Nghiên cứu tác dụng và bước đầu nghiên cứu cơ chế hóa sinh của cao chiết saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
--------***--------

NGUYỄN HỮU SƠN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU
NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HOÁ SINH CỦA
CAO CHIẾT SAPONIN LÁ CHÈ ĐẮNG
(Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MÔ HÌNH
RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN GÂY BỆNH
ALZHEIMER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
--------***--------

NGUYỄN HỮU SƠN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU
NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HOÁ SINH CỦA
CAO CHIẾT SAPONIN LÁ CHÈ ĐẮNG
(Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MÔ HÌNH
RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN GÂY BỆNH
ALZHEIMER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng
2. PGS.TS. Nguyễn Thị Lập
Nơi thực hiện:
1. Viện Dược liệu
2. Bộ môn Hoá sinh
HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng,
trưởng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu. Cô là người đã trực tiếp hướng dẫn
em trong quá trình nghiên cứu khoa học tại khoa, luôn bên cạnh động viên cổ vũ tôi, dìu
dắt em thực hiện tốt khoá luận này.
Tiếp đến, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Lập, bộ
môn Hóa sinh – trường Đại học Dược Hà Nội. Cô đã cho em cơ hội được nghiên cứu
khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời khuyên quý báu,
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị tại khoa Dược lý –
Sinh hóa – Viện Dược liệu đã giúp đỡ, hướng dẫn em về kỹ thuật cũng như tạo điều kiện
để em có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại khoa.
Nhân dịp này, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
em trong thời gian em học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè
đã luôn bên em, ủng hộ và động viên em, là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi em gặp
khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận
này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để
khóa luận được hoàn thiện hơn.

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Hữu Sơn


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: cây Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)
...................................................................................................................................... 2
1.1.1 Tên gọi – Vị trí phân loại................................................................................2
1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố ............................................................................2
1.1.3. Thành phần hoá học...................................................................................... 3
1.1.4. Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây chè đắng ............................... 4
1.2. Tổng quan về bệnh Alzheimer ........................................................................... 6
1.2.1. Sơ lược bệnh Alzheimer ................................................................................6
1.2.2. Dịch tễ.............................................................................................................7
1.2.3. Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di chuyền học ..........................................7
1.2.4. Yếu tố nguy cơ và bảo vệ ...............................................................................8
1.2.5. Cơ chế bệnh sinh ........................................................................................... 9
1.2.6. Một số mô hình nghiên cứu ........................................................................12
1.3. Tổng quan về ruồi giấm chuyển gen................................................................ 15
1.3.1. Tên gọi, vị trí phân loại ...............................................................................15
1.3.2. Đặc điểm .......................................................................................................15
1.3.3. Ưu điểm sử dụng ruồi giấm trong phòng thí nghiệm ................................ 15
1.3.4. Hệ thống GAL4/UAS ................................................................................... 16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị:.................................................................................... 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................19


2.1.2. Động vật thí nghiệm .................................................................................... 19
2.1.3. Dụng cụ, hoá chất nghiên cứu ....................................................................19
2.2 Phương pháp nghiên cứu................................................................................... 21
2.2.1. Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer được cung
cấp bởi Viện Công nghệ Kyoto. .............................................................................21
2.2.2. Đánh giá tác dụng của cao chiết saponin từ lá chè đắng (Ilex kudingcha
C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm gây bệnh Alzheimer bằng thử nghiệm hành
vi ............................................................................................................................. 22
2.2.3. Tìm hiểu cơ chế của cao saponin từ chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)
thông qua mức độ biểu hiện của protein APP ................................................... 30
2.3.

Xử lý thống kê ................................................................................................ 33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................35
3.1. Đánh giá tác dụng của cao chiết saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha
C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer bằng thử
nghiệm hành vi ......................................................................................................... 35
3.1.1. Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm ..............................................35
3.1.2 Đánh giá khả năng nhớ mùi của ruồi giấm trưởng thành ......................... 37
3.1.3. Đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành ........................ 40
3.2. Tìm hiểu cơ chế tác dụng của cây chè đắng Ilex kudingcha C.J.Tseng thông
qua việc đánh giá mức độ biểu hiện của protein tiền chất amyloid (Amyloid
precusor protein –APP) trong não ruồi giấm. ....................................................... 41
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 45

4.1. Về mô hình nghiên cứu ..................................................................................... 45
4.1.1. Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer ..................... 45
4.1.2. Về căn cứ để lựa chọn mức liều 2 mg/ml và 4 mg/ml ................................ 46
4.1.3. Về việc lựa chọn Amyloid precusor protein ................................................46
4.2. Về kết quả nghiên cứu ...................................................................................... 47
4.2.1. Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm ..............................................47
4.2.2. Đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm................................ 48
4.2.3. Đánh giá khả năng sống sót ruồi giấm trưởng thành ............................... 49


4.2.4. Tìm hiểu cơ chế tác dụng của cao chiết lá chè đắng Ilex kudingcha
C.J.Tseng thông qua việc đánh giá mức độ biểu hiện của protein tiền chất
amyloid APP ...........................................................................................................49
4.2.5. Về mức liều của cao chiết saponin lá chè đắng: ........................................50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ theo Tiếng

Viết đầy đủ theo Tiếng Việt

STT

Viết tắt

1

AA

Alzheimer's Association

Hiệp hội Alzheimer

2

AchE

Acetylcholin esterase

Acetylcholin esterase

3

AD

Alzheimer disease

Bệnh Alzheimer

5

AM

n- Amyl acetat

n- Amyl acetat

6

ApoE

Apolipoprotein E

Apolipoprotein E

Anh

Amyloid precursor
7

APP

protein

Protein tiền chất amyloid

8

ATCI

Acetylthiocholin iodid

Acetylthiocholin iodid

9

Aβ

β-amyloid

β-amyloid

10

BPB

Bromophenol blue

Bromophenol blue

11

CĐ

Ilex kudingcha

Chè đắng
Enzym Horseradish

12

HRP

Horseradish peroxidase

peroxidase

13

IK

Ilex kudingcha

Chè đắng

Neuroblastoma x glyoma
14

NG 108-15

hybrid cell, 108CC15

Olfactory bulbectomized

Tế bào lai giữa u nguyên bào
thần kinh và glyoma (một
trong các khối u não phổ biến)
Phẫu thuật loại bỏ vùng khứu

15

OBX

giác

16

OCT

1-octanol

1-octanol

17

PVDF

Polyvinyllidene difluoride

Polyvinyllidene difluoride

18

ROS

Reactive oxygen species

Gốc oxy hoá tự do

19

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Sodium dodecyl sulphate

Sodium dodecyl sulphate
SDS-PAGE
20

polyacrylamide gel

Điện di polyacrylamide với

electrophoresis

SDS

21

TBS

Tris buffer saline

Đệm tris

22

βAP

β-amyloid peptid

β-amyloid peptid


DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1. 1: Hình ảnh cây chè đắng và búp chè đắng khô (Ilex kudingcha C. J. Tseng) ..3
Hình 1. 2: Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào[46] ....................... 10
Hình 1. 3 : Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) ........................................................ 15
Hình 1. 4: Hệ thống biểu hiện GAL4/UAS với UAS-hAPP .........................................17
Hình 2. 1: Thiết kế nghiên cứu ...................................................................................... 18
Hình 2. 2: Mô hình kiểm tra trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm ......................... 29
Hình 3. 1: Tốc độ di chuyển của ấu trùng .....................................................................35
Hình 3. 2: Điểm leo trèo trung bình của các lô ruồi sau khi nở được 3 ngày, 7 ngày và
10 ngày. ......................................................................................................................... 37
Hình 3. 3: Giá trị PREFAM khi AM kết hợp với phần thưởng. .....................................38
Hình 3. 4: Giá trị PREFOCT khi OCT kết hợp với phần thưởng. ...................................39
Hình 3. 5: Chỉ số học tập (LI scores).............................................................................40
Hình 3. 6: Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ sống sót của ruồi theo ngày......................................41
Hình 3. 7: Sự biểu hiện của protein tiền chất amyloid theo cường độ tín hiệu hoá phát
quang thu được ..............................................................................................................42
Hình 3. 8: Tỉ lệ hAPP/beta-actin ở các lô ruồi ............................................................. 43


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1: Hoá chất .......................................................................................................19
Bảng 2. 2: Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................... 20
Bảng 3. 1: Mức độ biểu hiện protein ở các lô ruồi ........................................................ 42


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Alzheimer (Alzheimer's disease hay AD) hay đơn giản là Alzheimer là một
chứng mất trí phổ biến nhất. Chứng mất trí ảnh hưởng xấu tới chức năng nhận thức và
khả năng hoạt động hàng ngày. Điều nguy hiểm là các triệu chứng của sa sút trí tuệ tiến
triển một cách âm thầm và ngày càng trở nên tồi tệ hơn theo năm tháng. Người bệnh
phải được chăm sóc bởi những người thân trong gia đình. Đây quả thực là những áp lực

rất lớn về mặt xã hội, tâm lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người chăm
sóc. Ở các nước phát triển, Alzheimer là một trong những bệnh tốn kém nhất cho xã hội
do đó tìm ra các loại thuốc mới hoặc các chiến lược phát triển thuốc mới giúp ngăn ngừa,
điều trị chứng mất trí có hiệu quả và an toàn là vô cùng cần thiết.
Chè Đắng có tên khoa học là Ilex kudingcha C.J.Tseng (IK) (Ilex latifolia) là
loài cây thân gỗ sống lâu năm mọc trên các vùng núi đá vôi ở Việt Nam, phân bố chủ
yếu ở một số tỉnh như Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình và Ninh Bình. Trong y
học cổ truyền Việt Nam, Chè đắng được sử dụng làm vị thuốc để loại bỏ các độc tố,
kháng khuẩn, giảm cơn khát và ho, ngứa mắt, mắt đỏ, đặc biệt là để tăng cường sự tập
trung và cải thiện trí nhớ. Triterpenoid, axit phenolic, flavonoid và tinh dầu là những
chất chính của Chè đắng và các thành phần này có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu,
điều hòa quá trình chuyển hóa lipid, và có tác dụng chống oxy hoá, hạ đường huyết và
ức chế khối u [31]. Trong một nghiên cứu của tác giả Kim và các cộng sự đã chỉ ra rằng
Chè đắng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh tại các điểm thiếu máu cục
bộ ở chuột nhắt [25]. Hơn nữa, cũng có các nghiên cứu cho tác dụng bảo vệ thần kinh
chống lại protein amyloid β (Aβ)- yếu tố gây suy giảm trí nhớ và yếu tố gây độc tế bào
thần kinh vỏ não trên chuột [26]. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng của
cây chè đắng trên bệnh Alzheimer.
Vì những lý do trên, đề tài được thực hiện với mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết saponin lá Chè đắng (Ilex
kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer.
2. Nghiên cứu cơ chế hoá sinh giúp cải thiện trí nhớ của cao chiết saponin lá
Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh
Alzheimer.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: cây Chè đắng (Ilex kudingcha

C.J.Tseng)
1.1.1 Tên gọi – Vị trí phân loại
Ở Việt Nam, tên khoa học của cây CĐ mọc ở vùng núi đá vôi thuộc tỉnh Cao Bằng
và một số địa phương khác là Ilex kudingcha C. J. Tseng (với tên đồng nghĩa là Ilex
kaushue S. Y. Hu). Tên Việt Nam là chè đắng ( tiếng Tày-Nùng gọi là “Ché khôm”, khổ
đinh trà [2]. Chi Ilex thuộc họ Nhựa ruồi hay họ Bùi hay Trâm bùi (Aquifoliaceae, tên
khác là Ilicaceae), bộ Celetrales phân lớp Rosidae (phân lớp Hoa hồng), ngành Ngọc
Lan.
1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố
Cây thân gỗ, cao 6-20m, đường kính thân từ 20-60cm, có cây đường kính cao tới
1,2m (hình 1.1). Cành thô, màu nâu xám, không có lông, cành non hình trụ có nhiều gờ
nhỏ. Lá đơn mọc cách, mép lá có răng cưa nhỏ và tù. Phiến lá hình bầu dục đến thuôn
hoặc hình mác ngược. Ở cây trưởng thành lá thường dài 12-17cm, rộng 5-6cm. Mặt trên
của lá màu lục sẫm và láng bóng, mặt dưới màu lục nhạt, cả hai mặt đều không có lông.
Lá vò trong tay có mùi thơm mát, hơi hắc của tinh dầu. Hoa màu trắng ngà, đơn tính
khác gốc.
Cây CĐ là loại cây mọc tự nhiên, phân bố tản mạn ở một số địa phương miền núi
phía bắc nước ta như Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình, Ninh Bình, trong đó,
Cao Bằng là địa phương được xác định có 6/12 huyện có mật độ phát triển của cây CĐ
cao, chiếm 32% diện tích toàn tỉnh

2


Hình 1. 1: Hình ảnh cây chè đắng và búp chè đắng khô (Ilex kudingcha C. J. Tseng)
(Nguồn: Sở Khoa học công nghệ và môi trường tỉnh Cao Bằng (2002), “Cây chè
đắng giá trị kinh tế và kỹ thuật trồng”, Tài liệu phổ khoa học kỹ thuật. Số 1 - 2002)
1.1.3. Thành phần hoá học
Thành phần hóa học chủ yếu của chè đắng gồm các triterpenoid, các acid phenolic,
các flavonoid và các tinh dầu [30]. Một số saponin triterpenoid trong chè đắng: Các

ursan triterpenoid với vòng lacton ở vị trí C20 và C28 được gọi là α-kudinlacton, βkudinlacton và γ-kudinlacton được xem là thành phần hóa học chính trong các loài chè
đắng.
Ở Việt Nam, đã phát hiện trong lá CĐ thu hái tại Cao Bằng cũng có saponin
triterpenoid tương tự như lá CĐ ở Trung Quốc. Ngoài ra, còn có flavonoid, β-caroten,
polysaccharid, coumarin, acid hữu cơ, acid amin [5], [3], [4].

3


1.1.4. Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây chè đắng
1.1.4.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây chè đắng làm thuốc
Cây CĐ (Ilex kudingcha C.J. Tseng) đã được sử dụng làm thuốc và nước uống ở
miền nam Trung Quốc từ cách đây 2000 năm [20]. Theo kinh nghiệm, lá CĐ được sử
dụng trong nhân dân để làm thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng cường trí
nhớ; thuốc tăng lực, kích thích tiêu hóa, kéo dài tuổi thọ. Ngoài ra, lá CĐ còn được sử
dụng để giải độc, trị đau đầu, viêm mũi, viêm họng, viêm phế quản, ...
Trong vài năm qua, CĐ đã được coi là một loại đồ uống dành cho người ăn kiêng
và đang trở nên phổ biến với những cái tên như trà làm đẹp giảm béo, trà lâu năm, trà
xanh, trà và trà thanh đạm và đã được báo cáo về chất chống oxy hóa rõ ràng, chống
viêm, chuyển hóa lipid, bảo vệ gan và chống ung thư [31].
Uống chè đắng thường xuyên như một loại trà thảo dược có vai trò tích cực trong
ngăn ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, bệnh mạch não, tiểu đường, viêm họng và ung
thư, đặc biệt là các vấn đề liên quan đến xơ cứng động mạch, cao huyết áp, chóng mặt,
mất ngủ, đánh trống ngực, đau tức ngực do các bệnh tim mạch [55]. CĐ có hoạt tính
sinh học trên chuyển hóa lipid, chống oxy hóa, ức chế khối u, có tác dụng hạ đường
huyết, và bảo vệ hệ thống tim mạch tương tự như trà xanh và [32].
1.1.4.2. Các nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu về thành phần hóa học, độc tính, tác dụng trên thần kinh
Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Diệu Anh (2009) [1] đã phân lập và xác định được
cấu trúc 4 saponin triterpenoid pentacyclic, 2 flavonoid. Đây là những hợp chất saponin

và flavonoid lần đầu được phân lập và xác định cấu trúc hóa học từ lá CĐ thu hái tại
Cao Bằng. Saponin CĐ và cao nước CĐ có độc tính cấp thấp và được xếp vào loại chế
phẩm không xác định được LD50. Về độc tính bán trường diễn, cả 2 chế phẩm saponin
và cao nước CĐ đều không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, tạo máu của thỏ, tế bào
gan, cầu thận và ống thận trong giới hạn bình thường. Saponin CĐ không ảnh hưởng
đến sự phát triển của cơ quan sinh dục và khả năng thụ tinh của chuột cống trắng đực.
Đối với tác dụng tăng cường khả năng học tập và ghi nhớ: Saponin CĐ có tác dụng rút
ngắn 8,57% số ngày học tập phản xạ có điều kiện và kéo dài 69,14% thời gian duy trì
phản xạ đã học được so với lô chuột đối chứng.

4


1.1.4.3 Các nghiên cứu trên thế giới
Tác dụng trên lipid và lipoprotein huyết tương
Những kết quả nghiên cứu trên chó thực nghiệm cho thấy dịch chiết lá cây CĐ có
tác dụng hạ huyết áp (HA) rõ rệt. Mức độ hạ HA từ từ, thời gian và mức độ hạ HA phụ
thuộc vào liều lượng, liều càng cao tác dụng càng mạnh. Dịch chiết lá CĐ có tác dụng
làm hạ cholesterol máu, mức độ hạ cholesterol phụ thuộc vào liều lượng thuốc [41].
Tác dụng bảo vệ hệ mạch
Cao nước của I. kudingcha làm tăng sự chảy của dòng máu trong động mạch vành
trên tim lợn cô lập và làm tăng dòng máu động mạch não trên thỏ được gây mê, kéo dài
thời gian sống sót của chuột trong tình trạng thiếu oxy và bảo vệ chuột do thiếu máu cơ
tim gây bởi pituitrin. Các tác dụng này có lợi trong phòng ngừa và điều trị các bệnh
mạch vành và đau thắt ngực [56].
Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh
Kim và cộng sự đã báo cáo rằng CĐ bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần
kinh do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột nhắt. CĐ làm giảm đáng kể MCAO/tái
tưới máu gây ra do phù nề, thiếu máu thần kinh và chết tế bào não. Sự suy giảm
glutathion và quá trình peroxy hóa lipid gây ra bởi MCAO/tái tưới máu đã được ức chế

khi dùng CĐ. CĐ làm ức chế đáng kể sự tăng phosphoryl hóa MAPKs, COX-2 và
protein gây chết tế bào theo chương trình ở chuột. Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi
tổn thương do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột của CĐ có thể do tác dụng ngăn
chặn sự chết tế bào, là kết quả của tác dụng chống oxy hóa và tác dụng chống viêm của
nó [25].
Hơn thế nữa, dược liệu chè đắng I.latifolia đã được báo cáo là có tác dụng bảo vệ
thần kinh chống lại suy giảm trí nhớ gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) ở chuột. Tác
dụng bảo vệ thần kinh của dịch chiết ethanol của CĐ chống lại sự suy giảm trí nhớ gây
bởi Aβ ở chuột và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não chuột. Sự suy giảm trí nhớ ở
chuột được gây ra bởi tiêm trong não thất 15 nmol Aβ (25-35) và đánh giá bằng thử
nghiệm né tránh thụ động và thử nghiệm mê lộ nước Morris. Dùng CĐ trong thời gian
dài (25/100 mg/kg, p.o) giúp ngăn chặn đáng kể tác hại gây suy giảm trí nhớ gây ra bởi

5


Aβ (25-35). CĐ cũng ngăn chặn sự suy giảm nồng độ glutathion, sự tăng peroxy hóa
lipid, sự biểu hiện của phosphoryl hóa tau (p-tau) và sự thay đổi trong quá trình chết tế
bào theo chương trình liên quan đến protein trong suy giảm trí nhớ ở não chuột. Ủ các
tế bào thần kinh vỏ não nuôi cấy với 10 μM Aβ (25-35) trong 36 giờ gây chết tế bào
thần kinh. Tác động gây chết các tế bào thần kinh, làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào, tạo
ra các phản ứng oxy hóa và biểu hiện của các protein gây chết tế bào theo chương trình
gây ra bởi Aβ (25-35) trên các tế bào thần kinh bị ức chế bởi CĐ ở nồng độ 1-50 μg/ml).
Những kết quả này cho thấy CĐ có thể có vai trò trong cải thiện suy giảm nhận thức liên
quan đến bệnh Alzheimer. Cơ chế có thể do ức chế sự chết tế bào liên quan đến hoạt
tính chống oxy hóa và ức chế sự phosphoryl hóa protein tau [26].
Cơ chế bảo vệ thần kinh của chè đắng chống lại độc tính gây ra bởi protein amyloid
β (Aβ) là do ức chế sự chết tế bào thần kinh gây bởi stress oxy hóa và sự phosphoryl
hóa protein tau. Vì mất vùng khứu giác (olfactory bulbectomized - OBX) cũng gây tăng
mức Aβ [26] nên có thể xem xét cơ chế ức chế sự chết tế bào của chè đắng có thể góp

phần làm giảm chứng mất trí ở chuột OBX. CĐ có thể ngăn ngừa ảnh hưởng của
glutamat gây tổn thương tế bào thần kinh bằng cách ức chế sự gia tăng nồng độ Ca2+,
các ROS và con đường gây chết tế bào theo chương trình. Ngoài ra, tác dụng ngăn chặn
tổn thương não gây ra do thiếu máu cục bộ có thể liên quan đến các hoạt động chống
kích thích và chống oxy hóa của các hoạt chất CQA trong CĐ (3,4-Dicaffeoylquinic
acid (diCQA), 3,5-diCQA, và 3,5-diCQA methyl ester).
1.2. Tổng quan về bệnh Alzheimer
1.2.1. Sơ lược bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer (Alzheimer disease –AD) là một chứng mất trí phổ biến nhất,
được phát hiện lần đầu tiên năm 1906 bởi bác sĩ tâm thần và thần kinh học người Đức
Alois Alzheimer ((1864-1915).
Vào ngày 3 tháng 11 năm 1906, Alois Alzheimer đã báo cáo một bệnh nặng đặc
biệt của vỏ não ở một phụ nữ 50 tuổi ở Tây Nam Đức. Ông đã theo dõi từ khi cô mắc
chứng hoang tưởng, giấc ngủ tiến triển và rối loạn trí nhớ, gây hấn và bối rối, cho đến
khi cô qua đời 5 năm sau đó. Báo cáo của ông ghi nhận các mảng đặc biệt và các rối

6


loạn sợi thần kinh trong mô học não. Alzheimer đã công bố thêm ba trường hợp vào
năm 1909 và một biến thể chỉ có mảng bám vào năm 1911 [6], [36].
1.2.2. Dịch tễ
Tỷ lệ mắc bệnh Alzheimer tăng dần theo tuổi. Ước tính AD chiếm 60% trong các
bệnh suy giảm trí nhớ. Trong nhóm tuổi 65 đến 70 tỷ lệ mắc bệnh chiếm 1-4% và con
số này tăng gấp đôi cho mỗi 5 năm. Phụ nữ thường có tỉ lệ mắc bệnh cao gấp 2 lần so
với nam giới, một phần do tuổi thọ của họ cao hơn. Mặc dù vậy, ở nam giới tỷ lệ mắc
sa sút trí tuệ do mạch máu lại cao hơn nữ [6].
Theo số liệu thống kê của Hiệp hội Alzheimer thế giới 2015, tỷ lệ mắc Alzheimer
tăng dần theo tuổi, từ khoảng 5% của người dưới 75 tuổi lên đến 40-50% của người sau
85 tuổi. Bệnh Alzheimer luôn đi kèm với một khoản ngân sách điều trị khổng lồ và một

gánh nặng về thể chất cũng như tinh thần lên bệnh nhân và người thân của họ [6], [36],
[44].
Dân tộc: Các dân tộc khác nhau có tỷ lệ mắc bệnh cũng khác nhau. Người da trắng
ít mắc bệnh hơn người Mỹ gốc Phi hoặc Tây Ban Nha. Người châu Á cũng ít mắc bệnh
hơn những người ở nơi khác. Một số quan điểm còn cho rằng bệnh chịu ảnh hưởng của
yếu tố môi trường [6], [44].
Tăng huyết áp tâm thu và tăng cholesterol máu sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer
hơn những người bình thường [6].
Hội chứng Down: Người bị hội chứng này sẽ bị Alzheimer khi sống đến 40 tuổi
và những bà mẹ sinh con bị Down sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer [6].
1.2.3. Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di chuyền học
Nguyên nhân chính xác của bệnh Alzheimer còn chưa nghiên cứu được, nhưng
một số yếu tố di truyền và môi trường được xác định gây ra bệnh Alzheimer chiếm
khoảng dưới 1% số trường hợp. Các trường hợp Alzheimer khởi phát sớm có liên quan
đến thay đổi nhiễm sắc thể số 1, 14 hoặc 21, trong đó đa số các trường hợp do đột biến
một gen sản xuất perseniline 1 trên nhiễm sắc thể 14. Ngoài ra còn có perseniline 2 có
cấu trúc tương tự perseniline 1 được sản xuất bởi gen trên nhiễm sắc thể số 1. Cả 2
protein này đều mã hóa cho protein màng tế bào tham gia quá trình hình thành protein

7


tiền chất amyloid (APP). Các nhà khoa học đã xác định được hơn 160 đột biến trong các
gen perseniline làm giảm hoạt động của γ-secretase, hình thành Aβ. APP được mã hóa
bởi gen trên nhiễm sắc thể số 21 và chỉ số ít trường hợp khởi phát sớm liên quan đến đột
biến gen mã hóa cho APP [12].
Các trường hợp Alzheimer khởi phát muộn chủ yếu liên quan đến Apolipoprotein
E (ApoE). Có 3 loại ApoE là ApoE2, ApoE3, ApoE4 trong đó ApoE4 đóng vai trò nhiều
trong Alzheimer khởi phát muộn thông qua kết hợp với các yếu tố nguy cơ khác như bất
thường ty lạp thể, rối loạn chức năng thành tế bào và tiêu thụ glucose kém. Nguy cơ mắc

bệnh Alzheimer cao gấp 3 lần ở người có 1 ApoE4 và cao gấp 12 lần ở người có 2
ApoE4 so với người không có ApoE [8], [12].
Ngoài các nguyên nhân trên, còn một số yếu tố khác dẫn đến hình thành
Alzheimer:
Yếu tố nhiễm độc nhôm: tình trạng nhiễm độc nhôm dường như có liên quan đến
sự tăng lắng đọng protein Aβ và số lượng các đám rối sợi thần kinh trung ương não bệnh
nhân Alzheimer [6].
Yếu tố nhiễm trùng (virus chậm) giống như bệnh creutzfeld-Jakob [6].
Các rối loạn chuyển hóa: phản ứng oxy hóa quá mức dẫn đến tăng các gốc tự do.
Các gốc tự do này được cho là có liên quan đến sự kết hợp và tăng lắng đọng protein
Aβ gây chết tế bào thần kinh. Sự giảm lưu lượng máu não, rối loạn sinh tổng hợp các
yếu tố dinh dưỡng thần kinh...cũng được giả định là có vai trò trong cơ chế gây bệnh
Alzheimer [6].
1.2.4. Yếu tố nguy cơ và bảo vệ
1.2.4.1. Yếu tố nguy cơ
Tuổi là yếu tố nguy cơ rất lớn với bệnh Alzheimer. Ở người trên 60 tuổi, cả tỷ lệ
mắc chung và tỷ lệ mới mắc bệnh Alzheimer cứ sau 5 năm lại tăng lên gấp đôi: Ở nhóm
tuổi 65-69 số người bị bệnh là 2%, ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40% [6].
Tiền sử gia đình có người bị bệnh Alzheimer: Các thành viên trong gia đình này
có thể mang những biến đổi di truyền đã được xác định rõ (ở nhiễm sắc thể 21, 14,1...)

8


hoặc mang các kiểu gen làm tăng cơ địa dễ bị bệnh như ApoE4...Tần số xuất hiện bệnh
là 50% trong số con các bệnh nhân Alzheimer [6].
Bệnh mạch máu não gồm nhồi máu xuất huyết (hemorrhagic infarcts), nhồi máu
thiếu máu (ischemic infarcts), viêm mạch máu (vasculopathies) và thay đổi chất trắng
(white matter changes) làm tăng nguy cơ sa sút trí tuệ.
Tăng huyết áp (40-60 tuổi) làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức giai đoạn cuối.

Tuy nhiên, tuổi càng cao nguy cơ này càng giảm.
Đái tháo đường typ II tăng gần gấp đôi nguy cơ Alzheimer.
Cân nặng cơ thể quá cao hoặc quá thấp đều làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức
và Alzheimer.
Nồng độ lipid máu, hội chứng chuyển hóa, hút thuốc lá và chấn thương sọ não
có thể làm tăng hoặc giảm nguy cơ sa sút trí tuệ với các bằng chứng ở nhiều nghiên cứu
khác nhau [44].
1.2.4.2 Yếu tố bảo vệ
Chế độ ăn nhiều rau, cá, ít thịt với dầu oliu là nguồn cung cấp chất béo chính cùng
lượng vừa phải rượu vang làm giảm nguy cơ mắc Alzheimer và sa sút trí tuệ. Ngoài ra,
việc cung cấp caroten, vitamin C, vitamin E làm giảm nguy cơ suy giảm nhận thức vẫn
còn nhiều tranh cãi.
Tập thể dục có thể làm giảm nguy cơ suy giảm nhận thức hoặc không ảnh hưởng
ở các bằng chứng khác nhau.
Các hoạt động kích thích nhận thức như học tập, đọc sách, chơi trò chơi làm giảm
nguy cơ sa sút trí tuệ ở mọi lứa tuổi [44].
1.2.5. Cơ chế bệnh sinh
Cho đến nay, người ta đã thừa nhận Alzheimer là một bệnh thoái hóa não do nhiều
nguyên nhân gây ra, không đồng nhất về mặt di truyền, phát sinh và tiến triển theo những
cơ chế không hoàn toàn giống nhau giữa các bệnh nhân. Tuy nhiên, người ta đã đưa ra
1 giả thuyết để liên kết vai trò của tất cả các thành tố cơ bản trong bệnh nguyên, đó là
giả thuyết Beta amyloid (hình 1.2) [6].

9


Giả thuyết Beta amyloid:

Hình 1. 2: Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào[46]
β - amyloid peptid (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa

bao gồm 36-43 acid amin, βAP42 ít phổ biến hơn so với các βAP nhưng lại dễ bị kết tụ
và hình thành mảng bám. Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải của các peptid làm
cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào. Giả thuyết chỉ ra sự tích
tụ β-amyloid peptid (βAP) được coi là độc tố làm ngăn cản quá trình cân bằng ion calci,
ức chế chức năng của một số enzyme và khả năng sử dụng glucose của tế bào thần kinh
đồng thời kích hoạt sự chết theo chương trình (apoptosis) [48], [14]. Người ta vẫn chưa
biết chính xác sự biến đổi trong việc sản xuất βAP đến mức độ nào thì gây ra suy giảm
trí nhớ.
Sự hình thành mảng bám amyloid
Các APP gen mã hóa cho một protein gọi là protein tiền thân amyloid. Protein
này được tìm thấy trong nhiều mô và cơ quan, bao gồm não và tủy sống (hệ thần kinh
trung ương).

10


Hơn 50 đột biến khác nhau trong gen APP có thể gây ra bệnh Alzheimer khởi
phát sớm, bắt đầu trước tuổi 65. Những đột biến này chịu trách nhiệm cho ít hơn 10
phần trăm của tất cả các trường hợp khởi phát sớm.
Biến đổi APP phổ biến nhất thay đổi một trong các amino acids của protein tiền
thân amyloid. Đột biến này thay thế amino acid valine bằng amino acid isoleucine ở vị
trí protein 717 (viết bằng Val717Ile hoặc V717I). Các đột biến trong gen APP có thể
dẫn đến tăng lượng amyloid β peptide hoặc tạo ra một dạng peptide dài hơn và dính
hơn. Khi những mảnh protein này được giải phóng khỏi tế bào, chúng có thể tích tụ
trong não và tạo thành các khối gọi là mảng amyloid. Những mảng này là đặc trưng của
bệnh Alzheimer. Sự tích tụ các mảng amyloid β peptide và amyloid độc hại có thể dẫn
đến cái chết của tế bào thần kinh và các dấu hiệu và triệu chứng tiến triển của chứng rối
loạn này.
Mảng bám amyloid là sự phân giải của protein tiền thân amyloid (amyloid
precursor protein – APP) một glycoprotein xuyên màng, chức năng chưa rõ. APP gồm

770 acid amin, protein này biểu hiện trong nhiều mô nhưng đặc biệt trong các khớp thần
kinh cuả các neuron. APP bị phân cắt bởi 3 enzym: α, βvà γ secretase. Trước hết, APP
bị cắt cạnh tranh bởi α và β-secretase. Nhiều nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa làm
giảm hoạt tính của α-secretase, làm tăng cường biểu hiện và kích hoạt β-secretase. Con
đường α-secretase tạo ra sAPPα, các sAPPα hòa tan này liên quan đến sự dẫn truyền
thần kinh bình thường ở synap và C83. Con đường β-secretase sinh ra sAPPβ và C99.
Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ γ-secretase (γ-secretase là một
phức hợp đa enzyme có chứa preseniline 1,2. Đột biến preseniline được tìm thấy ở bệnh
nhân Alzheimer sớm có tính chất gia đình). Riêng với C99 dưới tác dụng của γ-secretase
sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan Amyloid β 40 (βAP40) và Amyloid β 42
(βAP42). βAP42 có tính chất độc hơn và nhiều hơn βAP40. Các monomer này trải qua
một sự thay đổi đáng kể về cấu hình ở nồng độ cao để hình thành cấu trúc bậc ba của
dạng monomer. Những monomer này sau đó kết hợp lại thành các oligomer (là dimer
hoặc trimer), chúng dường như là các chất độc thần kinh, không hòa tan xung quanh các
tế bào thần kinh và dần dần thành các mảng beta amyloid (hình 1.2) [7]
Giả thuyết cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác

11


Rối loạn chức năng và thoái hóa tế bào lan tỏa dẫn đến một loạt các khiếm khuyết
dẫn truyền thần kinh, trong đó, các bất thường trên hệ cholinergic là nổi bật nhất. Sự
mất hoạt động của hệ cholinergic tương quan thuận với mức độ nghiêm trọng của bệnh
Alzheimer. Vào giai đoạn muộn của bệnh Alzheimer, số lượng các tế bào thần kinh
cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và vỏ não giảm xuống.
Thụ thể nicotinic trước synap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng
như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm:
glutamat, serotonin và norepinephrin. Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất tế bào
cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh Alzheimer, do đó, việc tăng
chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ [48], [14].

1.2.6. Một số mô hình nghiên cứu
Mô hình sàng lọc đầu tiên phải kể đến là nghiên cứu các chất có tác dụng ức chế
hoạt tính enzym acetylcholinesterase. Đây là mô hình đơn giản, dễ làm và ít tốn kém.
Về nguyên tắc có thể định lượng acetylcholin (ACh) và acetylcholinesterase (AChE)
thông qua trung gian enzym cholin oxidase xúc tác các phản ứng. ACh sẽ bị enzym
AChE chuyển thành cholin, sau đó nó bị cholin oxidase oxy hóa chuyển thành betain và
H2O2. Dưới sự xúc tác của horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với thuốc
thử 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tạo chất có màu hồng. Đo cường độ huỳnh
quang ở 563 nm. Cường độ huỳnh quang của 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tỷ lệ
thuận với nồng độ ACh và AChE. Từ đó có thể định lượng được nồng độ ACh và hoạt
tính của AChE. Hoặc có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của enzym AChE ex
vivo theo nguyên tắc của Ellman và cộng sự: cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị
thủy phân bởi AChE tạo thành thiocholin và acid acetic. Thiocholin thu được cho phản
ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra accid 5-thio-2-nitro benzoic (RS) có màu vàng,
có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 412 nm. Chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến
hành định lượng hoạt tính enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng
sự. Có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của AChE in vitro với nguyên tắc tiến
hành theo phương pháp của Ellman và cộng sự nhưng sử dụng AChE có sẵn [11], [17].
Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh
vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị
Alzheimer, bằng cách gây độc các tế bào này bởi protein beta-amyloid hoặc glutamat,

12


sử dụng mẫu nghiên cứu để bảo vệ tế bào thần kinh đó, định lượng lượng tế bào sống
sót [22], [26], [28], [29]. Thuốc điều trị Alzheimer sẽ được sử dụng để ngăn chặn hoặc
làm giảm bớt độc tính của protein beta-amyloid hoặc glutamat trên tế bào thần kinh NG
108-15 nuôi cấy, có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của
tế bào thần kinh.

Trên mô hình động vật, người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen mang bệnh
Alzheimer như chuột Tg2576, PSAPP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới).
Nghiên cứu trên mô hình động vật chuyển gen mang bệnh ở người là cần thiết để hiểu
rõ về cơ chế phân tử và thúc đẩy nghiên cứu tiền lâm sàng. Bệnh Alzheimer đã được
gây trên mô hình chuột chuyển gen thế hệ đầu tiên (Tg), trên chuột chuyển gen này có
sự biểu hiện quá mức của protein có liên quan đến bệnh Alzheimer có tính chất gia đình,
hoặc sử dụng mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 là APP mang đột biến protein tiền
thân amyloid (APP), hoặc đột biến cả APP và presenilin (PS). Các chủng chuột chuyển
gen này thể hiện bệnh lý Alzheimer nhưng mô hình biểu hiện quá mức có thể dẫn tới
các kiểu hình bổ sung không liên quan đến Alzheimer. Mô hình chuột chuyển gen thế
hệ thứ 2 APP chứa các trình tự gen người và đột biến gen APP nội sinh trên lâm sàng.
Những chuột này cho thấy sự tích tụ β-amyloid không có kiểu hình liên quan đến biểu
hiện quá mức nhưng chưa phải là biểu hiện Alzheimer trên lâm sàng của người [45],
[27].
Một số mô hình gây mất trí nhớ cho chuột bằng hóa chất như tiêm scopolamin
bằng đường phúc mạc, hoặc truyền colchicin vào não chuột cống cũng được sử dụng
[15], [37], [51], [54].
Bên cạnh đó, các mô hình phẫu thuật gây mất trí nhớ cho chuột cũng được nhiều
nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Mô hình gây mất trí nhớ do thiếu máu não cục
bộ (ischemia induced learning and memory deficit) bằng cách thắt 2 động mạch cảnh
đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút máu đuôi chuột đã được giáo sư Kinzo
Matsumoto sử dụng để nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer từ năm 2000 [29]. Trong
mô hình này, chuột sẽ được gây mê, sau đó bộc lộ 2 động mạch cảnh một cách cẩn thận,
thắt 2 động mạch cảnh này bằng chỉ kẹp động mạch trong 30 phút, đồng thời lấy máu
đuôi chuột trong quá trình gây thiếu máu cục bộ. Đây cũng là mô hình đã triển khai
thành công tại Viện Dược liệu.

13

Một mô hình mới cũng được sử dụng hiện nay là mô hình gây suy giảm học và
nhớ trên chuột mất vùng khứu giác (learning and memory deficit in olfactory
bulbectomized mice) của giáo sư Kinzo Matsumoto áp dụng từ năm 2011 [29]. Chuột
được gây mê và cố định trên hệ thống định vị chuột. Sau đó, rạch da bộc lộ phần hộp sọ
bao phủ vùng khứu giác (OBX) rồi khoan thủng 1 lỗ đường kính 1 mm, phá hủy vùng
khứu giác của chuột, lấp đầy vùng này bằng bọt cầm máu gelatin. Chuột sau khi bị loại
bỏ vùng khứu giác sẽ bị suy giảm khả năng học tập và trí nhớ.
Mô hình ruồi giấm: Ruồi giấm có tên khoa học là Drosophila melanogaster, đã
được giải trình tự toàn bộ hệ gen, và nó cho thấy có hơn 70% gen tương đồng với bộ
gen của người [24], [23]. Với ưu thế vòng đời ngắn, dễ nuôi trong phòng thí nghiệm và
có thể cung cấp số lượng nhiều trong cùng một thời điểm, do đó ruồi giấm là nguồn gen
thuận lợi cho việc nghiên cứu bệnh liên quan đến yếu tố di truyền cũng như có tiềm
năng trở thành mô hình kinh tế cho những nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc thuốc
[18], [49].
Nhận thức được tính cần thiết của việc nghiên cứu bệnh, tạo mô hình để nghiên
cứu, cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu và sử dụng ruồi giấm làm mô
hình nghiên cứu bệnh trên người trong đó có bệnh thoái hóa thần kinh, ví dụ như công
bố của nhóm nghiên cứu Parsa Kazemi-Esfarjani, Seymour Benzer trong việc ức chế
độc tính của polyglutamine trên mô hình ruồi giấm [24], [23]. Nhóm tác giả của John
M. Warrick (năm 2005) thì ứng dụng mô hình tương tự cho nghiên cứu tác dụng ức chế
polyglutamine của Ataxin-3 [52]. Nhóm Botella và cộng sự năm 2009 và 2011 đã dùng
ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson [19]. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản,
nhóm tác giả Hideya Mizuno (năm 2011) cũng đã dùng mô hình ruồi giấm chuyển gen
alpha-synuclein làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson và các yếu tố liên quan. Nhóm
tác giả Masamitsu Yamaguchi (2017) và một số nhóm nghiên cứu khác đã dùng mô hình
ruồi giấm đột biến gen ATP binding cassette subfamily A member 13 (ABCA13) làm
mô hình nghiên cứu bệnh tự kỷ [47], [50].
Hiện nay trên thế giới có ba trung tâm lưu giữ đầy đủ nguồn gen ruồi giấm là Mỹ,
Ấn độ và Nhật bản, là những cơ sở luôn sẵn sàng cung cấp trao đổi nguồn gen sẵn có
cho các nhà nghiên cứu ở bất kỳ đâu trên thế giới, cần nhấn mạnh hơn là hầu hết các

trường y-dược lớn tại Nhật bản, Châu âu và Mỹ đều có các phòng thí nghiệm dùng mô

14


hình ruồi giấm trong nghiên cứu y sinh. Ở Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào đi
sâu vào mức độ phân tử về bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh tự kỷ, Parkinson, bệnh
Alzheimer, và Huntington cũng như chưa có phòng thí ngiệm nào tạo lập được các mô
hình động vật chuyển gen để nghiên cứu bệnh và sàng lọc thuốc. Các nghiên cứu chủ
yếu tập trung vào tỷ lệ mắc bệnh biểu hiện lâm sàng và các biến chứng của bệnh.
1.3. Tổng quan về ruồi giấm chuyển gen
1.3.1. Tên gọi, vị trí phân loại
Drosophila melanogaster là một loài ruồi trong họ Drosophilidae, phân bố ở tất cả các
châu lục, bao gồm cả các đảo.[35]

Hình 1. 3 : Ruồi giấm (Drosophila melanogaster)
1.3.2. Đặc điểm
Ruồi giấm có màu vàng nâu và có các vòng đen ngang bụng. Con cái trưởng thành
dài khoảng 2.5mm, con đực nhỏ hơn một chút với lưng tối hơn. Con đực dễ dàng phân
biệt được với con cái dựa trên sự khác biệt về màu sắc, với một mảng đen khác biệt ở
bụng.
1.3.3. Ưu điểm sử dụng ruồi giấm trong phòng thí nghiệm
D. melanogaster là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng để phân tích
di truyền. Tất cả các sinh vật đều sử dụng hệ thống di truyền phổ biến; do đó, hiểu được
các quá trình như phiên mã và sao chép ở ruồi giấm giúp hiểu được các quá trình này ở
các sinh vật nhân chuẩn khác, bao gồm cả con người. Có nhiều lý do để ruồi giấm là
một lựa chọn phổ biến trong nghiên cứu. Thứ nhất, Sử dụng ruồi giấm nghiên cứu sẽ ít

15

vấp phải các vấn đề liên quan tới đạo đức trong nghiên cứu y sinh học hơn là tiến hành
thử nghiệm lên các động vật bậc cao hơn hay động vật có vú như khỉ. Thứ hai, ruồi giấm
có vòng đời ngắn nên cho phép tạo ra một lượng lớn ruồi giấm trong một thời gian ngắn.
Một phôi xuất hiện trong vòng 24 giờ sau khi thụ tinh trứng. Phôi này sau đó trải qua ba
giai đoạn ấu trùng khác nhau cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng
thành. Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành chỉ mất 10 ngày kể từ khi thụ tinh.
Ruồi cái có thể tạo ra tới 1500 trứng trong suốt cuộc đời của nó do đó cung cấp một
lượng ruồi giấm mới liên tục cho các nghiên cứu di truyền. Thứ ba, ruồi giấm có kích
thước nhỏ nên tốn ít diện tích, nguyên vật liệu để nuôi dưỡng cũng như thí nghiệm. Thứ
tư, ruồi giấm có hệ gen đơn giản: Yếu tố di truyền cũng làm cho loài ruồi này trở thành
một sinh vật mẫu lý tưởng. D.melanogaster chỉ có bốn cặp nhiễm sắc thể so với 23 cặp
ở người. Sự đơn giản này là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những
sinh vật đầu tiên được sử dụng trong các nghiên cứu di truyền. Thứ năm, đặc điểm giải
phẫu: D.melanogaster có các đặc điểm giải phẫu (như cánh và mắt) cho phép dễ dàng
mô tả đặc điểm. Những dấu hiệu di truyền có thể dễ dàng xác định dưới kính hiển vi
(như mắt đỏ, cánh cong,…) . Các hành vi như ăn, giao phối và ngủ được quan sát thấy
ở người cũng được nhìn thấy ở Drosophila. Do đó, ảnh hưởng có thể có của di truyền
đến hành vi của con người cũng có thể được đánh giá thông qua ruồi giấm [38].
1.3.4. Hệ thống GAL4/UAS
Hệ thống GAL4-UAS là một phương pháp sinh hóa được sử dụng để nghiên cứu
biểu hiện và chức năng gen trong các sinh vật như ruồi giấm. Nó cũng đã được điều
chỉnh để nghiên cứu các chức năng liên kết hóa học trong nuôi cấy tế bào trong ống
nghiệm. Nó được phát triển bởi Hitoshi Kakidani [21] và Mark Ptashne,và Nicholas
Webster và Pierre Chambon vào năm 1988 [53] , sau đó được Andrea Brand và Norbert
Perrimon điều chỉnh vào năm 1993 [10] và được coi là một kỹ thuật tốt để nghiên cứu
sự biểu hiện của gen [13]. Hệ thống này có hai phần: gen GAL4 , mã hóa protein hoạt
hóa phiên mã GAL4 và UAS (Chuỗi kích hoạt ngược dòng ).
Đối với nghiên cứu ở Drosophila, gen GAL4 được đặt dưới sự kiểm soát của một
promoter hoặc gen điều khiển, trong khi UAS kiểm soát biểu hiện của gen mục tiêu.

GAL4 sau đó chỉ được biểu hiện trong các tế bào nơi gen điều khiển của nó được kích
hoạt [21], [10], [13] . Bên cạnh đó, GAL4 chỉ kích hoạt phiên mã gen khi có UAS. GAL4

16