XÁC ĐịNH NGƯờI LÀNH MANG GEN BệNH TRONG GIA ĐÌNH BệNH NHÂN β THALASSEMIA

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh thalassemia gây thiếu máu tan máu là bệnh thường gặp ở trẻ em
Việt Nam và cũng là bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên thế giới. Bệnh
có hai biểu hiện nổi bật là thiếu máu và ứ sắt trong cơ thể. Trẻ bị bệnh
thalassemia thường chậm phát triển thể chất, hiện tại chưa có phương pháp
điều trị khỏi bệnh, chủ yếu là điều trị triệu chứng suốt đời. Tại Việt Nam, tỷ lệ
người mang gen bệnh phân bố trong cả nước và khác nhau tùy từng địa
phương, từng nhóm dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh rất cao ở các dân
tộc ít người như: Mông (25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8.33%) [1].
Theo thống kê, cả nước hiện mới quản lý được khoảng 20.000 bệnh
nhân, trung bình mỗi năm có khoảng 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh. Tổ chức y tế
thế giới WHO đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và
khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những
ưu tiên về di truyền người.
β-thalassemia do đột biến gen β-globin, nằm trên cánh ngắn NST 11, gây
giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β- globin. Cho đến nay, có khoảng hơn 200 đột
biến đã được tìm thấy trên gen β-globin. Ở người Việt Nam, theo một nghiên
cứu của M.L. Saovaros Svasti và cộng sự năm 2002cho thấy có 8 đột biến gây
ra 95% các trường hợp β-thalassemia [2].
Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh β-thalassemia chia làm 3 thể chính:
thể nhẹ, thể trung gian, thể nặng. Bệnh nhân thể nặng hay còn gọi là thể
Cooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép hai đột biến khác nhau sẽ bị thiếu
máu nặng, có chất lượng cuộc sống thấp. Bệnh nhân thể nhẹ dị hợp tử với
một đột biến trên gen β-globin, là người lành mang gen bệnh thường không
có biểu hiện lâm sàng, cơ thể phát triển bình thường, có thiếu máu nhược sắc
trên công thức máu. Những người này có thể kết hôn và truyền gen bệnh cho


2

con cái, đây chính là nguồn phát tán gen bệnh chủ yếu trong cộng đồng.
Bệnh hiện chưa có phương pháp điều trị triệt để, liệu pháp gen và ghép tế
bào nguồn đã có những bước đầu thành công tuy nhiên những cách này khá
tốn kém và không phải lúc nào cũng thực hiện được.
Bệnh β-Thalassemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm
sàng và các xét nghiệm huyết học. Các xét nghiệm di truyền phân tử xác định
các đột biến trên gen β-globin là điều kiện cần thiết để khẳng định rõ thể
bệnh, phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm hạn
chế những thai nhi bị bệnh là một biện pháp thiết yếu và hữu hiệu nhằm giảm
tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng. Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR đã được sử
dụng khá rộng rãi để phát hiện đột biến gen gây bệnh β-thalassemia do có độ
chính xác cao, giá thành rẻ và ít phức tạp. Ở Việt Nam việc áp dụng các kỹ
thuật sinh học phân tử tại các phòng xét nghiệm khác nhau để xác định đột
biến gen các bệnh lý di truyền ngày càng được khuyến khích mở rộng để giúp
ích cho công tác chẩn đoán và phòng bệnh. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài
“Xác định người lành mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân βThalassemia” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Xác định người lành mang gen β-globin dị hợp tử trên các thành
viên gia đình bệnh nhân β-thalassemia.
2. Mô tả một số đặc điểm huyết học ở người lành mang gen bệnh.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ HỒNG CẦU, HEMOGLOBIN
VÀ BỆNH β-THALASSEMIA
1.1.1. Hồng cầu
Hồng cầu là những tế bào không nhân, soi tươi giống như những chiếc

đĩa lõm hai mặt, màu vàng rạ, trên phiến kính nhuộm giemmsa, thấy hồng cầu
hình tròn, màu hồng, ở giữa nhạt màu hơn.
Kích thước hồng cầu: 7-7,5 micromet, dày 2,3 micromet.
Thể tích hồng cầu: 90-100m3
Đời sống trung bình hồng cầu: 100-120 ngày.
Nơi sản sinh hồng cầu: tủy xương
Nơi phân hủyhồng cầu: hồng cầu già bị phân hủy chủ yếu tại lách, tủy
xương và gan. Hàng ngày có khoáng 0,85-1% tổng số hồng cầu già bị phân
hủy (tan máu sinh lý) và một tỉ lệ tương tự hồng cầu non được sinh ra để thay
thế.
Nhiệm vụ cơ bản của hồng cầu là vận chuyển oxy tới các tổ chức, các
mô, các tế bào trong cơ thể thông qua vai trò của huyết sắc tố hay hemoglobin
viết tắt là Hb chứa trong hồng cầu [3].
1.1.2. Hemoglobin bình thường
Định nghĩa:
Hemoglobin là thành phần chủ yếu của hồng cầu, là một phân tử protein
có sắc tố hem làm cho hồng cầu có màu đỏ. Hemoglobin có khả năng kết hợp
và phân ly với oxy và CO2 để vận chuyển các khí này trong cơ thể.


4

Cấu trúc mỗi phân tử hemoglobin bao gồm bốn tiểu đơn vị polypeptid
được liên kết với nhau bởi các liên kết như: liên kết ion, liên kết hydro, tương
tác kỵ nước, lực Van-der-waals và sắc tố hem trong mỗi tiểu đơn vị. Mỗi nhóm
hem có chứa một nguyên tử Sắt tích điện dương (Fe+2) có thể liên kết thuận
nghịch với các phân tử oxy. Lúc này cấu trúc hình thái của hemoglobin cũng
thay đổi để thích hợp với việc liên kết và vận chuyển oxy đến các khu vực khác
nhau trong cơ thể.
Cấu trúc của hemoglobin gồm 2 phần: Phần globin và phần hem.

Phần hem: Hem là phần tạo nên màu đỏ của hồng cầu, có cấu trúc chung
cho nhiều loài. Hem có cấu tạo là một vòng protoporphyrin và một nguyên tử
sắt hóa trị 2(Fe+II) [5]. Nhân protoporphyrin gồm 4 vòng pyrol gắn với nhau
qua liên kết allyl (-CH=), và chứa các thành phần như methyl (-CH3), vinyl (CH=CH2), propionic (-CH2-CH2-COOH). Nguyên tử sắt nằm ở trung tâm,
nhờ hai liên kết chặt chẽ với hai nguyên tử nitơ và hai liên kết giả với hai
nguyên tử nitơ khác.

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc phân tử hemoglobin ở người trưởng thành
-Cấu trúc bậc 4 của hemoglobin [nguồn: vtv.vn]
Đây là cấu trúc không gian ba chiều của phân tử hemoglobin: 2 phân tử α
là màu xanh ngọc, hai phân tử β là màu đỏ, nhóm hem là màu xanh lá cây.


5

Phần globin: Globin có bản chất là protein. Ở người, globin được cấu
tạo bởi bốn chuỗi polypeptid, giống nhau từng đôi một. Mỗi một chuỗi
polypeptid gắn với một hem. Vì vậy mỗi phân tử hemoglobin có hai đôi chuỗi
polypeptid và bốn hem đều có khả năng vận chuyển được bốn phân tử oxy [4].
Trong quá trình phát triển của cơ thể, các loại chuỗi polypeptid có sự chuyển
đổi, loại này thay thế loại kia ở từng giai đoạn của cuộc sống, các loại chuỗi
polypeptid được ký hiệu bằng chữ Hy Lạp α, β, γ , δ. Tùy từng loại chuỗi
polypeptide mà quyết định loại hemoglobin khác nhau.
Các loại hemoglobin sinh lý
Sự tổng hợp chuỗi polypeptid và thành phần các hemoglobin sinh lý thay
đổi qua các thời kỳ và lứa tuổi khác nhau [4], [5], [6].

Hình 1.2. Các loại hemoglobin ở người [7]
Như vậy ở thời kỳ đầu của bào thai, các chuỗi polypeptid ε, α, γ được
tổng hợp là chủ yếu, chuỗi ζ được tổng hợp rất sớm và mất đi nhanh chóng.

6
Sau tháng thứ 2 chuỗi α và γ được tổng hợp là chính cà HbF tồn tại chủ yếu
như như thành phần Hb chủ yếu của bào thai.
Sau đẻ chuỗi γ giảm nhanh chóng nhường chỗ cho chuỗi β. Vì vậy sau
đẻ HbF giảm đi nhanh chóng, thay vào đó lượng HbA1 tăng lên. Đến cuối năm
thứ nhất HbF chỉ còn dạng vết, HbA1 đạt cao trên 95%.
Chuỗi δ được tổng hợp chủ yếu ở thời kỳ sau khi đẻ, với lượng tăng dần
đến tuổi trưởng thành. Ở người lớn thì thành phần Hb chỉ còn 2 loại HbA 1
(97-99%) và HbA2 (1-3%).
Ở giai đoạn cuối của bào thai, huyết sắc tố F (α2γ2) chiếm khoảng 80%.
Ở trẻ sơ sinh, huyết sắc tố F vẫn chiếm tỉ lệ cao, tỷ lệ này giảm dần và
được thay thế bằng huyết sắc tố A.
Bảng 1.1. Các chuỗi hemoglobin theo lứa tuổi [7]
Hb sinh lý

Cấu trúc

Thời kỳ xuất hiện

Hb Porland

globin
ζ2γ 2

Hb Gower1

ε2ζ2

Thai 2-3 tuần, có trong 2 tháng đầu của thai

HbGower 2

α2ε2

Xuất hiện và có cùng Hb Gower1

HbF

α2γ 2

Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi

HbA2

α2δ2

Thai nhi gần đẻ, Hb ở người bình thường

HbA1

α2β2

Bào thai 6 tuần, Hb chủ yếu ở người bình thường

Phôi thai 2-3 tuần

HbF chiếm ưu thế trong máu bào thai, có ái lực với oxy cao hơn HbA,
cho phép hồng cầu bào thai vận chuyển được một lượng oxy thích hợp trong

điều kiện phân áp oxy thấp của môi trường thai nhi. Khi đứa bé ra đời, phổi


7

trở thành cơ quan trao đổi khí, HbA dần dần thay thế cho HbF. Khi đứa trẻ
được 6 tháng tuổi, sự thay thế này sẽ hoàn tất [8], [9], [10].
Các chuỗi polypeptid đều có cấu trúc từ các acid amin được sắp xếp theo
một trình tự chặt chẽ. Các chuỗi δ có 141 acid amin, còn các chuỗi α, β, γ có
146 acid amin.
Sự điều hòa tổng hợp các chuỗi polypeptid của globin được thực hiện bởi
các gen điều hòa (regulator gen), theo một quy trình phức tạp, những gen này
nằm ở các nhiễm sắc thể khác nhau. Gen điều khiển tổng hợp chuỗi α (gọi tắt là
gen α) nằm trên nhánh ngắn của đôi nhiễm sắc thể 16. Còn gen điều khiển tổng
hợp chuỗi β nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) [11].
1.1.3. Phân loại bệnh hemoglobin
Bệnh hemoglobin là nhóm bệnh di truyền phổ biến của loài người.
Những thay đổi bệnh lý phần lớn khu trú ở phần globin của phân tử
hemoglobin, gây nên nhóm bệnh gọi là bệnh hemoglobin và được xếp thành
hai nhóm:
• Nhóm hemoglobin bất thường: do sự thay đổi cấu trúc của các
chuỗi polypeptid ở phần globin. Sự thay đổi của các acid amin, gây nên sự
biến đổi cấu trúc của chuỗi polypeptid, từ đó có thể làm thay đổi tính chất lý,
hóa của phân tử hemoglobin gây bệnh hemoglobin. Ví dụ: Bệnh HbE (acid amin
ở vị trí thứ 26 trong chuỗi β-globin là glutamin bị thay thế bởi lysine) [12].
• Nhóm thalassemia: Do sự thay đổi về số lượng của các chuỗi globin,
thiếu hụt một loại chuỗi globin nào đó trong hai loại α và β. Nếu sự thiếu hụt
ở chuỗi β được gọi là β-thalassemia. Nếu thiếu hụt ở chuỗi α được gọi là α-

8

thalassemia. Trường hợp hai chuỗi α và β bị thiếu hụt hơn bình thường được
gọi là α //β thalassemia [13].


9

Cơ chế bệnh sinh của bệnh thalassemia:
Năm 1944 Valentin và Neel cho rằng: Thalassemia là một bệnh di truyền
gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Những thay đổi gen kiểm soát sự tổng hợp
hemoglobin như đột biến điểm, đứt đoạn, trao đổi đoạn dẫn đến thay đổi số
lượng hoặc chất lượng chuỗi polypeptide của globin.
Bệnh thalassemia ở nhóm nguyên nhân có sự thay đổi về số lượng của
các chuỗi globin.Trong bệnh thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự
thiếu hụt một loại chuỗi polypeptid của phần globin, gây ra thừa tương đối
hoặc tuyệt đối loại chuỗi kia. Nếu sự thiếu hụt chuỗi β gọi là bệnh βthalassemia, khi chuỗi β giảm thì chuỗi α nối với β bị giảm và chuỗi α còn dư
sẽ tăng nối với chuỗi δ và chuỗi γ. Còn nếu thiếu hụt chuỗi α thì gọi là bệnh αthalassemia, khi chuỗi α-globin giảm, β-globin tăng nối với globin còn lại.
Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ khác nhau phụ thuộc vào từng thể bệnh,
song hậu quả của nó là 2 quá trình:
- Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp hemoglobin
Quá trình bệnh lý thứ nhất là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng
hợp phần globin. Vì thiếu một loại chuỗi polypeptid nào đó mà việc tổng hợp
globin bị giảm. Biểu hiện là hồng cầu nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu
non trong tủy. Ở thể nhẹ sự mất cân bằng giữa các chuỗi α và β không nặng
nề thì hậu quả sự giảm tổng hợp hemoglobin là biểu hiện rõ rệt của
thalassemia. Ở những người dị hợp tử thì biểu hiện chủ yếu là hồng cầu nhỏ
nhược sắc và tăng sinh hồng cầu non trong tủy.
- Hiện tượng thứ 2: mất cân bằng giữa hai loại globin
Hiện tượng này là hậu quả thứ hai của việc thiếu hụt một loại chuỗi

globin nào đó. Việc thiếu hụt một loại chuỗi globin sẽ gây ra dư thừa loại kia.


10

Trong β-thalassemia do thiếu hụt chuỗi β gây dư thừa chuỗi α globin.
Trong α-thalassemia do thiếu hụt chuỗi α gây dư thừa chuỗi β globin.
Trong bệnh β-thalassemia , các chuỗi α dư thừa sẽ tạo nên những hạt tủa
rơi xuống màng hồng cầu nguyên sinh chất của các hồng cầu trưởng thành và
hồng cầu non trong tủy.
Đối với các hồng cầu ở máu ngoại vi các hạt tủa này làm cho màng hồng
cầu mất độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành một tế bào cứng đờ nên khó vượt
qua các màng lọc ở lách. Mặt khác các hạt tủa này ở màng hồng cầu làm cho
màng này tăng diện tích tiếp xúc và dễ bị các tác nhân oxy hóa phá hủy màng
hồng cầu. Các tủa này còn làm cho tính thấm màng hồng cầu thay đổi gây nên
mất kali ở bên trong tế bào ra huyết tương. Những tác hại của những hạt tủa
làm cho hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu [14].
Trong tủy xương các hạt tủa trên gắn lên nguyên sinh chất, màng của
hồng cầu non làm cho hồng cầu non chết trước khi trưởng thành. Điều này
làm tăng sinh mạnh hồng cầu non trong tủy, gây biến dạng xương, tăng hấp
thu sắt gây ra nhiễm sắt trong cơ thể. Hiện tượng hồng cầu non bị chết sớm
không đến được giai đoạn trưởng thành như trên gọi là hiện tượng sinh
hồng cầu không hiệu quả và là cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi lâm
sàng và huyết học ở những bệnh nhi β-thalassemia thể nặng.


11
Gen thalassemia

Giảm tổng hợp chuỗi globin (β

hoăc α)
Hồng cầu nhược sắc

Thừa chuỗi tương ứng (β hoăc α)

Thể vùi
(Màng hồng cầu)
Thể máu

Vỡ hồng cầu

Cục tiểu cầu

Tăng tạo bilirubin

Tăng hấp thụ sắt

Tăng sinh máu

Tăng sinh hệ liên võng

Tắc vi mạch

Ứ sắt
- Gan lách to
Chậm lớn

nhiễm trùng

- Loãng xương

- Biến dạng mặt

Vàng

Sỏi

da

mật

loét

Hình 1.3. Cơ chế hình thành triệu chứng lâm sàng trong thalassemia [7]


12

1.1.4. Hậu quả bệnh thalassemia
* Thiếu máu mạn nặng: Do đời sống hồng cầu bị giảm, thay đổi hình
dang, chất lượng. Tủy xương tăng tổng hợp hồng cầu non nhưng bị mất bù,
* Tăng sản tủy xương: Thiếu oxy mô gây tăng sản xuất erythropoietin, tủy
tăng hoạt động để tạo hồng cầu non nên bị rộng ra, vỏ xương mỏng đi gây
biến dạng hộp sọ tạo ra u trán, u chẩm, xương chi mỏng dễ gãy,răng dễ sâu.
* Quá tải sắt: Khi quá tải sắt, độ bão hòa sắt cao trên 50%, dễ dàng bị thay
đổi trạng thái từ sắt III sang sắt II sinh ra các ion hình thành các gốc tự do, làm tế
bào chết và hình thành tổ chức sợi. Các tổ chức bị tổn thương do quá tải sắt là:
Các tuyến nội tiết như tuyến tụy gây bệnh tiểu đường typ 2, tuyến giáp
gây suy giáp, trục hạ đồi tuyến yên làm dậy thì muộn, suy thượng thận, thiểu
năng cận giáp.
Tim bị tổn thương gây suy tim. Gan bị ảnh hưởng làm gan to, xơ gan. Da

sạm, tăng sắc tố da.
* Cường lách: Do đời sống hồng cầu ngắn, giảm bạch cầu, tiểu cầu.
1.1.5. Bệnh β-thalassemia
Định nghĩa
Bệnh thalassemie là bệnh thiếu máu tan máu di truyền rất hay gặp, được
đặc trưng bởi sự khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp chuỗi globin ảnh
hưởng đến sự trưởng thành về đời sống hồng cầu gây thiếu máu tán huyết
mãn tính bắt đầu từ lúc nhỏ tuổi.
β-Thalassemia là một dạng bệnh của hemoglobin (Hb) trong đó chuỗi βglobin giảm hoặc không được tạo thành gọi là bệnh β-thalassemia. Bệnh βthalassemia là bệnh di truyền đơn gen hay gặp nhất Ở Việt Nam.


13

Lịch sử phát hiện
β-thalassemia được phát hiện tương đối sớm từ năm 1910 bởi Jame
Henrick và năm 1925 bởi Lee và Cooley trên 5 bệnh nhi. Những biểu hiện
lâm sàng được coi như những chứng cớ phát hiện đầu tiên của bệnh với triệu
chứng: thiếu máu kèm theo lách to, gan to giống như bệnh mà Von jacksch
mô tả năm 1989. Năm 1927 Cooley phát hiện thêm 2 trường hợp nữa ngoài
triệu chứng như trên còn thấy da bị sắc tố, xương sọ dày lên có biến đổi sức
bền hồng cầu. Đó là những trường hợp β- thalassemia mô tả đầu tiên sau này
gọi là thiếu máu Cooley.
Tiếp những phát hiện của Cooley rất nhiều nghiên cứu được công bố
nhất là nghiên cứu ở Italia của Rietti năm 1925, Greppi (1928), Michcheli
(1935), Wintrobe và cộng tác viên năm 1940.
Năm 1936 Whipple và Brodford đã đề nghị từ “Thalassemia” để gọi
bệnh mà Cooley đã mô tả.
Lịch sử nghiên cứu
Năm 1940, Wintrobe và cộng sự cho rằng bệnh thiếu máu Cooley là βthalassemia thể nặng; các biểu hiện lâm sàng mà Cooley mô tả đầu tiên là
những biểu hiện của hiện tượng thiếu máu tan máu mạn tính (vàng da, lách

to), nhiễm sắt và biến dạng xương.
Để chứng minh có hiện tượng tan máu, ngay từ năm 1950, Hamilton
dùng phương pháp đánh dấu hồng cầu Cr51 xác định đời sống hồng cầu ở
bệnh nhân thalassemia thể nặng bị rút ngắn, thời gian bán hủy hồng cầu 2 - 7
ngày. Angelovoy A và cộng sự (1968), nghiên cứu đời sống hồng cầu ở những
trẻ em thiếu máu Cooley thu được kết quả tương tự. Thời gian sống của hồng
cầu rút ngắn bằng 1/3 so với thời gian sống của hồng cầu bình thường. Qua
thực nghiệm với nhiều nghiên cứu đã xác định rằng sở dĩ hồng cầu trong βthalassemia bị vỡ sớm là do khuyết tật bên trong hồng cầu [15].


14

Những công trình nghiên cứu sau này đều thấy có sự biến đổi khá đặc
biệt ở hồng cầu. Theo Aksoy và cộng sự, hemoglobin trung bình hồng cầu 1822 pg(picogam) [16], thể tích hồng cầu trung bình 55-81fl (feltolit). Modell và
cộng sự thấy hemoglobin trung bình hồng cầu trong bệnh β-thalassemia 15-26
pg và thể tích hồng cầu trung bình 57-75fl [17]. Các tác giả đều thống nhất sở
dĩ hồng cầu nhược sắc và thể tích hồng cầu trung bình nhỏ là do sự thiếu hụt
tổng hợp mạch β-globin dẫn đến giảm tổng hợp hemoglobin. Hồng cầu chứa
ít hemoglobin làm cho áp lực keo bên trong hồng cầu giảm, lượng dịch bên
trong hồng cầu ít đi.
Nghiên cứu hình dạng hồng cầu, Fessas, Yataganas…đều thấy hồng cầu
biến dạng nặng, to nhỏ không đều, nhiều hồng cầu hình bia và hình giọt nước,
hồng cầu mỏng, hồng cầu bắt màu không đều và hồng cầu có hạt kiềm.
Tại Việt Nam, năm 1963, lần đầu tiên Bạch Quốc Tuyên và cộng sự đã
xác định các trường hợp hemoglobin bất thường tại Việt Nam [18]. Tác giả đã
mô tả bệnh cảnh lâm sàng và biến đổi huyết học ở những người bệnh này. Từ
dó việc nghiên cứu bệnh hemoglobin ở nước ta được chú ý và dần dần được
mở rộng.
Nguyễn Khắc Hân Hoan và cộng sự đã nghiên cứu tầm soát và chẩn
đoán trước sinh đột biến gen thalassemia từ 01/12/2007 đến 31/3/2010 tại

Bệnh viện Từ Dũ: các thai phụ và chồng được tầm soát tình trạng mang gen
bệnh thalassemia bằng xét nghiệm huyết đồ và loại trừ nguyên nhân thiếu sắt,
các cặp dương tính được điện di Hb và thực hiện chẩn đoán trước sinh tìm đột
biến gen cho vợ, chồng và thai. Có 26965 thai phụ tham gia tầm soát với 1058
trường hợp được khảo sát đột biến (gồm thai phụ, chồng và thai). Kết quả
phát hiện được đột biến α-thalassemia chiếm 65,8%, có 21,4% thai mang kiểu
gen thalassemia nặng; khả năng phát hiện bệnh của chỉ số MCH < 28pg là
98,7% và MCV < 80fl là 92,3% [19].


15

Trần Danh Cường và cộng sự đã nghiên cứu từ tháng 8/2011 đến tháng
3/2012 tại Trung tâm chẩn đoán trước sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung ương:
sàng lọc trên những gia đình có tiền sử đẻ con bị bệnh β-thalassemia, cả bố và
mẹ đều mang gen đột biến, tiến hành chọc hút ối để xét nghiệm chẩn đoán
thalassemia ở thai. Kết quả là tỷ lệ β-thalassemia nặng chiếm 18,2%; tỷ lệ thai
nhi mang gen bệnh là 54,5% và tỷ lệ thai nhi bình thường là 27,3% [20].
Nguyễn Khắc Hân Hoan và cộng sự đã nghiên cứu chẩn đoán trước sinh
bệnh thalassemia tại Bệnh viện Từ Dũ trên 290 trường hợp thai của các cặp
vợ chồng mang đột biến gen α hoặc β-thalassemia, được chọc ối và tìm alen
đột biến bằng kỹ thuật ARMS, gap-PCR, enzym hạn chế và MLPA. Kết quả
phát hiện được 207 thai mang gen đột biến (71,4%), trong đó 128 thai mang
đột biến α-thalassemia (44%), cao hơn 2 lần so với số thai mang đột biến βthalassemia (59 trường hợp, tương ứng với 20,3%). Các đột biến hay gặp nhất
là - SEA; α3.7; HbE; codon 41/42-TCTT; codon 17A+. Chọc ối và chẩn đoán
trước sinh bằng kỹ thuật multiplex ARMS và multiplex gap-PCR chính xác và
an toàn [8].
Bạch Khánh Hòa và Nguyễn Quốc Cường đã nghiên cứu áp dụng kỹ
thuật sinh học phân tử để tìm hiểu một số đột biến gây β-thalassemia ở người
miền Bắc Việt Nam trên 46 người bệnh β-thalassemia, dùng kỹ thuật PCR

multiplex để xác định những đột biến của chuỗi β-globin. DNA được tách từ
máu toàn phần theo phương pháp Perchlorat sodium. Các mẫu DNA sau khi
tách được tiến hành phản ứng PCR multiplex với các cặp mồi để phát hiện
những đột biến hay gặp nhất ở khu vực Đông Nam Á và Nam Trung Quốc:
Cd 41/42 (-TCTT), Cd17 (A-T), FS 71/72 (A+), Cd29 (A-G), Cd28 (A-G),
IVS II-654(C-T). Kết quả là có 52,1% đột biến ở codon 17 (A-T và 32,15% là
đột biến Cd 41/42 (-TCTT) [9].


16

Dương Bá Trực và cộng sự nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sàng lọc βthalassemia ở cộng đồng bằng xét nghiệm đo sức bền thẩm thấu hồng cầu và
đo thể tích trung bình hồng cầu (MCV) trên 664 người dân tộc Thái và Giấy
tại Lai Châu và Điện Biên. Phương pháp đo sức bền thẩm thấu hồng cầu dễ
dàng thực hiện tại tuyến cơ sở, không cần trang bị máy móc gì; lấy 20µl máu
cho vào dung dịch NaCl 0,35% và nhận định kết quả sau 5 phút. Đo thể tích
trung bình hồng cầu bằng máy tự động tổng phân tích tế bào máu. Kết quả là
kỹ thuật đo sức bền thẩm thấu hồng cầu có thể sàng lọc được 80% người
mang gen β-thalassemia và 53% người mang gen HbE; kỹ thuật đo MCV có
thể sàng lọc được tới 95% người mang gen β-thalassemia và 84% người mang
gen HbE [10].
Qamar-ur-Nisa và cộng sự nghiên cứu tại khoa Phụ sản - Bệnh viện Đại
học Liaquat, Pakistan từ tháng 7 năm 2004 đến tháng 6 năm 2005: nghiên cứu
sàng lọc thalassemia nhẹ bằng điện di hemoglobin trên 200 phụ nữ có thai đến
khám tại bệnh viện. Kết quả là 8,5% phụ nữ có thai được chẩn đoán bị
thalassemia nhẹ; 59% những nàv kết hôn cận huyết với anh em ho; môt phu
nữ đâ có con bi thalassemia; 17,6% những người chồng của họ mang gen
bệnh thalassemia. Nghiên cứu này khuyến cáo sàng lọc thalassemia ở phụ nữ
có thai để phát hiện những trường hợp cặp vợ chồng mang gen bệnh - nguy cơ
cao con bị bệnh [21].

Ching-Tien Peng và cộng sự nghiên cứu chẩn đoán trước sinh bệnh I
laiassemia và bệnh thalassemia và bệnh hemoglobin ở 1240 trường hợp thai
nghén có nguy cơ cao bị phù thai α thalassemia và bị β-thalassemia nặng
trong thời gian từ 1998 đến 2011. Trong số 1240 trường hợp này có 87% được
chọc ối, 10% sinh thiết gai rau và 3% lấy máu cuống rốn. Kết quả chẩn đoán trước
sinh là: 21,5% thai bị thalassemia nặng (bao gồm phù thai α-thalassemia, βthalassemia nặng và Hb E/β-thalassemia); 50,2% thalassemia nhẹ và 28,3%


17

không bị thalassemia. Từ năm 1993, Bộ y tế Đài Loan đã cho triển khai một
chương trình sàng lọc phụ nữ cỏ thai để kiểm soát sự lan tràn của thalassemia,
kết quả là từ năm 2003 có 4 năm không có người mắc mới thalassemia là năm
2003, 2004, 2007 và 2008 [22].
Theo Fucharoen s và cộng sự: ở vùng Đông Nam Á, thalassemia là bệnh
khá phổ biến. Tỷ lệ người mang gen α-thalassemia tới 30-40% ở vùng Bắc
Thái Lan và Lào; tỷ lệ người mang gen β- thalassemia khác nhau từ 1 đến 9%
tùy từng vùng [23].
Nghiên cứu mới nhất của Phạm Thanh Loan và cộng sự năm 2013 cũng
nhằm phát hiện đột biến gen gây bệnh β-thalassemia bằng kỹ thuật
Multiplex ARMS-PCR trên 56 bệnh nhân, đã phát hiện được: 39/52 (75%)
có đột biến gen β-globin với 9 loại đột biến khác nhau gồm: Đột biến
Cd41/42 (-TCTT) và đột biến Cd17 (A>T) gặp với tần suất cao nhất:
30,4% và 21,4%. Đột biến Cd 95 (+A) và đột biến IVS II-654 (C>T) có tỷ
lệ thấp nhất 1,8%. Đột biến Cd26(G>A) gây thể HbE gặp với tỷ lệ 17,8%.
5/39 (12,8%) trường hợp có kiểu gen đồng hợp tử, 17/39 (43,6%) trường
hợp dị hợp tử kép, 17/39 (43,6%) trường hợp dị hợp tử đơn [24].
Các nghiên cứu về căn bệnh này trên thế giới cũng như trong nước mới
chỉ tập trung chủ yếu vào tỉ lệ mắc bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng,
những tác động tâm lý của bệnh đối với bệnh nhân, đã chú ý đến vấn đề tầm

soát bệnh nhưng mới chỉ dừng lại ở nhóm đối tượng là phụ nữ mang thai và
thai nhi. Như vậy việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong việc phân
tích, xác định đột biến gen β-globin ở người lành mang gen, thành viên gia
đình bệnh nhân chưa được nghiên cứu sâu.
Với các kiểu đột biến đa dạng phong phú trên gen β-globin thì việc xây
dựng một quy trình phát hiện người lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước


18

sinh, tư vấn di truyền sẽ giúp ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh, cung cấp
liệu pháp điều trị tối ưu, chế độ chăm sóc tốt hơn cho từng bệnh nhân sẽ giảm
gánh nặng về kinh tế cho gia đình người bệnh cũng như toàn xã hội.
Dịch tễ học
Trên thế giới
β- thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân
bố khắp thế giới, sự phân bố bệnh và tần số có liên quan chặt chẽ đến nguồn
gốc dân tộc, sự di cư và tập quán kết hôn. Bệnh phát hiện ra ở nhiều nước trên
thế giới, chủ yếu ở vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Cận Đông, Viễn Đông,
Bắc Phi, Đông Nam Á [25]. Theo ước tính của WHO (1981), có tới 241 triệu
người mang gen bệnh β-thalassemia trên thế giới, riêng châu Á có khoảng 60
triệu người mang gen bệnh β-thalassemia, Châu Âu là 4800 người, ở Bắc Phi
khoảng 2577 người [26].
Các nghiên cứu về tần suất mắc bệnh ở các nuớc châu Á cũng như Ðông
Nam Á cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Thalassemia phân bố khá phổ biến với 3-10%
số dân. Ở Lào tỷ lệ người mắc bệnh β-thalassemia là 9,6% dân số, ở Thái Lan
là 6% dân số, ở Campuchia tần số cũng khá cao [27].
Cũng theo WHO (2008) hàng năm số trẻ mới đẻ bị thalassemia thể nặng
ước tính vào khoảng 300.000 người [28]. Người ta ước tính khoảng 95% trẻ
em sinh ra bị β-thalassemia trong hai thập kỷ tới ở những vùng như châu Á,

Ấn Độ và Trung Đông, một số lượng lớn những trẻ em này có liên hợp với
Hemoglobin E [29], [30], [31].
Ở Việt Nam
Các công trình nghiên cứu cho đến nay đều thống nhất bệnh Hb phát
hiện thấy là α-thalassemia, β-thalassemia và HbE. Bệnh β-thalassemia phát
hiện thấy ở tất cả các tỉnh trong cả nước, gặp nhiều ở người dân tộc ít người ở
miền Bắc, người Mường 25%, người Thái 16,6%, người Nùng 7,1% [14].


19

Một nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thanh Liêm và cộng sự (2009) khi
khảo sát bệnh thalassemia ở nhóm người dân tộc Mường, huyện Kim Bôi,
tỉnh Hòa Bình cho thấy bệnh β-thalassemia rất phổ biến với tần suất là
10,67% [32].
Từ năm 1963 đến 1982, Bạch Quốc Tuyên và cộng sự nghiên cứu 415
bệnh nhân bị bệnh hemoglobin tại bệnh viện Bạch Mai và cho thấy bệnh
hemoglobin khá phổ biến tại Việt Nam, phân bố khắp các địa phương ở trong
cả nước, hai bệnh phổ biến là β- thalassemia và HbE, trong đó β-thalassemia
chiếm 91,8% các trường hợp bệnh hemoglobin [33].
1.1.6. Chẩn đoán và điều trị bệnh β-thalassemia
Chẩn đoán xác định
Vì bệnh β-thalassemia được truyền từ cha mẹ cho trẻ thông qua các gen.
Những nghiên cứu di truyển liên quan đến bệnh sử gia đình và các xét nghiệm
máu sẽ cho biết bất kỳ thành viên gia đình đã bị đột biến gen globin.
Bệnh β-thalassemia được chẩn đoán bằng lâm sàng và xét nghiệm thông
thường mà còn được chẩn đoán bằng xét nghiệm sinh học phân tử.
Các xét nghiệm này cho phép chẩn đoán chính xác người mang bệnh ở
bất cứ lúc nào, ngay cả khi đang còn là bào thai cho đến khi mới sinh ra.
- Trước sinh: Để tìm hiểu xem bào thai đó có bị thiếu máu và xác định

mức độ nghiêm trọng của bệnh. Các xét nghiệm được sử dụng gồm:
Lấy mẫu sinh thiết gai màng đệm: Khoảng tuần thứ 11 của thai kỳ.
Chọc ối xét nghiệm: Thực hiện khoảng tuần thứ 14 của thai kỳ
Lấy mẫu máu của thai nhi: thực hiện sau 18 tuần tuổi thai.
- Sau sinh: Chẩn đoán ngay bằng lâm sàng và được khẳng định bằng xét
nghiệm máu để xác định biến đổi cấu trúc của gen hemoglobin.


20

Phân loại bệnh theo mức độ biểu hiện lâm sàng
Trên lâm sàng bệnh thường biểu hiện ở 3 mức độ, nặng, trung bình và
nhẹ tương ứng với 3 thể bệnh.
•

Ở mức độ nặng hay gặp thể nặng (bệnh Cooley), là thể đồng hợp tử.
Kiểu gen: β+/β+, β0/β0.

Người bệnh bị thiếu máu nặng, xanh xao, da và vùng mắt vàng, chậm
phát triển thế chất, sốt tiêu chảy và các rối loạn tiêu hóa khác. Trẻ thường có
biểu hiện của biến chứng nặng như biến dạng xướng, hộp sọ to, bướu tránh,
bướu đỉnh, hai gò má cao, mũi Nếu được truyền máu đầy đủ trẻ có thể phát
triển bình thường đến khoảng 10 tuổi, thường có mũi tẹt, lách to, gan to, sỏi
mật, dậy thì sớm...
Công thức máu: Hb: 3 - 5 g/dl; MCV giảm; Hồng cầu nhỏ, hồng cầu hình
bia; MCH giảm, nhược sắc; Fe huyết thanh, ferritin tăng. X quang sọ: Tủy rộng,
hình bàn chải.
Điện di Hb: HbF 20 - 100%, HbA10 - 80%, HbA2 2 - 7%.

Hình 1.4: Bệnh nhân β-thalassemia với biểu hiện biến dạng xương

(nguồn: vtv.vn)


21
• Ở mức độ trung bình hay gặp thể trung gian (intermediate): Kiểu gen
có thể là đồng hợp tử, dị hợp tử hay thể phối hợp (β0/β0, β+/β+, β0/β+, β+/β,
β0/β). Biểu hiện thiếu máu xuất hiện muộn hơn khoảng 4 – 6 tuổi trẻ mới cần
truyền máu. Tuy nhiên, nếu không điều trị đầy đủ và kịp thời, người bệnh sẽ
gặp phải những biến chứng như lách to, gan, sỏi mật, sạm da… Đến độ tuổi
trung niên sẽ có biểu hện đái tháo đường, suy tim, sơ gan.
CTM: Hb 7 - 10g/dl; MCV: 50 - 70fl; MCH: 20 - 22pg; HC nhỏ, nhược
sắc. Điện di Hb: HbF, HbA1 20 - 80%; HbA2 2-7%.
• Mức độ nhẹ thường thấy ở thể nhẹ (minor) hay còn gọi là thể dị hợp
tử, thường người mang gen bệnh thường không có biểu hiện gì đặc biệt ở lâm
sàng. Chỉ vào những thời kỳ cơ thể có nhu cầu tăng về máu như phụ nữ khi
mang thai, kinh nguyệt nhiều lúc đó mới thấy biểu hiện mệt mỏi, da xanh, nếu
làm xét nghiệm thì sẽ thấy lượng huyết sắc tố giảm. (Hb 90 - 110g/l).
Tăng số lượng hồng cầu, hồng cầu nhỏ, nhược sắc, có hồng cầu hình bia,
MCV thấp. Điện di Hb: HbF tăng nhưng không quá 10%; HbA2 tăng (>3,5%).

Hình 1.5. Hồng cầu trong máu ngoại vi của bệnh nhân thalassemia
Hồng cầu thay đổi hình thái: hồng cầu nhược sắc, hồng cầu nhỏ,


22

hồng cầu hình giọt nước, hồng cầu hình bia (nguồn: vtv.vn)

* Ngoài ra còn có một thể phối hợp: Bệnh β- thalassemia /Hb E, là thể khá
nặng, trên chuỗi β-globin, acid amin thứ 26 Glutamin được thay bằng lysinThường gặp ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á.

Xuất hiện từ 6 tháng tuổi nhưng mức độ tán huyết và số lần nhẹ hơn βthalassemia thể nặng. Bệnh nhân thường nhập viện lúc đi học, thiếu máu, gan
lách to, biến dạng xương sọ mặt.
CTM: hồng cầu nhỏ, nhược sắc. Điện di: Hb F, Hb E cao, HbA 5,5 - 7,7%.
Điều trị bệnh β-thalassemia
β-thalassemia thể nhẹ không cần điều trị đặc hiệu. β-thalassemia thể
trung gian có thể được truyền máu khi có thiếu máu nặng.β-thalassemia thể
nặng có thiếu máu nặng phải truyền máu thường xuyên đảm bảo duy trì nồng
độ huyết sắc tố để trẻ phát triển bình thường, cần kết hợp với dùng thuốc thải
sắt. Ngoài ra cần sử dụng một số thuốc điều trị hỗ trợ như kích thích sinh tổng
hợp HbF, chống oxy hóa và chống gốc tự do. Ghép tủy từ người cho phù hợp
HLA là biện pháp được cho là điều trị khỏi β-thalassemia thể nặng.
Liệu pháp gen là một biện pháp đang được nghiên cứu, mục tiêu là gắn
gen HBB bình thường vào tế bào nguồn và sử dụng tế bào nguồn này để ghép
tủy xương cho bệnh nhân [34].
1.2. DI TRUYỀN HỌC BỆNH β-THALASSEMIA
β- thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, tần số và
khả năng mắc bệnh là giống nhau ở cả hai giới nam và nữ.
Đặc điểm di truyền của bệnh thalassemia:
Nếu 2 người lành mang gen bệnh có kiểu gen dị hợp tử với một đột
biến kết hôn với nhau: khi sinh con có 25% khả năng bị bệnh thalassemia
mức độ nặng do nhận cả 2 gen của bố và mẹ truyền cho, 50% khả năng con bị


23

bệnh mức độ nhẹ hoặc là người mang gen bệnh của bố hoặc của mẹ truyền
cho, 25% khả năng con bình thường.

Hình 1.6. Sơ đồ cơ chế di truyền bệnh β-thalassemia khi bố và mẹ mang
gen dị hợp tử với một đột biến

Bảng 1.2. Kiểu gen bố mẹ và tỉ lệ bị bệnh ở thế hệ con
[35]
Genotype và phenotype của
cha mẹ
Cha

Mẹ

Aa
Dị hợp Tử
Aa
Dị hợp Tử
aa
Đồng hợp tử
aa
Đồng hợp tử
aa
Đồng hợp tử

AA
Bình thường
Aa
Dị hợp Tử
AA
Bình thường
Aa
Dị hợp Tử
aa
Đồng hợp tử

Tần số con với các genotype khác nhau
AA
Bình thường

Aa
Dị hợp Tử

aa
Đồng hợp tử

50(%)

50(%)

0

25(%)

50(%)

25(%)

0

100(%)

0

0

50(%)

50(%)

0

0

100(%)


24

A: Alen bình thường AA: kiểu gen của người bình thường a: Alen đột biến
Aa: kiểu gen dị hợp tử aa: Kiểu gen đồng hợp tử bị bệnh

1.3. GEN MÃ HÓA VÀ ĐỘT BIẾN GEN Β-GLOBIN GÂY BỆNH βTHALASSEMIA
1.3.1. Vị trí và cấu trúc gen HBB
Gen mã hóa cho sự tổng hợp chuỗi β của phân tử globin là gen HBB
(Hemoglobin beta) còn gọi là gen β-globin, nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể
11 (11p15.5), chứa các gen được sắp xếp theo trình tự 5’-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3’.
Các gen được biểu hiện theo đúng trình tự phát triển. Vùng điều hòa chính,
được gọi là vùng điều khiển. Là vùng điều hòa sự biểu hiện của tất cả các gen.
(gene ID:NC_000011.9) [36].
Intron

Cụm gen β

5’

CCA
CCA
AT
AT

TA
TA
TA
TA

Intron
Enhancer

1-30

31-104

105-146

NST 11

ε

Gγ Aγ ψβ

δ

β

60 kb

Hình 1.7. Mô hình cấu trúc của gen HBB [35]
E-I, EII, E-III là các exon 1, exon 2, exon 3 của gen HBB; 1-30, 31-104, 105-146 là
vị trí các axit amin tương ứng của các exon 1, exon 2, exon 3 trên gen HBB

Gen HBB có chiều dài 1606 bp mã hóa cho 146 acid amin. Gồm 3 exon
và 2 intron. Vùng promoter hay vùng 5 (vùng điều khiển) có trình tự đặc hiệu
để gắn với enzym RNA polymerase và các yếu tố phiên mã. Promoter có chức

3’


25

năng kiểm soát hoạt động phiên mã củagen. Trong cấu trúc của gen HBB,
vùng promoter kéo dài từ vị trí -95 đến vị trí -26 của gen (nghĩa là nằm trước
vị trí của mã mở đầu mã hóa Methionin 95 và 26 nucleotid), các trình tự đặc
hiệu như hộp TATA (ở vị trí -28 đến vị trí -31), hộp CCAAT (vị trí -35 đến vị
trí -76) giúp các ribosom nhận biết đúng vị trí khởi đầu dịch mã trên trong quá
trình dịch mã, làm tăng hiệu quả phiên mã.
Điểm khởi đầu phiên mã có trình tự amino acid ACATTTG, đây là vị trí
gắn của phân tử 7 methylguanosin để tạo mũ đầu 5’ phân tử mRNA. Mũ là
yếu tố cần thiếu cho các ribosom nhận biết sự khởi đầu dịch mã và tránh cho
mRNA không bị phân hủy bởi các ribonuclease.
Bộ ba mở đầu là ATG (sẽ phiên mã thành AUG ở mRNA), định vị sau
khi khởi đầu phiên mã 50 cặp base. Đoạn 50 cặp base xen giữa điểm khởi đầu
phiên mã và bộ ba mở đầu là vùng không dịch mã, gọi là vùng 5’ UTR.
Exon thứ nhất gồm 90 cặp base, mã hóa cho acid amin 1-30 của β-globin.
Intron thứ nhất gồm 130 cặp base. Cấu trúc của intron này rất quan trọng

giúp hoàn thiện phân tử tiền mRNA thành mRNA trưởng thành và đi ra bào
tương để tổng hợp protein.Exon thứ hai gồm 222 cặp base, mã hóa cho acid
amin 31-104.Intron thứ hai gồm 850 cặp base. Exon thứ ba gồm 126 cặp base,
mã hóa cho acid amin 105-146 của HBB. Bộ ba kết thúc là TAA, bộ ba này được
phiên mã thành UAA ở phân tử mRNA. Ribosom sẽ tách ra tại vị trí này, phân tử
protein được giải phóng. Vùng không dịch mã 3’ (3’ UTR) mặc dù được phiên
mã nhưng không được dịch mã trong cấu trức của protein. Có trình tự
nucleotid là AATAAA, là vị trí gắn đuôi poly A (gồm khoảng 200 đến 300
phân tử adenyl) để hoàn thiện phân tử mRNA. Quá trình này giúp mRNA di
chuyển ra bào tương tham gia quá trình sinh tổng hợp protein.