Đánh giá tác dụng của cao rễ đan sâm trên mô hình gây suy giảm học nhớ bằng tiêm beta amyloid 2535 vào não chuột

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO RỄ
ĐAN SÂM TRÊN MÔ HÌNH GÂY SUY
GIẢM HỌC NHỚ BẰNG TIÊM BETAAMYLOID 25-35 VÀO NÃO CHUỘT
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH
Mã sinh viên: 1401549

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO RỄ
ĐAN SÂM TRÊN MÔ HÌNH GÂY SUY
GIẢM HỌC NHỚ BẰNG TIÊM
BETA-AMYLOID 25-35
VÀO NÃO CHUỘT
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Đào Thị Vui
2. NCS.DS Trần Thị Loan
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin được tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS. Đào Thị Vui,
người thầy đã định hướng, động viên và cho tôi rất nhiều lời khuyên quý báu để hoàn
thành đề tài này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới NCS.DS. Trần Thị Loan, người
đã luôn giúp đỡ tôi tận tình bằng tất cả những kiến thức và kinh nghiệm thực tế của mình.
Những điều được chị truyền dạy đã khai sáng và giúp tôi thêm tự tin trên con đường
nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Dược lực và anh chị kỹ thuật
viên DS. Nguyễn Thị Thủy, Đinh Thị Kiều Giang đã đồng hành và giúp đỡ tôi. Nhờ
sự hỗ trợ tận tình từ các anh chị mà quá trình thực nghiệm mới được tiến hành thuận lợi
và đạt kết quả tốt đẹp.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các
thầy cô giáo trong trường đã cho tôi những kiến thức quí báu trong suốt 5 năm học tập
tại trường và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành trọn vẹn đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời yêu thương và cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, em trai, những
bạn bè thân là chỗ dựa tinh thần vững chắc và là niềm động lực giúp tôi vượt qua mọi
khó khăn trong học tập cũng như cuộc sống.

Hà Nội, 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................ IV
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................... V

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ ........................................................................ VI
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. VII
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 1

1.1.1. Định nghĩa ...................................................................................................... 1
1.1.2. Dịch tễ học: .................................................................................................... 1
1.1.3. Các thể sa sút trí tuệ ....................................................................................... 2

1.2.1. Mô hình gây suy giảm học nhớ liên quan đến giả thuyết β-amyloid ............ 5
1.2.2. Mô hình gây suy giảm học nhớ liên quan đến giả thuyết Cholinergic .......... 7
1.2.3. Các mô hình gây suy giảm học nhớ khác ...................................................... 8

1.3.1. Tên khoa học .................................................................................................. 8
1.3.2. Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 9
1.3.3. Phân bố và bộ phận dùng ............................................................................... 9
1.3.4. Thành phần hóa học ....................................................................................... 9
1.3.5. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của Đan sâm ................................. 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 14

I


2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ............................................................................... 14
2.1.2. Động vật thí nghiệm ..................................................................................... 15

2.2.1. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................... 15
2.2.2. Thuốc và hóa chất nghiên cứu ..................................................................... 15

2.4.1. Triển khai mô hình gây suy giảm học nhớ thực nghiệm bằng β-amyloid ... 17
2.4.2. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình đã triển khai.............. 22

2.4.3. Phương pháp đánh giá .................................................................................. 23
2.3.3. Xử lý số liệu ................................................................................................. 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................... 31

3.1.1. Kết quả thăm dò liều β-amyloid gây suy giảm học nhớ trên động vật thí
nghiệm .................................................................................................................... 31
3.1.2. Kết quả thẩm định mô hình gây suy giảm học nhớ thực nghiệm bằng βamyloid với thuốc chứng dương donepezil ............................................................ 34

3.2.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm thể hiện thông qua các test hành vi .............. 37
3.2.2. Kết quả định lượng MDA ............................................................................ 40
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................... 42
II


4.1.1. Liều β-amyloid gây suy giảm học nhớ trên chuột nhắt trắng ...................... 42
4.1.2. Về kết quả thẩm định mô hình gây suy giảm học nhớ thực nghiệm bằng βamyloid với thuốc chứng dương là donepezil ........................................................ 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... IX

III


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACh

Acetylcholin

AChE

Acetylcholinesterase

Acid salvianolic B

Sal B

Aβ

Beta-amyloid

Aβ25-35

Beta-amyloid phân đoạn 25 – 35

β-amyloid

Beta-amyloid

β-amyloid 1-28

Beta-amyloid phân đoạn 1 – 28

β-amyloid 25-35

Beta-amyloid phân đoạn 25 – 35

β-amyloid 40

Beta-amyloid phân đoạn 40

β-amyloid 42

Beta-amyloid phân đoạn 42

APP

Protein tiền chất amyloid (amyloid precusor protein)

ACTI

Acetylthiocholin iodid

CPĐ

Cao phân đoạn

CTP

Cao toàn phần

DTNB

Acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic

MDA

Malondialdehyd

NMDA

N-methyl-D-aspartat

PUFA

Các acid béo chưa bão hòa đa (polyunsaturated fatty acids)

ROS

Các gốc oxy hoạt động (reactive oxygen species)

RCT

Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng
(Randomized Controlled Clinical Trial)

WHO

Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

IV


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1: Tỷ lệ chuyển tiếp của các lô chuột gây suy giảm học nhớ bằng tiêm Aβ 25-35 vào não thất .................... 31
Bảng 3.2: Thời gian tiềm tàng vào buồng tối của các lô chuột gây suy giảm học nhớ bằng tiêm Aβ25-35 vào não
thất ......................................................................................................................................................................... 32
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của tiêm Aβ25-35 vào não thất đến hoạt độ enzym AChE vùng não trước và hồi hải mã ...... 33
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của tiêm Aβ25-35 vào não thất đến hàm lượng MDA vùng não trước và hồi hải mã........ 33
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của Aβ25-35 và donepezil đến tỷ lệ chuyển tiếp trong test mê lộ chữ Y ................................. 34

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của Aβ25-35 và donepezil đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối trong test tránh né thụ
động ........................................................................................................................................................................ 35
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của Aβ25-35 và donepezil đến hoạt độ enzym AChE vùng não trước và hồi hải mã .............. 36
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của Aβ25-35 và donepezil đến hàm lượng MDA trong mô não chuột của các lô chuột thí
nghiệm .................................................................................................................................................................... 36

V


DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ
Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ........................................................................................................................ 16
Hình 2.2: Thao tác cố định chuột trên thiết bị cố định động vật bán tự động ........................................................ 18
Hình 2.3: Thao tác rạch da ở đỉnh đầu .................................................................................................................. 19
Hình 2.4: Vị trí hai điểm bregma và lambda trên bề mặt hộp sọ ......................................................................... 19
Hình 2.5: Bố trí thí nghiệm tiêm não thất β-amyloid .............................................................................................. 20
Hình 2.6: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng cải thiện khả năng học nhớ của cao rễ Đan sâm ......... 22
Hình 2.7: Sơ đồ minh họa sự di chuyển (A) đúng và (B) sai của chuột trong test mê lộ chữ Y ............................... 23
Hình 2.8: Sơ đồ mô tả test tránh né thụ động ........................................................................................................ 26
Hình 2.9: Nguyên tắc phản ứng định lượng hoạt độ AchE theo phương pháp Ellman .......................................... 27
Hình 2.10: Nguyên tắc phản ứng định lượng MDA theo phương pháp Wojciech Wasowicz ................................. 28
Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm đến tỷ lệ chuyển tiếp (%) của động vật thí nghiệm trong test mê lộ
chữ Y ....................................................................................................................................................................... 38
Hình 3.2: Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối của động vật thí nghiệm
trong 2 giai đoạn Pretest và Test trong test tránh né thụ động........................................................................... 39
Hình 3.3: Ảnh hưởng của cao rễ Đan sâm đến hàm lượng MDA vùng não trước và hồi hải mã ....................... 40

VI


ĐẶT VẤN ĐỀ

Sa sút trí tuệ là một hội chứng thoái hóa thần kinh có sự suy giảm nhận thức
và trí nhớ một cách nghiêm trọng, gây ảnh hưởng nặng nề đến hoạt động hàng ngày
của người bệnh. Trong đó Alzheimer chiếm 60 – 80 % nguyên nhân gây sa sút trí tuệ
với đặc trưng bệnh lý liên quan đến sự xuất hiện của các mảng lão hóa và đám rối sợi
thần kinh. Alzheimer nói riêng và sa sút trí tuệ nói chung là các bệnh lý mạn tính
chưa có thuốc điều trị khỏi, các thuốc hiện nay được FDA chấp thuận mới chỉ dừng
lại ở việc cải thiện các triệu chứng của bệnh kèm theo đó là rất nhiều tác dụng phụ.
Sự giới hạn trong lựa chọn cùng độc tính của các thuốc hiện có gây ra rất nhiều khó
khăn trong điều trị, từ đó đặt ra vấn đề cấp thiết cần nghiên cứu và phát triển các
thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu hiệu quả hơn và ít độc tính hơn.
Để giải thích được nguyên nhân và tiến triển của bệnh, các nhà khoa học đã
đưa ra rất nhiều giả thuyết về cơ chế bệnh sinh, một trong số đó là giả thuyết Amyloid
được đề xuất năm 1991 cho rằng sự tích tụ quá mức của các beta-amyloid (β-amyloid)
hình thành nên các mảng não hóa là nguyên nhân cơ bản của bệnh [104]. Cho tới nay
đây vẫn được xem là giả thuyết chính để giải thích sinh bệnh học bệnh Alzheimer và
trở thành hướng nghiên cứu quan trọng cho các phương pháp điều trị tiềm năng [41].
Mô hình gây suy giảm học nhớ bằng truyền amyloid-beta vào não chuột chính là dựa
trên cơ sở của giả thuyết này và đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phát
triển các thuốc mới điều trị Alzheimer nói riêng và sa sút trí tuệ nói chung.
Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là một dược liệu từ lâu đã được sử dụng
phổ biến để điều trị các bệnh tim mạch và mạch máu não [133], [54]. Những năm gần
đây, Đan sâm còn được xem là một trong những dược liệu tiềm năng trong điều trị
các bệnh lý thoái hóa thần kinh, mà cụ thể là Alzheimer. Bằng chứng từ nhiều nghiên
cứu trên thế giới đã cho thấy các hoạt chất có trong Đan sâm như: tanshinon IIA,
danshenu, cryptotanshinon, acid salvianolic B,… có nhiều tiềm năng bảo vệ thần kinh
thông qua một số cơ chế như: ức chế tổng hợp β-amyloid [50], chống oxy hóa [100],
chống viêm [114], làm giảm quá trình chết tế bào [67],... Tuy nhiên, số lượng nghiên

VII

cứu đã được triển khai tại Việt Nam đánh giá tác dụng tiềm năng này của Đan sâm
còn rất hạn chế.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá tác dụng
của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm học nhớ bằng truyền amyloidbeta vào não chuột” với mục tiêu:
1. Triển khai mô hình gây suy giảm học nhớ thực nghiệm bằng tiêm β-amyloid
25-35 vào não thất chuột nhắt trắng
2. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình đã triển khai.

VIII


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Đại cương về sa sút trí tuệ
1.1.1. Định nghĩa
Theo định nghĩa của WHO, sa sút trí tuệ (dementia) là hội chứng suy giảm rõ
rệt chức năng nhận thức của não vượt quá tốc độ lão hóa thông thường, tiến triển một
cách mạn tính trong một số bệnh lý thần kinh, đặc biệt là Alzheimer hoặc sau các tổn
thương tác động đến chức năng của não như: đột quỵ do chảy máu não hoặc tắc mạch
máu não…[128].
1.1.2. Dịch tễ học:
Theo thống kê của WHO, năm 2015, số người mắc sa sút trí tuệ trên thế giới
là 47 triệu người, dự đoán con số này có thể tăng lên tới 75 triệu người năm 2030 và
132 triệu người năm 2050. Các nghiên cứu ước tính có gần 9.9 triệu ca phát triển sa
sút trí tuệ mỗi năm, trung bình cứ 3 giây có một ca mắc mới. Phần lớn bệnh nhân sa
sút trí tuệ sống ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình (60% năm 2011; dự
đoán tăng lên 71% năm 2040) [126], [127]. Số lượng bệnh nhân ở các quốc gia này
dự đoán tăng thêm 100% tới năm 2040 so với 2001, 300% ở Ấn Độ, Trung Quốc,
khu vực Đông Á và Châu Âu Thái Bình Dương [89].
Tại Việt Nam, cùng với sự già hóa dân số, số lượng người mắc chứng sa sút

trí tuệ đang có xu hướng ngày càng gia tăng. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Việt
và cộng sự ở Thái Nguyên cho biết tỷ lệ hiện mắc sa sút trí tuệ trong cộng đồng trên
60 tuổi là 7,9%, tỷ lệ này tăng lên rõ rệt theo nhóm tuổi, cứ 5 năm lại tăng gấp đôi
[8]. Theo số liệu nghiên cứu của Phạm Thắng, Lương Chí Thành về sa sút trí tuệ ở
Ba Vì, Hà Nội năm 2010, tỷ lệ người trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ là 4,5% [6]. Trong
khi đó, nghiên cứu của Lê Văn Tuấn và cộng sự, thực hiện từ tháng 9 năm 2010 đến
tháng 9 năm 2012 tại hai quận, huyện ở Hà Nội, cho kết quả tỷ lệ này là 4,24% [7].
Một nghiên cứu khác ở thành phố Hồ Chí Minh năm 2011 của Vũ Anh Nhị xác định
được tỷ lệ sa sút trí tuệ ở người trên 60 tuổi là 4,8% [5].

1


1.1.3. Các thể sa sút trí tuệ
Sa sút trí tuệ là một hội chứng suy giảm nhận thức tiển triển theo sau rất nhiều
nguyên nhân. Có rất nhiều thể sa sút trí tuệ như: sa sút trí tuệ thể Alzheimer, sa sút trí
tuệ thể Lewy, sa sút trí tuệ thể thái dương, sa sút trí tuệ trong bệnh Parkinson,
Hungtington, Creutzfeldt-Jakob (CJD), sa sút trí tuệ trong bệnh suy giảm miễn dịch
ở người (ví dụ HIV), các bệnh chuyển hóa và nội tiết ( ví dụ suy giáp, lupus ban đỏ
hệ thống, tăng calci huyết, thiếu vitamin B12)…[121].
Trong đó thể Alzheimer là thể bệnh phổ biến nhất, chiếm tới 60 – 70% trong
các trường hợp. Bệnh Alzheimer là bệnh lý thoái hóa thần kinh không hồi phục, tiến
triển từ suy giảm trí nhớ tới mất trí nhớ hoàn toàn kèm theo sự thay đổi hành vi, mất
khả năng phân tích ngôn ngữ, mất nhận thức không gian, suy giảm các giác quan [43],
[53].
 Giả thuyết gây bệnh
Từ năm 1906 khi lần đầu tiên được mô tả bởi bác sĩ tâm thần và thần kinh học
người Đức Alois Alzheimer [119], đến nay các nhà khoa học vẫn chưa hiểu rõ hoàn
toàn nguyên nhân và tiến triển của bệnh Alzheimer. Từ những nghiên cứu đã tiến
hành, có một số giả thuyết cơ chế bệnh sinh đã được đặt ra:

- Giả thuyết β-amyloid (Aβ)
Năm 1991, giả thuyết β-amyloid lần đầu được đưa ra bởi John Hardy and
David Allsop [104] dựa trên những khám phá tại thời điểm đó về các đột biến gây
bệnh trên nhiễm sắc thể 21 của APP – protein tiền chất amyloid cho thấy sự thay đổi
chuyển hóa APP và tăng lắng đọng β-amyloid là những quá trình chính diễn ra trong
quá trình sinh bệnh [104]. Hầu hết các cụm đột biến tập trung tại hoặc gần các vị trí
bên trong APP mà tại đó thường bị phân cắt bởi α, β, và γ-secretases; nhờ đó thúc đẩy
sự tạo thành Aβ thông quá quá trình phân giải APP nhờ các enzym secretase [46],
[74], [80]. Xa hơn, chính các đột biến bên trong APP thúc đẩy các chuỗi Aβ kết tập
tạo ra các vi sợi Aβ và tạo nên các cụm dày đặc tích tụ bên ngoài neuron gọi là mảng
lão hóa (senile plaques) [32], [49], [59]. Sự tích tụ của các vi sợi (fibril) amyloid,
được coi là dạng có độc tố làm ngăn cản cân bằng ion canxi trong tế bào, kích hoạt sự
2


chết tế bào theo chương trình (apoptosis) [65]. Đồng thời, Aβ cũng tích tụ nhiều hơn
trong ty thể ở tế bào của não bệnh nhân Alzheimer, và nó cũng ức chế chức năng của
một số enzym và việc sử dụng glucose trong tế bào thần kinh [78].
- Giả thuyết Cholinergic
Đây là giả thuyết cổ điển nhất được đưa ra dựa trên cơ chế dẫn truyền thần
kinh nhờ acetylcholin và những khám phá về vai trò của acetylcholin trong việc hình
thành và tăng cường khả năng ghi nhớ, học tập [96]. Giả thuyết đề xuất rằng chính
sự thiếu hụt của các neuron cholinergic ở nhân nền của não trước và sự mất liên hệ
dẫn truyền thần kinh ở võ não và một số vùng não là nguyên nhân dẫn đến sự suy
giảm trí nhớ ghi nhận trên các bệnh nhân Alzheimer [90], [96], [117].
- Giả thuyết Tau
Sự tích tụ bất thường của protein tau cũng được xem là một nguyên nhân gây
tiến triển bệnh Alzheimer. Mỗi neuron đều có một bộ khung tế bào – là cấu trúc đỡ
bên trong góp phần tạo nên cấu trúc tế bào gọi là vi ống (microtubule). Các vi ống
này hoạt động với vai trò như các “đường ống” dẫn các chất dinh dưỡng và phân tử

từ thân tế bào đến một đầu sợi trục và quay ngược trở lại. Tau khi được phosphoryl
hóa giúp ổn định cấu trúc vi ống, vì thế tau còn được gọi là protein liên hệ với vi ống.
Ở bệnh nhân Alzheimer, tau bị phosphoryl hóa quá nhiều, bắt cặp với các sợi khác,
tạo thành các đám rối sợi thần kinh (neurofibrillary tangle) và làm tan rã hệ thống vận
chuyển của neuron.
- Giả thuyết stress oxy hóa
Stress oxy hóa là tình trạng nồng độ các gốc tự do cùng các sản phẩm oxy hóa
vượt quá nồng độ các chất chống oxy hóa bảo vệ của cơ thể. Não rất dễ bị tổn thương
do stress oxy hóa do đây là nơi có tỉ lệ tiêu thụ oxy cao, lại chứa nhiều acid béo không
bão hòa đa (PUFA) dễ bị oxy hóa nhưng thiếu hụt nhiều cơ chế chống oxy hóa mạnh
[118]. Khi gia tăng quá mức các gốc tự do, các acid béo chưa bão hòa do có các liên
kết đôi liên hợp tạo điều kiện cho quá trình peroxid hóa lipid, làm hủy hoại mô não.
Các gốc tự do cùng các sản phẩm peroxid hóa lipid tấn công vào các protein hoặc
acid nucleic như ADN hay ARN gây phá hủy và mất chức năng của các đại phân tử
3


này. Các gốc tự do làm cạn kiệt các chất chống oxy hoá, khiến cho hệ thống chống
oxy hoá giảm khả năng bảo vệ cơ thể chống lại tình trạng stress oxy hóa. Hậu quả là
quá trình oxy hóa càng diễn tiến trầm trọng [122], [123]. Markesbery trong các nghiên
cứu đã làm rõ vai trò của stress oxy hóa trong quá trình bệnh sinh gây thoái hóa các
tế bào thần kinh và tử vong của bệnh lý Alzheimer [118] [18].
- Giả thuyết Glutamat
Glutamat là một chất dẫn truyền thần kinh kích thích receptor N-methyl-Daspartat (NMDA) có vai trò trong học hỏi và ghi nhớ. Khi xảy ra sự chết tế bào hàng
loạt sẽ kích thích giải phóng glutamat quá nhiều, từ đó gây kích thích quá mức các
thụ thể NMDA dẫn đến phá hủy tế bào thần kinh, góp phần nặng thêm quá trình chết
tế bào [124].
 Các thuốc điều trị
- Các thuốc ức chế cholinesterase:
Dựa trên cơ sở giả thuyết cholinergic cho rằng sự suy giảm trí nhớ và thiếu hụt

nhận thức là kết quả của sự thoái hóa các neuron acetylcholin, sự mất chức năng của
các enzym tham gia tổng hợp và thoái hóa acetylcholin [72], [82], các thuốc ức chế
cholinesterase tăng cường dẫn truyền cholinergic thông qua giảm thoái hóa
acetylcholin giữa các khhe synap [66]. Tính đến nay đã có 3 thuốc ức chế
cholinesterase được FDA chấp thuận và được xem là lựa chọn đầu tay trong điều trị
Alzheimer thể nhẹ đến trung bình: donepezil (Pfizer), rivastigmin (Novartis) và
galantamin (Janssen) [88].
- Các chất ức chế thụ thể N-methyl-D-aspartat (NMDA):
Memantin là chất đối kháng NMDA duy nhất hiện có và được sử dụng trong
điều trị Alzheimer thể vừa đến nặng [66]. Memantin phong bế thụ thể NMDA, ngăn
chặn kích thích quá mức của glutamat lên thụ thể này, nhờ đó giảm thiểu độc tính gây
độc thần kinh [85].
- Các chất ức chế β-secretase và γ-secretase:
Mặc dù giả thuyết amyloid đã được khẳng định chắc chắn là một trong những
cơ chế bệnh sinh quan trọng trong hình thành bệnh lý Alzheimer nhưng kết quả từ
4


các RCT cho thấy việc loại bỏ các mảng amyloid sẽ không thể thay đổi hoặc dừng
tiến triển sa sút trí tuệ trong Alzheimer [93], [98], do đó mà các thuốc ức chế amyloid
vẫn chưa được chấp thuận để điều trị trong thực hành.
Các mô hình gây suy giảm học nhớ trên động vật thí nghiệm
Có thể phân loại các mô hình gây bệnh theo giả thuyết gây bệnh:
1.2.1. Mô hình gây suy giảm học nhớ liên quan đến giả thuyết β-amyloid
 Nguyên tắc:
Mô hình dựa trên giả thuyết β-amyloid cho rằng dù khởi phát bệnh là di truyền
hay tự phát, sự tạo thành các mảng lão hóa do tích tụ và tập hợp của các sợi β-amyloid
mới là nguyên nhân chính dẫn tới bệnh Alzheimer [40], [11]. Việc xác định β-amyloid
tham gia vào cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer là cơ sở để xây dựng các mô hình thực
nghiệm đưa β-amyloid vào não động vật thí nghiệm gây suy giảm khả năng học nhớ

không gian và phi không gian cũng như làm thay đổi hành vi của động vật thí nghiệm
tương tự như các triệu chứng quan sát thấy trong bệnh lý Alzheimer [95], [63]. Sự
suy giảm học nhớ này được đánh giá thông qua các test hành vi như: test mê lộ nước
Morris, test tránh né thụ động, test nhận diện đồ vật hay test mê lộ chữ Y... [95],
[112]. Mức độ suy giảm ghi nhận trong các nghiên cứu khác biệt tùy thuộc vào loại
β-amyloid sử dụng, chế độ liều, khu vực tiêm, khoảng thời gian từ khi đưa β-amyloid
vào não cho tới khi đánh giá [112].
1.2.1.1. Các loại β-amyloid được sử dụng trong các nghiên cứu
Có nhiều phân đoạn β-amyloid đã được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế
giới khi triển khai mô hình này như: β-amyloid 40, β-amyloid 42, β-amyloid 25-35,
β-amyloid 1-28.
β-amyloid 40 và β-amyloid 42 – hai phân đoạn phổ biến nhất được tìm thấy
trên cả não người bình thường và trên bệnh nhân Alzheimer thường được các nghiên
cứu lựa chọn. Đoạn β-amyloid 40 mang tới hơn 90% cấu trúc phân tử peptid βamyloid là hướng nghiên cứu chính trong nhiều nghiên cứu in vivo, với kết quả cho
thấy vai trò của β-amyloid 40 trong việc phát triển các khiếm khuyết về nhận thức
mặc dù các ảnh hưởng này phụ thuộc vào liều β-amyloid 40 sử dụng [20], [81], [112].
5


β-amyloid 42 là phân đoạn quan trọng trong sự hình thành các mảng amyloid và
thường được xem là đoạn có độc tính nhất. Ảnh hưởng gây suy giảm học nhớ ngắn
hạn và dài hạn trên động vật thí nghiệm của β-amyloid 42 phụ thuộc vào liều [19],
[29], [62], [102], [115].
Hai phân đoạn β-amyloid ngắn hơn, β-amyloid 25-35 và β-amyloid 1-28, cũng
được các nghiên cứu ghi nhận khả năng gây suy giảm khả năng học nhớ trên chuột
và động vật gặm nhấm [19], [33], [44], [63], [95]. Trong đó, β-amyloid 25-35 là sản
phẩm của sự phân cắt β-amyloid 40 được tìm thấy trên não các bệnh nhân lớn tuổi
[57], [120], được xem là phân đoạn ngắn nhất thể hiện được hoạt tính sinh học của
cả chuỗi β-amyloid mà vẫn giữ nguyên độc tính như các phân đoạn dài [38], [73],
[120]. Vì lẽ đó, β-amyloid 25-35 thường được lựa chọn thay thế cho các phân đoạn

dài hơn trong các nghiên cứu. [73], [112]
1.2.1.2. Chế độ liều
Tùy thuộc mục tiêu nghiên cứu mà có thể lựa chọn chế độ đơn liều hoặc đa
liều. Để đánh giá ảnh hưởng gây độc cấp tính, β-amyloid được đưa vào não với liều
duy nhất [94], [95] còn khi nghiên cứu ảnh hưởng mạn tính của sự tích tụ β-amyloid
ưu tiên chế độ liều lặp lại và kéo dài [28], [29], [34].
1.2.1.3. Khu vực tiêm
Các nghiên cứu đã ghi nhận rất nhiều khu vực não khi tiêm β-amyloid có thể
gây ra được sự suy giảm học nhớ rõ rệt trên động vật thí nghiệm như: não thất
(ventricular), hồi hải mã (hippocampus), vỏ não nội khứu (entorhinal cortex) [112].
Đây đều là các vùng não liên quan mật thiết đến chức năng ghi nhớ và học tập của
não bộ. Trong số đó, khu vực não thất được sử dụng phổ biến nhất do có nhiều ưu
điểm:
- Đây là khu vực cho phép vận chuyển nhanh Aβ vào não mà ít gây tổn thương
vùng cấy kim.
- Các nghiên cứu đã khẳng định việc tiêm Aβ vào não thất (ICV) với liều đơn
hay liều lặp lại đều gây ra sự suy giảm khả năng học tập và ghi nhớ trên động vật thí
nghiệm [25].
6


1.2.1.4. Ưu nhược điểm:
- Ưu điểm:
+ Mô hình gây ra các tổn thương não làm thay đổi khả năng học nhớ của động
vật thí nghiệm trong thời gian ngắn tương tự các triệu chứng quan sát được trên lâm
sàng [95], [63], [112].
+ Đánh giá được hiệu quả của các liệu pháp điều trị tiềm năng có cơ chế hướng
đích β-amyloid [52].
- Nhược điểm:
+ Có thể gây tổn thương não do làm khởi phát các quá trình viêm do tiêm

truyền bởi đây là một thủ thuật xâm lấn nhu mô não, hoặc do làm gia tăng áp lực nội
sọ não khi sử dụng các dung môi không có áp suất thẩm thấu xấp xỉ với dịch não tủy
(nonphysiological solvent) để hòa tan β-amyloid
+ Không đánh giá được tác động của các yếu tố quan trọng khác ngoài βamyloid đến tiến triển của bệnh như: các đám rối thần kinh (neurofibrillary tangles),
thay đổi mạch máu não (perturbations in vasculature), tuổi tác [112].
1.2.2. Mô hình gây suy giảm học nhớ liên quan đến giả thuyết Cholinergic
Từ khi việc thoái hóa các neuron hệ cholinergic ở nhân nền của não trước được
phát hiện xảy ra ngay trong giai đoạn sớm của bệnh Alzheimer và có mối liên quan
tới sự suy giảm nhận thức [71], [83], [91], [96] như đã trình bày trong phần giả thuyết
gây bệnh, mô hình gây suy giảm hệ cholinergic đã được sử dụng để nghiên cứu vai
trò của hệ cholinergic đối với chức năng nhận thức của não bộ [21], [27] cũng như
đánh giá hiệu quả của các thuốc mới tiềm năng trong điều trị Alzheimer nói riêng và
sa sút trí tuệ nói chung.
 Nguyên tắc: Mô hình được xây dưng dựa trên giả thuyết hệ cholinergic gây rối
loạn chức năng bộ nhớ được đề xuất bởi Davies và Maloney (1976) [83] . Có
nhiều biện pháp nhằm làm suy giảm cấp tính hoạt động hệ cholinergic : kích điện
(electrocoagulation) hay sử dụng các chất kích thích (excitotoxins), các chất độc
với hệ cholinergic (scopolamin), AF64A.

7


 Ưu điểm: Quy trình đơn giản, có thể áp dụng để đánh giá hiệu quả của nhiều nhóm
thuốc có cơ chế khác nhau như: các thuốc tăng cường hoạt tính hệ cholinergic
[26], [101], các thuốc hỗ trợ hoạt động hệ thần kinh (nootropic) [31], [109],...
 Nhược điểm: Không áp dụng để đánh giá hiệu quả của các liệu pháp điều trị hướng
đích do không gây ra được các đặc điểm bệnh lý đặc trưng như: các mảng lão hóa
(senile plaques), đám rối sợi thần kinh (neurofibrillary tangle),...
1.2.3. Các mô hình gây suy giảm học nhớ khác
Từ những giả thuyết gây bệnh Alzheimer đã được đề xuất, có rất nhiều mô

hình khác đã được xây dựng và áp dụng nghiên cứu đánh giá tác dụng của các thuốc
và dược liệu tiềm năng trong điều trị sa sút trí tuệ như:
- Mô hình gây suy giảm hệ glutamergic
- Mô hình gây bệnh liên quan tới tạo đám rối thần kinh
- Mô hình gây bệnh liên quan tới presenilin
- Mô hình động vật gây tổn thương não
Dược liệu Đan sâm
1.3.1. Tên khoa học
Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc họ Hoa môi
(Lamiaceae) [4].

Hình 1.1: Hình ảnh về Đan sâm
1. Toàn cây 2. Rễ
8


1.3.2. Đặc điểm thực vật
Cây thảo lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng
nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm màu đỏ nâu (do đó nên còn được
gọi là Xích sâm, Huyết sâm, Hồng căn). Lá kép mọc đối, thường gồm 3-7 lá chét; lá
chét giữa thường lớn hơn, mép lá chét có răng cưa tù; mặt trên lá chét màu xanh, có
các lông mềm màu trắng, măt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng dài hơn. Hoa
mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-15 cm; hoa mọc thành vòng,
mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa; tràng hoa màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên
cong hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ ba thùy; 2 nhị ở môi dưới; bầu có vòi dài. Quả nhỏ,
dài 3 mm, rộng 1,5 mm [3].
1.3.3. Phân bố và bộ phận dùng
1.3.3.1. Phân bố
Ở Việt Nam, Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là cây nhập nội, có nguồn
gốc từ Trung Quốc [9]. Cây được trồng ở: Sapa, Bắc Hà (Lào Cai), Tam Đảo, Hà

Nội, Phú Thọ, Thanh Hóa [9], ngoài ra còn có ở Trung Quốc, Nhật Bản [3].
1.3.3.2. Bộ phận dùng
Rễ phơi khô hay sấy khô của cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) [3].
1.3.4. Thành phần hóa học
Các thành phần hóa học có trong Đan sâm có thể phân thành 3 nhóm: các thành
phần tan trong nước, các thành phần tan trong dầu và các thành phần khác [70], [129].
- Các thành phần tan trong nước: Chủ yếu là các acid phenolic. Từ năm 1984
cho tới năm 1997, LiLN và các cộng sự đã phân lập và xác định được 15 hợp chất
acid phenolic gồm các acid polyphenolic (acid salvianolic A, B, C, D, E) và các hợp
chất có liên quan (acid rosmarinic, danshenu, protocatechuic aldehyd, protocatechuic
acid) [70], [116], [129].
- Các thành phần tan trong dầu: Hơn 60 hợp chất diterpen [129] đã được phân
lập và xác định từ dịch chiết Đan sâm, chủ yếu là các dẫn chất nhóm tanshion
(tanshion I, IIA, IIB), crytotanshinon. Trong số đó, tanshion IIA và cryptotanshion
đã được nghiên cứu kỹ lưỡng có nhiều tác dụng dược lý [54], [61], [69], [70].
9


- Các thành phần khác: Baicalin, β-sitosterol, ursolic acid and daucosterol
(phân lập từ dịch chiết cồn), 5,3-dihydroxy-7,4-dimethoxy flavanon (phân lập từ dịch
chiết ethyl acetat), vitamin E và tanin.
1.3.5. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của Đan sâm
1.3.5.1. Trên thế giới
Các nghiên cứu đã chỉ ra các thành phần tan trong nước (các acid salvianolic
và danshenu) và tan trong dầu (các tanshinon và cryptotanshinon) của Đan sâm đều
có nhiều tác dụng sinh học [132] như: chống oxi hóa [100], kháng khuẩn [113], kháng
ung thư [69], chống viêm [105], điều trị các bệnh tim mạch [16], [30], [47], [110]…
 Một số nghiên cứu liên quan đến giả thuyết β-amyloid:
- Nghiên cứu in vivo:
Năm 2013, nghiên cứu của Lee và các cộng sự đánh giá tác dụng của acid

salvianolic B (Sal B) trên mô hình gây bệnh thực nghiệm bằng β-amyloid 25-35 cho
thấy Sal B thể hiện khả năng chống oxi hóa và ức chế quá trình viêm cũng như cải
thiện khả năng ghi nhớ của chuột khi đánh giá thông qua test tránh né thụ động [114].
Năm 2016, Zhu và cộng sự nghiên cứu tác dụng của tanshinon IIA trên mô
hình gây suy giảm học nhớ bằng β-amyloid 25-35 đánh giá thông qua test hành vi
(test mê lộ nước Morris) và thông qua biểu hiện gen nhờ kỹ thuật Western blot. Kết
quả test hành vi cho thấy điều trị hàng ngày với Tanshinon IIA với liều 80 hoặc 40
mg/kg cải thiện đáng kể ảnh hưởng gây suy giảm học nhớ của Aβ25-35 so với lô
chứng bệnh do làm giảm thời gian và quãng đường tìm thấy bến đỗ.
- Nghiên cứu in vitro:
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các hoạt chất trong Đan sâm có nhiều cơ chế tiềm
năng bảo vệ thần kinh, đặc biệt liên quan đến bệnh lý Alzheimer [68] như: ức chế tạo
các mảng β-amyloid [17], [22], [23], [75], chống oxi hóa [56], ức chế quá trình
apoptosis (quá trình tế bào chết theo chương trình) [48], [79], ức chế quá trình viêm
[77], [103] và tăng cường dẫn truyền tín hiệu thần kinh thông qua hệ cholinergic [15],
[106]. Ngoài ra, Đan sâm còn cho thấy khả năng kích thích làm tăng số lượng tế bào
thần kinh mới trong vùng hồi hải mã (quá trình neurogenesis) trên một số dòng tế bào
10


tiền thân/tế bào gốc tế bào thần kinh (neural progenitor cells/stem cells) in vitro và in
vivo [3], [69], [92], [99], [130].
Năm 2008, nghiên cứu của Durairajan và các cộng sự đã cho thấy vai trò của
acid salvianolic B – một hoạt chất phân lập từ Đan sâm trong việc ức chế sự tích tụ
β-amyloid 1-40, làm mất ổn định cấu trúc các sợi β-amyloid đã tạo thành trước đó và
ngăn cản độc tính thần kinh do β-amyloid 25-35 gây ra trên dòng tế bào u nguyên bào
thần kinh (neuroblastoma cell) SH-SY5Y [111].
Năm 2012, nghiên cứu của Shi và các cộng sự đề xuất khả năng bảo vệ tế bào
thần kinh của tanshinon IIA trước độc tính của phân đoạn β-amyloid 25-35 nhờ làm
tăng khả năng sống cho các tế bào thần kinh, giảm quá trình phosphoryl hóa protein

tau, giảm sự chuyển p35 sang p25 , ức chế sự vận chuyển cdk5 từ nhân tế bào vào tế
bào chẩt cũng như ức chế hoạt động của cdk5 [42]
Năm 2013, nghiên cứu của Cao và các cộng sự đề xuất vai trò ức chế quá trình
tích tụ β-amyloid của acid salvianolic A thông qua ngăn chặn quá trình hình thành
cấu trúc dạng phiến gấp nếp (β-sheet) của β-amyloid từ cấu trúc dạng xoắn (α-helice),
làm phân tách các sợi β-amyloid, bảo vệ các tế bào u nguyên bào thần kinh SH-SY5Y
trước độc tính của β-amyloid 42, làm giảm sự tê liệt thần kinh do β-amyloid gây ra
trên dòng tế bào CL4176 chủng biến đổi gen Caenorhabditis elegans [75].
Năm 2013, nghiên cứu của Wang và cộng sự cho thấy tanshinon I và tanshinon
IIA có thể ức chế sự hình thành β-amyloid, làm phân tách các sợi Aβ và bảo vệ các
tế bào SH-SY5Y trước độc tính của β-amyloid nhờ khả năng gắn lên đầu C của cấu
trúc phiến gấp nếp (β-sheet) của β-amyloid dạng pentamer, từ đó ngăn cản sự tích tụ
β-amyloid [55].
Như vậy, mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu in vitro đi sâu vào
đánh giá và bước đầu chứng minh tác dụng ức chế sự tạo mảng β-amyloid của các
dẫn chất có hoạt tính sinh học trong Đan sâm nhưng số lượng những nghiên cứu
invivo triển khai theo mô hình gây bệnh bằng β-amyloid còn rất hạn chế.
 Một số nghiên cứu khác:

11


Năm 2007, Kim và cộng sự đã khẳng định vai trò của tanshinon trong quá trình
làm giảm sự đối kháng cạnh tranh của scopolamin với acetylcholin trên thụ thể
muscarinic dẫn tới suy giảm khả năng học nhớ bằng cách tăng cường dẫn truyền tín
hiệu thần kinh thông qua cơ chế ức chế AChE và hoạt hóa các thụ thể
GABA/benzodiazepin [106].
Năm 2010, nghiên cứu của Wong và cộng sự đã cho thấy khả năng ức chế quá
trình suy giảm học nhớ của cryptotanshinon (được phân lập từ dịch chiết Đan sâm)
trên mô hình gây bệnh bằng scopolamin thông qua test hành vi mê lộ chữ Y [60].

Năm 2017, Ozarowski và cộng sự đánh giá ảnh hưởng của cao Đan sâm toàn
phần (liều 200mg/kg, đường uống) lên hoạt tính AchE ở não trên mô hình gây bệnh
bằng scopolamin. Kết quả cho thấy hoạt tính AchE bị ức chế bởi cao Đan sâm toàn
phần ở vỏ não và vùng hồi hải mã là 47% và 55% (khác biệt có ý nghĩa thống kê) khi
so với nhóm chứng sử dụng huperzin [35].
1.3.5.2. Tại Việt Nam
 Các nghiên cứu liên quan tới giả thuyết β-amyloid:
Hiện nay chưa có nghiên cứu in vitro nào ở Việt Nam đánh giá tác dụng của
dược liệu Đan sâm theo hướng giả thuyết β-amyloid cũng như chưa có nghiên cứu in
vivo nào triển khai mô hình gây suy giảm học nhớ bằng β-amyloid.
 Các nghiên cứu khác:
Năm 2017, nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đánh giá tác
dụng chống oxy hóa in vitro trên mô hình quét gốc tự do DPPH cho thấy dịch chiết
toàn phần và các dịch chiết phân đoạn EtOAc và n-BuOH từ rễ cây Đan sâm thu hái
ở Việt Nam đều thể hiện tác dụng chống oxy hóa trên mô hình quét các gốc tự do
DPPH mạnh. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy tiềm năng của Đan sâm Việt
Nam trong viêc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer [2].
Năm 2018, chúng tôi đã tiến hành đánh giá tác dụng kháng cholinesterase trên
mô hình in vivo gây bệnh bằng scopolamin của cao rễ Đan sâm Việt Nam. Kết quả
cho thấy cao toàn phần liều 600 mg/kg, 1200 mg/kg, 2400 mg/kg và cao phân đoạn

12


n-hexan ở 2 mức liều 17,5 mg/kg, n-hexan 35 mg/kg của rễ Đan sâm đều làm giảm
họat độ enzym AChE có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,05) [1].
Như vậy, dữ liệu nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Đan
sâm Việt Nam còn rất hạn chế, để tiếp tục làm rõ hơn và đưa ra các bằng chứng đầy
đủ hơn, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô
hình gây suy giảm học nhớ bằng truyền amyloid-beta vào não chuột” này.

13


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Thân rễ của cây Đan sâm (Salvia mitilorrhiza Bunge, Lamiaceae) thu hái tại
Tân Lập, Mộc Châu, Sơn La được giám định tên khoa học là Salvia mitilorrhiza
Bunge, họ Lamiaceae; và lưu mẫu tại Bảo tàng thực vật. Số tiêu bản lưu tại nơi lưu
mẫu là HNU 022613 (Phụ lục 1).
Dược liệu được định lượng hàm lượng tanshinon IIA và acid salvianolic B
bằng phương pháp HPLC đạt tiêu chuẩn theo quy định Dược điển V (Phụ lục 3).
2.1.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
- Chuẩn bị cao toàn phần (CTP): Bột dược liệu Đan sâm được chiết bằng dung
môi ethanol tuyệt đối (tỷ lệ dược liệu : dung môi 1 : 10) theo phương pháp chiết ngấm
kiệt. Ngâm dược liệu trong 10 ngày, sau đó rút dịch chiết với tốc độ 1,5 L/giờ đồng
thời bổ sung dung môi mới cho đến khi dịch chiết thu được nhạt màu thì dừng lại.
Gộp dịch chiết, lọc qua vải và màng lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
(áp suất 100 mmHg và nhiệt độ 55°C), sấy chân không ở 55°C, thu được 1520,32 g
CTP (hàm ẩm 13,64%).
- Chuẩn bị cao phân đoạn (CPĐ): 760 g CTP (hàm ẩm 13,64%) được hòa tan
trong nước cất theo tỷ lệ 1:1, sau đó đem chiết phân đoạn với dung môi n-hexan. Dịch
chiết phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (áp suất 120 mmHg và
nhiệt độ 55°C), sau đó sấy chân không ở 55°C thu được 19.93 g CPĐ n-hexan hàm
ẩm 2,81% và 701,50g cắn nước hàm ẩm 19,42%.
- Xác định liều nghiên cứu
Từ 760 g CTP Đan sâm (hàm ẩm 13,64%) chiết phân đoạn n-hexan thu được
19,93g CPĐ n-hexan (hàm ẩm 2,81%). Do đó, CTP Đan sâm liều 600 mg/kg, 1200

mg/kg cân nặng sẽ tương đương với CPĐ n-hexan liều lần lượt là 17,5 mg/kg và 35
mg/kg.

14