NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO BẠC CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS PHÂN LẬP TỪ PHÂN CHIM CÚT

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

PHAN PHƯỚC THANH THUẬN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO BẠC CỦA
CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS PHÂN LẬP TỪ
PHÂN CHIM CÚT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS. ĐOÀN THỊ VÂN

Đà Nẵng, Tháng 04 năm 2019

1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kì công trình nào khác.
Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018
Tác giả luận văn

PHAN PHƯỚC THANH THUẬN

2

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến TS. Đoàn Thị Vân đã tận tình hướng dẫn,
trực tiếp truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thiện được khóa luận tốt nghiệp,
cũng như cô đã luôn tìm kiếm cơ hội để nhóm nghiên cứu vi sinh chúng em nâng cao được kiến
thức và kỹ năng nghề nghiệp sau này. Cảm ơn cô đã động viên em trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận.
Xin cảm ơn TS. Phạm Thị Mỹ (giáo viên chủ nhiệm), ThS. Lê Thị Mai (cán bộ quản lý
phòng thí nghiệm vi sinh) cùng các thầy cô ở Khoa Sinh – Môi Trường, Đại học Sư Phạm – Đại
học Đà Nẵng đã giúp đỡ em trong quá trình thực nghiệm đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong nhóm nghiên cứu vi sinh ứng dụng, đã
hỗ trợ nhiệt tình trong suốt thời gian qua. Cảm ơn tập thể lớp 15CNSH, bạn bè và gia đình đã
động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện

Phan Phước Thanh Thuận

3


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................................................ 9
1.

Đặt vấn đề .................................................................................................................................................. 9

2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................................................................. 10
3. Ý nghĩa của đề tài........................................................................................................................................ 10
3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................................................... 10

3.2. Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................................................................... 10
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................................................ 11
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ NANO VÀ NANO BẠC ................................................................. 11
1.1.1. Vật liệu nano ...................................................................................................................................... 11
1.1.2. Hạt nano bạc ...................................................................................................................................... 12
1.1.3. Một số ứng dụng của nano bạc ........................................................................................................ 15
1.1.4. Các phương pháp chế tạo nano bạc................................................................................................. 16
1.2. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ BACILLUS LICHENIFORMIS ................................................................ 19
1.2.1. Phân loại khoa học vi khuẩn Bacillus licheniformis ....................................................................... 19
1.2.2. Đặc điểm phân bố.............................................................................................................................. 20
1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa ............................................................................................................ 20
1.2.4. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................................................. 20
1.2.5. Cơ chế tổng hợp nano bạc và nhận diện nano bạc ......................................................................... 21
1.3. Một số nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc từ vi sinh vật ở trong nước và trên thế giới .................. 24
1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới ....................................................................................................... 24
1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước ......................................................................................................... 24
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 25
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu........................................................................................................... 25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................................................ 25
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu........................................................................................................................... 25
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................................................ 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................................................ 26
2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................................................................... 26
2.3.2. Phương pháp thu mẫu và phân lập ................................................................................................. 27
2.3.3. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử .................................. 27

4


2.3.4. Phương pháp phá vỡ tế bào vi khuẩn.............................................................................................. 27

2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc của Bacillus
licheniformis................................................................................................................................................. 28
2.3.6. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis ........................................ 28
2.3.7. Phân tích phổ tử ngoại và phổ khả kiến (UV – Vis) ....................................................................... 28
2.3.8. Phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD).......................................................................................... 28
2.3.9. Phân tích kích thước hạt và hình dạng hạt nano bạc tạo thành thông qua kính hiển vi điện tử
truyền qua (TEM) ....................................................................................................................................... 28
2.3.10. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc .......................................................... 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ....................................................................................................... 30
3.1. Phân lập, định danh vi sinh vật .............................................................................................................. 30
3.1.1. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn trong phân chim cút đã ủ hoai .......................................... 30
3.2. Khảo sát thời gian đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc ................................................................... 35
3.2.1. Phân tích phổ tử ngoại và phổ khả kiến (UV – Vis) ....................................................................... 35
3.3. Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) ................................................................................................ 38
3.4. Kết quả phân tích kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) .................................................................. 38
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc ............................. 32
3.5.1. Kết quả kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán qua giếng thạch ....................................... 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................ 40
1. Kết luận ........................................................................................................................................................ 40
2. Kiến nghị ...................................................................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................................. 42

5


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Abs

Absorbance

CT

Công thức

LB

Luria – Bertani

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

PTN

Phòng thí nghiệm

UV – Vis

Ultraviolet – Visible

TEM

Transmission Electron Microscopy

XRD

X-ray diffraction

6


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Kí hiệu bảng

Tên bảng

2.1

Bố trí các lô thí nghiệm

3.1

Đường kính vòng kháng khuẩn gây ra bởi Nano Bạc tổng hợp
ở nồng độ 1mM AgNO3 (Đơn vị: mm)

3.2

Đường kính vòng kháng khuẩn gây ra bởi Nano Bạc tổng hợp
ở nồng độ 2mM AgNO3 (Đơn vị: mm)

3.3

Vị trí đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch nano
bạc tổng hợp từ CT3

3.4

Vị trí đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch nano
bạc tổng hợp từ CT2

7

Trang


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu

Tên hình ảnh

Trang

8


MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, khoa học và công nghệ nano đang phát triển mạnh mẽ, đó là

một trong những công nghệ tiên tiến hiện nay với rất nhiều lĩnh vực được ứng dụng trong y học,
điện tử, nông nghiệp, xử lý môi trường,... Với kích thước nano mét các loại vật liệu nano có thể
can thiệp điến từng phân tử - nguyên tử, điều này đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng
công nghệ nano trong Y – Sinh học.
Bạc là một trong những kim loại có tính sát khuẩn mạnh, từ lâu con người đã biết ứng

dụng nó, và hiện nay thì công nghệ nano bạc đóng vai trò khá quan trọng trong các nghiên cứu
về vật liệu nano. Nghiên cứu chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ 1 đến 100 nm), hoạt tính sát
khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1 gam bạc nano có thể
sát khuẩn cho hàng trăm mét vuông chất nền [4]. Điều này sẽ làm cho khối lượng bạc sử dụng
trong các sản phẩm sẽ giảm mạnh, nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể.
Nano bạc có tính kháng khuẩn mạnh, vô hiệu hóa hầu như tất cả các enzyme cần thiết cho sự
trao đổi oxy của vi khuẩn và tiêu diệt chúng trong vài phút, ngoài ra các hạt bạc với kích thước
nhỏ chui vào trong tế bào, kết hợp với các enzyme hay DNA có chứa nhóm sunfua hoặc
photphate gây bất hoạt enzyme hay DNA dẫn đến gây chết tế bào. Nano bạc không gây tác dụng
phụ, không gây độc cho con người và vật nuôi khi nhiễm lượng bạc bằng nồng độ diệt khuẩn
(khoảng nồng độ nhỏ hơn 100ppm), không gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy nano bạc đang được
ứng dụng rộng rãi. Trong nông nghiệp, ứng dụng công nghệ nano bạc đang được nhiều quốc gia
xem là một hướng để phát triển một nên nông nghiệp hiệu quả, kinh tế và an toàn hơn, phòng
trị các bệnh do vi khuẩn, vi rút, nấm, gây ra trên cây trồng, vật nuôi, bảo quản nông sản. Trong
ngành may mặc, nano bạc có thể ứng dụng để tạo ra các loại quần áo có khả năng diệt khuẩn, vi
khuẩn gây mùi hôi, mốc... Đặc biệt, nghiên cứu tổng hợp nano bạc để phục vụ cho các ứng dụng
trong y học, nhất là hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như hiện nay.
Có nhiều phương pháp để tổng hợp nano bạc, trong đó các phương pháp hóa học, vật lý,
hóa lý kết hợp thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu tư tốn kém, giá thành
cao lại khó sản xuất rộng rãi. Vì vậy, tổng hợp nano bạc bằng con đường sinh học đang là một

9


xu hướng mạng tính tất yếu. Phương pháp tổng hợp này tạo ra các hạt nano bạc tiêu chuẩn về
kích thước và phân bố tốt hơn so với các phương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất
với qui mô lớn. Các hạt nano cũng có thể được ổn định ngay trong quá trình sản xuất bởi các
polymer sinh học. Ở Phương pháp sinh học thì tác nhân chính sinh tổng hợp nano bạc chính là
các vi nấm, vi khuẩn. Với thời gian sinh trưởng ngắn, quá trình sinh tổng hợp tạo ra kích thước
hạt nhỏ và đồng đều, không tốn dung môi hóa học và không gây ảnh hưởng môi trường nên các

loài vi nấm hay vi khuẩn là đối tượng đang được nghiên cứu. Trong đó, Bacillus licheniformis
là vi khuẩn có khả năng sinh trưởng ở phổ nhiệt cao và môi trường nuôi cấy thông thường, nó
là vi khuẩn được ứng dụng trong công nghiệp khi sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào chịu nhiệt
như protease, amylase, lipase...v.v. Như vậy B. licheniformis có
Nhằm tiếp cận với phương pháp và xuất phát từ những lý luận, thực tiễn nêu trên, tôi tiến
hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nano bạc của chủng vi khuẩn
Bacillus licheniformis phân lập từ phân chim cút”.
2. Mục tiêu đề tài
Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis từ phân chim cút.
Đánh giá khả năng sinh tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus licheniformis phân lập
được.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên,
kĩ thuật viên về loài Bacillus licheniformis được định danh, cũng như khả năng tổng hợp nano
bạc từ loài Bacillus licheniformis.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Thành công của khóa luận sẽ xác định được một số điều kiện sinh tổng hợp nano bạc từ
vi khuẩn Bacillus licheniformis có ý nghĩa trong việc ứng dụng tạo nên các vật liệu, sản phẩm
nano bạc phục vụ trong các ngành y học, nông nghiệp, điện tử, môi trường,...v.v.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ NANO VÀ NANO BẠC
1.1.1. Vật liệu nano
Khoa học nano là khoa học nghiên cứu vật chất ở kích thước cực kì nhỏ bé – kích thước
nanomet (nm), một nanomet bằng một phần tỉ của mét (m) hay bằng một phần triệu của milimet
(mm). Công nghệ nano là các công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo, ứng dụng

các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước ở quy mô nanomet
(từ 1 – 100nm). Vật liệu nano là đối tượng của hai lĩnh vực khoa học nano và công nghệ nano.
Năm 1959, khái niệm về công nghệ nano được nhà vật lý người Mỹ Richard Feynman
nhắc đến khi ông đề cập đến khả năng chế tạo vật chất ở kích thước siêu nhỏ đi từ quá trình tập
hợp các nguyên tử, phân tử. Những năm 1980, nhờ sự ra đời của hàng loạt các thiết bị phân tích,
trong đó có kính hiển vi đầu dò quét (SEM hay TEM) có khả năng quan sát đến kích thước vài
nguyên tử hay phân tử, con người có thể quan sát và hiểu rõ hơn về lĩnh vực nano.
Phân loại vật liệu nano
Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám nano, hạt
nano.
Vật kiệu nano một chiều là vật liệu trong đó có một chiều tự do, hai chiều có kích thước
nano, ví dụ dây nano, ống nano.
Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều tự do, một chiều có kích thước nano,
ví dụ màng mỏng (có chiều dày kích thước nano).
Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một phần
của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một chiều, hai chiều
đan xen lẫn nhau.

11


Hạt nano kim loại
Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạo thành từ
các kim loại. Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp chế tạo và hiểu
được các tính chất thú vị của hạt nano. Một trong những tính chất đó là màu sắc của hạt nano
phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [3].
Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng. Tuy nhiên, ánh sáng
truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sâng màu da cam khi kích thước hạt thay
đổi. Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do một hiệu ứng gọi là cộng hưởng plasmon bề
mặt. Chỉ có các hạt nano kim loại, trong đó các điện tử tự do mới có hấp thụ ở vùng ánh sáng

khả kiến làm cho chúng có hiện tượng quang học trên [13].
1.1.2. Hạt nano bạc
Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm. Bạc nano
thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer (polyvinylalcol PVA,
polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để các hạt nano bạc không bị kết tụ. Bạc ở
kích thước nano có những đặc trưng rất khác so với bạc bình thường. Đó là một kháng sinh tự
nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm. Tính chất kháng khuẩn
của dung dịch keo nano bạc đã được tìm hiểu một cách khoa học vào đầu thế kỉ 20, Nhưng sự
phát minh ra thuốc kháng sinh đã ngăn cản những nghiên cứu sâu trong lĩnh vực này. Những
năm gần đây, do công nghệ nano phát triển và do các kháng sinh càng ngày càng bị lờn với vi
khuẩn, nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trrong lĩnh vực Y sinh học được quan tâm nghiên
cứu và phát triển mạnh mẽ [13].

12


Nhìn chung, nano bạc có những đặc điểm đáng quan tâm sau đây:
Diệt trên 650 loại vi khuẩn
Hiệu quả cao
Tác dụng nhanh
Không độc
Không kích thích
Không gây dị ứng
Tính kháng khuẩn của nano bạc được giải thích theo một số cơ chế sau:
Với tính chất xúc tác, nano bạc vô hiệu hóa các enzyme mà vi khuẩn và nấm cần cho quá
trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến rối loạn quá trình biến dưỡng của vi khuẩn. Tác động này
làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh chóng [9].
Hạt nano bạc liên kết với các nhóm chứa phospho trong phân tử DNA làm rối loạn quá
trình sao chép DNA làm chết vi khuẩn [11].
Các hạt nano bạc tương tác với nhóm –SH của các protein, enzyme trên màng tế bào dẫn

đến sự thay đổi hình thái và gia tăng tính thấm của màng. Sự vận chuyển vật chất qua màng tăng
làm vỡ màng tế bào của vi khuẩn [11].
Nano bạc giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong nước hoặc không khí tương tác với
các lipid màng làm tổn thương màng [11].

13


Hình 1.1 Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc
Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1nm – 100nm), Diện tích bề mặt tổng cộng của nano bạc
rất lớn và hiệu quả hoạt động của nano bạc tăng đáng kể so với hạt bạc có kích thước lớn hơn
(micro). Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có kích thước lớn và với ion. Theo tính
toán lý thuyết nano bạc có hoạt tính mạnh hơn ít nhất 40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung
dịch keo bạc thông thường. Vì vậy, người ta có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả
tương đương. Điều này rất có ý nghĩa vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một
người chỉ có thể dùng tối đa 350 µg/ liều dùng mỗi ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria
hay còn gọi là trúng độc bạc. Nếu dùng 1 đến 2 muỗng cà phê/ngày (20ppm) tương đương 100
– 200 μg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc trong nguồn nước cung
cấp ở Mỹ), ta sẽ có hiệu quả phòng bệnh rất tốt. Điều này đảm bảo cho người dùng có thể sử
dụng nano bạc như một chất bổ sung trong bữa ăn hay trong nước uống mà không bị hiện tượng
Argyria [13].
Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khỏe con người, các nhà khoa học cho rằng nano
bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con người có được là do các vi khuẩn có lợi cho

14


cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng có thể diệt các vi khuẩn này và ảnh
hưởng đến sức khỏe. Tuy nhiên cho đến nay chưa thấy công trình nào công bố sự tác hại của
nano bạc. Các nghiên cứu tại Odense Universitets Hospital [13] cũng đã chứng minh rằng các

hạt nano bạc được hấp thu vào trong cơ thể mà không hề gây ra một tác dụng phụ nào cúng như
gây độc cho cơ thể. Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải phóng ra
cơ thể theo thời gian [13]. Các hãng sản xuất những sản phẩm chức nano bạc chẳng hạn như
Samsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử nghiệm và cho đến nay họ vẫn khẳng
định tính an toàn của nó đói với sức khỏe của người sử dụng [3].
1.1.3. Một số ứng dụng của nano bạc
Trong y học
Một số sản phẩm chứa nano bạc như khăn ăn, khăn vệ sinh khô cho cả bé lẫn người lớn,
băng đắp bỏng, đắp vết thương, găng tay, quần áo dùng trong y tế với khả năng diệt khuẩn cao
tới 99%.
Hãng dược phẩm Nucryst ở Fort Saskachevan, Alberta (Canada) đã đưa bạc nano vào
miếng băng gạc để băng những vết loét do bỏng vì chúng có tác dụng diệt khuẩn mạnh hơn so
với hạt bạc bình thường.
Trong công nghiệp
Bạc nano được đưa vào các polymer như polyethylene (PE), polypropylene (PP) có khả
năng giết chết nhiều loại vi khuẩn: tụ cầu khuẩn vàng, Bacillus pneumoniae, E.coli... Ứng dụng
của việc phân bố nano trong các chất dẻo, polymer, hiện nay người ta đã sản xuất các mặt hàng
tiêu dùng có tính kháng khuẩn chứ các hạt nano bạc như tủ lạnh; máy điều hòa; máy giặt, trong
máy giặt công nghệ nano bạc tạo thành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi
nước, cách làm trên vừa ít hao tốn điện năng những vẫn đảm bảo hiệu quả; ngoài ra còn ứng
dụng vào bình sữa cho trẻ sơ sinh; hộp đựng thực phẩm...v.v.
Hãng Mummybear (Hàn Quốc) gần đây đã giới thiệu công nghệ Nano Silver được ứng
dụng vào sản xuất bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ. Những sản phẩm này đã được bộ

15


y tế, Viện dinh dưỡng, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, Vinacontrol cấp chứng nhận tiêu chuẩn
sản phẩm và chất lượng.
Ngoài ra, ngày nay người ta còn ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm như nước rửa

rau, các loại sơn, mỹ phẩm,...v.v.
Trong nông nghiệp
Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây MIFUM 0,6 DD được sản xuất với nồng độ hạt nano bạc
1000ppm và chitosan 5000ppm. MIFUM 0,6 DD được khảo nghiệm trừ bệnh đạo ôn, lem lép
hạt trên lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng và đã được chứng tỏ ưu việt của mình, cả 2 liều lượng
0,5 lít MIFUM 0,6 DD và 1 lít MIFUM 0,6 DD/ha đều cho hiệu quả cao trong việt phòng trừ
bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt trên lúa, nhất là trong giai đoạn 3 – 7 ngày sau khi phun.
Trong công nghệ xử lý nước
Việc sử dụng nano bạc trong công nghệ xử lý nước khá mới mẻ. Do bề mặt riêng khá
lớn, hạt nano bạc có hoạt tính khá cao trong vấn đề xử lý nước nhiễm khuẩn và đã được khá
nhiều nhà khoa học nghiên cứu [10]. Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano đã sử dụng vật liệu
polyurethane mút xốp tẩm nano bạc (PU/Ag) để xử lý nước uống nhiễm khuẩn E.coli. Nước qua
hệ thống lọc PU/Ag không còn vi khuẩn và uống được theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) [5].
1.1.4. Các phương pháp chế tạo nano bạc
Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phương pháp từ
trên xuống. Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc các nguyên tử kết hợp lại
với nhau. Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật liệu nano từ vật liệu khối ban đầu.
Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim,... thì phương pháp thường
được áp dụng là phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là khử các ion kim loại như Ag+, Au+ để
tạo thành các nguyên tử Ag và Au. Các nguyên tử sẽ liên kết với nhau tạo ra hạt nano. Các
phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn nhưng thời gian gần đây đã có những bước tiến
trong việc nghiên cứu theo phương pháp này.

16


Phương pháp khử hóa học
Trong phương pháp này, ion Ag+ dưới tác dụng của chất khử sẽ tạo ra nguyên tử Ag0,
sau đó các nguyên tử này kết hợp với nhau tạo thành các hạt nano bạc [2].

Các tác nhân hóa học có thể sử dụng là: NaBH4, sodium citrate, citric acid, EDTA,
ethanol, ethylene glycol, hydrogen, hydrogen peroxid, hydroxylamine, hydrazine, formaldehyde
và các dẫn xuất của nó [1]...v.v.
Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta sử dụng
phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng
phương pháp bao bọc chất hoạt động bề mặt. Phương pháp tĩnh điện đơn giản nhưng bị giới hạn
bởi một số chất khử. Phương pháp bao phủ phức tạp nhưng vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp
này có thể làm cho bề mặt hạt nano có các tính chất cần thiết cho các ứng dụng. Các hạt nano
Ag, Au, Pt, Pd, Rh với kích thước từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này.
Phương pháp khử vật lý
Phương pháp này sử dụng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao
như tia gamma, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia laser, tia UV để khử ion Ag+ thành nguyên tử
Ag0 [12]. Dung dịch muối bạc không có thêm chất phụ gia nào khác có thể được chiếu bằng
phương pháp chiếu xạ với bức xạ năng lượng cao, quá trình này tạo ra các electron hydrate hóa
và hydro nguyên tử có khả năng khử bạc ion.
Phương pháp khử hóa lý
Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật lý. Nguyên lý là dùng phương pháp
điện phân kết hợp với sóng siêu âm để tạo hạt nano. Phương pháp điện phân thông thường chỉ
có thể tạo được màng mỏng kim loại. Trước khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử kim
loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bám lên điện cực âm. Lúc này người ta tác dụng
một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi
vào dung dịch[2].
Phương pháp khử sinh học

17


Phương pháp sinh học sử dụng các tác nhân như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm có khả năng
khử ion bạc tạo nguyên tử bạc kim loại.
Từ lâu người ta đã biết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc giữ vai trò quan

trọng trong việc xử lý các độc tố kim loại nhờ khả năng khử các ion kim loại. Sastry và cộng sự
[10] đã nhận thấy có sự hình thành các hạt nano vàng khi cho loài nấm Verticillum sp tiếp xúc
với ion vàng. Klaus và cộng sự [7] cũng đã chứng minh được có sự hiện của nano bạc trong
vùng chu chất của Pseudomonas stutzeri AG259 khi cho vi khuẩn này tiếp xúc với dung dịch
bạc nitrate. Tuy nhiên việc áp dụng đặc tính khử kim loại để biến vi sinh vật thành các nhà máy
sản xuất các hạt nano kim loại chỉ mới được quan tâm đến trong thời gian gần đây [8].
Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: thiết bị nuôi cấy đơn giản, môi trường nuôi cấy
rẻ tiền, không phụ thuộc nhiều vào hóa chất và thiết bị đắt tiền, dễ thực hiện, thân thiện với môi
trường do không sử dụng các hóa chất độc hại. Ngoài ra nó có thể áp dụng với quy mô sản xuất
lớn mà chi phí đầu tư ban đầu lại rất thấp. Vì vậy, các nhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến
các phương pháp sinh tổng hợp. Phương pháp sinh tổng hợp tạo ra các hạt nano bạc có độ phân
bố khá đồng đều và có khả năng sản xuất với qui mô lớn do các hạt được ổn định ngay trong
quy trình sản xuất bởi các protein.
Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc:
Nấm: Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus
flavus, Phaenerochaete chrysosporium, Penicillium fellutanum, Verticillium sp…v.v.
Vi khuẩn: Pseudomonas stutzeri,, Lactobacillus sp, Bacillus licheniformis, Bacillus
subtilis, Klebsiella pneumonia…v.v.
Xạ khuẩn: Rhodococcus sp, Thermomonospora…v.v.
Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở vi sinh vật vẫn chưa được tìm hiểu tường tận
nhưng đa số giả thuyết cho rằng quá trình này liên quan đến hoạt động của enzyme khử nitrate
(nitrate reductase) do vi sinh vật tiết ra. Quá trình khử bắt đầu bởi sự vận chuyển electron từ các
chất cho electron đến Ag+ để khử các ion Ag+ tạo thành các nguyên tử Ag. Các enzyme phụ

18


thuộc NADH như nitrate reductase đóng vai trò chất vận chuyển điện tử. Bên cạnh các enzyme
này, một số naphthoquinone và anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể
đóng vai trò chất truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa khử đặc trưng

của chúng [7], [17].
Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta chia quá trình
tổng hợp sinh học thành hai dạng:
Tổng hợp nội bào: sản phẩm nano bạc tạo ra nằm bên trong tế bào. Các chủng vi sinh vật
có khả năng tổng hợp nano bạc nội bào là Psedomonas stutzeri [8], Rhodococcus sp, Verticillium
sp, Bacillus licheniformis [19]...
Vì sản phẩm nano bạc tạo ra nằm trong tế bào nên để nhận được sản phẩm cần phải phá
vỡ màng tế bào bằng hóa chất hoặc sóng siêu âm, sau đó ly tâm tách bỏ các mãnh vỡ tế bào.
Theo S.Basavaraja [18] ưu điểm của quá trình này là có thể kiểm soát được kích thước hạt nano
bạc.
Tổng hợp ngoại bào: sản phẩm được tạo ra nằm bên ngoài tế bào vi sinh vật. Các chủng
Fusarium oxysporum [7], Fusarium semitectum [18], Aspergillus fumigatus [8], Aspergillus
flavus [15], Phaenerochaete chrysosporium [18], Lactobacillus sp [22], Penicillium
fellutanum [23],… tổng hợp nano bạc theo kiểu này.
Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng các phương pháp tách tế bào ra khỏi dịch
nuôi cấy như ly tâm, lọc… sau đó thu lấy phần dịch nổi.
Theo tài liệu [18], ưu điểm của quá trình này là không cần đến các phương pháp phá
màng tế bào để thu nhận sản phẩm.
1.2. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ BACILLUS LICHENIFORMIS
1.2.1. Phân loại khoa học vi khuẩn Bacillus licheniformis
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes

19


Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus

Loài: Bacillus licheniformis
1.2.2. Đặc điểm phân bố
Bacillus licheniformis là vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất. Nó được tìm thấy trên
lông chim, đặc biệt là ngực và lưng bộ lông, và thường xuyên nhất trong các loài chim ở trên
mặt đất và các loài chim thủy sinh. B. licheniformis còn được tìm thấy và phân lập ở các suối
nước nóng [18].
1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa
Hình thái: Là vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng di động và khả năng
Tạo nội bào tử (endospore) [18] gần như hình cầu giúp nó tồn tại trong thời gian dài khi
gặp điều kiện sống khắc nghiệt.
Bộ gen: Có chiều dài là 4,22Mb chứa khoảng 4200 gen mã hóa cho 4192 protein [17].
Đặc điểm sinh hóa: B. licheniformis cho phản ứng catalase dương tính, sử dụng khí oxy
làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Có thể tổng hợp một lượng
lớn enzyme amylase và protease [1]. Có khả năng gây ngộ độc thực phẩm với các triệu chứng
như: đau bụng, tiêu chảy, nôn mữa [7].
1.2.4. Đặc điểm nuôi cấy
Là vi khuẩn chịu nhiệt có thể sống ở nhiệt độ 55oC, pH thích hợp cho sự phát triển là
pH=7.
Không giống với các thành viên khác trong chi Bacillus là các vi sinh vật hiếu khí,
Bacillus licheniformis là vi sinh vật kị khí tùy ý.

20


Sau 18 – 20 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt môi trường. Bacillus
licheniformis dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, khuẩn lạc có màu trắng đục,
lồi, bề mặt sần sùi.
Vi khuẩn này thường được sử dụng trong công nghiệp chất tẩy, bột giặt, xử lý nước thải
do có khả năng tiết enzyme protease, amylase ngoại bào, ngoài ra còn được dùng làm thuốc trừ
nấm bệnh trên cây trồng.

1.2.5. Cơ chế tổng hợp nano bạc và nhận diện nano bạc
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp
nano bạc nội bào khi cho nó tiếp xúc với dung dịch muối nitrate bạc [19].
Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở loài này vẫn chưa được xác định cụ
thể. Nhưng theo nhóm tác giả [19] thì B. licheniformis có khả năng tổng hợp NADH
và các enzyme phụ thuộc vào NADH ở bên trong tế bào của nó, trong đó quan trọng
nhất là enzyme nitrate reductase (enzyme khử nitrate). Enzyme này có vai trò khử
gốc NO3- và vận chuyển electron từ chất cho electron là NADH đến chất nhận là Ag+
để khử Ag+ thành Ag0.

Hình 1.2 Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn Bacillus licheniformis

21


Phương pháp phổ tử ngoại và phổ khả kiến UV – Vis
Phương pháp này dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết cấu trúc các
chất, phân tích hỗn hợp xác định khối lượng phân tử, dự đoán kích thước phân tử…, khi tiến
hành đo phổ của các mẫu thì mỗi mẫu sẽ cho ta một dạng phổ có chiều cao đỉnh phổ xác định
và đặc trưng cho dạng hợp chất đó. Do vậy khi đo phổ hấp thu của dung dịch bạc nano ta sẽ thu
được dạng phổ có đỉnh với chiều cao lớn nhất ứng với bước sóng khoảng 380 - 450 nm. Từ kết
quả đó ta sẽ xác định được sơ bộ rằng ta đã chế tạo ra dung dịch bạc nano và cũng dự đoán được
kích thước hạt nano bạc [13].

Hình 1.3 Phổ UV – Vis của dung dịch nano bạc (Nguồn: Tập đoàn dầu khí Quốc gia
Việt Nam)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy (TEM) là một công
cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano. Nó cho phép quan sát chính xác cấu

22


trúc nano với độ phân giải lên đến 0,2 nm. Do đó, phương pháp này ngày càng được sử dụng
rộng rãi trong việc nghiên cứu vật liệu nano. Nguyên tắc của phương pháp hiển vi điện tử truyền
qua: trong phương pháp này, hình ảnh thu được chính là do sự tán xạ của chùm electron xuyên
qua mẫu.
Công dụng chủ yếu của thiết bị này là để xác định một cách chính xác kích thước của hạt
nano mà cụ thể ở đây là hạt nano bạc tạo thành. Dựa vào ảnh chụp các phần tử nano bạc bằng
kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kích thước và hình dáng của hạt nano
tạo thành, đồng thời xem xét xem kích thước đó đã đảm bảo là tốt hay chưa để hoạch định quá
trình điều chế nano bạc.
Máy đo nhiễu xạ tia X (XRD)
Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) được sử dụng để phân tích các vật liệu
có cấu trúc, nó cho phép xác định hằng số mạng và các đỉnh đặc trưng cho các cấu trúc đó. Đối
với kim loại, phương pháp XRD cho phép xác định chính xác sự tồn tại của kim loại trong mẫu
dựa trên các đỉnh thu được so sánh với các đỉnh chuẩn của nguyên tố đó.

Hình 1.4 Phổ XRD của nano bạc (Nguồn: Công ty TNHH nghiên cứu khoa học và phát
triển công nghệ HELEN)

23


1.3. Một số nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc từ vi sinh vật ở trong nước và trên thế giới
1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới
Vào năm 2001 Klaus-Joerger nhận thấy vi khuẩn Pseudomonas stutzeri AG259 phân lập
từ mỏ bạc có thể khử Ag+ trong dung dịch muối AgNO3 thành các hạt Ag nano trong vùng chu
chất của nó [8].
Tiếp sau đó, rất nhiều báo cáo cho thấy các chủng vi sinh đơn bào (vi khuẩn) hoặc đa bào

(nấm sợi, nấm đảm) đều có khả năng khử Ag+ tạo bạc nano theo các cơ chế ngoại bào hoặc nội
bào. Cụ thế như A.Ahmad chứng minh khả năng tổng hợp nano bạc của nấm Fusariuim
oxysporum [7]. Sastry và cộng sự nhận thấy Verticillium sp và Fusariuim oxysporum khi tiếp
xúc với ion Au3+ và Ag+ sẽ nhanh chóng khử các ion này tạo thành hạt nano kim loại. N.Duran
nghiên cứu cơ chế khử Ag+ thành Ag0 của F.oxysporum [17]. S.Basavaraja khảo sát quá trình
sinh tổng hợp bạc nano ngoại bào bởi nấm Fusarium semitectum [18]. K.C.Bhainsa xác định có
sự hình thành nano bạc khi cho nấm Aspergillus flavus tiếp xúc với muối bạc nitrate.
K.Kalimuthu khảo sát khả năng tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus licheniformis [19].
N.Saifuddin nghiên cứu phương pháp tổng hợp nano bạc nhờ Bacillus subtilis [14]. N.Mokhtari
sử dụng Klebsiella pneumonia để thu nhận bạc nano [20].
Các vi sinh vật sử dụng hệ enzyme khử nitrate để đưa AgNO3 về Ag tạo nên những hạt
nano có kích thước rất nhỏ, chỉ khoảng dưới 20nm, do đó làm tăng hiệu quả kháng khuẩn khi so
sánh với phương pháp hoá – lý cổ điển [7].
1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước
Hiện nay, hướng sinh tổng hợp nano bạc ứng dụng công nghệ vi sinh vật đang được
nghiên cứu và mới phát triển tại Việt Nam. Một số nghiên cứu tiêu biểu như: Nghiên cứu sinh
tổng hợp bạc nano bằng nấm Fusarium oxysporum (Nguyễn Hoàng Ngọc Phương và cộng sự
(2009)), Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng sinh khối vi khuẩn B.subtilis và
B.licheniformis (Phan Huê Phương (2010)) nghiên cứu này đã mở ra con đường sinh tổng hợp
nano bạc bằng cách khảo sát sinh khối ủ với AgNO3.

24


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu phân chim cút được lấy tại xã Điện Thắng, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam.
- Vi khuẩn Bacillus licheniformis phân lập từ phân chim cút ủ 25 – 30 ngày
- Ba dòng vi khuẩn gây bệnh được dùng kiểm định trong nghiên cứu này bao gồm E.coli,

Bacillus cereus, Ralstonia solanacearum (giống bảo quản lạnh sâu -22oC) được cung cấp bởi
được cung cấp bởi khoa sinh – môi trường, Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng. Các chủng
nấm bệnh phytophthora sp. Phân lập từ rễ cây cà chua bệnh.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm thu mẫu ở thực địa:
Xã Điện Thắng, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam.
Địa điểm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm:
Phòng thí nghiệm Vi sinh – hóa sinh – sinh lý thực vật, PTN Công nghệ sinh học, PTN
sinh học phân tử thuộc khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis từ phân chim cút.
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp nano bạc từ dịch ngoại bào và sinh khối Bacillus
licheniformis.

25