NGHIÊN cứu xác ĐỊNH đột BIẾN một số GEN TRONG BỆNH u NGUYÊN bào THẦN KINH đệm (GLIOBLASTOMA)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
U nguyên bào thần kinh đệm-Glioblastoma(GB) là loại u não nguyên phát
của hệ thần kinh trung ương, chiếm khoảng 15-20% các u nội sọ [1]. Tổ chức Y
tế thế giới phân loại U nguyên bào thần kinh đệm là loại ác tính nhất (độ IV)[2].
Tỉ lệ U nguyên bào thần kinh đệm ở nam cao hơn nữ giới, tuổi phát hiện trung
bình khoảng 64 tuổi [3].
U nguyên bào thần kinh đệm thường hình thành trong chất trắng não, phát
triển nhanh chóng, và có thể thành khối u lớn trước khi xuất hiện triệu chứng. Biểu
hiện lâm sàng đầu tiên thường bằng hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp
điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời gian sống thêm của bệnh nhân sau mổ
trung bình chỉ 10-12 tháng [4]. Do vậy, việc tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và
quá trình sinh bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm để có thể can thiệp chính
xác và hiệu quả, đồng thời đưa ra tiên lượng bệnh là điều rất cần thiết.
Từ những nghiên cứu đột phá trong Y học, cơ chế phân tử của ung thư dần được
sáng tỏ. Theo đó, chính sự tích lũy đột biến gen theo thời gian dẫn tới sự phát sinh,
phát triển mọi dạng tế bào ung thư trong cơ thể. Quá trình chuyển dạng tế bào sang
ác tính thường được đánh dấu bằng sự kích hoạt các gen gây ung thư và đột biến
gây bất hoạt các gen áp chế ung thư nằm tại một số vị trí chủ chốt trên các con
đường tín hiệu tế bào [4, 5]. Cơ chế điều hòa gen vốn hoạt động nhịp nhàng và chặt
chẽ cũng bị rối loạn khiến hệ thống các enzym sửa chữa thương tổn gen của tế bào
không thể khắc phục dẫn tới việc tích lũy một số lượng lớn các đột biến, khởi phát
quá trình ung thư [6-8]. Nhưng cũng chính các đột biến lại làm tăng ái lực của thuốc
điều trị đích với các phân tử này và ức chế sự dẫn truyền tín hiệu trong các tế bào
ung thư. Nhờ đó chúng làm tăng hiệu quả của thuốc điều trị đích trong việc tiêu diệt
các tế bào ung thư [9].
Các nhà khoa học trên thế giới đã tìm thấy sự biến đổi một số gen đóng vai
trò quan trọng đối với bệnh sinh u nguyên bào thần kinh đệm như FGFR, EGFR,
RTEL1, TP53, Hes3 [5-8]… Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, đột biến trên
một số vùng gen FGFR và EGFR sẽ làm tăng ái lực của các thuốc ức chế hoạt tính

2

tyrosine kinase, vì vậy xét nghiệm gen đóng vai trò trong liệu pháp điều trị bệnh.
Trong khi đó, các gen RTEL1, TP53, Hes3 có thể được sử dụng để đánh giá nguy cơ
đối với sự phát triển của u nguyên bào thần kinh đệm [9-12].
Trong báo cáo này chúng tôi đề cập đến “Xác định đột biến gen trong bệnh u
não Glioblastoma: FGFR,EGFR RTEL1, PT53, Hes3”
Thuộc sản phẩm khoa học của đề tài: Đề tài: “Nghiên cứu xác định đột biến
một số gen trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma)


3

I- CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ chế bệnh sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
1.1.1. Các yếu tố nguy cơ
Yếu tố di truyền: các yếu tố di truyền có tác động vào sự xuất hiện một số
loại u não như u nguyên bào võng mạc cũng như u thần kinh da. Trong nhóm u xơ
thần kinh typ 1, các u tế bào hình sao hay gặp nhiều gấp 4 lần. Nhóm 2 (được đặc
trưng bởi u dây VIII hai bên) là tập hợp rất nhiều u khác nhau (u thần kinh đệm
ngoại biên, u xơ thần kinh, u màng não, u thần kinh đệm). Các u nguyên bào mạch
trong não và trong ống sống thường xuất hiện với bệnh Von Hippel Lindau.
Suy giảm miễn dịch làm tăng nguy cơ mắc các u lymphô ở não. Khoảng 20%
bệnh nhân có biểu hiện suy giảm miễn dịch kéo dài và từ 5% đến 8% bệnh nhân
AIDS bị u lymphô ác tính, thường là lympho B.
1.1.2.Cơ chế bệnh sinh
Cơ chế phân tử và vai trò của đột biến gen trong u nguyên bào thần kinh đệm
Nghiên cứu đầu tiên về tổn thương gen trong u nguyên bào thần kinh đệm

được công bố khoảng 35 năm trước đây. Trong nhiều năm sau đó, những gen đóng
vai trò quan trọng trong bệnh sinh ung thư như thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào
sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), thụ thể yếu tố phát triển biểu mô
(epidermal growth factor receptor, EGFR), gen áp chế ung thư TP53 đã được nghiên
cứu [11, 12]. Bên cạnh đó một số gen đánh giá mức độ ác tính và biệt hoá, hay kiểm
soát sự phân chia của tế bào ung thư như RTEL1 và Hes3 cũng được xem xét và
đánh giá trong u nguyên bào thần kinh đệm. Dựa trên tình trạng đột biến gen, các
nhà khoa học, các bác sỹ lâm sàng có một cái nhìn tổng thể về nguy cơ, mức độ tiến
triển để có biện pháp can thiệp điều trị kịp thời, nâng cao hiệu quả điều trị cũng như
theo dõi tiên lượng đối với bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [13].
Đột biến gen thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi (FGFRs) và thụ thể
yếu tố phát triển biểu mô (EGFR).
FGFRs là một nhóm các thụ thể xuyên màng có hoạt tính tyrosine kinase [14].
Phân tử FGFRs gồm một vùng gắn kết các phối tử nằm ngoài màng tế bào, một


4

vùng xuyên màng đặc hiệu và một vùng nội bào. Phần ngoài màng của FGFRs có
hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử của FGFRs. Vùng xuyên màng
trọng lượng nhỏ tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng. Phần trong tế bào
là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hóa
của FGFRs [15,16]. Ngay sau khi được hoạt hóa bằng cách gắn với phối tử của
chúng, vùng nội bào của FGFRs sẽ tự phosphoryl hóa, khởi đầu một dòng thác tín
hiệu lan tỏa khắp tế bào gây kích hoạt: con đường PI3K/Akt, sự tăng sinh mạch
máu, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình (appoptosis), tín hiệu
Ras/mitogen-activated protein kinase, và các con đường dẫn truyền tín hiệu phiên
mã (hình 2) [17-19]. Do đó các đột biến làm rối loạn hoạt động của gen FGFRs đề
làm thay đổi hoạt động sống của tế bào và là nguyên nhân cho sự hình thành và phát
triển ung thư.

Hình 1.1. Cấu trúc, vị trí hoạt động và con đường tín hiệu thông qua thụ thể
yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGFRs.
Nguồn: Haugsten et. al. Mol Cancer Res. 2010;11,1439-1452.
Nghiên cứu của Shing và cộng sự vào năm 2012 cho thấy đột biến dung hợp gen
FGFRs-TACC đóng vai trò rất quan trọng đối với bệnh sinh u nguyên bào thần kinh


5

đệm [20]. Bên cạnh đó, các đột biến điểm N546K và R576W nằm trong vùng có
hoạt tính tyrosin kinase của gen FGFRs trên nhiễm sắc thể số 8 cũng được tìm thấy
trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (hình 3) [21]. Các đột biến này làm
tăng ái lực của thuốc điều trị với thụ thể và trở thành một trong những đích tác dụng
của các thuốc điều trị hướng đích ức chế hoạt tính tyrosine kinase trên bệnh nhân
Glioblastoma [13,22]. Như vậy ngoài vai trò trong bệnh sinh u nguyên bào thần
kinh đệm thì các đột biến gen FGFRs còn có tác dụng trong định hướng điều trị và
một xét nghiệm gen không thể thiếu đối với các bác sỹ lâm sàng khi triển khai các
liệu pháp điều trị đối với bệnh nhân.

Hình 1.2. Đột biến gen FGFRs trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
(A) Hình ảnh minh hoạ cấu trúc gen FGFRs và vùng phát hiện đột biến tại exon 12
và 13 trên vùng có hoạt tính tyrosine kinase. (B) Kết quả giải trình tự gen trực tiếp
xác định đột biến N546K và R576W của gen FGFRs.
Nguồn: Rand et. al. PNAS. 2005;102,14344-14349.
Bên cạnh đó thì thụ thể yếu tố phát triển biểu mô, EGFR đóng một vai trò quan
trọng trong cơ chế phân tử và định hướng điều trị của u nguyên bào thần kinh đệm


6

[23,24]. Gen EGFR nằm tại vị trí p11.2 trên nhiễm sắc thể số 7. Giống như FGFR,
EGFR cũng có hoạt tính tyrosine kinase có tác dụng kích hoạt một loạt gen sinh ung
thư chủ chốt trong con đường tín hiệu nội bào và khởi phát quá trình ung thư [25].
Nghiên cứu của Libermann và cộng sự công bố vào năm 1985 cho thấy khoảng 3540% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có sự khuếch đại gen EGFR [26].
Không lâu sau đó các nhà khoa học đã chứng minh đột biến gây hoạt hoá gen EGFR
đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh u nguyên bào thần kinh đệm. Tỷ lệ đột biến
gen trong u nguyên bào thần kinh đệm lên đến 30-40%. Các dạng đột biến bao gồm:
đột biến xoá đoạn EGFRvIII (del.aa 30-297) và các đột biến điểm nằm chủ yếu tại
vùng N-tận của EGFR (hình 4) [27,28]. Đột biến gây mất kiểm soát gen EGFR
thường xảy ra với bệnh nhân mang khối u nguyên phát. Các dạng đột biến này ảnh
hưởng chủ yếu đến hoạt động vùng ngoại bào của phân tử EGFR, nơi xảy ra tương
tác với các phối tử của chúng [29]. Đây là những đột biến làm tăng ái lực của EGFR
với các thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase loại 2. Chính vì vậy các loại thuốc
này sẽ có hiệu quả hướng đích trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có
đột biến gen EGFR [30,31].

Hình 1.3. Đột biến gen EGFR trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
Hình ảnh minh hoạ các vùng của gen EGFR và vị trí các đột biến được xác trên các
vùng tương ứng của gen.
Nguồn: Wilson và cộng sự, Trung tâm gen, Đại học Washington


7

Do đó, với mong muốn mang lại hiệu quả điều trị cao nhất cho các bệnh nhân
u nguyên bào thần kinh đệm ở Việt Nam, bên cạnh khảo sát đột biến gen FGFR,
chúng tôi đề xuất thêm việc xác định các đột biến trên gen EGFR. Nắm tình trạng
đột biến của các gen này sẽ cũng cấp những thông tin hữu ích nhất để phối hợp
thuốc điều trị đích nhằm gia tăng thời gian sống cho bệnh nhân ung thư [32-35].

Đột biến gen PT53
TP53 là gen áp chế ung thư nằm trong con đường tín hiệu p53 đóng vai trò
quan trọng trong việc duy trì tính ổn định của bộ gen dưới tác động của các yếu tố
có hại như sự thương tổn DNA, giảm oxy máu, rối loạn chuyển hóa hay tăng cường
hoạt động của các gen sinh ung thư [36]. Gen TP53 nằm tại vị trí p13.1 trên nhiễm
sắc thể số 17. Khi hoạt động, TP53 có tác dụng sửa chữa thương tổn DNA, thúc đẩy
sự chết tế bào khi thương tổn DNA không thể sửa chữa. Ngoài ra p53 còn kiểm soát
nhiều hoạt động chức năng khác của tế bào thông qua sự tăng cường hay ức chế sao
chép một loạt các gen trong con đường tín hiệu p53. Chính vì vậy, p53 được xem
như trạm gác của bộ gen tế bào (guardian genome) [36,37]. Tỷ lệ đột biến gen TP53
trong u nguyên bào thần kinh dao động từ 35-40%, tỷ lệ này cao hơn trong các khối
u thứ phát và phát triển từ u thần kinh đệm có mức độ ác tính thấp hơn [38]. Đột
biến gen TP53 trong u nguyên bào thần kinh đệm hầu hết là các đột biến điểm nằm
rải rác trên toàn bộ chiều dài gen PT53 nhưng tập trung chủ yếu ở 3 bộ ba mã hoá
codon-175, -248 và -273 [39,40]. Các dạng đột biến này được chứng minh có vai
trò quan trong đối với quá trình tiến triển và xâm lấm của ung thư [41]. Chính vì
vậy việc xác định đột biến gen TP53 được xem như là một marker quan trọng đánh
giá tiên lượng trong điều trị đối với bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.


8

Hình 1.4. Hình ảnh minh hoạ sự phân bố và tần suất đột biến gen TP53 trên
bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
Nguồn: The UMD p53 database
Đột biến đa hình thái đơn trên gen RTEL1 và Hes3.Nhiều nghiên cứu trên thế giới
đã thống kê rằng các thành viên trong gia đình bệnh nhân u nguyên bào thần kinh
đệm có nguy cơ cao mắc loại ung thư này cũng như một số loại hình ung thư khác.
Điều này gợi ý đến tính nhạy cảm gen đối với sự hình thành và phát triển ung thư
[42]. Với thành công của sự kiện giải mã bộ gen người, các nhà khoa học đã

chứng minh các đột biến đa hình thái đơn (single nucleotide polymorphism, SNPs)
là những yếu tố quan trọng nhất quyết định đến tính nhạy cảm gen. Hiện tượng đa
hình thái đơn là sự khác nhau về trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn - A,
T, C hay G - ở trong bộ gen khác nhau giữa các cá thể của một loài hay giữa các
cặp NST của một người . Trong u nguyên bào thần kinh đệm, các nhà khoa học đã
tìm thấy các dạng đột biến đa hình thái đơn rs6010620 và rs2297440 trên gen
RTEL1 [43,44]. Đây là gen có tác dụng duy trì sự ổn định của bộ gen, nằm trên
nhiễm sắc thể số 20 tại vị trí q13.3. Các dạng SNPs này được chứng minh là các


9

yếu tố nguy cơ đối với sự hình thành và tiến triển u nguyên bào thần kinh, đặc biệt
là đối với các thành viên trong gia đình các bệnh nhân. Ngoài ra đối với các bệnh
nhân đang được điều trị thì việc xác định các dạng SNPs này cũng là những yếu tố
đánh giá tiên lượng và theo dõi hiệu quả điều trị [44,45]. Bên cạnh đó một số
dạng đột biến đa hình thái đơn của gen Hes3 cũng được nghiên cứu. Gen Hes3
nằm trên nhiễm sắc thể số 1 tại vị trí p36.31, quy định tổng hợp yếu tố điều hoà
liên quan đến sự phân chia và chết theo chương trình của tế bào thần kinh, đây là
những đặc trưng cơ bản của các tế bào ung thư. Các dạng SNPs của Hes3 bao
gồm: rs6304634 và rs6304696 [46,47]. Tuy nhiên vai trò của các SNPs trên gen
Hes3 đối với u nguyên bào thần kinh là khác nhau giữa các chủng tộc người.
Chính vì vậy chúng tôi sẽ khảo sát vai trò của các SNPs trên gen Hes3 đối với
bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Việt Nam.
1.2. Các phương pháp xác định đột biến gen
1.2.1. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)
Nguyên tắc chung: dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase có khả năng
tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại
nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có
trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.Phản ứng PCR là một chuỗi

nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:
1. Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến tính ở
nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 oC - 95oC trong
vòng 30 giây - 1 phút.
2. Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm của
các mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây - 1 phút.
3. Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng
lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taqpolymerase, Tth
polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc
vào độ dài của trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến
nhiều phút.


10

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng làm
các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của
phản ứng PCR là những đoạn DNA mạch kép có chiều dài là khoảng cách giữa hai
đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’
của hai đoạn gen mồi [18], [19], [20].

Số lượng sản phẩm DNA tạo thành khi hoàn thành phản ứng PCR được biểu
thị bằng công thức sau:
N = 2n
N: số lượng bản copy sản phẩm tạo thành
n là số chu kỳ của phản ứng.
Hình 1.5. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR
(Nguồn: quora.com)
1.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotid
trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho
phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của deoxy- và
dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các
dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn
DNA đang được tổng hợp.Sự gắn của các dideoxynucleotidsẽ làm gián đoạn quá
trình kéo dài các đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA


11

có kích thước khác nhau. Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác
định bằng cách chạy đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa
một loại dideoxynucleotid(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng
hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh
quang đặc hiệu khác nhau.

Hình 1.6. Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP
Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách bằng
điện di trên thạch acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt được các sợi
đơn DNA hơn kém nhau 1 nucleotid. Trình tự các nucleotid được xác định tương
ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid.


12

Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau
để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có
một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3 ’ của đoạn DNA sẽ phát
ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhậnmàu sắc này và chuyển về

máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận biết được từng loại
nucleotid và trình tự của DNA đích.
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên Gene Bank
(National Center for Biotechnology Information – NCBI).
Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được
thiết kế trên nguyên tắc của Sanger. Với các máy thế hệ mới sau này, người ta
dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phản
ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên
một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây, hệ thống điện di
thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP
cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng,
máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu
huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự
của DNA đích. Phương pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột
biến, đặc biệt là các đột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc
phát hiện một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen.


13

II- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nhóm bệnh: Nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
Tiêu chuẩn lựa chọn: 60 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng mô bệnh
học tại Bệnh viện Việt Đức là u nguyên bào thần kinh đệm.
Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan nào khác.
Nhóm chứng: 60 đối tượng
Tiêu chuẩn lựa chọn: người khoẻ mạnh, không có bất kỳ một khối u hay ung
thư một cơ quan nào, không mắc các bệnh mãn tính, đặc biệt là các bệnh lý về phổi.
Nghiên cứu phả hệ.

Thành viên trong gia đình có quan hệ huyết thống trực tiếp với bệnh nhân đã
được xác định có đột biến gen, bố mẹ, con đẻ, được lựa chọn tham gia vào nghiên
cứu để xác định các yếu tố liên quan đến tính chất gia đình.
Cách thức thu thập mẫu.
Thu thập mẫu mô: Để xác định đột biến trên gen FGFR, EGFR
Thu thập mẫu máu: Để xác định đột biến trên gen RTEL1, PT53, Hes3
Các thành viên gia đình được xác định có đột biến trên các gen FGFR,
EGFR trên cũng được thu thập mẫu máu ngoại vi để xác định đột biến.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
2.2.1. Trang thiết bị nghiên cứu
• Máy PCR (Eppendorf)
• Máy điện di: Mupid (Nhật Bản).
• Máy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin Chemi Wealtec, USA).
• Máy quang phổ kế Nano- Drop (Nhật Bản).
• Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm các loại (Đức).
• Tủ lạnh âm sâu: -30oC và - 80oC (Sanyo-Nhật Bản).
• Máy điện di mao quản Beckman Coulter.
• Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (USA).


14

2.2.2. Dụng cụ nghiên cứu
• Dụng cụ được vô trùng tuyệt đối bằng hấp ướt 120oC trong 20 phút.
• Pipet, đầu côn các loại.
• Ống Eppendorf các loại.
2.2.3. Hóa chất nghiên cứu
- Hóa chất tách chiết DNA từ máu ngoại vi và tinh sạch DNA:
+ Kít tách chiết DNA (Hàng QIAGEN-Đức).
+ Dung dịch lysis buffer.

+ Dung dịch K.
+ Dung dịch SDS10%.
+ Proteinase K (10mg/l).
+ Dung dịch phenol:chloroform:isoamyl có tỷ lệ 25:24:1.
+ Dung dịch chloroform:isoamyl có tỷ lệ 24:1.
+ Sodium acetate 3M, pH 5,2.
+ Ethanol tuyệt đối và Ethanol 70%.
+ Dung dịch TE để hòa tan DNA và bảo quản DNA sau khi tách.
+ Kít tinh sạch DNA từ gel (Hãng QIAGEN-Đức).

- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR:
+ Taq DNA polymerase 1000U (Hãng QIAGEN-Đức).
+ Taq PCR Microsatellite kit (Hãng QIAGEN-Đức).
+ dNTP, PCR grade (Hãng QIAGEN-Đức, 250µl).
+ Sử dụng các cặp mồi được gắn với chất huỳnh quang đặc hiệu.

- Hoá chất để giải trình tự gen:
+ Big dye.
+ Cột lọc.
+ SAM solution.
+ Terminator Solution.


15

2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu:
+ 2 ml máu tĩnh mạch và mẫu mô của bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
vào ống chống đông EDTA
+ 2ml máu tĩnh mạch của nhóm chứng vào ống chống đông EDTA.

Bệnh viện Việt Đức: thu thập mẫu nghiên cứu
Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội: Tách DNA và bảo
quản -20˚C, phân tích gen.
2.3.2. Quy trình tách chiết DNA
Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi:
DNA được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform từ bạch cầu máu
ngoại vi theo quy trình thường quy.
Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô:
Quy trình xử lý mẫu mô trong paraffin:
Tiến hành tuần tự theo các bước sau:
1) Sau khi xác định vùng tập trung tế bào ung thư của mẫu mô, cắt lát 3-5 lát mô
(10 µm) cố định bằng formalin đúc trong paraffin, cho các lát mô vào ống
eppendorf .
2) Thêm vào ống 1200 µL dung dịch toluen, mix 30 giây.
3)

Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 15 000 vòng/phút trong 5 phút, đổ bỏ phần dung
dịch phía trên, giữ lại phần cặn lắng.

4) Thêm vào ống 1200 µL ethanol 100%, trộn đều bằng máy và ủ ở nhiệt độ
phòng 10 phút.
5) Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 15 000 vòng/phút trong 5 phút, đổ bỏ phần dung
dịch phía trên, giữ lại phần cặn lắng.
6) Lặp lại bước 4 và 5.
7) Thêm vào ống 600 µL Lysis buffer (50mM Tris pH8, 1mM EDTA, 0,5%
Tween20), 25 µL dung dịch SDS 10%, 10 µL dung dịch Proteinase K (nồng
độ 1 mg/mL).


16

8) Ủ mẫu ở 56oC qua đêm (máy ủ lắc).
Quy trình tách chiết và tinh sạch DNA:
Sử dụng ống chứa mẫu sau khi đã ủ ở máy ủ lắc, tiếp tục các bước sau:
1) Thêm vào ống 500 µL dung dịch phenol-cloroform-isoamyl (25:24:1), trộn
đều bằng máy.
2) Ly tâm lạnh hỗn hợp với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.
3) Lặp lại bước 1 và 2 .
4) Thêm vào 1 thể tích dung dịch chloroform-isoamyl (24:1) (khoảng 500 µL)
5) Ly tâm lạnh hỗn hợp với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.
6) Thu lấy lớp dung dịch trong suốt trên cùng, cho vào một ống mới.
7) Thêm vào ống 2,5 lần thể tích ethanol 100% (khoảng 1,25 mL) và 1/10 thể
tích natri acetat 3M (khoảng 50 µl).
8) Trộn đều hỗn hợp bằng máy, để ở -20oC qua đêm.
9) Ly tâm lạnh hỗn hợp với tốc độ 13 000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC
10) Đổ bỏ phần dung dịch trên cùng. Thu lấy cặn lắng còn lại.
11) Thêm vào cặn lắng 1ml ethanol 70%, trộn đều và ly tâm lạnh hỗn hợp với
tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC (2 lần).
12)Loại bỏ phần dung dịch nổi phía trên, giữ lại cặn.
13) Để cặn lắng trong ống khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
14) Sau khi mẫu khô, thêm vào ống 50 µl nước tinh khiết để hòa tan DNA.
15) Tiến hành kiểm tra chất lượng DNA và nồng độ DNA, lưu giữ ở -20oC.
2.3.3. Xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số sau khi tách chiết
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA được tách chiết: bằng phương pháp đo quang,
dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.
2.3.4. Các quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen
2.4.4.1. Quy trình phản ứng PCR
Quy trình và thành phần phản ứng PCR khuếch gen FGFR, EGFR:

17

Bảng 2.1. Thành phần và điều kiện tham gia phản ứng PCR
STT
1

Thành phần

Thể tích

Điều kiện phản ứng

(µl)
2 (~50ng)

Biến tính: 94 oC trong 3 phút

2

DNA tổng số
Master mix PCR

3

2X
Mồi xuôi

0,5

4

Mồi ngược

0,5

5

Nước cất vô trùng

7,0

Tổng thể tích

20

Lặp lại 35 chu kỳ gồm các bước

10

sau:
Biến tính: 94 oC trong 30 giây
Gắn mồi: 55 oC trong 45 giây
Tổng hợp: 72 oC trong 30 giây
Sau 35 chu kỳ, tổng hợp lần cuối ở
72oC trong 5 phút.

Quy trình và thành phần phản ứng PCR khuếch gen RTEL1, TP53, Her3:
Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện tham gia phản ứng PCR
STT
1

2
3
4
5

Thành phần
DNA tổng số
Master mix PCR 2X
Mồi xuôi
Mồi ngược
Nước cất vô trùng

Thể tích
(µl)
2 (~50ng)
10
0,5
0,5
7,0

Điều kiện phản ứng
Biến tính: 94 oC trong 3 phút
Lặp lại 35 chu kỳ gồm các bước
sau:
Biến tính: 94 oC trong 30 giây
Gắn mồi: 55 oC trong 30 giây

Tổng thể tích

20

Tổng hợp: 72 oC trong 30 giây
Sau 35 chu kỳ, tổng hợp lần cuối
ở 72oC trong 5 phút.

Sản phẩm PCR được điện di sản phẩm trên gel agarose 2%. Sản phẩm PCR
sau điện di được tinh sạch từ gel agarose.
Quy trình làm sạch sản phẩm PCR Trên Gel agarose
Sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA.


18

2.3.5. Kỹ thuật giải trình tự gen
- Giải trình tự gen theo quy trình và sử dụng phương pháp BigDye terminator
sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA).
Quy trình giải trình tự gen trực tiếp
Sử dụng BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit
Applied Biosystems, Foster city, USA theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.4. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y học dựa vào phần mềm thống kê
SPSS.
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Việc thực hiện nghiên cứu hoàn toàn tuân thủ theo đạo đức nghiên cứu y học.
- Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút
khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu.
- Các thông tin liên quan đến đối tượng tham gia nghiên cứu được đảm bảo bí mật.
- Các kỹ thuật, thao tác thực hiện trong nghiên cứu được bảo đảm đúng
chuyên môn.
- Đối tượng nghiên cứu sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm.

- Đề tài nghiên cứu này được thực hiện hoàn toàn vì mục đích khoa học chứ
không vì mục đích nào khác.


19

III- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả xác định đột biến gen FGFR
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra, đột biến dung hợp gen FGFRs-TACC và đột
biến điểm biến điểm N546K và R576W ở exon 12, exon 13 đóng vai trò rất quan
trọng đối với bệnh sinh u nguyên bào thần kinh đệm. Toàn bộ mẫu DNA của 60
bệnh nhân sau khi tách chiết từ mẫu mô parafin được khuếch đại với cặp mồi đặc
hiệu tại vị trí exon 12 và exon 13 trên gen FGFR. Sau khi khuếch đại được kiểm tra
bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% và được giải tình tự gen và so sánh
kết quả với trình tự chuẩn trên GeneBank bằng phần mềm CLC Main Workbench,
kết quả được tổng kết ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phát hi
ện đột biến điểm trên gen FGFR
STT
1
2
3
4
5

Mã
BN
GB46
GB48
GB52

GB53
GB57

Exon
13
12
13
13
13

Thay đổi

Thay đổi

nucleotid
g.57835C>T
g.56504C>T
g.57837C>T
g.57837C>T
g.57837C>T

acid amin
p. A575V
p. N546K
p. R576W
p. R576W
p. R576W

Tên acid amin thay đổi
Alanine > Valine

Asparagine > Lysine
Arginine > Tryptophan
Arginine > Tryptophan
Arginine > Tryptophan

Giải trình tự 60 mẫu bệnh phẩm phát hiện thấy 5/60 mẫu có đột biến gen
FGFR. Trong đó, 1 mẫu phát hiện thấy đột biến trên exon 12, và 4 mẫu phát hiện
thấy đột biến trên exon 13. Dạng đột biến chiếm tỷ lệ cao nhất là R576W trên exon
13, nghiên cứu cũng phát hiện 1 bệnh nhân có đột biến N546K trên exon 12. Ngoài
ra, nghiên cứu còn phát hiện thấy 01 đột biến mới A575V trên exon 13.


20

Hình 3.1. Tỉ lệ đột biến trên các exon (A) và tỉ lệ các dạng đột biến (B) trên
gen FGFR.
Kết quả trên cho thấy, hầu hết các đột biến xuất hiện ở exon 13 chiếm 80%,
trong đó dạng đột biến R576W chiếm tỉ lệ cao nhất với 60%.
Gen FGFR là thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi mã hóa cho protein
nằm trên màng tế bào và có hoạt tính tyrosin kinase, protein này tham gia vào hoạt
hóa con đường tín hiệu nội bào và được điều hòa nhờ sự bắt cặp phối tử đặc hiệu,
kết quả là sự tăng sinh, xâm lấn, di căn và chết theo chương trình của tế bào. Đột
biến gen này liên quan đến cơ chế bệnh sinh của nhiều loại ung thư như ung thư
bàng quang, ung thư vú, tuyến tiền liệt… trong đó có glioblastoma. Việc xác định
đột biến gen FGFR đóng vai trò quan trọng quyết định tính đáp ứng với thuốc điều
trị đích. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, có hai dạng đột biến gen FGFR thường
gặp liên quan đến cơ chế bệnh sinh và khả năng đáp ứng với thuốc trong u nguyên
bào thần kinh đệm là đột biến điểm tại exon 12, exon 13 của gen FGFR1 và đột
biến dung hợp gen TACC3-FGFR3.

21

Hình 3.2. Đột biến gen FGFRs trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
Tuy nhiên, tỷ lệ đột biến dung hợp gen TACC3 và FGFR3 thấp mà chủ yếu
là hai dạng đột biến điểm N546K tại exon 12 và R576W tại exon 13 của gen
FGFR1. Theo nghiên cứu của Vikki Rand và cộng sự, đây là hai đột biến soma làm thay
đổi sự mã hóa cho protein ở miền kinase và được chứng minh đóng một vai trò quan
trọng trong quá trình tiến triển và quyết định tính đáp ứng với thuốc ức chế FGFR của
khối u.
Ngoài ra, trên thế giới đã có những nghiên cứu sâu và rộng hơn về đột biến
FGFR cũng như ảnh hưởng của đột biến này trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh
đệm. Cụ thể, nghiên cứu của Vikki Rand, Jiaqi Hungang, Jim Stockwell và cộng sự
đã tiến hành thực hiện nghiên cứu khuếch đại 161 exon trên 20 vùng tyrosine kinase
của 20 bệnh nhân glioblastoma ở Mỹ năm 2005. Phân tích sự biểu hiện của gen
FGFR1 phát hiện một đột biến điểm tại exon 12 và một đột biến điểm tại exon 13.


22

Đây là nghiên cứu đầu tiên về xác định đột biến gen trên vùng tyrosine kinase của
gen FGFR1 có liên quan đến ung thư [35]. Do tỷ lệ bệnh glioblastoma gặp ở chủng
tộc người da trắng nhiều hơn các chủng tộc khác nên tỷ lệ đột biến ở Mỹ cao hơn so
với nưới ta.
3.2. Kết quả xác định đột biến gen EGFR
Các dạng đột biến gen EGFR trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm đã
được công bố chủ yếu là đột biến xoá đoạn EGFRvIII (del.aa 30-297) và các đột
biến điểm nằm tại vùng N-tận của EGFR. Nhóm nghiên cứu tiến hành khuếch đại
các exon nằm trong vùng đột biến ở vùng N-tận (exon 2, exon 7) và exon nằm
ngoài vùng đột biến (exon 8). Trong trường hợp đoạn gen đó bị đột biến xóa đoạn

đồng nghĩa với việc không có vị trí bắt cặp của đoạn mồi, chính vì vậy phản ứng
PCR sẽ cho kết quả âm tính. Việc khuếch đại exon nằm ngoài vùng đột biến được
tiến hành như một phản ứng đối chiếu để đánh giá chất lượng của DNA khuôn và
hiệu quả của phản ứng PCR.

Hình 3.3. Kết quả xác định đột biến xóa đoạn exon 2. Giếng M: Marker 100bp.
Giếng GB20, GB21, GB25, GB26, GB38, GB40, GB43, GB44 là các mẫu bệnh
nhân U nguyên bào võng mạc, (-) mẫu chứng âm, (+) mẫu chứng dương.
Sản phẩm PCR của các mẫu GB20, GB21, GB25, GB40, GB44 thu được
đặc hiệu với một 1 băng sáng duy nhất, rõ nét, không có các băng phụ, kích thước
đồng đều và có chiều dài tương ứng với kích thước tính toán trên lý thuyết. Sản
phẩm PCR ở các bệnh nhân mã số GB26, GB38, GB43 không xuất hiện vạch chứng
tỏ bệnh nhân có đột biến xóa đoạn exon 2, kết quả thu được tương tự ở các bệnh
nhân mã số GB5, GB14, GB34, GB37. Như vậy 7/60 bệnh nhân có đột biến xóa
đoạn exon 2 gen EGFR chiếm tỉ lệ 11,6%.


23

Kết quả khuếch đại exon 3, exon 7 và exon 8 của 60 mẫu đều cho kết quả
dương tính. Sản phẩm PCR khuếch đại các exon của gen EGFR sẽ được giải trình
tự để xác định đột biến điểm.
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench
và so sánh với trình tự chuẩn của gen EGFR (NM_005228) trên ngân hàng dữ liệu
Gene Bank. Giải trình tự 60 mẫu bệnh phẩm xác định đột biến điểm trên exon 2,
exon 3, exon 7 và exon 8 của gen EGFR, kết quả được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả phát hi
ện đột biến điểm trên gen EGFR
STT

Mã

1
2
3
4
5

BN
GB6
GB8
GB10
GB23
GB24

6
7

GB25
GB26

8

GB27

Exon
7
7
7
2

2
7
7
2
2
7
7

Thay đổi

Thay đổi

nucleotid
c. 814 C>T
c. 814 C>T
c. 814 C>T
c.124G> A
c.124G> A
c. 820 C>T
c. 877 A>T
c.183 C > A
c.124 G > A
c. 866 G>A
c. 866 G>A

acid amin
p. P272S
p. P272S
p. P272S
p. G42D

p. G42D
p.T274M
p. K293X
p. L62I
p. G42D
p. A289T
p. A289T

Tên acid amin thay đổi
Proline >Serine
Proline > Serine
Proline > Serine
Glycine > Aspartat
Glycine > Aspartat
Threonine > Methionine
Lysine → termination
Leucine → Isoleucine
Glycine → Aspartat
Alanine → Threonine
Alanine → Threonine

Nghiên cứu đã phát hiện được 8/60 mẫu có đột biến điểm trên gen EGFR
chiếm tỉ lệ 13,3%. Trong đó, 4/60 mẫu phát hiện thấy đột biến trên exon 2 chiếm tỉ
lệ 36%, 6/60 mẫu phát hiện thấy đột biến trên exon 7 chiếm tỉ lệ 64% (hình 3.4.
không phát hiện thấy đột biến nào trên exon 3 và exon 8 của gen EGFR.


24

Hình 3.4. Tỉ lệ đột biến trên các exon 2 và exon 7 của gen EGFR

Trong nghiên cứu này, 2/8 mẫu phát hiện thấy đột biến kép trên cả hai exon 2
và exon 7, còn lại là các đột biến riêng lẻ trên từng exon gồm 4/8 mẫu phát hiện đột
biến trên exon 7 và 2/8 mẫu phát hiện trên exon 2 (hình 3.13)

Hình 3.5. Tỉ lệ đột biến đơn và đột biến kép trên các exon 2 và exon 7
Nghiên cứu phát hiện được 6 loại đột biến khác nhau, các dạng đột biến phát
hiện được bao gồm 5 đột biến sai nghĩa c. 814C>T (P272S), c.124G>A (G42D),
c.820 C>T (T274M), c.183C > A (L62I), c.866G>A (A289T) và 1 đột biến vô
nghĩa c.877A>T (p. K293X). Tỉ lệ đột biến cao nhất là đột biến sai nghĩa c.814C>T
(P272S) và đột biến c.124G>A (G42D) chiếm tỉ lệ 27,27%, tiếp theo là đến đột biến
c.866G>A (A289T) chiếm tỉ lệ 18,18%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ 9,09%
và 9,10% (hình 3.14).


25

Hình 3.6. Tỉ lệ các dạng đột biến trên gen EGFR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với mồi đặc hiệu
khuếch đại các exon nằm trong vùng đột biến (exon 2, exon 3, exon 7) và các exon
nằm ngoài vùng đột biến (exon 8). Trong trường hợp đoạn gen đó bị đột biến xóa
đoạn đồng nghĩa với việc không có vị trí bắt cặp của đoạn mồi, chính vì vậy phản
ứng PCR sẽ cho kết quả âm tính. Việc khuếch đại exon nằm ngoài vùng đột biến
được tiến hành như một phản ứng đối chiếu để đánh giá chất lượng của DNA khuôn
và hiệu quả của phản ứng PCR. Những mẫu không phát hiện thấy đột biến xóa đoạn
sẽ được giải trình tự để xác định đột biến điểm trên gen EGFR. Kết quả trên 60 mẫu
nghiên cứu chúng tôi chưa tìm được mẫu nào có đột biến xóa đoạn gen EGFR. Tuy
nhiên, bằng kỹ thuật giải trình tự gen, 6 dạng đột biến điểm được phát hiện bao gồm
5 đột biến sai nghĩa (G42D, L62I, P272S, T274M, A289T) và 1 đột biến vô nghĩa
(K293X). Trong đó, ba dạng đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao nhất là G42D (exon 2),
P272S (exon 7) và A289T (exon 7). Trong đó, đột biến A289T đã được công bố

trong nghiên cứu của Jeffrey C Lee và cộng sự (2006) với tần suất đột biến cao kết
hợp với nhiều kiểu đột biến xảy ra tại codon 289 như A289V; A289D (12). Các
dạng đột biến còn lại phát hiện được trong nghiên cứu đều là các đột biến mới. Vị
trí đột biến cũng thay đổi và có sự khác biệt so với nghiên cứu của Jeffrey C Lee
(p.G42D so với p.D46N và p.L62I so với p.G63R). Sự khác biệt về chủng tộc, màu
da hay vị trí địa lý có thể là nguyên nhân gây nên sự sai khác trong vị trí đột biến và
kiểu đột biến exon 2 và exon 7 gen EGFR trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm.