19].
Brown và Goldstein thấy rằng receptor trên bề mặt tế bào có liên quan với
việc thu nhận những mảnh còn lại của LDL lưu hành trong máu [20]. Vào
năm 1986, họ khám phá ra sai sót về phân tử gây FH là do đột biến chức năng
ở gen mã hóa LDLR [21]. Giải thưởng Nobel này đã cung cấp nền tảng cơ sở
cho công tác dự phòng và điều trị hiện tại để làm giảm LDL-C. Tiếp bước
những thành công này nhiều nghiên cứu đã được tiến hành tại nhiều quốc gia
trên thế giới. Và người ta thấy rằng FH là một trong những bệnh di truyền
phổ biến nhất. Tỷ lệ mắc ước tính toàn cầu là 1:300 đến 1:500 (0,2%) ở một


17

vài quần thể tỷ lệ còn cao hơn như: quần thể người Libăng theo đạo Cơ đốc
giáo là 1:85, người Nam Phi gốc Âu: 1:72 tới 1:100, người Tuynidi 1:165,
người Pháp gốc Canada là 1:270 [22]. Tỷ lệ ước tính này tương ứng với
khoảng 13 triệu người khắp thế giới và khoảng 600.000 người Mỹ mắc FH.
Phần lớn những trường hợp mắc là dị hợp tử (được di truyền một đột biến gây
bệnh). Một số nhỏ bệnh nhân là dị hợp tử phức tạp (được di truyền một bản
sao của từng cặp hai đột biến khác nhau), trong khi đó những bệnh nhân đồng

hợp tử FH được di truyền hai đột biến gây bệnh giống nhau. Các đột biến gen
trội gây FH đã được tìm thấy trên gen LDLR, ApoB và PCSK9. Trong đó đột
biến ở LDL-R chiếm trên 80% còn các đột biến gen ApoB và PCSK9 chỉ
chiếm tương ứng khoảng 5,5% và 1,5% các trường hợp FH [23].
Ngoài ra đã phát hiện đột biến lặn gây FH (ARH là dạng đồng hợp tử
về đột biến gen mã hóa cho LDLR adaptor protein 1 (LDLRAP1) [18]. Và
một số dạng hiếm khác của di truyền lặn gây tăng cholesterol máu gồm
sitosterolemia do ATP gắn cassette subfamily G member 5 (ABCG5) hoặc
thiếu hụt ABCG8, và thiếu cholesterol 7 alpha hydroxylase (CYP7A1) là
enzym của bước đầu tiên tổng hợp acid mật dẫn tới nồng độ cholesterol cao
trong tế bào gan và giảm sự hiện diện bề mặt của LDLreceptor [24].
1.2.2. Cơ chế gây bệnh
LDL trong máu có ApoB-100 trên bề mặt. LDL-Repceptor là một
glycoprotein có trên bề mặt tế bào gan và gắn ApoB-100 của LDL-C. Phức
hợp LDL-C và LDL receptor (tạo túi clathrin) được hình thành, cả thụ thể và
chất gắn LDL-C đều được đưa vào trong thể nội bào (endosome) cùng với
những protein khác thông qua tương tác liên quan đến protein chuyển đổi
LDLR (LDLR adaptor protein 1: LDLRAP1). Sau khi phức hợp chất gắn –
thụ thể phân ly, LDLR được tái sử dụng trên màng tế bào, trong khi
cholesterol tự do được sử dụng bên trong tế bào. PCSK9 có vai trò như một


18

chất ức chế LDLR sau phiên mã. Nó được tiết ra ngoài tế bào và ức chế
LDLR thông qua các tương tác trên bề mặt tế bào. Các bằng chứng cũng cho
thấy một con đường nội bào của ức chế LDLR thông qua PCSK9, tuy nhiên
cơ chế cụ thể vẫn chưa được làm sáng tỏ [25]. Điều hòa của nhân đối với sản
xuất LDLR bao gồm 2 con đường. Con đường thứ nhất, việc gắn của protein
gắn yếu tố đáp ứng steroid (steroid response element binding protein:

SREBP) với một yếu tố đáp ứng steroid (steroid response element) trên DNA
sẽ kích thích sự phiên mã của LDLR nhằm đáp ứng với sự giảm nồng độ
cholesterol nội bào [25]. Con đường này được hoạt hóa trong quá trình điều
trị bằng các chất ức chế HMG-CoA Reductase. Con đường thứ hai trong điều
hòa LDLR là một thụ thể của nhân qua trung gian sterol khác (LXR), được
cho thấy làm giảm phiên mã của chất thoái giáng cảm ứng của LDLR
(inducible degrader of the LDLR: IDOL). IDOL kích hoạt sự ubiquitin hóa
của LDLR giúp thoái giáng phân tử này [26]. Con đường này giúp hấp thu
LDL-C trong máu. Bất kỳ thiếu hụt nào trong con đường này cũng tạo ra sai
sót trong quá trình hấp thu và LDL-C tăng cao trong máu, gây nên các triệu
chứng lâm sàng của FH.


19

1.2.3. Một số đặc trưng của FH và tiêu chuẩn chẩn đoán:
Nồng độ Cholesterol toàn phần và LDL-C ở bệnh nhân FH dị hợp tử
trong khoảng 9-14mmol/L và 5-10mmol/L còn ở bệnh nhân đồng hợp tử
khoảng 17-26mmol/L và LDL-C trên 15mmol/L.
LDL lắng đọng ở mô gây ra những biểu hiện lâm sàng của FH như: u
vàng ở gân và dây chằng hay gặp nhất là ở khuỷu tay, gân achille, bàn tay.
Lipid có thể lắng đọng quanh mắt và có thể xuất hiện ở cả giác mạc dẫn tới
lão hóa giác mạc hình vòng cung [18]. Tuy nhiên đặc điểm này ít gặp ở quần
thể người châu Á hơn so với các nơi khác trên thế giới [27]. Quan trọng hơn,


20

lắng đọng LDL-C ở động mạch khi sinh ra là nguyên nhân dẫn tới bệnh tim
mạch từ khi còn trẻ và nhất là bệnh mạch vành trẻ (coronary heart disease

CHD) ở bệnh nhân FH. Trung bình bệnh nhân FH không điều trị có nguy cơ
CHD gấp 20 lần so với nhóm chứng [28]. Với bệnh nhân FH dị hợp tử nếu
không được điều trị hơn 50% bệnh nhân nam đến tuổi 50 tuổi và ít nhất 30%
bệnh nhân nữ đến tuổi 60 tuổi xuất hiện triệu chứng của bệnh mạch vành. Còn
với bệnh nhân FH đồng hợp tử thì sớm hơn trung bình là 20 tuổi [22, 29].
Việc chẩn đoán lâm sàng FH dựa vào sự kết hợp: tiền sử gia đình, dấu
hiệu lâm sàng (đặc biệt là u vàng ở gân) và nồng độ cholesterol máu. Hiện
nay được sử dụng phổ biến trên thế giới là MEDPED của Mỹ (make early
diagnosis to prevent early death) của Anh (Simon Broome), Dutch lipid clinic
của Hà Lan [18]. Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng tiêu chuẩn chẩn
đoán lâm sàng của Simon Broome cụ thể như sau:
- Tiêu chuẩn 1: người trưởng thành (≥ 16 tuổi) cholesterol toàn phần ≥
7,54/ LDL-C ≥ 4,94 hoặc trẻ em có cholesterol toàn phần ≥ 6,76/ LDL-C ≥
4,03 (mmol/L)
- Tiêu chuẩn 2: xét nghiệm DNA tìm thấy đột biến/ u vàng ở bệnh nhân
hoặc ở họ hàng có quan hệ sinh học bậc 1,2 với bệnh nhân.
- Tiêu chuẩn 3: Tiền sử gia đình có người bị NMCT < 50 tuổi trong số
họ hàng có quan hệ sinh học bậc 2 với bệnh nhân / < 60 tuổi trong số họ hàng
có quan hệ sinh học bậc 1 với bệnh nhân.
Hoặc tiền sử gia đình có người có cholesterol như trên trong số họ hàng
có quan hệ sinh học bậc 1,2 với bệnh nhân.
Bệnh nhân có tiêu chuẩn 1+2: khẳng định FH
Bệnh nhân có tiêu chuẩn 1+3: nguy cơ cao bị FH (possible FH ).
Chẩn đoán FH chính xác nhất là phối hợp giữa tiêu chuẩn lâm sàng
và xét nghiệm DNA vì xét nghiệm DNA đối với FH hiện nay không nhạy


21

100% bởi bệnh có thể bị gây ra bởi một đột biến vẫn chưa được đánh giá. Do

đó, không phát hiện thấy đột biến không loại trừ được chẩn đoán FH [30].
Nghiên cứu cho thấy khoảng 15% bệnh nhân FH không có đột biến gen
LDLR, ApoB hay PCSK9 (ước tính thay đổi từ 12% đến 48%) [31]. Ngược
lại, dù sàng lọc đột biến đối với FH có độ đặc hiệu cao, vẫn có thể cho kết quả
dương tính giả do một vài thay đổi trình tự phát hiện được có thể không gây
bệnh [32] [33] [34] [35]. Trường hợp này có thể loại trừ dựa vào tiêu chuẩn
lâm sàng.
1.2.4. Đột biến ở LDL-receptor gây FH:
1.2.4.1. Phân loại
en mã hóa LDL receptor nằm trên nhánh ngắn của NST 19 vùng 13.2
(19p13.2) dài 45kb gồm 18 exon và 17 intron. Chứa 11.089.361 đến
11.133.829 đôi base. Mã hóa cho mARN dài 5,3kb [24]. Đột biến ở gen mã
hóa LDLR là nguyên nhân phổ biến nhất gây FH (chiếm khoảng 80%). Hiện
nay, trên 1700 đột biến ở gen LDL-R đã được phát hiện. Ban đầu một số thiếu
hụt đầu tiên ở LDLR có đặc trưng là các mất đoạn lớn được xác định bằng
Southern blooting. Sau đó với sự ra đời của các phương pháp mới và đơn giản
hơn trong việc chỉ ra những thay đổi nhỏ (thay đổi ở 1 base của gen) như:
PCR định lượng (MLDPA), giải trình tự tự động trực tiếp các sản phẩm PCR,
DGGE-PCR(denaturing gradient gel electrophoresis) hoặc SSCP (single
strand conformational polymorphism)...ngày càng nhiều đột biến ở LDLR
được chỉ ra. Bao gồm: sắp xếp lại đoạn lớn, codon kết thúc sớm, thay thế 1a.a,
đột biến ở vùng promotor tác động đến sự sao chép gen, đột biến ảnh hưởng
đến sự kéo dài của pre-mARN. Điều thú vị là các đột biến của LDLR mà ảnh
hưởng đến chức năng của nó trải dài suốt chiều dài của gen và hầu hết mỗi
thay thế amino acid đơn mà đã được tìm thấy đều có tác động có hại lên chức
năng của receptor [17]. Đột biến ở LDLR chia làm 5 loại chính:


22

- Loại 1: đột biến gen LDLR dẫn tới không tổng hợp được receptor LDL.
Người dị hợp tử chỉ sản xuất được một nửa số receptor LDL.
- Loại 2: vẫn tổng hợp được receptor LDL nhưng những receptor này
không thể rời khỏi lưới nội sinh chất để tới bộ Golgi để thể hiện trên bề mặt
tế bào và sẽ bị giáng cấp
- Loại 3: đột biến dẫn tới sản xuất LDL bất thường: có thể di chuyển tới
bề mặt tế bào nhưng không thể gắn với LDL
- Loại 4: hiếm, LDLR tổng hợp được nhưng không tới được lõm áo ở bề
mặt màng tế bào do đó không vận chuyển được LDL vào trong tế bào.
- Loại 5: LDLR khi vào trong tế bào không tách được LDLR do đó
không thể quay trở lại màng tế bào và bị giáng cấp{Soutar, 2006 #14}{Paul
N. Hopkins, 2011 #13}
1.2.4.2. Cơ chế bệnh sinh
Những tế bào của người bình thường thu nhận cholesterol từ quá trình
tổng hợp cholesterol nội sinh trong tế bào và thu nhận cholesterol từ ngoài vào
trong chế độ ăn. Ở người bình thường nồng độ cholesterol trong tế bào đủ sẽ
tác động ức chế (feedback repression) tổng hợp LDLR và giảm tổng hợp
cholesterol nội sinhl. LDL-C vào trong tế bào phải được receptor LDL tiếp
nhận. LDLR là một glycoprotein có trên bề mặt tế bào gan và gắn ApoB-100
của LDL-C. Phức hợp LDL-C và LDL receptor (tạo túi clathrin) được hình
thành, cả thụ thể và chất gắn LDL-C đều được đưa vào trong thể nội bào
(endosome) cùng với những protein khác thông qua tương tác liên quan đến
protein chuyển đổi LDLR (LDLR adaptor protein 1: LDLRAP1). Sau khi phức
hợp chất gắn – thụ thể phân ly, LDLR được tái sử dụng trên màng tế bào, trong
khi cholesterol tự do được sử dụng bên trong tế bào. Sai sót trong cấu trúc của
LDLR dẫn tới giảm vận chuyển LDL-C vào trong tế bào làm tăng nồng độ
LDL-C trong huyết thanh và gây nên các triệu chứng lâm sàng của FH.


23

1.2.4.3. Ảnh hưởng của loại đột biến lên kiểu hình
Kiểu hình lâm sàng của FH rất thay đổi và ban đầu giả thiết rằng sự
thay đổi này phụ thuộc vào mức độ hoạt động còn lại của hoạt động của LDLr có liên quan với mỗi phần của allen đột biến. Mặc dù bệnh nhân FH đồng
hợp tử với vài chức năng của LDLr vẫn còn thì ít ảnh hưởng trầm trọng lên
lâm sàng hơn là những người không thể phát hiện hoạt động của LDL-r, khi
đủ số lượng bệnh nhân để nghiên cứu mối liên quan này dường như không
đúng với bệnh nhân dị hợp tử trưởng thành, bất chấp nhiều nỗ lực để chứng
minh [36]. Trẻ con FH dị hợp với kiểu gen null tuy nhiên lại có nồng độ
LDL-C cao hơn, lớp áo trong của động mạch cảnh dày hơn những trẻ đột biến
thiếu hụt receptor, nó chỉ ra rằng chúng có thể hưởng lợi từ việc điều trị tích
cực hơn bắt đầu từ thời thơ ấu [37]. Hơn nữa kiểu hình lâm sàng của những
người mang đột biến apoB Arg3500Gln cũng rất khác nhau bất chấp sự có
mặt của cùng alen đột biến. Đột biến mất đoạn của PCSK9 dẫn tới rất nhiều
nồng độ LDL-C khác nhau ở những cá thể bị ảnh hưởng từ nhẹ đến nặng. Hầu
hết những cá thể bị ảnh hưởng nặng là những cá thể mang đột biến Asp374Tyr
[38].
Chỉ 1 hoặc 2 đột biến LDLr có thể được xem là nhẹ (tất cả những người mang
đột biến có cholesterol máu tăng nhẹ hơn hầu hết những bệnh nhân FH [39].
Với tất cả những bệnh nhân FH khác gây ra bởi sự thiếu hụt LDLR, môi
trường, hoặc yếu tố di truyền khác dường như quan trọng hơn loại đột biến
được xác định là kiểu hình trầm trọng [40]. Chúng thường là những yếu tố
tương tự mà dẫn đến CHD ở quần thể chung (thuốc lá, nồng độ HDL-C thấp,
giới tính nam, tuổi cao). Nghiên cứu của chúng tôi về những bênh nhân FH
Trung Quốc dị hợp tử [69]. Chúng tôi thấy rằng những bệnh nhân được di cư
tới Canada thì cholesterol máu tăng trầm trọng và có nguy cơ CHD như
những bệnh nhân FH khác, ngược lại người giống hệt họ vẫn sống ở Trung


24

quốc không có CHD và cholesterol máu tăng nhẹ. Nhiều allen đột biến LDLr
giống nhau và phân tích haplotype chỉ ra rằng họ có thể được di truyền từ tổ
tiên chung. Vì vậy, sự khác nhau về nguy cơ tim mạch phải do sự khác nhau
về môi trường [41].
Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để chỉ ra rằng sự thay đổi ở các locus
gen khác nhau có thể ảnh hưởng đến kiểu hình lâm sàng FH ở bệnh nhân đột
biến LDLr, nhưng hầu hết trong số này chưa kết luận được vì mới một số nhỏ
bệnh nhân được nghiên cứu. Mặc dù tồn tại nhiều đột biến, có thể là nhiều
trong số này sẽ là các allen hiếm mà có thể có ảnh hưởng rõ lên một dòng họ
nhưng có thể không nhanh chóng có thể phát hiện được trong nhóm bệnh
nhân FH do tính đa hình ở một nucleotid đơn liên quan với nghiên cứu. Tất
nhiên, cũng có thể có những allen tương tác với yếu tố môi trườngđể ảnh
hưởng lên kiểu hình, nhưng ví dụ thì vẫn chưa tìm thấy.
1.2.4.4. Một số đột biến LDLR
1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong
phát hiện đột biến gen
Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật
để xác định kiểu gen. Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiên
cứu như kỹ thuật RFLP- PCR (Restriction fragment length polymorphismsPCR: kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn ADN do enzyme giới hạn tạo nên),
ASP-PCR (Allen specific- PCR: phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu allen),
Taqman, Real-Time multiplex PCR, giải trình tự gen trực tiếp (Sequencing).
Trong đó RFLP-PCR là phương pháp có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản và
giá thành rẻ, được áp dụng rộng rãi trong các labo sinh học phân tử ở Việt
Nam. Bởi vậy, trong phạm vi của đề tài tôi xin trình bày những nét chính của
kỹ thuật RFLP-PCR, là kỹ thuật liên quan đến việc xác định kiểu gen LDL
receptor trong nghiên cứu này. Sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp giải


25

trình tự gen. Kỹ thuật PCR-RFLP được tiến hành dựa trên cơ sở khuếch đại
đoạn gen nghi ngờ mang đột biến bằng kỹ thuật PCR.
1.3.1. Kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA
polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA
khuôn, với nguyên liệu là 4 loại nucleotide tự do. Phản ứng này đòi hỏi sự có
mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của
trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm 3 bước như sau:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch
phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA
được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,
thường là 940C-950C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
-Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 400C- 700C, tùy
thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30giây đến 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extention). Nhiệt độ được
tăng lên 720C để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq
polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase...) hoạt động xúc tác quá trình
tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch
đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm khuôn mẫu để tổng hợp các đoạn DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.
Sản phẩm của phản ứng PCR là các đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài xác
định là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm
được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của 2 đoạn gen mồi{Văn, 2010 #54}.
1.3.2. Kỹ thuật PCR-RFLP