ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂNCHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN RHIZOBIUM SP. TỪ RỄ CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA. L) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH QUẢNG NAM.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI H ỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂNCHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN RHIZOBIUM SP. TỪ
RỄ CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA. L) TRÊN ĐỊA
BÀN TỈNH QUẢNG NAM.

Ngành: Công nghệ sinh học
Người hướng đẫn: TS. Phạm Thị Mỹ
Sinh viên thực hiện: Cao thị Vân Lâu, Trần Thị Thúy Hương, Võ Thị Như
Huỳnh

Đà Nẵng, 01/2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong bài nghiên cứu khoa học này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Đà Nẵng, tháng 04 năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Bằng tấm lòng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô TS. Phạm Thị Mỹ
người đã trực tiếp chỉ bảo, hướng đẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và
động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành bài nghiên cứu khoa
học này.

Xin cảm ơn thầy ThS. Vũ Đức Hoàng, cô ThS. Lê Thị Mai đã nhiệt tình
hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đại học
Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức và tạo
những điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong 4 năm học.
Xin chân thành cảm ơn!


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1.

Khái quát chung về Rhizobium sp. ............................................................. 3

1.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại vi khuẩn Rhizobium sp. ........................... 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn Rhizobium sp. .............. 3
1.2.

Một số ứng dụng của vi khuẩn Rhizobium sp. .......................................... 5

1.3. Một số nghiên cứu về vi khuẩn Rhizobium sp. trong nước và trên thế giới . 5
1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới .................................................................. 5
1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước.................................................................... 7
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 9
2.1.

Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 9

2.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................... 9

2.2.1. Địa điểm thu mẫu ........................................................................................ 9
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 9
2.2.3. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 9
2.3.

Hóa chất, thiết bị .......................................................................................... 9

2.3.1. Hóa chất ....................................................................................................... 9
2.3.2. Thiết bị.......................................................................................................... 9
2.4.

Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 9

2.5.

Phương pháp nghiên cứu. ......................................................................... 10

2.5.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm .............................................................................. 10
2.5.2. Phương pháp thu mẫu ............................................................................... 10
2.5.3. Phương pháp phân lập .............................................................................. 11


2.5.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và các test hóa sinh
của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn .......................................................... 11

2.5.1. Phương pháp định danh các chủng VK bằng kỹ thuật sinh học phân tử15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .............................................................. 18
3.1.

Phân lập vi khuẩn Rhizobium sp. ............................................................. 18

3.2. Kết quả nghiên cứu các đặc điểm hình thái tế bào, sinh hóa của các chủng
vi khuẩn được tuyển chọn ...................................................................................... 19
3.2.1. Kết quả quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ................................ 19
3.2.2. Thử nghiệm khả năng di động .................................................................. 20
3.2.3. Thử nghiệm catalase ................................................................................. 20
3.2.4. Thử nghiệm khả năng chịu mặn .............................................................. 21
3.2.5. Kết quả xác định khả năng cố định nitơ của chủng VK tuyển chọn ...... 21
3.2.6.. Kết quả định danh bằng phương pháp khuếch đại vùng gen 16S rRNA
.............................................................................................................................. 23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 26


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
VSV :

Vi sinh vật

MT

:

Môi trường

VK

:

Vi khuẩn

KL

:

Khuẩn lạc

ĐC

:

Đối chứng

PTN :

Phòng thí nghiệm

DD

Dung dịch

:

NCBI :
UV

:

AND :
ARN :

National Center for Biotechnology Information
Ultraviolet
Acid deoxyribonucleic
Acid ribonucleic


DANH MỤC CÁC BẢNG
Kí hiệu
Tên bả ng

bảng

Trang

2.1

Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn

14

2.2

Kết quả xác định đường chuẩn NH4+

14

2.3

Trình tự cặp mồi được sử dụng để khuếch đại vùng gen

16

16S rRNA
3.3

Tổng hợp các đặc điểm tế bào, sinh lý, sinh hóa của
chủng VK L1

23


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Số hiệu

Tên hình ảnh

Trang

2.1

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

10

2.2

Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại PCR

17

3.1

Hình của chủng VK phân lập được từ rễ cây lạc

18

3.2

Hình thái khuẩn lạc của chủng VK tuyển chọn

18

3.3

Tế bào dưới kính hiển vi của chủng VK L1

19

3.4

Khả năng di động của chủng VK L1

20

3.5

Thử nghiệm catalase chủng VK L1

21

3.6

Sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn ở các
nồng độ muối NaCl từ 1 – 4%.

21

3.7

Hình ảnh phản ứng màu của chủng VK tuyển chọn với
thuốc thử Nessler

22

3.8

Sản phẩm PCR (Số1: mẫu L1, M: marker phân tử)

24


MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Trong nền nông nghiệp, năng suất cây trồng luôn luôn là vấn đề được quan tâm hàng

đầu. Đã có nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng như tăng
cường đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc
trừ sâu và phân hóa học. Tuy nhiên các biện pháp này còn rất hạn chế như: gây ô nhiễm
môi trường, thoái hóa đất và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người [17]. Cùng với sự
phát triển của khoa học kĩ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu
xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng
suất cao. Ngày nay nhiều công bố khoa học đã cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có
lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó có các
vi khuẩn có khả năng cố định Nitơ đang được quan tâm nhiều nhất.
Nitơ (N) là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay
cả đối với vi sinh vật. Nguồn dự trữ Nitơ trong tự nhiên rất lớn chỉ tính riêng trong không
khí Nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích [9]. Người ta ước tính trong bầu không khí bao
trùm lên 1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn Nitơ, lượng Nitơ này có thể cung cấp dinh
dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng.
Trong cơ thể các loại vi sinh vật chứa khoảng 4,1015 tỷ tấn Nitơ. Cây trồng cũng như
các loại động vật và người không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn N2 tự do từ
không khí. Nhưng tất cả nguồn Nitơ trên cây trồng đều không tự đồng hóa được mà phải
nhờ vi sinh vật. Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn Nitơ. Bằng cách
bón phân con người đã trả lại cho đất khoảng hơn 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản
được bổ sung bằng Nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật. Vì vậy việc nghiên cứu sử
dụng loại đạm sinh học này được xem là một giải pháp quan trọng trong nông nghiệp,
đặc biệt trong sự phát triển để hướng tới một nền nông nghiệp sinh thái bền vững. Tuy
nhiên tồn tại một số vi sinh vật có khả năng biến N2 trong khí quyển thành NH3 cung cấp
đạm cho cây mà chỉ cần một lượng năng lượng rất ít (3-5kcal/M) như Rhizobium,
Azotobacter, Beijerinckia [9]. Những vi sinh vật này thường tồn tại nhiều trong rễ của
các loại cây trồng như cây lúa, cây mồng tơi, cây thuộc họ đậu,…
Xuất phát từ những lý luận và thực tiễn trên cho nên chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Rhizobium sp. từ
rễ cây lạc (Arachis hypogaea. L) trên địa bàn tỉnh Quảng Nam”.
1


2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập, tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn Rhizobium sp. từ rễ cây lạc
(Arachis hypogaea. L) trên địa bàn tỉnh Quảng Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
•

Ý nghĩa khoa học
Phân lập và lưu trữ được một số chủng vi khuẩn Rhizobium sp. Đây là nguồn gen

cung cấp cho các hướng nghiên cứu chuyên sâu hơn về sinh lý, sinh hóa, di truyền…
• Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh
trong rễ cây họ đậu có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả,
nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng và
góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Khái quát chung về Rhizobium sp.

1.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại vi khuẩn Rhizobium sp.

a.

Lịch sử phát hiện
Năm 1886, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bản chất của quá trình cố định nitơ

phân tử. Các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng của cây họ đậu lấy được nitơ
khí quyển là nhờ vi khuẩn nốt sần sống ở vùng rễ cây họ đậu và đặt tên cho loài này là
Bacterium radicicola. Cuối năm 1889 Frank đề nghị đổi tên là Rhizobium [24].
b. Vị trí phân loại chi Rhizobium trong giới vi sinh vật như sau:
Giới: Bacteria, ngành: Proteobacteria, lớp: Alphaproteobacteria, bộ: Rhizobiales, họ:
Rhizobiaceae, chi: Rhizobium.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn Rhizobium sp.
Rhizobium là loại trực khuẩn hình que, kích thước tế bào 0,5-0,9 x 1,2-3 micromet
háo khí, gram âm, không sinh nha bào, có tiêm mao mọc theo kiểu đơn hoặc chu mao,
có khả năng di động được, khuẩn lạc có màu đục, nhày, lồi, sống trong đất có vai trò cố
định đạm. Rhizobium hình thành một nhóm vi khuẩn cộng sinh cố định đạm sống trong
rễ của các cây họ Đậu và Parasponia [6], [24].
Người ta chia vi khuẩn này thành hai nhóm, nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh
trưởng chậm dựa vào thời gian xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy.
Nhóm sinh trưởng nhanh khuẩn lạc xuất hiện sau 3 ­ 5 ngày, có đường kính 2 4mm thuộc chi Rhizobium. Nhóm sinh trưởng chậm khuẩn lạc xuất hiện sau 5 - 7 ngày
nuôi cấy, có đường kính không quá 1mm thuộc chi Bradirhizobium [6], [12].
Trong quá trình phát triển vi khuẩn nốt sần thường có sự thay đổi hình thái.
Lúc còn non, đa số các loài có hình que, có khả năng di động bằng đơn mao, chùm mao
hoặc chu mao tuỳ từng loài. Sau đó trở thành dạng giả khuẩn để có hình que phân nhánh,
mất khả năng di động. Ở dạng này, vi khuẩn nốt sần có khả năng cố định nitơ cao nhất.
Khi già dạng hình que phân nhánh phân cắt tạo thành dạng hình cầu nhỏ [12].
Vi khuẩn nốt sần thuộc loại háo khí, ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm, thích hợp với
nhiệt độ 28 - 300C, độ ẩm 60 - 80%. Chúng có khả năng đồng hoá các nguồn cacbon
khác nhau như các loại đường đơn, đường kép, axit hữu cơ, glyxerin,... Đối với nguồn
3

nitơ, khi cộng sinh với cây đậu, vi khuẩn nốt sần có khả năng sử dụng nitơ không khí.
Khi sống tiềm sinh trong đất hoặc được nuôi cấy trên môi trường, chúng mất khả năng
cố định nitơ. Lúc đó chúng đồng hoá các nguồn nitơ sẵn có, nhất là các nguồn amôn và
nitrat. Chúng có thể đồng hoá tốt các loại axit amin, một số có thể đồng hoá pepton.
Ngoài nguồn dinh dưỡng cacbon và nitơ, vi khuẩn nốt sần còn cần các loại chất khoáng,
trong đó quan trọng nhất là photpho. Khi nuôi vi khuẩn nốt sần ở môi trường có sẵn
nguồn đạm lâu ngày, chúng sẽ mất khả năng xâm nhiễm và hình thành nốt sần [6], [12].
Sự hình thành nốt sần và quan hệ cộng sinh của vi khuẩn nốt sần với cây bộ đậu.
Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây đậu tạo thành một thể sinh lý hoàn
chỉnh. Chỉ trong quan hệ cộng sinh này, chúng mới có khả năng sử dụng nitơ của không
khí. Khi tách ra, cả cây đậu và vi khuẩn đều không thể sử dụng nitơ tự do, không phải
tất cả các cây thuộc bộ đậu đều có khả năng cộng sinh với vi khuẩn nốt sần mà chỉ
khoảng 9% trong chúng.
Khả năng hình thành nốt sần ở cây đậu không những phụ thuộc vào vi khuẩn có
trong đất mà còn phụ thuộc vào các điều kiện ngoại cảnh khác nhau. Về độ ẩm, đa số
cây đậu có thể hình thành nốt sần trong phạm vi độ ẩm từ 40-80%, trong đó độ ẩm tối
thích là 60-70%. Tuy nhiên, cũng có những trường hợp ngoại lệ, ví dụ như cây điền
thanh có thể hình thành nốt sần trong điều kiện đất ngập nước.
Độ thoáng khí của đất cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần.
Thường nốt sần chỉ hình thành ở phần rễ nông, phần rễ sâu rất ít nốt sần. Nguyên nhân
là do tính háo khí của vi khuẩn nốt sần, thiếu Oxy sẽ làm giảm cường độ trao đổi năng
lượng và khả năng xâm nhập vào rễ cây. Đối với cây, thiếu Oxy cũng làm giảm sự hình
thành sắc tố Leghemoglobin. Những nốt sần hữu hiệu có màu hồng chính là màu của
sắc tố này. Nhiệt độ thích hợp nhất với hoạt động của vi khuẩn nốt sần là 240C, dưới
100C nốt sần vẫn có thể hình thành nhưng hiệu quả cố định nitơ giảm. Ở nhiệt độ 36 0C
cây đậu phát triển tốt nhưng cường độ cố định nitơ lại kém [12].
PH môi trường cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần. Có loại
chỉ hình thành nốt sần ở pH từ 6,8 đến 7,4 có loại có khả năng hình thành nốt sần, ở pH

rộng hơn từ 4,6 đến 7,5 [6], [12], [16].

4


1.2.

Một số ứng dụng của vi khuẩn Rhizobium sp.
Đa số các vi khuẩn Rhizobium đều có khả năng cố định đạm. Cây trồng không có

khả năng sử dụng nitơ hữu cơ mà phải nhờ các VSV phân hủy và chuyển hóa thành các
dạng nitơ dễ tiêu (NH3 hoặc NH4+), cung cấp nguồn nitơ dinh dưỡng cho cây trồng. Nhờ
khả năng cố định đạm này mà VK Rhizobium được ứng dụng vào việc sản xuất phân
phón vi sinh nhằm nâng cao năng suất cây trồng, phát triển một nền nông nghiệp sinh
học bền vững [6].
Công nghệ ứng dụng các chế phẩm phân bón sinh học cho thực tiễn sản xuất là sử
dụng các loại chế phẩm hỗn loài , nhiều chủng nhằm làm tăng và ổn định hiệu lực của
chế phẩm. Một nghiên cứu cho thấy sự kết hợp hai chủng vi khuẩn Rhizobium và
Agrobacterium trên cây đậu Faba làm cho năng suất cây trồng tăng lên, giảm lượng phân
bón hóa học mỗi năm, cải thiện đất trồng, giảm ô nhiễm môi trường [26].
Theo một số nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn trong chi Rhizobium có khả
năng tổng hợp nhựa PHB (Poly-β-hydroxybutyrate), một loại nhựa polymer chịu nhiệt,
là nguồn carbon dự trữ ở VSV. PHB được coi như là một loại nhựa sạch, không gây ô
nhiễm môi trường, được áp dụng trong lĩnh vực y dược, nông nghiệp hay công nghiệp
thực phẩm. PHB được điều chế thành các sản phẩm có giá trị cao như chỉ khâu dùng
trong phẫu thuật, vật liệu gắn kết xương bị gãy, nhựa chịu nhiệt,… [10].
Ngoài ra, vi khuẩn Rhizobium sp. có thể tự sản sinh ra được vitamin và các chất
kích thích sinh trưởng , một số nòi khác lấy vitamin từ môi trường sống [6].
1.3. Một số nghiên cứu về vi khuẩn Rhizobium sp. trong nước và trên thế giới
1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới

Năm 2013, Diange E.A, Lee S.S chỉ định AB21T được phân lập từ đất nhiễm
chloroethylenes là vi khuẩn gram âm, không hình thành bào tử, và có khả năng di
chuyển. Phân tích dựa trên trình tự gen 16S rRNA cho thấy nó thuộc về chi Rhizobium,
và có liên quan chặt chẽ đến Rhizobium sullae IS 123T (97,4%), Rhizobium
yanglingense SH 22623T (97,2%), Rhizobium gallicum R 602spT (97,1%), Rhizobium
alamii GBV 016T (97,0%) và Rhizobium monogolense USDA 1844T (97,0%). Quá
trình phân lập này tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 25-370C (tối ưu, 300C) và pH 6–9 (tối
ưu, pH 8,0). Nó phát triển khi có mặt của 0–4% (w/v) NaCl, dung nạp 4% (w/v) NaCl.

5


Dựa trên phân tích đa diện, chủng AB21T được gọi là một loài mới thuộc giống
Rhizobium có tên Rhizobium halotolerans sp. nov.[19].
Năm 2015, Lin S.Y phân lập được một loại vi khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí
và có khả năng di chuyển, được chỉ định chủng CC-SKC2 (T), được phân lập từ khối u
gốc của cây ớt chuông xanh (Capsicum annuum var. Grossum) ở Đài Loan.
Các tế bào dương tính với các hoạt động oxidase và catalase và biểu hiện tăng
trưởng ở 25-370C, pH 4,0-9,0 và dung nạp NaCl lên tới 4,0% (w / v). Phân tích dựa trên
trình tự gen 16S rRNA tương tự Rhizobium rhizoryzae KCTC 23652 (T) và Rhizobium
straminoryzae CC-LY845 (T) (97,5%) tiếp theo là Rhizobium lemnae L6-16 (T)
(97,3%), Rhizobium pseudoryzae KCTC 23294 (T) (97,1%) và Rhizobium paknamense
NBRC 109338 (T) (97,0%), trong khi các loài Rhizobium khác có độ tương đồng nhỏ
hơn 96,7%. Trên cơ sở các bằng chứng phân loại đa diện của nghiên cứu, chủng CCSKC2 (T) được đề xuất để đại diện cho một loài mới trong chi Rhizobium, có tên là
Rhizobium capsici sp. nov. [23].
Năm 2017, Jun-lian Gao, Xu-ming Wang, Fan-uang Lv, Xiao-jie Mao, Jianguang
Sun , phân lập từ mô rễ khử trùng bề mặt của ngô được trồng ở quận Fang Sơn, Bắc
Kinh, Trung Quốc được một chủng vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que mới được chỉ
định 166T. Phân tích trình tự gen 16S rRNA chỉ ra rằng chủng 166T thuộc chi Rhizobium
và có liên quan chặt chẽ với Rhizobium cellulilyticum ALA10B2T và Rhizobium yiltense

H66T với độ tương tự trình tự lần lượt là 98,8 và 98,3%. Kết quả của các xét nghiệm
sinh lý, sinh hóa của chủng 166T từ các chủng loại của các loài có liên quan chặt chẽ
với R. cellasilyticum DSM 18291T và R. yantense CCTCC AB 2014007T. Chủng 166T
được đề xuất để đại diện cho một loài mới thuộc trong chi Rhizobium, với tên Rhizobium
wenxiniae sp. nov [22].
Năm 2017, Sameh H. Youseif, Fayrouz H. Abd El-Megeed, Saleh A. Saleh, các
thí nghiệm thực địa được thực hiện qua hai mùa sinh trưởng liên tiếp đã chứng minh
rằng nốt sần, tổng lượng nitơ hấp thụ, năng suất, thành phần của đậu faba có thể được
cải thiện đáng kể thông qua việc sử dụng kết hợp chế phẩm Rhizobium và
Agrobacterium từ hai chủng vi khuẩn Rhizobium và Agrobacterium . Kết quả của nghiên
cứu còn cho thấy khả năng sử dụng chủng này để phát triển chế phẩm đậu faba thương

6


mại và để đạt năng suất cây trồng tốt hơn, giảm lượng phân bón hóa học mỗi năm, cải
thiện đất trồng, giảm ô nhiễm môi trường [26].
1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước
Năm 2012, Lai Chí Quốc, Nguyễn Thị Dơn và Cao Ngọc Diệp đã phân lập được
hai mươi tám dòng VK được phân lập trên môi trường Aleksandrov từ hai mươi mẫu
vật liệu phong hóa của đá hoa cương đều có khả năng tổng hợp ammonium trong môi
trường Burk‘s. Trong đó, có 5/28 dòng tổng hợp NH4+ cao. Giải trình tự 3/5 dòng VK
đã tuyển chọn và sử dụng phần mềm BLAST N để so sánh với trình tự các dòng vi khuẩn
có trong GenBank của NCBI. Kết quả cho thấy, dòng vi khuẩn CA10 có tỉ lệ đồng hình
cao với dòng AY117623.1 Rhizobium tropici PRF34 tỉ lệ 99%, dòng CA18 có tỉ lệ đồng
hình cao với dòng JF496331.1 Bacillus subtilis A2-9 với tỉ lệ 99%, dòng CA29 có tỉ lệ
đồng hình cao với dòng JN896359.1 Rhizobium multihospitium CC-13H với tỉ lệ 99%.
Đánh giá khả năng cố định đạm của hỗn hợp ba dòng vi khuẩn này trên Hành lá (Allium
fistulosum sp.) và Mồng tơi (Basella alba L.) cho thấy các dòng vi khuẩn này giúp cây
phát triển chiều cao, trọng lượng và năng suất [3].

Năm 2016, Nguyễn Thi Minh và Nguyễn Thanh Nhàn tuyển chọn được tổ hợp
giống vi sinh vật gồm 5 chủng giống có đặc tính sinh học tốt và có khả năng cộng sinh
cao với rễ cây, trong đó có 3 chủng Rhizobium (Shinorhizobium fredii M1,
Bradyrhizobium japonicum và Bradyrhizobium vigna) và 2 chủng Arbuscular
mycorrhizae (Gigaspara sp1, Acaulospora sp1) để làm giống sản xuất vật liệu sinh học.
Vật liệu sinh học từ Arbuscular mycorrhizae và Rhizobium phát huy được hiệu quả hiệp
đồng của nấm rễ và vi khuẩn nốt sần, khi sử dụng tái tạo thảm cỏ có tác dụng làm tăng
cường khả năng sinh trưởng phát triển của cây trồng, góp phần cải thiện tính chất đất,
đặc biệt tỉ lệ che phủ ở công thức sử dụng VLSH đạt 95,63% cao hơn hẳn so với đối
chứng (chỉ đạt 54,6%) nên có tiềm năng ứng dụng để tạo tiểu cảnh cho các khuôn viên
nhỏ hẹp mà đất nghèo dinh dưỡng [11]
Năm 2017, Nguyễn Thành Luân, Nguyễn Thị Liên Thương, Nguyễn Thị Quỳnh
Mai, Nguyễn Minh Chánh, khi khảo sát hàm lượng và thời gian thu nhận nhựa PHB ở 3
chủng CR2, RB3, RC3 cho thấy chủng VK CR2 hoang dại có khả năng sinh tổng hợp
PHB cao nhất đạt 39,84% trong thời gian 48 giờ và đạt giá trị màu sắc tốt nhất khi hòa

7


tan bằng H2SO4 đậm đặc. Kết quả định danh cho thấy chủng CR2 là loài Rhizobium
gallicum, RB3 là loài Agrobacterium tuminfaciens.
Cấu trúc PHB thu nhận được giống với cấu trúc của PHB thương phẩm. Nghiên
cứu chuyên sâu về PHB là tiềm năng phát triển cho một nền công nghiệp và nông nghiệp
xanh, cải tiến các phương pháp sản xuất nhựa PHB ở quy mô công nghiệp trong vật liệu
mới thay thế [10].

8


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU
Đối tượng nghiên cứu

2.1.

- Mẫu rễ cây lạc thu nhận ở xã Quế Châu, huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam.
- Các chủng vi khuẩn Rhizobium sp. được phân lập từ các mẫu rễ cây trên.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.

2.2.1. Địa điểm thu mẫu
Một số mẫu rễ cây lạc được lấy từ các địa điểm khác nhau thuộc xã Quế Châu,
huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam.
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm (PTN) Vi sinh - sinh lý thực vật - hóa sinh, PTN Công nghệ
sinh học, PTN Sinh học phân tử thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư
Phạm, Đại học Đà Nẵng.
2.2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8/2018 đến tháng 4/2019.
Hóa chất, thiết bị

2.3.

2.3.1. Hóa chất
- Các loại đường chuẩn: Glucoza, Fructoza, Saccaroza, Mannitol.
- Các hóa chất khác: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, Na2SO4, CaCO3, NaCl,
Cao nấm men, Công gô đỏ, Peptone, FeCl3.6H2O, NaMoO4.2H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O,
NaOH, KOH, NH4Cl, KI, HgCl2, ZnSO4, KNaC4H4O6, Agar, …
2.3.2. Thiết bị

Tủ cấy thổi khí vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, máy lắc ổn nhiệt, kính hiển vi, cân
điện tử, dụng cụ thủy tinh, máy so màu,…
Nội dung nghiên cứu

2.4.

Đề tài tập trung nghiên cứu các nội dung sau:
- Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn Rhizobium sp. từ rễ cây lạc (Arachis
hypogaea. L) cố định đạm trong trên địa bàn tỉnh Quảng Nam.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy của chủng vi khuẩn được tuyển
chọn.
- Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn được tuyển chọn.
9


- Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng kĩ thuật sinh học phân tử.
2.5.

Phương pháp nghiên cứu.

2.5.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Sơ đồ bố trí thí nghiệm thể hiện ở hình 2.1.

Mẫu rễ cây họ đậu
Phân lập

Các chủng vi khuẩn
Làm thuần

Các chủng vi khuẩn thuần

Khảo sát các đặc điểm hình thái,
nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa
Tuyển chọn

Chủng vi khuẩn Rhizobium được
tuyển chọn

Định danh bằng kỹ thuật sinh học
phân lập

Các loài thuộc chi Rhizobium
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.5.2. Phương pháp thu mẫu
Lấy các mẫu rễ cây lạc phải tốt, rễ phải có nốt sần to, nhiều kẻ sọc trắng, màu hồng
ở thời kì cây đang ra hoa và phải đảm bảo các mẫu không bị biến đổi trong thời gian từ
khi lấy mẫu tới khi phân tích.
10


Tiến hành: dùng kéo, dao mổ vô trùng cắt khoảng 2g mẫu cho vào túi ziplock vô
trùng, đậy kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước
đá và được vận chuyển về phòng thí nghiệm, giữ ở 4 oC. Các mẫu được phân lập ngay
không quá 24h [7], [14].
2.5.3. Phương pháp phân lập
Cách tiến hành:
- Cân 1-2g mẫu rễ. Nốt sần có nhiều tạp khuẩn, phải tiệt trùng trước khi phân lập.
Rửa sạch nốt sần, lấy kéo cắt nốt sần ra khỏi rễ. Chú ý không làm nốt sần xây xát. Cho
nốt sần vào nước trong rửa sạch, cho cồn 95º vào trong 3 phút rửa sạch, cho tiếp vào
dung dịch HgCl2 0.1% trong 5 phút, rửa bằng nước vô trùng 5 đến 6 lần. Sau đó dùng

cối nghiền nát nốt sần, cho vào cốc thêm 2ml nước cất [3], [20].
- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml
nước cất vô trùng, lắc đều ta được độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng như vậy đến độ
pH loãng 10-4, 10-5. Dùng pipet vô trùng hút ở mỗi độ pha loãng 100µl dịch mẫu và nhỏ
vào đĩa petri có chứa môi trường YMA đã được hấp khử trùng ở
121oC trong vòng 15 phút. Sau đó dùng que trang trải đều giọt dung dịch khắp mặt
thạch. Mỗi nồng độ pha loãng cấy trên 3 đĩa petri, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ
ấm ở nhiệt độ 28 - 30oC trong 3 -7 ngày để tạo thành các khuẩn lạc riêng lẽ [16] .
- Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi
trường đặc để thu khuẩn lạc đơn. Quá trình làm thuần được tiến hành 2 đến 3 lần. Chọn
khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống [7],
[16].
2.5.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và các test hóa sinh của
các chủng vi khuẩn được tuyển chọn
a. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào
Nhuộm Gram
Nguyên tắc: Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm
Gram, vi khuẩn Gram (+) sẽ giữ được phức hợp tím không bị tẩy màu bởi alcohol trong
khi Gram (-) không giữ được phức hợp màu này. Do vậy, sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram
(+) vẫn giữ được màu tím còn vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của fuchsin [4], [7],
[11].
11


Cách tiến hành:
Làm tiêu bản vệt bôi mẫu cần nhuộm.
-

Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn.

-

Nhuộm tím gentian trong 1 phút, rửa nước (tối đa 5 giây), thấm khô.

-

Thêm dung dịch lugol trong 1 phút.

-

Rửa bằng cồn 90 độ trong 15-30 giây, rửa lại bằng nước, thấm khô.

-

Nhuộm bổ sung bằng fuchsin trong 1 phút, rửa qua nước, thấm khô rồi mang đi

quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu 100X. Ghi nhận khả năng bắt màu
thuốc nhuộm, mô tả hình dạng tế bào.
b. Phương pháp kiểm tra các test sinh hóa
Thử nghiệm khả năng di động
Nguyên tắc : Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận khi thử nghiệm cấy vi
khuẩn trong thạch mềm. Nếu vi khuẩn chỉ phát triển xung quanh đường cấy thì vi khuẩn
không có tính di động, nếu vi khuẩn mọc lan rộng khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả
năng di động [1].
Cách tiến hành:
- Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch
mềm YMA.
- Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở 30oC, quan sát sau 3 ngày.
Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng sinh catalase và phân giải H2O2 của các chủng

vi sinh vật.
Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn phết lên giữa lam kính
sạch. Nhỏ vài giọt H2O2 3% phủ lên vi khuẩn. Đọc kết quả sau khoảng 15 giây. Phản
ứng catalase dương tính: có hiện tượng sủi bọt khí [4], [7].
c. Thử nghiệm khả năng chịu mặn
Để quan sát tính tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn cố định đạm chúng tôi cũng
quan sát khả năng tăng trưởng trên môi trường YMA có bổ sung muối NaCl 14%.
Nguyên tắc: Màu của môi trường có chứa 2 chủng VK càng đục thì chứng tỏ
VK phát triển mạnh hơn so với các ống nghiệm chứa môi trường và VK trong hơn.
12


Cách tiến hành: Nuôi 2 chủng VK trong ống nghiệm chứa môi trường YMA
có bổ sung muối NaCl lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4% và 1 ống nghiệm đối chứng chỉ chứa
môi trường YMA. Nuôi VK trong môi trường lỏng tĩnh nhiệt độ 28-300C, sau 3-5 ngày
quan sát sự thay đổi [18].
d. Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
[5], [13].
Dựa vào sự có mặt của sản phẩm đầu tiên của quá trình cố định đạm là amoni
(NH4+) trong MT nuôi cấy vô đạm để xác định khả năng cố định nitơ của các chủng
VK tuyển chọn.
Nguyên tắc:
NH4+ có mặt trong dung dịch nuôi cấy sẽ tạo thành hợp chất màu vàng khi tác
dụng với thuốc thử Nessler. Theo phương trình phản ứng:
NH4+ + 2K2HgI4 + 4KOH =

NH2HgOI + 7KI + 3H2O ( vàng nâu)

Cường độ màu của dung dịch thuốc thử phụ thuộc vào nồng độ của NH4+ trong
dung dịch.

Thuốc thử Nessler:
-

Dung dịch KI: cân 35g KI hòa tan trong 100ml nước cất.

-

HgCl2: cân 17g hòa tan vào 300ml nước cất.

-

Dung dịch NaOH: 20%
Sau đó đổ dung dịch HgCl2 vào dung dịch KI cho đến khi có kết tủa màu đỏ của

HgI2 tạo thành, không tan nữa thì ngừng lại. Dùng dung dịch kiềm 20% dẫn đến thể tích
1 lít. Thêm 5ml dung dịch HgCl2 đến khi xuất hiện kết tủa đỏ. Để dung dịch lắng đến
khi hoàn toàn trong suốt, lọc lấy nước trong, bảo quản trong lọ mẫu. Hóa chất khác:
Dung dịch muối Xe-nhiet (C4H4O6KNa) 50%.
Cách tiến hành
Bước 1: Xây dựng đường chuẩn
Dung dịch amoniac tiêu chuẩn: cân chính xác 0,297g NH4Cl tinh khiết cho vào cốc
thủy tinh và hòa tan trong một ít nước cất, sau đó định mức thành 1000ml, lắc đều. Ta
được dung dịch chuẩn amoni (dd A), 1ml dung dịch này có 0,1mg NH4+.

13


Tiến hành pha loãng 10 lần dung dịch trên để có dung dịch nồng độ 0,01mg NH4 +
trong 1ml bằng cách lấy 10ml dd A cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng
nước cất cho đến vạch (dd B).

Sử dụng 5 bình định mức, lần lượt cho vào các bình định mức dung dich NH4+ theo
thứ tự bảng 2.1:
Bảng 2.1 : Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn
Số bình định mức 100ml

1

2

3

4

5

0

5

10

15

20

0

0,5

1

1,5

2

Dung dịch chuẩn NH4+
(dd B) (ml)
Hàm lượng NH4+ (mg/l)

Kết quả so màu được trình bày trong bảng 2.2:
Bảng 2.2: Kết quả xác định đường chuẩn NH4+
Hàm lượng
NH4+ (mg/l)

0

0,5

1

1,5

2

OD

0

0,154

0,21

0,271

0,328

Từ kết quả trên ta có phương trình đường chuẩn: y = 0,1166x + 0,095 (R = 0,9997).
Dựa vào phương trình đường chuẩn xác định được hàm lượng NH4+ trong mẫu nghiên
cứu, trong đó y = OD và x = NH4+ mg/l trong mẫu.
Bước 2: Xác định hàm lượng NH4+ trong dịch nuôi cấy
Ly tâm 500 vòng/phút dịch nuôi cấy của các chủng VK nghiên cứu. Lấy 5ml
dịch trong cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 0,5ml Xe-nhiet (C4H4O6KNa), tiếp theo
là 1ml thuốc thử Nessler. So màu ở bước sóng 420nm và dựa vào đường chuẩn để xác
định hàm lượng NH4+ trong dịch nuôi cấy.
14


2.5.1. Phương pháp định danh các chủng VK bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Phương pháp định danh các chủng VK bằng kỹ thuật sinh học phân tử bao gồm
các bước sau đây:
a. Nuôi cấy sinh khối VK được chọn lọc
Các chủng VK Rhizobium sp. được chọn lọc nuôi trong 10 ml dung dịch LB lỏng,
lắc trên máy lắc trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng để thu sinh khối [3].
b. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Sinh khối chủng Rhizobium sp. được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo
phương pháp của Gawel và cộng sự (1991) có sự cải tiến, sử dụng đệm chiết CTAB
[21].
Nguyên tắc của phương pháp tách chiết DNA tổng số (3 giai đoạn chính):
- Giai đoạn 1: Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lý và hóa học. Tùy thuộc vào
từng loại tế bào, có cấu tạo thành và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng

thích hợp, riêng rẽ hay phối hợp. Đối với Rhizobium sp. sử dụng đệm chiết CTAB và
dùng cát thủy tinh để phá vỡ tế bào VK .
- Giai đoạn 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein,
lipid, polysaccharide…) chủ yếu là protein. Mẫu được ly tâm mạnh trong dung dịch C:I
(chloroform: isoamyl acohol - 24:1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein,
đồng thời không hòa tan acid nucleotic vì thế sau khi ly tâm protein sẽ tủa thành một
lớp giữa dung dịch có chứa acid nucleotic và C:I. Thu nhận lớp ở trên có chứa acid
nucleotic.
- Giai đoạn 3: Kết tủa acid nucleotide bằng isopropanol, thu nhận acid nucleotide
dưới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để
hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Sau đó hòa tan trong ethanol
70% để loại bỏ dấu vết của isopropanol còn dính trên mẫu.
Quy trình tách chiết DNA tổng số:
- Lấy 1.5ml dịch nuôi cấy tế bào đem ly tâm 6000 vòng/phút trong vòng 10 phút,
loại bỏ dịch thu cặn tế bào.
- Tái sinh huyền phù sinh khối bằng 500 µL đệm chiết CTAB (ủ ở 60oC khoảng
10 phút trước khi sử dụng, votex, để mẫu trên đá lạnh).
- Bổ sung 100 mg glass bead, votex mạnh trong 1 phút.
- Bổ sung 500 µL CI (chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), votex. Ly tâm 13.000
15


vòng/phút, 5 phút. Chuyển 400 µL dịch trong sang tube effendorte mới.
- Bổ sung thể tích tương đương isopropanol, trộn nhẹ. (ủ nhiệt độ -20 oC trong
vòng 30 phút để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme). Ly tâm
13.000 vòng/phút, 10 phút, thu kết tủa.
- Rửa tủa bằng cách cho 500 µL ethanol 70%, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút,
5 phút, đổ bỏ dịch, để khô tự nhiên.
- Kết tủa được hòa loãng trong 20 µL nước cất vô trùng, bảo quản ở -20oC.
Khuếch đại vùng gen 16S - rRNA

b.

Gen mã hóa 16S - rRNA của chủng VK được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ
DNA tổng số sử dụng cặp mồi:
Trình tự mồi để khuếch đại gen 16S – rRNA (bảng 2.3) [25].
Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi được sử dụng để khuếch đại vùng gen 16S rRNA

Mồi
27F
1492R

Trình tự
5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG – 3’
5’ – TACCTTGTTACGACTT – 3’

Hỗn hợp phản ứng khuếch đại có tổng thể tích là 20µL bao gồm:
-

Primer F: 1 µL (nồng độ 10pmol/ µL).

-

Primer R: 1 µL (nồng độ 10pmol/ µL).

-

PCR Master mix 2X: 10 µL (công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa).

-

DNA tổng số: 40 ng.

-

Nước cất 2 lần: được thêm đến thể tích 20 µL.

-

Khuếch đại vùng gen 1 được thực hiện trong máy luân nhiệt (AERiS –

BG096.EscoMicro Pte Ltd) theo chu trình ở hình 2.2.

16


Hình 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại PCR
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, điện áp 90V, 120mA, trong 45
phút (sử dụng maker phân tử có kích thước khoảng 1Kb của công ty TNHH MTV Phù
Sa) và nhuộm bằng EtBr 0.05%. Hình ảnh điện di được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại
(UV transilluminator, Wealtec).
c.

Đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA và định danh loài Rhizobium sp.
Sản phẩm PCR được gửi đến “Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa” để đọc

trình tự đoạn gen 16S – rRNA.
Kết quả đọc trình tự 16S – rRNA được so sánh trên ngân hàng gen NCBI để định
danh loài vi khuẩn.

17