XÁC ĐỊNH HELICOBACTER PYLORI TRONG MẢNH SINH THIẾT DẠ DÀY HÀNH tá TRÀNG VÀ PHÁT HIỆN đột BIẾN KHÁNG CLARITHROMYCIN BẰNG REAL TIME PCR TẠI BỆNH VIỆN đa KHOA TỈNH bắc GIANG

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Loét dạ dày tá tràng (LDDTT) là bệnh rất phổ biến và đã được y học
biết đến từ rất lâu. Có rất nhiều giả thuyết về nguyên nhân gây bệnh. Tuy vậy,
đến năm 1983, qua nhiều nghiên cứu, Marshall và Warren mới chứng minh
được vai trò gây bệnh của Helicobacter pylori (H. pylori) trong LDDTT, từ
đó, có rất nhiều công trình nghiên cứu về H. pylori ra đời, quan điểm điều trị
LDDTT và kết quả điều trị đã thay đổi rất nhiều. Với sự phát triển của ky
thuật nội soi tiêu hóa, hiện nay, để chẩn đoán và điều trị LDDTT đồng nghĩa
với việc nội soi xác định tổn thương và xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm
H. pylori [1].
H. pylori là vi khuẩn với các đặc điểm: bắt màu Gram (-); hình xoắn,
hơi cong; sinh enzym urease ngoại bào rất mạnh; đặc biệt, rất khó nuôi cấy,
độ nhạy của ky thuật nuôi cấy thấp (50%), thời gian trả kết quả nuôi cấy và
kháng sinh đồ chậm (7 - 14 ngày).
Để xác định nhiễm H. pylori, hiện nay y học có thể sử dụng nhiều ky
thuật, trong đó có hai nhóm ky thuật chính: Các ky thuật có sử dụng thủ thuật
xâm lấn, dựa vào nội soi dạ dày, lấy mảnh sinh thiết cho các ky thuật như
(test urease, mô bệnh học, nhuộm soi, nuôi cấy, các ky thuật PCR ...). Thứ hai
là các ky thuật không xâm lấn như (test huyết thanh IgM, định lượng IgG,
test hơi thở, test tìm H. pylori trong nước tiểu và trong phân...). Mỗi ky thuật
này đều có giá trị riêng trong xác định nhiễm H. pylori [1].
Real-time PCR phát hiện H. pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày dựa
vào xác định những đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn, là ky thuật hiện đại, có
độ nhạy và đặc hiệu cao (từ 95 – 100%), thời gian trả kết quả nhanh, bệnh
phẩm không đòi hỏi phải bảo quản đặc biệt. Ngoài ra, còn phát hiện được
một số đột biến liên quan đến kháng kháng sinh của vi khuẩn [1].
Do các đặc điểm về bệnh LDDTT và H. pylori như trên, hiện nay, điều
trị LDDTT được hướng dẫn sử dụng theo các phác đồ, bản chất là phối hợp

2
kháng sinh diệt H. pylori. Trong các phác đồ điều trị LDDTT và diệt H.
pylori, clarithromycin là kháng sinh chủ yếu và được sử dụng. Clarithromycin là thuốc gắn vào peptydyl transferase thuộc vùng domain V và VI của
23S rRNA H. pylori, làm ngừng tổng hợp protein vi khuẩn. H. pylori kháng
lại clarithromycin bằng nhiều cơ chế, trong đó cơ chế chính là đột biến thay
thế một số nucleotid ở gen 23S rRNA làm giảm ái lực gắn của
clarithromycin.
Hiện nay, H. pylori đã kháng lại clarithromycin rất nhiều, tỷ lệ kháng
thuốc ở các khu vực và ở các thời điểm không đều nhau: Trung Quốc (65,4%
- 2009); My và các nước Châu Âu (> 20% - 2010); Ba Lan, Cameroon (gần
50% - 2010); Việt Nam (> 20% - 2009 - 2012), có những khu vực tại Việt
Nam có > 50% chủng H. pylori kháng clarithromycin [2].
Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang là bệnh viện tuyến cuối cùng của
ngành y tế tỉnh Bắc Giang. Tại đây, các bệnh nhân VLDDTT được chỉ định
nội soi chẩn đoán. Khoa Vi sinh có các trang thiết bị đáp ứng nhu cầu về xét
nghiệm trực tiếp, nuôi cấy, phân lập cũng như real-time PCR. Tuy nhiên, việc
áp dụng real-time PCR trong xác định H. pylori trên lâm sàng còn rất hạn
chế. Các bác sy thường chỉ định nhuộm soi và test urease cho xác định vi
khuẩn H. pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày và kê đơn theo các phác đồ
điều trị. Hơn nữa, việc nuôi cấy và làm kháng sinh đồ với H. pylori gặp nhiều
khó khăn do thời gian chờ kết quả dài và độ nhạy thấp.
Hiện nay, tại Bắc Giang chưa có công trình nghiên cứu nào đánh giá về
H. pylori kháng kháng sinh, đặc biệt là kháng clarithromycin.
Từ những thực tế trên, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu:
1. Xác định H. pylori từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân loét
dạ dày tá tràng bằng real-time PCR tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang.
2. Xác định tỷ lệ H. pylori có đột biến kháng clarithromycin bằng kỹ
thuật real-time PCR.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của vi khuẩn H. pylori
1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu.
Các bệnh về dạ dày tá tràng đã được nghi ngờ có liên quan đến nhiễm
khuẩn từ rất lâu. Tuy vậy, đến năm 1983, hai tác giả là Marshall và Warren
bằng nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh là vi khuẩn H. pylori là
nguyên nhân chính liên quan đến các bệnh như viêm loét dạ dày tá tràng, ung
thư dạ dày, viêm dạ dày trào ngược, rối loạn tiêu hóa dạ dày… và đã được
giải Nobel y học năm 2005 [1].
1.1.2. Đặc điểm sinh học vi khuẩn H. pylori
1.1.2.1. Hình thái, cấu trúc, tính chất bắt màu của vi khuẩn H. pylori.
H. pylori có hình xoắn, hơi cong, kích thước 0,3-1 x 1,5-5 µm.
H. pylori có thể chuyển dạng hình cầu khi gặp một số điều kiện không
thuận lợi hoặc sau khi dùng một số kháng sinh. Morozov đã gặp vi khuẩn
chuyển dạng hình cầu ở bệnh nhân được điều trị metronidazol và omeprazol
ở ngày thứ 3 - 7. Khi ở dạng hình cầu, các hoạt động chuyển hóa của vi
khuẩn giảm mạnh, không sinh urease, vi khuẩn có thể chuyển sang dạng hoạt
động khi có điều kiện thích hợp. Goodwin gọi đây là “thể ngủ” của H. pylori,
dạng này giúp vi khuẩn tồn tại lâu hơn ở môi trường không thuận lợi [1],[3].
H. pylori có 5 - 7 lông ở một cực của tế bào, các lông vi khuẩn có thể
nhuộm bằng phương pháp Kodaka (nhuộm âm với 1% acid phosphotungstic).
Khi cắt ngang một lông, Susumo Ito (1965) nhận thấy trong vỏ bọc của sợi
lông có 15 sợi tách biệt nhau, mỗi sợi kích thước 30 nm, dài 2 - 3 µm.
Tính chất bắt màu của vi khuẩn tùy thuộc phương pháp nhuộm:
Nhuộm Gram, vi khuẩn có màu Gram (-), nhuộm HE bắt màu tím đỏ, nhuộm
Giemsa hoặc Diff-Quik cho màu xanh thẫm, nhuộm Warthin-starry vi khuẩn
bắt màu đen đậm, nhuộm huỳnh quang vi khuẩn bắt màu da cam....[1],[3].

4
1.1.2.2. Đặc điểm sinh vật hóa học.
- Các tính chất sinh vật hóa học chung của H. pylori:
Bảng 1.1: Một số tính chất sinh vật hóa học của H. pylori [4].

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Tính chất
Catalase
Oxydase
Urease
Phosphatase kiềm
γGT (γ Glutamyl transferase)
Lipase
Protease
Esterase C4 - C12
DNase

Hipuricase
Sinh Nitrate

Đặc điểm
+
+
++
+
+
+
+
+
+
Âm tính
Âm tính

Westblot và Majewski thấy một số chủng H. pylori đột biến khiến vi
khuẩn không sinh catalase.
Mendz và CS nghiên cứu về chuyển hóa pyruvate và cho thấy, H.
pylori có chuỗi chuyển hóa của vi khuẩn kỵ khí, nhưng thực tế H. pylori vẫn
cần oxy.
H. pylori có con đường chuyển hóa kiểu Entner - Doudonoff, giống
cách chuyển hóa ở các sinh vật cổ xưa.
H. pyloricó vòng chuyển hóa urea, cách chuyển hóa này chủ yếu ở các
tế bào có nhân điển hình, ít gặp ở các vi khuẩn.
Schafer (Đức) đã xác định một chức năng khác biệt của H. pylori là
vận chuyển ion do men type P vận chuyển ion sắt và 2 clone khác vận chuyển
ion Cu2+ và Ni2+.

5
1.1.2.3. Đặc điểm bộ gen.
- Bộ gen của các chủng H. pylori tương đối đồng nhất, khoảng từ 1,6 –
1,72 Mb (Taylor, Chang và Easton), với tỷ lệ G + C từ 35 đến 40%. Gần như
tất cả các chủng H. pylori phân lập được đều có hai plasmid pHPM180 (3,5
kb) và pHel1 (2,9 kb. Chúng được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn E. coli.
Còn một plasmid hiếm gặp hơn chỉ có ở một số chủng H. pylori là pHPK225
(1,5 kb) có nguồn gốc từ vi khuẩn Gram (+) [5].
- Bộ gen của H. pylori có sự đa dạng rất lớn về trình tự giữa các chủng.
Hiện nay, toàn bộ cấu trúc bộ gen của 2 chủng H. pylori là HP 26695 được
phân lập ở Anh vào năm 1987 và HP 199 được phân lập ở My vào năm 1994
đã được nghiên cứu xong. Cấu trúc bộ gen của chúng gồm một nhiễm sắc
thể dạng vòng có kích cỡ 1,64 - 1,67 Mb; 90,8 - 91% là các vùng mã hóa.
Nhiễm sắc thể chủ yếu chứa các gen tham gia vào sự tổng hợp men urease,
yếu tố độc tế bào vacA, kháng nguyên cagA và lông. Bộ gen H. pylori
chủng 26695 bao gồm 1587 gen, trong khi chủng J99 chỉ có 1491 gen. Mặc
dù bộ gen của chủng 26695 lớn hơn J99 tới 24kb nhưng tỷ lệ G + C đều bằng
39% và có một số đặc điểm chung bao gồm cả chiều dài trung bình của các
trình tự mã hóa, mật độ mã hóa và các codon khởi đầu. Cả hai bộ gen đều có
hai bản sao các gen 16S, 23S, 5S rRNA nhưng chủng 26695 có thêm một
bản sao 5S rRNA [5].
- Đa số các chủng phân lập ở Đông Á có gen cagA và các allen gây
độc tế bào của gen vacA. Trong khi đó, 50% số chủng ở Châu Âu và My có
các gen này. Sự khác biệt này có thể do nguồn gốc địa lý của các chủng hoặc
sự chọn lọc khác nhau của các chủng theo đặc điểm của cơ thể vật chủ.
- Tính đa dạng di truyền có thể là sự thích nghi của H. pylori đáp ứng
lại điều kiện môi trường ở dạ dày tá tràng của cơ thể vật chủ. Cơ chế tạo nên
tính đa dạng di truyền xảy ra theo con đường thông thường bằng sự sắp xếp
lại DNA và việc thêm vào hoặc bỏ đi các trình tự lạ. Các chủng đột biến
thường có thành phần G + C khác biệt và mang các gen độc lực. Sự đa dạng

6
cũng thấy ở mức độ điều hòa và biểu hiện gen dẫn đến sự đa dạng về kiểu
hình. Ví dụ như sự đa dạng kiểu hình của các enzyme sinh tổng hợp
lipopolysaccharid (LPS) [5].
- Kích cỡ bộ gen của H. pylori nhỏ hơn của các vi khuẩn khác. Tuy
vậy, trình tự của bộ gen rất khác nhau ở các chủng, ngay cả trong dạ dày của
một bệnh nhân, trình tự gen của các chủng H. pylori cũng có thể khác nhau.
- Các gen chính của H. pylori đã được xác định gồm:
Gen tổng hợp enzym urease: có khoảng 9 gen ký hiệu từ A - I, trong đó
A, B là gen cấu trúc, F, G, H là gen hoạt hóa.
Gen sinh độc tố tế bào: cagA, vacA: sinh protein gây độc vật chủ.
Tất cả các chủng H. pylori đều mang gen vacA mã hóa protein vacA
với các mức độ đa hình khác nhau [1].
+ Một số nghiên cứu về dịch tễ học bộ gen của H. pylori như sau:
- Peek và CS (1998) phát hiện gen iceA của H. pylori, thấy một trong
hai alen là iceA1 có liên quan đến loét đường tiêu hóa và sự gia tăng nồng độ
IL-8 ở màng nhầy niêm mạc dạ dày sau sự bám dính của vi khuẩn [6].
Van Doorn và CS (1998) khảo sát tại Hà Lan, kết quả là iceA1 chiếm
56,4%, iceA2 chiếm 26,6%, của 94 trường hợp. Tác giả kết luận, kiểu gen
iceA độc lập với cagA và vacA, nhưng vacA s1, cagA và iceA1 đều giữ vai
trò quan trọng bệnh sinh loét đường tiêu hóa [7].
Yamaoka và CS (1999) nghiên cứu trên 424 chủng H. pylori phân lập
từ bốn nước Colombia, My, Hàn Quốc và Nhật. Kết quả là các kiểu gen phân
bố khác nhau theo khu vực địa lý. Kiểu gen cagA+ iceA1 vacAs1c-m1 chiếm
ưu thế ở Nhật và Hàn Quốc, kiểu gen cagA+ iceA2 vacAs1b-m1 chiếm ưu
thế ở My, kiểu cagA+ iceA2 vacAs1a-m1 chiếm ưu thế ở Comlobia [8].
Van Doorn và CS (2000) công bố cấu trúc locus iceA của H. pylori.
Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp Northern Blots và RT-PCR để phân

tích sự phiên mã của iceA1 và các gen liền kề hpyIM và cysE. Kết quả cho
thấy, iceA1 không mã hóa một protein có chức năng. Sự phiên mã của hpyIM


7
(gen mã hóa CATG-methyltransferase) phụ thuộc vào sự phiên mã của
iceA1. Tác giả cho rằng, iceA1có thể gây độc thông qua điều hòa phiên mã
hpyIM. Đồng thời, Van Doorn và CS dùng real-time RT-PCR xác định mức
độ biểu hiện các gen của H. pylori trong cơ thể. Từ đó tìm hiểu mối liên quan
của các gen này với quá trình sinh viêm ở dạ dày. Các kết quả cho thấy, mức
độ phiên mã của iceA1, iceA2 và 16S rRNA độc lập. Mức độ biểu hiện của
iceA1 liên quan đáng kể với sự gia tăng nồng độ IL-8, thu hút bạch cầu đoạn
và phản ứng viêm tại lớp màng nhầy niêm mạc dạ dày [7].
Ito và CS (2000) công bố các trình tự đầy đủ của gen iceA1 từ 25
chủng H. pylori khác nhau. Các chủng vi khuẩn này phân lập được từ hai
nhóm bệnh nhân viêm và loét dạ dày tại Nhật [9].
Kidd và CS (2001) công bố kết quả khảo sát các kiểu gen iceA của H.
pylori ở Nam Phi. Tác giả sử dụng PCR kết hợp giải trình tự để xác định kiểu
gen iceA của H. pylori ở hai nhóm bệnh nhân ung thư và loét dạ dày tá tràng.
Kết quả là, iceA1 liên quan đến ung thư dạ dày, trong đó kiểu vacA s1/iceA1
chiếm tỷ lệ cao [10].
Xu và Blaser (2001) chứng minh promotor trình tự DNA khởi động
phiên mã của gen hpyIM giữa hai chủng H. pylori, gen iceA1 và iceA2 khác
nhau. Chủng có gen iceA1, hpyIM có hai promotor hoạt động độc lập. Chủng
có gen iceA2, hpyIM có một promotor khác. Mức độ phiên mã của gen này ở
chủng có gen iceA1cao hơn ở chủng có iceA2. Trình tự của hpyIM bảo tồn
cao nhưng sự biểu hiện của phức hợp iceA1-hpyIM hệ thống restrictionmodification (R-M) rất đa dạng giữa các chủng H. pylori. Hoạt động R-M
trình tự chuyên biệt CATG gây độc cho vật chủ và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tồn tại và phát triển của vi khuẩn trong vật chủ [11].
1.1.2.4. Nuôi cấy.

H. pylori là vi khuẩn khó mọc trên các điều kiện khí trường bình
thường, các tác giả nuôi cấy thành công khi sử dụng điều kiện vi hiếu khí với
nồng độ các khí: N2: O2: CO2 là 85:5:10 [1],[3],[4],[12].


8
Nhiệt độ môi trường thích hợp nhất cho H. pylori là 370C, nó có thể
phát triển được từ 34 - 370C.
pH môi trường thích hợp nhất từ 7 - 8, vi khuẩn có thể phát triển được
ở pH từ 5,5 – 8,5.
Môi trường nuôi cấy cần có các yếu tố giàu dinh dưỡng cho phát triển,
một số yếu tố phụ gia cần thiết, một số yếu tố ức chế vi khuẩn khác gồm một
số kháng sinh không nhạy với H. pylori.
Đặc điểm nuôi cấy: H. pylori khó mọc và chậm trên các môi trường
nuôi cấy, thường sau 48 - 72 giờ mọc thành khuẩn lạc nhỏ khoảng 1mm.
Độ ẩm môi trường cũng là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi
khuẩn H. pylori, theo một số nghiên cứu cho thấy độ ẩm cần thiết cho vi
khuẩn phát triển là 85% [90].
Bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm nuôi cấy là vấn đề quan trọng cho sự
thành công của ky thuật nuôi cấy H. pylori [1],[4].
1.1.2.5. Các yếu tố độc lực.
+ Enzym urease.
- Enzym urease được H. pylori tổng hợp dưới sự điều hòa của gen ure
A, B và C, là một protein có trọng lượng phân tử 550 kDa.
- Một số đặc điểm của enzym urease:
Vị trí hoạt động đòi hỏi có gắn yếu tố nikel với urease của jack Bean
và một vài loại vi khuẩn khác, tuy vậy việc hoạt hóa in vitro có thể sử dụng
được mangan và cobalt.
Trọng lượng phân tử: 480 hoặc 545 kDa (với urease Jack Bean), có
840 amino acid cho mỗi phân tử trong đó 90 là cystein.

pH hoạt động tốt nhất: 7,4.
Nhiệt độ hoạt động mạnh nhất: 600C.
Hoạt động đặc hiệu: thủy phân urea
Yếu tố ức chế: các kim loại nặng (Pb-, Pb2+)


9
Hầu hết các urease của vi khuẩn khác là hoạt động nội tế bào, ngoại trừ
urease của H. pylori là hoạt động ngoại tế bào [13].
+ Các gen phụ của H. pylori: có 5 gen là:
- Ure E - I tham gia hoạt hóa apoenzyme bằng thu nhận ion Ni+.
- Gen urel của H. pylori mã hóa cho một protein màng để tạo một lỗ
cho urea ở màng bào tương, lỗ này mở ra khi có pH acid, do vậy urea được
vận chuyển dễ dàng trong môi trường có pH acid, vì vậy gen urel có thể coi
như đầu dò độ acid của H. pylori.
+ Tính di động của vi khuẩn:
H. pylori di động nhờ 5 - 7 lông ở một cực của vi khuẩn, lông giúp vi
khuẩn quần cư trên niêm mạc và chui sâu vào các tuyến của dạ dày, lẩn tránh
tác dụng của acid dịch vị.
+ Yếu tố bám dính:
H. pylori bám vào niêm mạc dạ dày nhờ các yếu tố bám dính và các
receptor trên tế bào niêm mạc. Một số gen liên quan đến bám dính như sau:
- Gen babA (Hp 1243) và receptor là kháng nguyên Leb.
- Gen babB (Hp 0896).
- Gen alpA (Hp 0912) và alpB (Hp 0913) khi bị bất hoạt làm giảm tính
bám dính.
- Gen sabA (Hp 0725) và receptor là thụ thể Lex.
Các gen quy định tính bám dính của H. pylori thuộc nhóm 32 gen mã
hóa protein màng ngoài, tùy vào mức dộ tổng hợp ra các protein mà chúng
làm thay đổi các thành phần trên bề mặt tế bào vi khuẩn.

+ Một số enzym sinh học:
- Enzym SOD (Superoxide dismutase) tách các ion superxyd thành các
hydro, peroxyd, oxy.
- Enzym catalase giáng hóa hydrogen peroxyd thành nước và oxy,
enzym này không có hoạt tính peroxydase, nó giống urease, cần cho H.
pylori tồn tại khi tiếp xúc với các tế bào thực bào.


10
- Enzym Ahp (Alkalinhydroperoxyd).
- Gần đây, mới phát hiện enzym argininase của H. pylori, đây là enzym
trong chu trình urea hiếm có ở các vi khuẩn khác. Enzym này có thể điều
chỉnh các tế bào chủ trong sản xuất ra NO, có tác dụng bảo vệ H. pylori
chống lại NO của các đại thực bào sản xuất ra.
Các enzym và một số đặc tính trên có tác dụng bảo vệ H. pylori chống
lại hệ thống bảo vệ của cơ thể bị nhiễm vi khuẩn.
+ Độc tố cagA:
CagA (Cytotocin associated gen A) là protein có trọng lượng phân tử
120 - 140 kDa, do kết quả biểu hiện của gen cagA. Gen cagA nằm trên chuỗi
DNA của H. pylori, tại vùng tiểu đảo tạo cơ chế gây bệnh PAI (Pathogenicity
island). Có 7/31 gen của hệ thống cagPAI mã hóa các protein tương tự trong
hệ thống tiết typ IV. Tiểu đảo PAI mã hóa cho bộ máy tiết vận chuyển protein
cagA vào trong tế bào khi vi khuẩn tiếp xúc với tế bào biểu mô hoặc đại thực
bào.
Một số nghiên cứu ở châu Âu cho thấy, 60% các chủng phân lập được
là có cagA(+) và các thể bệnh viêm loét và ung thư dạ dày thường liên quan
đến các chủng có cagA(+) [1].
Một số nghiên cứu khác cho thấy, ở bệnh nhân loét tá tràng, 80 - 100%
các chủng H. pylori phân lập được có cagA(+). Trong khi đó, ở bệnh nhân
viêm dạ dày chỉ có 40 - 60% các chủng có cagA(+). Ở các bệnh nhân nhiễm

H. pylori có cagA(+), thường thấy có dị sản ruột, viêm mạn teo và ung thư dạ
dày, các yếu tố viêm như IL-1α, IL-1β, IL-8 tăng cao hơn ở người nhiễm các
chủng cagA(-)[14],[15],[16], [17], [18].
Nghiên cứu đa trung tâm tại Pháp (2001) cho thấy, 652 bệnh nhân
được nội soi, sinh thiết và làm các xét nghiệm. Những người có H. pylori với
cagA(+) thường có tổn thương mô bệnh học rất nặng như viêm dạ dày hoạt


11
động, teo niêm mạc hang vị và thân vị, dị sản ruột cao hơn người nhiễm
H. pylori có cagA(-) [18],[19], [20].
+ Yếu tố vacA:
VacA (Vacuolating cytotocin) là một protein độc tố gây rỗng tế bào
được tổng hợp bởi gen vacA.
Trọng lượng phân tử protein vacA khoảng 124 kDa, gồm peptid tín
hiệu 3 kDa, độc tố tiết ra 88.2 kDa, đoạn carboxyl cuối cùng không tiết ra 33
kDa. Tác động của vacA đã được thực nghiệm và chứng minh như sau:
- Trên invitro:
Gây rỗng bằng giết chết tế bào.
Giảm điện trở tế bào, tăng tính thấm với các ion Fe 3+, Ni2+ và các chất
chuyển hóa nhỏ, tạo điều kiện cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn.
Tạo lỗ để vận chuyển anion trong lớp lipid và trên các màng plasmic.
- Trên invivo:
Vai trò trên invivo của vacA còn một số chưa thống nhất nhưng có
nhiều ý kiến cho rằng phụ thuộc vào từng typ H. pylori. Có typ H. pylori sinh
nhiều protein vacA có độc lực mạnh gây bệnh với nhiều typ tế bào.
Cấu trúc gen vacA hiện nay được giải mã gồm hai vùng:
Vùng tín hiệu s (signal) có phần s1, s2, trong đó s1 chia ra s1a - c.
Vùng giữa (middle): 2 typ: m1, m2, trong đó m1 chia m1a, m1b.
Altherton cho rằng: các chủng s1m1 sinh nhiều protein vacA có độc

lực mạnh, chủng s2m2 không sinh độc tố, chủng s1m2 là kiểu trung gian [1],
[21].
+ Các protein tiền viêm của H. pylori.
Protein oipA (outer inflamatory protein), HP-NAP (H. pylori
neutrophil activating protein) có khả năng hoạt hóa bạch cầu đơn nhân, các tế
bào viêm.


12
+ LPS và kháng nguyên Lewis:
LPS (Lipopolysacarid) là kháng nguyên thân O của H. pylori.
Người ta phân ra 2 loại LPS trên H. pylori là R-LPS (rough LPS) có
trọng lượng phân tử thấp và S-LPS (smooth LPS) là thể mềm có trọng lượng
phân tử cao. S-LPS có một chuỗi oligosacarid ở một đầu khác nhau tùy
chủng phân lập được.
+ Các yếu tố độc lực khác:
- Các protein sốc nhiệt.
- IceA (include by contact with epithelium):
1.1.3. Phân loại Helicobacter.
Hiện nay Helicobacter được xếp vào một họ riêng là họ
Helicobacteraceae. Việc phân loại các Helicobacter dựa vào kích thước bộ
gen (1,67 – 1,72 Mb) và lượng nucleotid G+C, sự giống nhau của các đoạn
RNA của riboxom 16S. Có trên 15 loài được tìm thấy trên người và động vật
trong đó có 8 loài ở dạ dày, 6 loài ở ruột, 1 loài ở gan.
Các Helicobacter quần cư ở dạ dày người thường gặp 2 loài:
H. pylori: Chiếm tỷ lệ lớn nhất, liên quan đến các bệnh lý DDTT. Các
H. pylori được chia 4 typ dựa vào độc tố cagA, vacA [1],[20], [23].
H. heimannii: do nhà khoa học Đức Heilmann phát hiện ra, trước kia vi
khuẩn có tên là Gastrospirilium hominis, cũng có hình xoắn, dài gấp 3 lần so
với H. pylori, có 12 lông ở đầu, chủ yếu chúng quần cư ở vùng tế bào thành

niêm mạc dạ dày. Vai trò gây bệnh của H. heimanii chưa được biết rõ, một số
tác giả cho rằng chúng cũng gây viêm dạ dày nhưng nhanh chóng bị loại khỏi
dạ dày [1],[3],[23],[24].
1.1.4. Khả năng gây bệnh của H. pylori.
+ Loét dạ dày - tá tràng.
Các LDDTT thường là kết quả của VDD mạn có nhiễm H. pylori.


13
Nhiều nghiên cứu và theo dõi cho thấy: Không có trường hợp LDDTT
nào nếu không có viêm teo niêm mạc dạ dày trước đó. Mức độ và độ lan rộng
của VDD ảnh hưởng đến vị trí ưu tiên của ổ loét ở dạ dày hay tá tràng, nguy
cơ tương đối của loét tăng gấp 10 lần nếu có viêm teo. Tỷ lệ LDDTT chiếm
1/5 các trường hợp có viêm teo niêm mạc.
Trên 90% LTT có nhiễm H. pylori, nếu diệt H. pylori, tỷ lệ liền sẹo
cao, thời gian liền sẹo nhanh hơn rõ rệt, tỷ lệ tái phát giảm nhiều.
Tỷ lệ nhiễm H. pylori trong LDD mạn tính thấp hơn trong loét tá tràng
(chiếm 70 - 80%) tùy thời kỳ điều tra và phương pháp xét nghiệm (Sobala,
Axon - 1992; Tạ Long - 1997; Nguyễn Duy Thắng - 2003) [1].
+ Rối loạn tiêu hóa chức năng.
Rối loạn tiêu hóa chức năng là các rối loạn vận động dạ dày, ruột do
thần kinh chi phối, sự suy giảm chức năng tiết acid... [1],[17],[22].
+ Viêm dạ dày cấp.
Có nhiều nguyên nhân dẫn tới viêm dạ dày cấp, nếu do H. pylori
thường kèm theo thiểu toan kéo dài và dễ diễn biến thành viêm dạ dày mạn
nếu không tiệt trừ H. pylori [1],[17],[22].
+ Viêm dạ dày mạn.
Có một số yếu tố là nguyên nhân hoặc điều kiện thuận lợi của viêm dạ
dày mạn, tuy vậy nguyên nhân do H. pylori chiếm 90% các trường hợp. Các
trường hợp viêm dạ dày mạn phục hồi sau điều trị diệt H. pylori đã chứng

minh vai trò H. pylori trong cơ chế bệnh sinh của viêm dạ dày mạn [1],[22].
+ Ung thư dạ dày.
Năm 1984, tổ chức nghiên cứu về ung thư (IARC) và Tổ chức y tế Thế
giới (WHO) đã xếp H. pylori vào nhóm I các tác nhân gây ung thư, nó có liên
quan đến ung thư dạ dày cả thể ruột và thể lan tỏa [1],[17],[22].
+ U tế bào lympho niêm mạc dạ dày (u MALT)
Có nhiều nghiên cứu chứng minh liên quan của nhiễm H. pylori và u
lympho dạ dày [1],[17],[22].


14
+ Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản (GERD – Gastro-esophangus
reflux disease).
Vai trò của H. pylori với bệnh GERD còn nhiều tranh cãi, nhưng có
nhiều ý kiến cho rằng trong bệnh này nếu phát hiện có H. pylori thì nên điều
trị tiệt trừ [1],[17],[22].
+ Các bệnh ngoài đường tiêu hóa.
Có thể gặp một số bệnh ngoài đường tiêu hóa đã được chứng minh có
liên quan đến nhiễm H. pylori như:
Viêm quanh gan do H. pylori.
Thiếu máu thiếu sắt mạn tính không do giun móc.
Bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim.
Bệnh tự miễn: Hội chứng Sjogren, ban dạng thấp, ban xuất huyết do
giảm tiểu cầu...
Ngoài da: mề đay mạn tính, trứng cá, xơ cứng bì... [1], [17],[22],[30].
1.1.5. Xác định tổn thương LDD-HTT qua nội soi.
+ Loét dạ dày: Ổ loét là sự phá hủy tại một vị trí ở thành dạ dày hay tá
tràng sâu tới lớp cơ niêm hoặc hơn nữa, đường kính ổ loét thường > 5 mm
[1],[90].
- Nội soi thấy ổ loét tròn hay bầu dục, đôi khi có hình dài, hẹp, bờ đều,

phù nề và có các nếp quy tụ.
- Vị trí ổ loét có thể ở thân vị phía bờ cong lớn, bờ cong nhỏ, hang vị,
tiền môn vị… [1].
+ Loét HTT:
- Nội soi dạ dày tá tràng thấy có ổ loét đáy phủ fibrin màu xám, bờ phù
nề, xung quanh xung huyết, hình dạng ổ loét có thể tròn hoặc nham nhở hình
sao hoặc như một rãnh nứt sâu…các dạng hay gặp trong loét hành tá tràng:
Ổ loét tròn, kích thước 5 – 20 mm.
Loét bờ không đều, hình sao hoặc tam giác.


15
Loét Salami: trông như miếng súc sích, có nhiều loét nhỏ trên niêm
mạc phù nề hoặc tấy đỏ.
Ổ loét dài, hẹp: dạng nứt rãnh sâu ở đỉnh nếp niêm mạc tá tràng phù
nề, dài 1 – 2 mm, rộng 1 – 2 mm.
Ổ loét thành sẹo: có thể lõm như hình chậu hoặc sẹo dài hẹp trên nền
biểu mô đang tái tạo hoặc sẹo ở giữa có các nếp niêm mạc quy tụ hoặc sẹo
làm co kéo và biến dạng hành tá tràng [1].
1.2. Các phương pháp xét nghiệm xác định nhiễm H. pylori hiện nay.
1.2.1. Các test có sử dụng thủ thuật xâm lấn.
1.2.1.1. Nội soi dạ dày, lấy mảnh sinh thiết cho xét nghiệm.
Đánh giá tổn thương tại dạ dày trong khi nội soi, các tổn thương dạ dày
do H. pylori là những vết trợt mạn tính ở hang vị, viêm dạng cục nhỏ nổi lên
trên bề mặt niêm mạc dạ dày kèm những ban nhỏ ở vùng hang vị... Tuy vậy,
giá trị dự báo riêng của nội soi không cao và không chắc chắn, chỉ có giá trị
định hướng cho các nhà nội soi trong chẩn đoán nhiễm H. pylori, cần kết hợp
với các phương pháp xét nghiệm xác định vi khuẩn.
Các mảnh sinh thiết để xét nghiệm xác định H. pylori được lấy khi nội
soi dạ dày, vị trí lấy các mảnh sinh thiết là: hang vị và thân vị, không sinh

thiết trên tổ chức bệnh lý. Số lượng mảnh sinh thiết tùy chỉ định các xét
nghiệm, thường lấy 2 - 4 mảnh cho làm 1 - 3 ky thuật [1],[4],[26].
1.2.1.2. Test urease.
H. pylori có lượng enzym urease cao gấp hàng trăm lần các vi khuẩn
đường ruột khác, do vậy người ta dùng đặc tính này để áp dụng xác định sự
có mặt của vi khuẩn trong bệnh phẩm.
Test urease nhanh (RUT - Rapid urease test) được công bố vào năm
1986, đầu tiên có tên CLO test (Campylobacter like organism test) do tên đầu
tiên của vi khuẩn H. pylori là Campylobacter like organism.
Có nhiều loại test urease với các tên thương phẩm khác nhau tùy theo
nước và hãng sản xuất, hiện nay theo khuyến cáo của Hội Tiêu hóa Việt Nam,


16
tại các nơi bệnh viện tuyến tỉnh và Trung ương, khoa Vi sinh có thể tự pha
chế test urease theo công thức chung có độ nhạy và độ đặc hiệu tương tự như
các test thương phẩm.
Nguyên lý của test urease: Khi đặt mảnh sinh thiết vào test, nếu trong
mảnh sinh thiết có urease thì nó sẽ thủy phân urea thành amoniac và CO 2,
amoniac trong môi trường có nhiều nước sẽ tạo các gốc amoni (NH 4+) sẽ làm
tăng độ pH của môi trường, làm cho chất chỉ thị màu đỏ phenol từ không
màu trong môi trường trung tính sang màu đỏ cánh sen ở môi trường kiềm,
có thể thấy sự chuyển màu này bằng mắt thường.
H. heimannii cũng dương tính với test urease.
Test urease được khuyến cáo dùng rộng rãi tại các phòng nội soi dạ
dày tá tràng, độ nhạy và đặc hiệu tùy từng cơ sở, tuy vậy giá trị của chung là:
độ nhạy: 89 - 95%, độ đặc hiệu: 90 - 98% [1],[22],[28],[31],[32].
1.2.1.3. Xét nghiệm mô bệnh học.
+ Vị trí lấy mảnh sinh thiết và vận chuyển bệnh phẩm.
Theo hướng dẫn lấy mẫu của Sydney system: lấy 2 mảnh sinh thiết ở

hang vị, 2 mảnh ở thân vị.
Bệnh phẩm lấy xong được ngâm trong dung dịch formaldehyd 10% để
cố định, để trong nhiệt độ phòng và gửi tới phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
Bệnh phẩm cố định bằng formaldehyd để được < 1 tuần. Không cố
định bằng dung dịch Bauin, vì làm thay đổi hình dạng H. pylori.
+ Các ky thuật nhuộm của chuyên nghành giải phẫu bệnh học:
Các mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày được cố định, đúc parafin và cắt
theo phương pháp thông thường, độ dày lát cắt từ 4 - 6 µm.
Tiêu bản có thể nhuộm bằng các ky thuật khác nhau tùy điều kiện của
từng cơ sở Giải phẫu bệnh và sự quen dùng của người đọc tiêu bản.
- Nhuộm HE (Hematoxilin - Eozin) có độ nhạy thấp hơn các ky thuật
khác nhưng có thể xác định được tổn thương niêm mạc dạ dày, được ứng
dụng rộng rãi tại nhiều nước, cần lưu ý là mảnh sinh thiết để xét nghiệm tìm


17
H. pylori chỉ lấy ở hang vị và thân vị, không lấy tại vị trí ổ loét nên việc quan
tâm về tế bào học ở đây chỉ là thứ yếu.
- Nhuộm bạc Warthin starry: cho hình ảnh H. pylori dễ nhận biết, có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao, tuy vậy ky thuật thực hiện phức tạp và tốn kém, đôi
khi có hình ảnh giả tạo, ky thuật này chưa được phổ biến.
- Nhuộm Giemsa: là ky thuật đơn giản, dễ làm, không tốn kém, độ
nhạy và đặc hiệu tương tự nhuộm Warthin starry, được dùng rộng rãi.
- Nhuộm Gram: cho phép phát hiện được vi khuẩn, tuy vậy với các tiêu
bản cắt và đúc nến thì nhuộm Gram khó thực hiện và khi đọc tiêu bản cũng
khó phát hiện vi khuẩn [33].
- Nhuộm Acridin Orange: nhuộm màu huỳnh quang có gắn chất đặc
hiệu với DNA của vi khuẩn, soi tìm vi khuẩn dưới kính hiển vi huỳnh quang,
nếu có H. pylori sẽ thấy vi khuẩn bắt màu da cam ánh vàng. Ky thuật này có
độ nhạy 89%, đặc hiệu 87%. Tuy vậy ky thuật ít thực hiện vì phức tạp, phải

thực hiện tại cơ sở có kính hiển vi huỳnh quang [34],[35],[36],[37].
- Nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể đánh dấu: có độ nhạy và đặc
hiệu cao (độ nhạy 95%, đặc hiệu 100%), nhưng khó thực hiện, đắt tiền [1].
+ Cách đánh giá tiêu bản:
- Hình dạng điển hình của H. pylori có dạng cong hoặc xoắn, dài 2,5 4 µm, rộng 0,5 µm. Vi khuẩn H. pylori được nhìn thấy bám vào niêm mạc dạ
dày hoặc ở tự do trong dịch ở lòng ống tuyến, thậm chí chúng có thể ở cả
khoảng gian bào, rất ít các vi khuẩn được nhìn thấy nằm trong tế bào, một số
vi khuẩn có thể được nhìn thấy vượt qua màng đáy niêm mạc dạ dày hoặc
trong hạch lympho.
- Để đánh giá mức độ nhiễm H. pylori, có thể bán định lượng bằng các
dấu (+), có nhiều quan điểm về đánh giá mật độ H. pylori khi soi kính hiển
vi, hiện nay có một số cách phân loại như sau:
Theo Hệ thống Sydney 1996 (Dixon et al):[18],[38],[39],[40].
Nặng (+++):

>20 vi khuẩn/1 ống tuyến.


18
Vừa (++):

10- 20 vi khuẩn/ ít nhất 1 ống tuyến.

Nhẹ (+):

<10 vi khuẩn/ 1 ống tuyến.

Theo Tokunaga và CS (2000)[41].
Độ 0:

Không thấy vi khuẩn

Độ 1 (+):

1 – 9 vi khuẩn/1 vi trường

Độ 2 (+):

10 – 29 vi khuẩn/1 vi trường

Độ 3 (+):

30 – 99 vi khuẩn/1 vi trường

Độ 4 (+):

≥ 100 vi khuẩn/1 vi trường.

1.2.1.4. Nhuộm soi vi khuẩn.
Một số tác giả đề xuất ky thuật áp mảnh sinh thiết lên lam kính hoặc
trong khi nội soi thì dùng bàn chải để chải toàn bộ niêm mạc dạ dày vùng
hang vị, sau đó phết lam, để khô tự nhiên rồi cố định bằng cồn - ether sau đó
nhuộm Gram, huỳnh quang hoặc Giemsa.
Đây là ky thuật thực hiện nhanh, rẻ tiền, dễ làm. Tuy nhiên độ nhạy và
độ đặc hiệu phụ thuộc vào kinh nghiệm người đọc, tùy từng ky thuật và một
số yếu tố ảnh hưởng khác [1],[32],[42],[43],[44].
1.2.1.5. Nuôi cấy vi khuẩn.
+ Yêu cầu khí trường.
H. pylori là vi khuẩn khó mọc trên các điều kiện khí trường bình
thường, các tác giả nuôi cấy thành công khi sử dụng điều kiện vi hiếu khí với

nồng độ các khí: N2: O2: CO2 là 85: 5: 10 [3],[4].
Hiện nay có một số hãng sản xuất các thiết bị tạo khí trường để nuôi
cấy H. pylori như túi Aerocal C, túi Genbag microaerobic....
H. pylori có thể mọc được trong bình nến, có đủ độ ẩm, tuy vậy nó
mọc chậm và khuẩn lạc nhỏ hơn so với điều kiện tiêu chuẩn [12].
+ Nhiệt độ, pH môi trường.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho H. pylori phát triển là 370C, nó có thể phát
triển được từ 34 - 370C.
pH thích hợp nhất: 7 - 8, có thể phát triển được ở pH từ 5,5 – 8,5.


19
+ Môi trường nuôi cấy:
Yêu cầu môi trường nuôi cấy H. pylori cần có các điều kiện sau:
- Các yếu tố giàu dinh dưỡng: Các thành phần trong thạch dinh dưỡng
như thạch máu, thạch Columbia, thạch não tim, Thayer martin...
- Một số yếu tố phụ gia cần thiết: máu người 7% hoặc máu ngựa 7%
hoặc máu cừu 7% cùng với một số vitamin.
- Một số yếu tố ức chế vi khuẩn khác và nấm.
+ Đặc điểm nuôi cấy:
- H. pylori rất khó mọc và mọc chậm trên các môi trường nuôi cấy.
Trên các môi trường nuôi cấy, sau 48 - 72 giờ, H. pylori mọc thành khuẩn lạc
nhỏ khoảng 1mm, màu trong hoặc xám nhạt, đôi khi có tan máu.
- Độ nhạy của ky thuật nuôi cấy H. pylori phụ thuộc vào điều kiện bảo
quản mẫu, môi trường nuôi cấy, khí trường, nhiệt độ... Nếu các điều kiện trên
thích hợp thì có thể phát hiện được H. pylori trong bệnh phẩm ở nồng độ > 5
CFU/ mg bệnh phẩm [1]. Tỷ lệ nuôi cấy thành công 50 - 70% [4].
1.2.1.6. Nghiên cứu sử dụng kính hiển vi điện tử.
Cho phép nghiên cứu các siêu cấu trúc của vi khuẩn, các thay đổi siêu
cấu trúc tế bào bị nhiễm vi khuẩn, vị trí cư trú của vi khuẩn.....

Nhược điểm ky thuật hiển vi điện tử là: độ nhạy thấp vì các lát cắt rất
mỏng không đủ đại diện, chỉ thực hiện được ở các labo có kính hiển vi điện
tử, máy siêu cắt và các hóa chất chuyên dùng, đòi hỏi có các ky thuật viên
chyên sâu, giá thành xét nghiệm cao, không thể thực hiện thường quy trong
vi sinh lâm sàng [1],[3].
1.2.2. Các test không sử dụng thủ thuật xâm lấn.
1.2.2.1. Các test huyết thanh.
+ Xét nghiệm huyết thanh định tính:
- Xác định lượng kháng thể IgG kháng H. pylori ở ngưỡng nào đó
được cho là dương tính (được quy chuẩn chung) trong máu người bệnh.


20
- Đây là xét nghiệm đơn giản, dễ sử dụng, có thể lấy máu đầu ngón tay
hoặc huyết thanh bệnh nhân, có thể thực hiện tại phòng khám.
- Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm khoảng 95%, tuy nhiên nó
không đặc hiệu cho tình trạng đang bị nhiễm H. pylori và không dùng để
đánh giá hiệu quả của liệu pháp kháng sinh vì kháng thể tồn tại lâu trong cơ
thể sau khi đã tiệt trừ được H. pylori.
- Một số test tìm kháng thể trong nước bọt, độ nhạy 66 - 82% [45].
+ Xét nghiệm định lượng kháng thể:
- Kháng thể IgM chỉ xuất hiện trong giai đoạn cấp của nhiễm khuẩn.
Kháng thể IgG tồn tại lâu trong máu, chỉ giảm đáng kể sau liệu pháp
tiệt trừ H. pylori thành công sau 6 tháng, sau khoảng 12 tháng thì giảm gần
hoàn toàn, tuy vậy nếu có tái nhiễm H. pylori trở lại thì nó lại tăng cao.
- Các xét nghiệm định lượng kháng thể chủ yếu dùng trong điều tra
dịch tễ, ít dùng trong chẩn đoán lâm sàng do sự tồn tại của kháng thể rất lâu.
- Hiện nay chủ yếu dùng ky thuật ELISA định lượng các kháng thể
trong máu bệnh nhân, tuy vậy cần xác định giá trị ngưỡng của lượng kháng
thể ở người bình thường. Giá trị ngưỡng này có thể khác nhau tùy vùng địa lý

và lứa tuổi [1],[28],[48].
Một số tác giả sử dụng ky thuật Western blot phát hiện kháng thể IgG
trong máu hoặc trong nước bọt có độ nhạy khá cao [49],[50].
Ky thuật hóa miễn dịch khô cũng được dùng để xác định kháng thể
kháng H. pylori, độ nhạy > 90% [1].
+ Tìm kháng thể trong nước bọt và nước tiểu.
Một số nghiên cứu tìm kháng thể IgA trong nước bọt và nước tiểu.
Có thể tìm kháng thể đặc hiệu kháng H. pylori trong nước tiểu, theo
một số tác giả, có độ nhạy cao (nhạy 95,9%; đặc hiệu 90%), phục vụ tốt cho
điều tra dịch tễ [51].


21
1.2.2.2. Test hơi thở.
Test hơi thở được Graham và CS công bố năm 1997, sử dung carbon
đánh dấu là C13 hoặc C14 trong dung dịch urea.
+ Nguyên lý: sử dụng dung dịch urea có C13 cho bệnh nhân uống vào
dạ dày, H. pylori có men urease sẽ phân hủy nhanh urea thành amoni và CO 2,
khí CO2 có C13 đánh dấu được hấp thu vào máu và đào thải qua phổi, thu lấy
phần khí đó và đo trên máy quang phổ kế để phát hiện C 13 được thải ra, nếu
có mặt carbon đánh dấu trong khí thở ra thì gián tiếp đánh giá sự có mặt của
H. pylori trong dạ dày người bệnh.
+ Độ nhạy và đặc hiệu: 90 – 98% [1],[22],[28],[35],[52],[53].
1.2.2.3. Test tìm H. pylori trong phân.
H. pylori quần cư tại dạ dày của người, vì vậy nó có thể được đào thải
qua phân, tuy vậy trong phân có hệ thống các vi khuẩn chí rất phức tạp, vì
vậy việc tìm H. pylori trong phân đòi hỏi phải có quy trình xét nghiệm hợp lý
và công nghệ cao thì xét nghiệm mới có giá trị chẩn đoán.
Tại Nhật, người ta sản xuất test tìm kháng nguyên vi khuẩn H. pylori
trong phân, theo một số báo cáo có độ nhạy 89%, có thể sử dụng để xác định

nhiễm H. pylori cho trẻ em khi không nội soi dạ dày được.
Có thể thực hiện test bằng ky thuật PCR phát hiện H. pylori trong
phân, tuy vậy độ nhạy và độ đặc hiệu của ky thuật này theo nhiều nghiên cứu
có kết quả rất khác nhau [1],[54],[55].
1.3. Các kỹ thuật real-time PCR xác định H. pylori.
1.3.1. Giới thiệu chung về real-time PCR.
1.3.1.1. Nguyên lý kỹ thuật.
Là một cải biên của ky thuật PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase
của Taq DNA polymerase do Holland và CS công bố năm 1991. Là ky thuật
nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành nhiều bản sao dựa vào chu kì
nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống được hiển thị cùng lúc với phản ứng


22
khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được qua thiết bị đọc
tín hiệu huỳnh quang chuyên biệt. Trong phản ứng real-time PCR, thường sử
dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch
đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng đánh
dấu mẫu dò đặc hiệu (Taqman, Beacon ...) [57],[58],[59].
1.3.1.2. Real-time PCR dùng màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA.
- Các thuốc nhuộm huỳnh quang thường dùng: Ethydium bromide,
SYBR green, EVA green, LCG green…
- Nguyên lý: khi không có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại PCR,
chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix, do vậy tube phản
ứng không phát huỳnh quang hoặc phát rất yếu khi có nguồn sáng kích thích.
Khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại PCR, màu huỳnh quang chèn
tập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại, khi chiếu ánh sáng
kích thích nó sẽ phát màu mạnh hơn và ghi nhận được qua CCD camera.
Hiện nay, có nhiều cải tiến về các màu huỳnh quang chèn làm khả
năng phát huỳnh quang cao hơn và không bị ức chế phản ứng. Các chất

huỳnh quang này được gọi là các thuốc nhuộm huỳnh quang phân giải cao
(HRM – high resolution melting dye). Có nhiều loại HRM dùng cho các loại
máy real-time PCR của các hãng sản xuất khác nhau (EVA green, BEBO,
BOXTO dùng cho máy real-time PCR thông dụng, CYTO9, LC green chỉ
dùng cho máy của Roche…).
Các thuốc nhuộm huỳnh quang HRM cho kết quả đỉnh chảy cao và rõ
ràng, chỉ cần phân tích trong khoảng nhiệt độ hẹp, cho phép dùng multiplex
real-time PCR, cường độ huỳnh quang mạnh, có thể dùng tốt cho chạy đa
mồi, phát hiện các SNP, định typ vi sinh vật... [57],[59].

Hình 1: Real-time PCR dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EvaGreen [59].


23
1.3.1.3. Real-time PCR dùng các đầu dò đánh dấu huỳnh quang (probe).
+ Đầu dò đánh dấu huỳnh quang (probe):

là những đoạn oligo-

nucleotide mạch đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệu
trên DNA đích. Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong tube phản
ứng, sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch
đại, do đó, khi có nguồn sáng kích thích thì nó sẽ phát huỳnh quang và ghi
nhận được qua thiết bị CCD camera. Có nhiều loại probe dùng làm đầu dò
như Taqman, Beacon, các probe lai…
+ Đầu dò Taqman (Taqman probe):
Taqman probe là những oligonucleotid có trình tự bổ sung với trình tự
đặc hiệu trên DNA đích, kích thước từ 24 – 30 base, đầu 5’ có gắn chất huỳnh
quang gọi là reporter, đầu 3’ gắn chất hấp phụ tương ứng gọi là quencher.
Nguyên lý hoạt động của Taqman probe: khi chưa có sản phẩm khuếch

đại đặc hiệu từ DNA đích thì các Taqman probe còn nguyên vẹn, do đó, chất
huỳnh quang phát ra từ đầu 5’ bị quencher ở đầu 3’ hấp phụ làm cho tube
phản ứng không phát được huỳnh quang. Khi bắt đầu có sản phẩm khuếch
đại đặc hiệu thì Taqman probe bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm ở giai
đoạn nhiệt độ bắt cặp, khi đó enzym Taq polymerase hoạt động cắt bỏ để kéo
dài mồi tổng hợp lên sợi bổ sung. Do đó, các reporter bị cắt rời xa các
quencher và phát được tín hiệu huỳnh quang khi có nguồn sáng kích thích.
Có thể ghi nhận được cường độ các tín hiệu này trên CCD camera.
Reporter: là chất gắn vào đầu 5’ của Taqman probe, có khả năng phát
huỳnh quang khi có ánh sáng kích thích. Có nhiều loại hóa chất dùng làm
reporter với độ dài sóng kích thích khác nhau như FAM, TAMRA, TET…
Quencher: là các chất có khả năng hấp phụ được ánh sáng huỳnh
quang phát ra từ reporter. Có hai loại là quencher phát huỳnh quang và
quencher phát nhiệt. Quencher phát huỳnh quang khi hấp phụ huỳnh quang
từ reporter sẽ chuyển năng lượng hấp phụ được thành ánh sáng nhưng không
ghi nhận được trên CCD camera, tuy vậy cần lưu ý vấn đề trùng sóng với


24
reporter khi dùng quencher loại này. Quencher phát nhiệt có tác dụng chuyển
năng lượng hấp phụ thành nhiệt, loại này hay được dùng, đặc biệt cho thiết kế
multiplex real-time PCR do không lo vấn đề trùng bước sóng với reporter.
Thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe: cần lưu ý một số
điểm: nhiệt độ nóng chảy của mồi 55 – 60 0C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy
của Taqman probe 5 – 100C. Kích cỡ sản phẩm khuếch đại từ 75 – 150 bps,
tuy vậy, còn phụ thuộc vào độ đặc hiệu của độ dài đích.
Thiết kế Taqman probe: nên để độ dài không quá 30 base. Tỷ lệ GC
chiếm 30 – 80%, C nhiều hơn G. Đầu 5’ gắn reporter không là G.
Chương trình luân nhiệt real-time PCR dùng Taqman probe: nên chạy
2 giai đoạn nhiệt: biến tính ở 94 – 950C trong 15 – 30 giây. Vừa bắt cặp và

kéo dài chuỗi ở 600C trong 30 – 60 giây.
Ky thuật này thể hiện tính ưu việt và chính xác vì nó chỉ cho phép định
lượng các đoạn DNA có gắn đặc hiệu, có thể đọc được kết quả khi có cả các
sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu và có thể dùng thử nghiệm đa mồi, tuy
vậy đây là ky thuật còn đắt tiền.
Ưu điểm đầu dò Taqman: chỉ phát tín hiệu huỳnh quang khi có sự lai
đặc hiệu giữa đầu dò và đích. Đầu dò có thể được đánh dấu với các chất phát
màu khác nhau trong cùng một phản ứng, do vậy có thể thực hiện được
multiplex PCR. Không phải xử lý số liệu sau khi thực hiện PCR, dễ thực hiện
phản ứng.
Nhược điểm đầu dò Taqman: với mỗi thử nghiệm khác nhau phải thiết
kế kích cỡ probe khác nhau [57],[58],[59].


25

Hình 2: Ky thuật real-time PCR với mẫu dò Taqman.
Denature – biến tính; Anneal – bắt cặp; Extend – kéo dài chuỗi [59]

+ Đầu dò phân tử Beacon (Beacon probe):
Phân tử Beacon là probe có kích thước 25 – 40 base, đầu 5’ gắn
reporter, đầu 3’ gắn quencher. Ở giữa probe là trình tự bổ sung đặc hiệu trên
sợi DNA đích, hai đầu có trình tự bổ sung nhau 5 – 6 base làm cho probe gắn
hai đầu với nhau như cái kẹp tóc.

Hình 3: Ky thuật real-time với mẫu dò beacon.
1 - Mô phỏng probe Beacon; 2 – Probe Beacon gắn vào DNA đích [59].

+ Các probe lai (Hybridization probe):
Nguyên tắc của ky thuật là dùng 2 probe, probe lai 1 có đầu 3’ gắn chất

phát huỳnh quang D (donor), probe lai 2 gắn có đầu 5’ gắn chất phát huỳnh
quang A (acceptor) và một gốc phosphat ở đầu 3’. Hai probe được thiết kế