Xác định hàm lượng lutein và zeaxanthin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ MINH HỒNG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LUTEIN VÀ
ZEAXANTHIN TRONG THỰC PHẨM
BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ MINH HỒNG
1401257

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LUTEIN VÀ
ZEAXANTHIN TRONG THỰC PHẨM
BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. ThS. Nguyễn Thị Hồng Ngọc
Nơi thực hiện
1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
2. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ
sinh Thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian nghiên cứu thực hiện đề tài, lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính
trọng và biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà và Th.S. Nguyễn Thị Hồng Ngọc – những
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, quan tâm chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện
thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến của các anh chị nghiên cứu viên, kĩ
thuật viên tại Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, các thầy cô
giáo tại Bộ môn Hóa Phân tích- Độc chất – những người đã tận tình giúp đỡ tạo điều
kiện cho em nghiên cứu và hoàn thành đề tài này.
Em cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Bộ môn Hóa phân tích- Độc chất
Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia
Đã tạo điều kiện hỗ trợ cho em hoàn thành nghiên cứu.
Và cuối cùng em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình và bạn bè
những người đã luôn động viên, đồng hành em trong trong suốt quá trình hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Lê Minh Hồng


Mục lục
Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1

Chương 1. Tổng quan ..................................................................................................... 2
1.1. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe..................................................................................2
1.1.1. Khái niệm........................................................................................................2
1.1.2. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe về mắt ...............................................................2
1.2. Carotenoid .............................................................................................................2
1.2.1. Khái niệm........................................................................................................2
1.2.2. Phân loại .........................................................................................................2
1.2.3. Tác dụng sinh học chung ................................................................................3
1.3. Lutein và zeaxanthin .............................................................................................3
1.3.1. Công thức cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học ...............................................3
1.3.2. Nguồn gốc trong tự nhiên của lutein và zeaxanthin .......................................4
1.3.2.1. Thực phẩm ..............................................................................................4
1.3.2.2. Nguồn nguyên liệu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe ......................4
1.3.3. Công dụng .......................................................................................................5
1.3.3.1. Lutein và zeaxanthin đối với bệnh thoái hóa điểm vàng do lão hóa ......5
1.3.3.2. Các tác dụng khác trên sức khỏe người (kết quả từ các nghiên cứu in
vitro, thuần tập, dịch tễ và thử nghiệm lâm sàng) ...............................................6
1.3.3.3. Công dụng trong ngành công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm .......7
1.4. Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin .......................7
1.4.1. Các phương pháp chung .................................................................................7
1.4.2. Các phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA.....11
1.4.2.1. Điều kiện phân tích mẫu .......................................................................11
1.4.2.2. Điều kiện xử lý mẫu .............................................................................11
Chương 2. Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu ..................... 17
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ......................................................................................17


2.1.1. Nguyên vật liệu, hóa chất .............................................................................17
2.1.2. Chất chuẩn ....................................................................................................17
2.1.2.1. Chất chuẩn ............................................................................................17

2.1.2.2. Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn...............................................17
2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ ..................................................................................18
2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................19
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................19
2.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp...........................................................19
2.2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích ................................................................19
2.2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ...............................................................19
2.2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích .......................................................20
2.2.3. Áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực tế ...................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................20
2.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp...........................................................20
2.3.1.1. Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích ...........................................20
2.3.1.2. Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu .........................................20
2.3.1.3. Phương pháp xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích .....21
2.3.2. Áp dụng phân tích một số mẫu thực tế .........................................................22
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................22
Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận.............................................................. 23
3.1. Khảo sát điều kiện phân tích ...............................................................................23
3.1.1. Lựa chọn cột phân tích..................................................................................23
3.1.2. Lựa chọn pha động .......................................................................................23
3.1.3. Lựa chọn bước sóng phát hiện ......................................................................24
3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ..............................................................................25
3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch kiềm ................................................................25


3.2.2. Khảo sát nhiệt độ xà phòng hóa ....................................................................26
3.2.3. Khảo sát thời gian xà phòng hóa ..................................................................26
3.2.4. Khảo sát khối lượng cân mẫu .......................................................................27
3.2.5. Khảo sát số lần chiết mẫu: ............................................................................28
3.2.6. Quy trình xử lý mẫu đã tối ưu hóa ................................................................30

3.3. Thẩm định phương pháp phân tích .....................................................................30
3.3.1. Độ đặc hiệu, chọn lọc ...................................................................................30
3.3.2. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ..................................................................31
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ...........................33
3.3.4. Độ lặp lại và độ tái lập nội bộ .......................................................................35
3.3.5. Độ thu hồi .....................................................................................................36
3.4. Áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực tế .........................................39
Kết luận và kiến nghị .................................................................................................... 41


Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
AMD

Thoái hóa điểm vàng do lão hóa

ACN

Acetolnitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

BHT

Butyl hydroxy toluen

DCM

Dichloro methan

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

JECFA

Ủy ban chuyên gia về Phụ gia thực phẩm

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

MPOD

Mật độ quang sắc tố

MS

Khối phổ

MtBE

Methyl tert-butyl ether

PDA

Detector mảng diod

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Độ lệch chuẩn

TPBVSK

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe

TEA

Triethylamin

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng


Danh mục các bảng
Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý, hóa học của lutein và zeaxanthin ...............................4

Bảng 1.2 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin sử dụng kĩ
thuật khác kĩ thuật HPLC detector PAD .........................................................................8
Bảng 1.3 Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA xác định hàm
lượng lutein và/hoặc zeaxanthin ....................................................................................12
Bảng 2.1 Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn gốc ..........17
Bảng 3.1 Pha động trong các nghiên cứu sử dụng cột phân tách C18 ..........................23
Bảng 3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn lutein ...........................................................31
Bảng 3.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn Zeaxanthin ..................................................32
Bảng 3.4 Kết quả LOD và LOQ – nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nang mềm ...33
Bảng 3.5 Kết quả LOD và LOQ – nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nang cứng ...34
Bảng 3.6 Kết quả độ lặp lại - nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang mềm ...35
Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại - nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang cứng ...35
Bảng 3.8 Kết quả độ thu hồi – thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang mềm ...............37
Bảng 3.9 Kết quả độ thu hồi – thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang cứng ...............38
Bảng 3.10 Kết quả áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực tế ......................39


Danh mục các hình vẽ, biểu đồ và đồ thị
Hình 1.1 Công thức cấu tạo dạng all-trans của lutein và zeaxanthin ..............................3
Hình 3.1 Sắc ký đồ với pha động hexan:ethyl acetat = 65:35 (v/v) ..............................23
Hình 3.2 Sắc ký đồ với pha động MeOH/dichloromethan/ACN/nước 67,5:22,5:9,5:0,5
.......................................................................................................................................24
Hình 3.3 Sắc ký đồ với pha động ethyl acetat/ACN (12:88) + 0,1% (v/v) n-decanol .24
Hình 3.4 Phổ của Lutein và Zeaxanthin – dung dịch chuẩn hỗn hợp ...........................25
Hình 3.5 Kết quả độ đặc hiệu, chọn lọc ........................................................................31
Biểu đồ 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KOH tới hàm lượng lutein và
zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe ...................................................25
Biểu đồ 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa tới hàm lượng
lutein và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe ....................................26
Biểu đồ 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian xà phòng hóa với hàm lượng

lutein và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe ....................................27
Biểu đồ 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của khối lượng cân mẫu đến hàm lượng lutein
và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe ..............................................28
Biểu đồ 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết trên nền
mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe ...................................................................................29
Đồ thị 3.1 Đường chuẩn lutein ......................................................................................32
Đồ thị 3.2 Đường chuẩn zeaxanthin ..............................................................................33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sử dụng TPBVSK mỗi ngày đã trở thành một thói quen của nhiều người dân
trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, nhằm mục đích cung cấp các dưỡng
chất lành mạnh cho cơ thể. Trong số đó, dưỡng chất có nguồn gốc từ thực vật
(phytonutrient) đang được nhắc đến càng ngày càng nhiều, mặc dù không phải là
dưỡng chất thiết yếu cho cơ thể như vitamin hay chất khoáng, nhưng chúng lại có vai
trò bảo vệ cơ thể chống lại bệnh tật. Khi ô nhiễm môi trường đang gia tăng và tình
hình dịch tễ bệnh diễn biến phức tạp, việc tiêu thụ các dưỡng chất thực vật đang được
khuyến cáo mạnh mẽ nhằm mục đích bảo vệ sức khỏe. Carotenoid là một nhóm dưỡng
chất thực vật có tác dụng bảo vệ mắt, bao gồm phân nhóm xanthophyll với hai đại diện
tiêu biểu là lutein và zeaxanthin đã được chứng minh có tác dụng chống lại và làm
chậm sự tiến triển của thoái hóa điểm vàng do lão hóa.
Lutein và zeaxanthin là hai thành phần chính cấu tạo nên điểm vàng của mắt,
thường luôn đi kèm với nhau trong tự nhiên. Cấu tạo hoàn chỉnh này giúp mắt nhìn rõ
được mọi vật. Khi đó mắt không phải điều tiết nhiều, tránh nhức mỏi mắt, giảm nguy
cơ mắc bệnh. Chúng còn được gọi là carotenoid võng mạc.
Mức lutein được khuyến cáo cần tiêu thụ là 6mg mỗi ngày để đạt được tác dụng
có hiệu quả. Tuy nhiên trên thực tế chúng ta mới chỉ nạp một lượng rất ít so với mức
khuyến cáo, cần bổ sung thêm. Do đó, các TPBVSK chứa lutein và zeaxanthin đã ra
đời và được sử dụng ngày càng phổ biến.
Từ đó, nảy sinh ra yêu cầu cần thiết phải quản lý chất lượng TPBVSK như trên,

đồng thời ở Việt Nam hiện nay chưa có phương pháp chính thống nào xác định đồng
thời hàm lượng lutein và zeaxanthin trong TPBVSK, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác
định hàm lượng lutein và zeaxanthin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao”.
Với các mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lutein và zeaxanthin
trên hai nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào chế viên nang mềm và
viên nang cứng.
2. Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng lutein và zeaxanthin trong một số
TPBVSK trên thị trường.
1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe
1.1.1. Khái niệm
Theo Thông tư số 43/2014/TT-BYT của Bộ Y tế quy định về quản lý thực
phẩm chức năng; chương I, điều 2:
Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Food Supplement, Dietary
Supplement) là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên hoàn, viên nén,
cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn hợp của các chất
sau đây:
a) Vitamin, khoáng chất, axit amin, axit béo, enzym, probiotic và chất có hoạt
tính sinh học khác;
b) Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn
gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa.
1.1.2. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe về mắt
Nguồn gốc
Đa phần các TPBVSK về mắt có thành phần là các dưỡng chất có nguồn gốc
thiên nhiên như dược liệu và chiết xuất từ động vật.

Phân loại
Phân loại theo dạng bào chế: viên nang cứng, viên nang mềm, viên nén,…
Phân loại theo thành phần hoạt chất chính: vitamin (vitamin A, C), nguyên tố vi
lượng (kẽm), acid béo thiết yếu (omega – 3), dưỡng chất thực vật (carotenoid bao gồm
lutein và zeaxanthin), …
Cách sử dụng: cách dùng phổ biến nhất là dùng đường uống.
1.2. Carotenoid
1.2.1. Khái niệm
Carotenoid là những sắc tố màu vàng, da cam hoặc đỏ, phân bố rộng rãi trong
động thực vật. Hầu hết carotenoid thiên nhiên là tetraterpenoid gồm có 8 monoisopren.
1.2.2. Phân loại
Dựa theo công thức cấu tạo, carotenoid có thể chia thành hai nhóm:
+ Hydrocacbon tan trong dung môi kém phân cực: caroten, lycopen,…

2


+ Xanthophyll: dẫn chất oxy hóa của carotenoid (alcol, aldehyd, ceton, epoxid
và acid). Đại diện tiêu biểu là lutein và zeaxanthin, các dẫn chất epoxid của carotenoid.
1.2.3. Tác dụng sinh học chung
Cấu trúc của các carotenoid có chứa nhiều nối đôi liên hợp, nên các hợp chất
này dễ bị oxy hóa. Do đó, các carotenoid đều có tác dụng chống oxy hóa, từ đó quy
định nên nhiều tác dụng khác đối với sức khỏe như bảo vệ thị giác, phòng chống các
bệnh tim mạch, bảo vệ da chống lão hóa, cải thiện chức năng thần kinh,…
Vì vậy, hiện nay các carotenoid đang được nghiên cứu nhiều nhằm ứng dụng
trong sản xuất thuốc, TPBVSK, mỹ phẩm,…
1.3. Lutein và zeaxanthin
1.3.1. Công thức cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học
Lutein và zeaxanthin đều có công thức phân tử là C40H56O2, và công thức cấu
tạo chứa hai nhóm hydroxy, hai vòng và cấu trúc C40 isoprenoid như các carotenoid

khác. Điểm khác nhau duy nhất là ở vị trí của một liên kết đôi, dẫn đến lutein có một
vòng β và một vòng ε, còn zeaxanthin có hai vòng β. Lutein có 10 liên kết đôi liên
hợp, zeaxanthin có 11 liên kết đôi liên hợp. Do đó, lutein có màu vàng nhạt còn
zeaxanthin có màu vàng đậm hơn.
Vì công thức cấu tạo dễ bị oxi hóa nên lutein và zeaxanthin dễ bị phân hủy
thậm chí bởi các tác nhân yếu như ánh sáng, nhiệt độ,… Điều này quy định nên tác
dụng chống oxi hóa cho cơ thể của hai chất này. Tuy nhiên trong quá trình xử lý mẫu
và phân tích cần chú ý tránh các tác nhân gây phân hủy như ánh sáng, nhiệt độ cao.
Mặc dù cả lutein và zeaxanthin đều có chuỗi liên kết đôi liên hợp có thể tồn tại
ở dạng cis hoặc dạng trans, nhưng trong tự nhiên chúng thường tồn tại ở dạng all-trans.
Công thức cấu tạo dạng all-trans được trình bày trong hình 1.1.

Hình 1.1 Công thức cấu tạo dạng all-trans của lutein và zeaxanthin
3


Một số tính chất vật lý, hóa học của lutein và zeaxanthin được trình bày trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý, hóa học của lutein và zeaxanthin
Đặc điểm

Lutein

Zeaxanthin

Phân tử lượng

568,88 g/mol

568,88 g/mol

Danh pháp

3R,3'R,6’R-β,ε-caroten-3,3'-diol

3R,3'R-β,β-caroten-3,3'-diol

Cảm quan

Bột màu vàng cam, mùi đặc trưng Bột màu vàng cam sẫm, ít
hoặc không mùi

Độ tan
tonc

Không tan trong nước

Không tan trong nước

Tan trong hexan

Tan ít trong cloroform

190oC

207oC

1.3.2. Nguồn gốc trong tự nhiên của lutein và zeaxanthin
1.3.2.1. Thực phẩm
Lutein và zeaxanthin thường luôn đi cùng nhau trong thức ăn và trong mô của
cơ thể người, trong đó, lutein thường có hàm lượng cao hơn [25]. Lutein và zeaxanthin

trong thực phẩm tồn tại ở cả dạng tự do hoặc dạng ester kết hợp với các acid béo.
Lutein trong thực phẩm
Một số loại thức ăn chứa lutein: lòng đỏ trứng (143 +/- 28μg trên một lòng đỏ
[24]; 292 +/- 117μg [14], 197,14 +/- 131,4μg hoặc 598,92 +/- 131,7μg tùy mẻ trứng
[52]); rau bina (18mg/100g sau khi nấu), ngô (267μg/100g sau khi nấu) [13]
Lutein dường như có hàm lượng cao nhất trong rau bina và cũng có hàm lượng
cao trong trứng (loại thức ăn giúp hấp thụ lutein tốt nhất).
Zeaxanthin trong thực phẩm
Các loại thức ăn đã được chứng minh có chứa zeaxanthin bao gồm: trứng (xấp
xỉ 85 μg mỗi lòng đỏ), quả đào [23], quả hồng [55].
Rau xanh đậm chứa nhiều zeaxanthin hơn trứng nhưng zeaxanthin trong trứng
lại rất dễ hấp thụ, do đó trứng là nguồn thực tế để hấp thu zeaxanthin và lutein [41].
1.3.2.2. Nguồn nguyên liệu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe
Trong công nghiệp sản xuất TPBVSK, nguồn nguyên liệu tự nhiên phổ biến để
chiết xuất lutein và zeaxanthin là hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.). Cúc vạn thọ là
nguồn giàu lutein ester nhất và cũng có thể xem là nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả
năng chiết xuất lutein ester cao nhất.
4


1.3.3. Công dụng
1.3.3.1. Lutein và zeaxanthin đối với bệnh thoái hóa điểm vàng do lão hóa
Thoái hóa điểm vàng do lão hóa (age mascular degenerated – AMD)
AMD là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở người lớn tuổi.
AMD gồm hai giai đoạn là AMD sớm, thường không có triệu chứng, và AMD muộn,
có thể dẫn đến mất thị lực trung tâm và có khả năng gây mù lòa.
Sự có mặt duy nhất của lutein và zeaxanthin ở trung tâm điểm vàng thể hiện vai
trò quan trọng của chúng đối với thị giác [15]. Giả thuyết cơ chế bảo vệ mắt chống lại
AMD của lutein và zeaxanthin là do các tính chất chống oxy hóa và lọc ánh sáng xanh
bước sóng ngắn của chúng [5].

Lutein và zeaxanthin đối với AMD (các nghiên cứu dịch tễ và can thiệp)
Đã có một lượng lớn nghiên cứu thuần tập và đối chứng ca lâm sàng đánh giá
mối liên quan giữa chế độ ăn chứa lutein và zeaxanthin với nguy cơ AMD [31], [44],
[43].
Tác dụng bảo vệ chống lại AMD muộn: năm 2012, một tổng quan hệ thống và
sáu phân tích thuần tập theo chiều dọc đưa ra bằng chứng cho thấy tác dụng bảo vệ
tiềm năng của lutein và zeaxanthin đối với bệnh nhân mắc AMD muộn và những
người có yếu tố nguy cơ di truyền cao AMD [28].
Chống lại sự tiến triển của AMD: có bằng chứng cho thấy lutein và zeaxanthin
có thể bảo vệ chống lại sự tiến triển của AMD từ nghiên cứu AREDS2. Kết quả phân
tích cho thấy lutein và zeaxanthin đứng đầu trong các chất được nghiên cứu về việc
làm chậm tiến triển thành AMD giai đoạn nặng, mặc dù điều này chỉ đúng ở những
người có chế độ ăn chứa ít lutein và zeaxanthin [7].
Nguy cơ di truyền: có bằng chứng cho thấy khi tiêu thụ nhiều lutein và
zeaxanthin có thể bảo vệ chống lại AMD ở người có nguy cơ di truyền cao dựa trên
hai gen AMD chính [51].
Thị lực: năm 2015, phân tích meta các thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng cho
thấy việc bổ sung lutein và zeaxanthin có liên quan đến những cải thiện có ý nghĩa trên
thị lực và độ nhạy cảm với tương phản, phụ thuộc liều dùng [27]. Hơn nữa, một mối
quan hệ tuyến tính đã được chỉ ra giữa sự cải thiện trên và sự gia tăng mật độ quang
sắc tố hoàng điểm (MPOD) [27].
5


Mật độ quang sắc tố hoàng điểm (MPOD) và AMD: Nồng độ mật độ quang sắc
tố hoàng điểm, đặc biệt là ở võng mạc trung tâm, có thể ảnh hưởng đến AMD [33] .
Một lượng lớn các nghiên cứu cho thấy MPOD giảm theo tuổi và có sự thiếu hụt
MPOD ở bệnh nhân AMD so với người khỏe mạnh [23]. Một phân tích meta 20 thử
nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng vào năm 2016 cho thấy bổ sung lutein, zeaxanthin và
meso-zeaxanthin (chất chuyển hóa của lutein) cải thiện MPOD ở cả đối tượng khỏe

mạnh và bệnh nhân AMD phụ thuộc vào liều [29].
Hàm lượng lutein và zeaxanthin cần tiêu thụ ở người
Chưa có khuyến cáo chính thức về hàm lượng lutein và zeaxanthin cần tiêu thụ.
Tuy nhiên, dựa trên một nghiên cứu công bố vào năm 1994 [44], mức 6 mg lutein và
zeaxanthin mỗi ngày (khoảng ≥ 6 lòng đỏ trứng hoặc xấp xỉ 1,3 kg ngô) đã được đề
xuất là mục tiêu để giảm nguy cơ AMD cho cả nam và nữ.
Mặc dù dữ liệu nghiên cứu còn hạn chế, nhưng cho thấy lượng tiêu thụ lutein và
zeaxanthin thực tế thấp hơn đáng kể so với mục tiêu được đề nghị. Người Mỹ trưởng
thành tiêu thụ khoảng 1−2 mg lutein mỗi ngày [31]. Người lớn tuổi ở Blue Mountain,
Úc, tiêu thụ trung bình 0,9 mg mỗi ngày [30].
Nguồn thức ăn chính để hấp thu lutein và zeaxanthin là bông cải xanh, đậu xanh
và cam. Tuy nhiên, kết quả từ “Khảo sát Sức khỏe” ở Úc cho thấy chỉ có 7% người Úc
trưởng thành tiêu thụ các loại rau ≥ lượng được khuyến cáo [3].
Hiện nay chưa có dữ liệu về lượng lutein và zeaxanthin thực tế được người Việt
Nam tiêu thụ mỗi ngày nhưng có thể dự đoán là thấp hơn mục tiêu được đề nghị dựa
trên dữ liệu ở các nước phát triển và lượng rau xanh người Việt Nam tiêu thụ thấp. Do
đó các TPBVSK bổ sung lutein và zeaxanthin vào chế độ ăn là cần thiết và đang trở
nên càng ngày càng phổ biến ở Việt Nam.
1.3.3.2. Các tác dụng khác trên sức khỏe người (kết quả từ các nghiên cứu in vitro,
thuần tập, dịch tễ và thử nghiệm lâm sàng)
Chống oxy hóa: lutein và zeaxanthin đều có tác dụng chống oxy hóa, làm chậm
quá trình oxy hóa do tia UV, bảo vệ màng lipid tế bào chống lại các gốc tự do [47].
Bệnh tim mạch: tiêu thụ thực phẩm giàu lutein có tác dụng bảo vệ chống lại sự
tiến triển của bệnh xơ vữa động mạch sớm [11]. Nồng độ lutein và zeaxanthin trong
huyết thanh có liên quan đến việc giảm nguy cơ xơ vữa động mạch [53], nồng độ thấp
có liên quan đến việc tăng nguy cơ rung tâm nhĩ [22]. Bổ sung lutein làm giảm
6


biomarker của các bệnh tim mạch một cách có ý nghĩa thông qua peroxy hóa lipid và

đáp ứng viêm [51].
Hệ thần kinh trung ương: lutein là một carotenoid chính trong mô não và nó có
thể ảnh hưởng đến chức năng thần kinh ở người lớn tuổi. Nổng độ lutein cao có liên
quan đến khả năng nhận thức tốt hơn ở người lớn tuổi [20]. Mật độ quang sắc tố thấp
liên quan đến việc đạt kết quả kém trong bài kiểm tra tình trạng tâm thần và đánh giá
nhận thức Montreal [12].
Các tác dụng khác: trong điều kiện in vitro, lutein đã được chứng minh có tác
dụng ức chế sự phát triển của một số loại tế bào ung thư. Lutein cũng có các tác dụng
bảo vệ chống lại đái tháo đường và các biến chứng đi kèm [32], kháng khuẩn và chống
viêm, …
1.3.3.3. Công dụng trong ngành công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm
Xu hướng hiện nay trong công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm là ưu tiên
các chất màu có nguồn gốc tự nhiên hơn nguồn gốc tổng hợp do tính an toàn đối với
sức khỏe người dùng. Vì vậy, lutein và zeaxanthin (chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ) càng
ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để tạo màu vàng cam
cho dẩu ăn, các loại sốt, bánh, kẹo, thức ăn cho trẻ em,…
1.4. Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin
1.4.1. Các phương pháp chung
Đã có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để xác định hàm lượng
lutein và/hoặc zeaxanthin trong dược liệu và các sản phẩm sữa công thức, sản phẩm
dinh dưỡng.
Các phương pháp này sử dụng các kĩ thuật khác nhau bao gồm: quang phổ
huỳnh quang [4]; quang phổ UV – VIS [26]; UPLC [10], [21], [37], [42]; HPLC
detector PDA [1], [2], [17], [18], [34], [38], [48], detector UV đa bước sóng [54], MS
[9], [49]; kết hợp HPLC và quang phổ UV-VIS [19],… Trong đó, kĩ thuật HPLC
detector PDA được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu do các ưu điểm như trang
thiết bị phổ biến tại các phòng thí nghiệm, độ chính xác cao, độ nhạy cao,… Kĩ thuật
này sẽ được trình bày ở phần 1.4.2. Một số ví dụ về các phương pháp khác dùng để
xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin được tóm tắt trong bảng 1.2.

7


Bảng 1.2 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin sử dụng kĩ thuật khác kĩ thuật HPLC detector PAD
Stt Tác giả

Đối tượng

Nền mẫu

Kĩ thuật

Ưu điểm

Nhược điểm

1

Kupper và

Chlorophyll và

Lá của thực

Quang phổ

Đơn giản và tiết kiệm thời

- Độ chính xác không cao

các cộng sự

carotenoid

vật bậc cao,

UV-VIS

gian, chi phí

khi xác định các chất có hệ

[26]

Euglena, tảo

số hấp thụ thấp (trong

nâu và các

vùng phổ phân tích) hoặc

loại vi khuẩn

hàm lượng thấp.

lam khác

- Không thể phân biệt các

nhau

chất sắc tố màu có phổ hấp
thụ UV-VIS (gần như)
giống nhau.

2

3

Pham Van

Carotenoid (tổng lượng

Hung, David

sắc tố, β-carotene, lutein)

Bột mì cứng

UPLC

Có độ nhạy cao. Nhanh

Thiết bị không phổ biển,

chóng (rửa giải hoàn toàn

đắt tiền

W.Hatcher

các carotenoid trong vòng

[37]

6 phút)

Karlina và
các cộng sự

Lutein

Huyết thanh

UPLC

chuột

[21]

8

Phương pháp đơn giản,

Thiết bị không phổ biển,

chọn lọc, độ nhạy cao

đắt tiền

4

Dugo và các

ζ-carotene, phytofluene,

cộng sự [10]

Dầu cam đỏ

LC × LC-

Có khả năng phân tích hỗn

Thiết bị không phổ biển,

lutein và các lutein ester,

PDA/APCI-

hợp carotenoid rất phức

đắt tiền

các β-cryptoxanthin

MS

tạp (40 carotenoid khác

ester, antheraxanthin

nhau)

ester, luteoxanthin ester,
auroxanthin ester,
violaxanthin ester.
5

Helen

Carotenoid (lutein,

Gạo (Oryza

Quang phổ

- Khả năng phân tích

Belefant-

zeaxanthin và β-

sativa L.)

huỳnh quang

tương đương HPLC, đặc

Miller &

carotene)

Cần một số lượng lớn mẫu

biệt là ở nồng độ thấp của

Stephen

carotenoid.

C.Grace [4]

- Ít gây phân hủy lutein và
zeaxanthin

6

S. Rivera, F.

Antheraxanthin,

Nguyên liệu

Vilaro, R.

violaxanthin, neoxanthin, sản xuất

Canela [42]

astaxanthin, zeaxanthin,

UHPLC-

Độ nhạy và độ chọn lọc

Thiết bị không phổ biển,

MS/MS

cao

đắt tiền

lutein, β-apo-8′carotenal, lycopene, βcarotene, phytoene
9


7

Yuhas và các

Lutein

cộng sự [54]

Sữa công

HPLC với

- Giảm hao hụt

thức trẻ em

detector UV

xanthophyll do chiết hexan

đa bước sóng

trước khi xà phòng hóa

Chỉ phân tích lutein

- Thêm THF + hexane tăng
hiệu suất chiết
8

JECFA [19]

Trans-zeaxanthin, cis-

Bột tinh thể

Kết hợp UV-

Phương pháp đơn giản,

Nền mẫu là bột tinh thể

isomer zeaxanthin, apo-

zeaxanthin

VIS & HPLC

phân tích được nhiều chất

tinh khiết

zeasxanthinal,

tinh khiết

Phân tách tốt, độ chọn lọc

Thiết bị đắt tiền

Độ chọn lọc không cao

parasiloxanthin,
diatoxanthin
9

Crupi và các

Zeaxanthin; 9Z,9'Z-

Nho

HPLC với

cộng sự [9]

lutein; cis-isomer β-

Negroamaro

detector ESI-

carotene; 5,6-

MS, 100 ~

epoxyxanthophyll; 5,8-

1200 m/z

epoxy xanthophyll
diasteroisomer
10

Tsai và các

Lutein, β-cryptoxanthin,

Lá cây

HPLC với

Phân tách được hỗn hợp

cộng sự [49]

β α-caroten

gynostemma

detector

phức tạp nhiều cis, trans-

pentaphyllum

ESI/APCIMS

lutein khác nhau

10


1.4.2. Các phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA
1.4.2.1. Điều kiện phân tích mẫu
Về pha tĩnh, cột C18 và C30 thường được lựa chọn. Trong đó, cột C18 có ưu
điểm về giá thành và về tính phổ biến tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam, đồng thời
cũng có thời gian cho một lần chạy ngắn hơn nhiều so với cột C30.
Về pha động, các hệ dung môi có thành phần chính là ACN và/hoặc methanol
được sử dụng chủ yếu [40]. ACN được chọn do có độ nhớt thấp, độ hấp thụ UV thấp,

áp suất cột thấp và đa phần cho hình dạng pic tốt [40]. Một tỷ lệ nhỏ dung môi ít phân
cực hơn thường được cho thêm vào để đạt thời gian lưu mong muốn, tăng độ hòa tan
của chất phân tích và cải thiện độ phân giải. Các dung môi được sử dụng thường
xuyên nhất là dichloromethan, THF, MtBE, ethyl acetat, hexan, aceton, các dung môi
clo (ví dụ: chloroform) và nước cất hai lần [40].
1.4.2.2. Điều kiện xử lý mẫu
Lutein và zeaxanthin trong tự nhiên ngoài dạng tự do còn tồn tại ở cả dạng các
lutein ester và zeaxanthin ester, do đó trước khi phân tích cần có quá trình xà phòng
hóa để chuyển toàn bộ dạng ester về dạng tự do. Một số nghiên cứu không thực hiện
quá trình này, vì trong dược liệu nghiên cứu không tồn tại dạng ester (hàm lượng thấp,
không có ý nghĩa) [1] hoặc xác định đồng thời cùng các chất bị loại bỏ bởi quá trình xà
phòng hóa (ví dụ như chlorophyll) [49].
Các tác nhân xà phòng hóa đã được sử dụng trong các nghiên cứu bao gồm
dung dịch kiềm [2], [34], [38] và enzym lipase [6], [56]. Dung dịch kiềm thường được
ưu tiên do có ưu điểm về độ phổ biến và giá thành, ngoài ra hiệu quả xà phòng hóa của
enzym lipase cũng cần được nghiên cứu thêm [6], [56].
Hexan là thành phần phổ biến của dung môi chiết [2], [34], [38]. THF có thể
được thêm vào vì có khả năng hòa tan lutein và zeaxanthin cao, độ tan của lutein trong
THF là 8000mg/L, gấp 400 lần so với trong hexan là 20 mg/L [8]. Tuy nhiên, THF có
khả năng làm peroxid hóa lutein nên các chất chống oxy hóa (ví dụ như BHT [8], acid
ascorbic [45]) được thêm vào để ngăn chặn điều này. Trong môi trường kiềm, tránh
ánh sáng, ở nhiệt độ từ –30oC đến 50oC, acid ascorbic được chứng minh có vai trò
chống oxi hóa, làm giảm phân hủy lutein từ 0,04% – 2,5%/ngày [45].
Một số ví dụ các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA được trình bày trong bảng 1.3.
11


Bảng 1.3 Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin
Nền mẫu

Xử lý mẫu

Phương pháp phân tích

Ưu nhược điểm

Pratheesh Trans cis-

Dịch

- Xà phòng hóa

- Cột: C18

- Ưu: trung hòa bằng acid

và các

lutein, trans

chiết cúc

bằng KOH 40%

- Pha động: hexan/ethyl acetat 65:35

yếu như acetic đến pH 8

cộng sự

zeaxanhin,

vạn thọ

ở 56oC trong

- Tốc độ dòng: 1ml/phút

sau khi xà phòng hóa →

[38]

cryptoxanthin

vòng 20 phút.

- Thể tích tiêm mẫu: 20 μL

tăng độ ổn định.

- Chiết bằng

- Bước sóng phát hiện: 447nm

- Nhược: dung môi chiết có

Stt Tác giả
1

Đối tượng

chứa toluen độc hại.

hexan.
2

3

- Cột: 4,6mm x 250mm C30

- Ưu: phân tách tốt lutein và

zeaxanthin, β- chiết xuất bằng dung dịch

- Pha động:

zeaxanthin, thời gian 1 lần

cryptoxanthin

KOH 85%,

+ A: MeOH/MtBE/nước 81:15:4

chạy ngắn (<25 phút)

85oC, 10 phút.

+ B: MeOH/MtBE 9:91

- Nhược: quy trình xử lý

- Chiết bằng

+ Gradient: 100%A → 50% A trong 45

mẫu không chiết được toàn

hexan.

phút → 100% B trong 15 phút

bộ xanthophyll với một số

- Tốc độ dòng: 1,0mL/phút

mẫu ngô.

Moros và

Lutein,

các cộng
sự [34]

Dịch

từ ngô

- Xà phòng hóa

AOAC

Cis, trans-

Sản phẩm -Xà phòng hóa

- Cột: C30 4,6mm x 250mm

- Ưu: phân tách tốt, độ nhạy

[2]

lutein;

dinh

- Pha động:

và độ chọn lọc cao

cis, trans-β-

dưỡng trẻ 60oC, 15 phút.

+ A: MeOH/MtBE 85:15

- Nhược: các ưu điểm trên

carotene;

em, trẻ sơ -Chiết bằng hỗn

+ B: MtBE

chỉ đúng với nền mẫu sản

bằng KOH 45%,

12


4

cis, trans-

sinh và

hợp hexan/

+ Gradient: 0-10 phút 100% A; 10,1-18

phẩm dinh dưỡng trẻ em,

lycopene;

người

MtBE 75:25

phút 65% A; 18,1-27 phút 25% A; 27,1-

trẻ sơ sinh và người trưởng

trưởng

30 phút 100% A

thành.

thành

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

JECFA

Lutein,

Tinh thể

- Cột: C30 4,6mm x 250mm

- Nhược: nền mẫu là tinh

[18]

zeaxanthin

tinh khiết

- Pha động: hexan/ethyl acetat 70:30

thể tinh khiết, ít tạp

- Tốc độ dòng: 1,5mL/phút
5

6

Al-Duais

Lutein;

Lá

Không có quá

- Cột: C30 (250 × 4.6 mm, 5 µm) và tiền

- Ưu: độ nhạy cao

và các

zeaxanthin;

Cyphoste

trình xà phòng

cột tương ứng

- Nhược: thời gian một lần

cộng sự

canthaxanthin mma

hóa

- Pha động: MtBE/MeOH; gradient.

chạy dài (70 phút), độ chọn

[1]

; β-

- Nhiệt độ cột: 17 ± 1oC

lọc với lutein và zeaxanthin

cryptoxanthin

- Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút

không cao mặc dù sử dụng

; β-carotene.

- Bước sóng phát hiện: 470 nm

cột C30.

digitatum

Tlili và

β-carotene,

Lá, nụ,

Không có quá

- Cột: C18 (250 mm x 4.6 mm)

-Nhược: không phân tích

các cộng

lutein,

hoa

trình xà phòng

- Pha động:

đồng thời lutein và

sự [48]

neoxanthin,

Capparis

hóa

+A: acetonitril/nước 90:10

zeaxanthin

violaxanthin,

spinosa

tocopherols

+ B: ethyl acetat.
+ Gradient: 0 phút 100% A → 35 phút
100% B → 40 phút 100% A
13


- Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Bước sóng phát hiện: 440 nm.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 μL
7

Không có quá

- Cột C30 (250 mm × 4.6 mm, 5 µm)

- Ưu: hiệu suất chiết cao do

ester, α β-

trình xà phòng

- Pha động:

chiết bằng kĩ thuật CO2 siêu

carotene,

hóa

+ A: MeOH/MtBE/nước 81:15:4

tới hạn

+ B: MeOH/MtBE/nước 4:92:4

- Nhược: thời gian cho một

+ Gradient: 0-60 phút B tăng từ 0-80%;

lần chạy dài (80 phút),

Shi và

Lutein, lutein

các cộng
sự [46]

Bí đỏ

lycopene

60-65 phút B tăng 100%; 65-70 phút giảm không phân tích đồng thời
0% B; 70-80ph 0% B

lutein và zeaxanthin.

- Tốc độ dòng: 0,42 mL/phút

Phương pháp phức tạp, thiết

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

bị đắt tiền.

- Bước sóng phát hiện: 450 nm
8

Hsu và

Lutein,

Dịch

-Cột: C30 (250 × 4.6 mm, 5 µm)

- Ưu: phân tách tốt (Rs >

các cộng

zeaxanthin

chiết

-Pha động: MeOH/MtBE 86:14

1), hiệu suất chiết cao, thời

CO2 siêu

-Tốc độ dòng: 1 mL/phút;

gian cho một lần chạy ngắn

tới hạn

-Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

(20 phút)

daylily

-Bước sóng phát hiện: 450 nm

- Nhược: phương pháp

sự [16]

phức tạp, thiết bị đắt tiền
14


9

Dịch

Loại bỏ diệp lục

-Cột: Zorbax ODS 150 mm x 4.6 mm

- Ưu: phương pháp đơn

chiết từ

thông qua quá

hoặc tương đương.

giản, các thiết bị phổ biến,

cỏ linh

trình xà phòng

-Pha động: ethyl acetat/ACN 12:88 +

dễ thực hiện.

lăng

hóa và tinh chế

0.1% (v/v) n-decanol

bằng cách chiết

-Thể tích tiêm mẫu: 10 µL

bằng dung môi

-Bước sóng phát hiện: 450 nm

Dịch

- Ly tâm 2ml

-Cột C18 250 x 4.6 mm (5μm)

- Ưu: trình bày được các

các cộng

chiết từ

dịch nuôi cấy,

-Pha động: MeOH/dichloro

yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn

sự [45]

tảo

loại bỏ tế bào.

methan/ACN/nước cất 67,5:22,5:9,5:0,5

định của lutein.

Chlorella

- Thêm 1mL hỗn -Tốc độ dòng: 1mL/phút

- Nhược: không có độ chọn

protothec

hợp chiết gồm

-Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

lọc cao với lutein. Không

oides

2,5% acid

-Bước sóng phát hiện: 450 nm

phân tích đồng thời lutein

JECFA

Lutein

[17]

10

Shi và

Lutein

ascorbic và

và zeaxanthin.

KOH 10M.
- Xà phòng hóa,
60°C, 10 phút,
làm nguội.

- Chiết với
19mL MeOH.
15


11

Zorn và

Lutein,

Hoa cúc

Xà phòng hóa

- Cột: C30 250mm ×4.6mm (5 μm)

- Nhược: Thời gian một lần

các cộng

zeaxanthin

vạn thọ

bằng lipase

- Pha động:

chạy dài (55 phút). Khoảng

+ A: MeOH/MtBE/nước 81:15:4

10% carotenoid bị phân hủy

+ B: MeOH/MtBE/nước 6:90:4

bởi phản ứng peroxyd hóa

+ Gradient: 99% A, 56% B sau 39 phút,

xúc tác bởi enzym.

sự [56]

100% B sau 45 phút, 100% A sau 50 phút, - Ưu: độ chọn lọc cao giữa
và giữ nguyên 100% A từ phút 50 đến 55.

lutein và zeaxanthin.

- Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Bước sóng phát hiện: 450 nm
12

Bunea [6] Lutein

Hoa cúc

Xà phòng hóa

- Cột: C18 Zorbax ODS (250 x 4.6 mm),

- Nhược: điều kiện xà

vạn thọ

bằng lipase

5 µm.

phòng hóa bằng enzym

- Pha động:

(nồng độ, thời gian) chưa

+ A: ACN/nước 9:1 + 0,25 % TEA

được tối ưu hóa, cần nghiên

+ B: ethyl acetat + 0,25% TEA

cứu thêm. Không phân tích

+ Gradient: 20 % B → 50% B sau 3 phút

đồng thời lutein và

→ 75 % sau 12 phút → giữ nguyên đến

zeaxanthin.

phút 60
- Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Bước sóng phát hiện: 450nm
16