Thiết lập phương pháp định lượng Ceftazidim trong huyết tương phục vụ theo dõi điều trị

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ LAN HƯƠNG

THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG CEFTAZIDIM TRONG
HUYẾT TƯƠNG PHỤC VỤ THEO DÕI
ĐIỀU TRỊ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ LAN HƯƠNG
Mã sinh viên: 1401308

THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG CEFTAZIDIM TRONG
HUYẾT TƯƠNG PHỤC VỤ THEO DÕI
ĐIỀU TRỊ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
1. TS. Lê Đình Chi
2. Th.S Nguyễn Thu Minh
Nơi thực hiện
Bộ môn Hóa phân tíchđộc chất

HÀ NỘI – 2019


HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới TS. Lê Đình Chi và ThS. Nguyễn
Thu Minh- người đã dành rất nhiều thời gian hướng dẫn, giúp đỡ, định hướng và luôn
cho tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Vũ Ngân Bình, Th.S Nguyễn Mai Hương cùng
toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất đã
luôn tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo trường Đại học
Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn sát cánh bên tôi,
động viên và khích lệ tôi giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2019
Sinh viên

Phạm Thị Lan Hương.


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về kháng sinh ceftazidim .................................................................. 3
1.1.1. Công thức hóa học ...................................................................................... 3

1.1.2. Tính chất lý hóa, độ ổn định ........................................................................ 3
1.1.3. Dược lý, dược động học............................................................................... 4
1.1.4. Dạng thuốc và hàm lượng............................................................................ 6
1.2. Ứng dụng ceftazidim trong giám sát điều trị ceftazidim ..................................... 6
1.2.1. Giám sát điều trị (TDM) .............................................................................. 6
1.2.2. Ứng dụng HPLC trong phân tích thuốc phục vụ cho giám sát điều trị
ceftazidim .............................................................................................................. 7
1.2.3. Một số phương pháp định lượng ceftazidim trong huyết tương bằng HPLC . 8
1.3. Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học. ......................... 18
1.3.1. Độ chọn lọc ............................................................................................... 18
1.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ........................................................... 18
1.3.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ............................................................. 19
1.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày ........................................ 19
1.3.5. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết) .................................................................... 20
1.3.6. Độ ổn định................................................................................................. 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 22
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị. .................................................................................. 22
2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn ............................................................................... 22
2.1.2. Các hóa chất dung môi .............................................................................. 22
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................ 22


2.1.4. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 22
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ............................................................. 23
2.2.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................ 23
2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích .............................................................. 24
2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................................ 26
2.2.4. Xác định nồng độ CFZ trong mẫu huyết tương thực của người đang sử dụng
ceftazidim vào mục đích điều trị hoặc nghiên cứu. .............................................. 28
2.3. Phương pháp xử lý kết quả .............................................................................. 28

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. ....................................... 29
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp phân tích ........................................................ 29
3.1.1. Khảo sát, xác định điều kiện sắc ký và lựa chọn chuẩn nội ........................ 29
3.1.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu ..................................................... 34
3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng CFZ trong huyết tương bằng
HPLC - UV ......................................................................................................... 35
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ...................................................... 35
3.2.1. Độ phù hợp hệ thống ................................................................................. 35
3.2.2. Độ chọn lọc ............................................................................................... 36
3.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ........................................................... 38
3.2.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ............................................................. 39
3.2.5. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày ........................................ 40
3.2.6. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết) .................................................................... 44
3.2.7. Độ ổn định................................................................................................. 47
3.3. Kết quả định lượng CEZ trong huyết tương của người bệnh đang sử dụng
ceftazidim ............................................................................................................... 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 53
I. KẾT LUẬN .......................................................................................................... 53
1. Về xây dựng phương pháp phân tích ............................................................... 53


2. Về thẩm định phương pháp phân tích .............................................................. 53
II. KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 54


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

MeCN

Acetonitril

CFZ

Ceftazidim

CFD

Cefadroxil

CFE

Cefepim

IMI

Imipenem

Mero
HQC

Meropenem

High quality control
Mẫu chuẩn nồng độ cao

IS

Internal standard
Chuẩn nội

LC – MS
PDA

Sắc ký lỏng khối phổ
Diode array detectors
Detector mảng diod

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới

LQC

Low quality control
Mẫu chuẩn nồng độ thấp

MQC

Medium quality control
Mẫu chuẩn nồng độ trung bình

Ppm

Parts per million
Một phần triệu

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

TB

Giá trị trung bình

CV

Hệ số biến thiên



DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Nồng độ thuốc trong huyết thanh sau khi tiêm ceftazidim ............................ 5
Bảng 1.2.Một số phương pháp định lượng CFZ trong huyết tương bằng HPLC ........... 8
Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu ....................................................... 22
Bảng 2.2. Cách chuẩn bị mẫu chuẩn trong huyết tương, mẫu huyết tương trắng ........ 23
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương .................................... 24
Bảng 3.0. Các chương trình gradien ........................................................................... 32
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống của phương pháp ............................ 35
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời gian lưu của CFZ và IS ......................... 37
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát đường chuẩn ................................................................... 38
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới .............................................. 39
Bảng 3.5. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày ................................. 40

Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày ................................. 40
Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày ................................. 41
Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày ................................. 42
Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác khác ngày .................................. 43
Bảng 3.10. Kết quả độ lặp lại của hiệu suất chiết CFZ và IS ...................................... 44
Bảng 3.11. Kết quả hiệu suất chiết của IS .................................................................. 45
Bảng 3.12. Kết quả hiệu suất chiết của CFZ............................................................... 46
Bảng 3.13. Độ ổn định của dung dịch IS làm việc thời gian ngắn............................... 47
Bảng 3.14. Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc CFZ thời gian ngắn ........................ 47
Bảng 3.15. Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng sau 6 giờ .................... 48
Bảng 3.16. Kết quả độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ đông – rã đông .................. 49
Bảng 3.17. Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý ...................................................... 50
Bảng 3.18. Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT ................................................ 50
Bảng 3.19. Kết quả định lượng ceftazidim trong huyết tương bệnh nhân tại khoa hô hấp
.................................................................................................................................. 51


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo ceftazidim ...................................................................... 3
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu huyết tương ....................................................... 25
Hình 3.1. sắc ký đồ với IS là Imipenem ...................................................................... 29
Hình 3.2. sắc ký đồ với IS là Meropenem ................................................................... 30
Hình 3.3. Sắc ký đồ với IS là Cefadroxil .................................................................... 30
Hình 3.4. Phổ UV của ceftazidim ............................................................................... 31
Hình 3.5. Phổ UV của cefadroxil ............................................................................... 31
Hình 3.6. Sắc ký đồ thu được khi chạy đẳng dòng với tỷ lệ 10% MeCN ..................... 32
Hình 3.7. Sắc ký đồ thu được với chương trình gradient 1 ......................................... 33
Hình 3.8. Sắc ký đồ thu được với chương trình gradient 2 ......................................... 33
Hình 3.9. Sắc ký đồ thu được với chương trình gradient 3 ......................................... 33
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng ............................................................. 36

Hình 3.11. Sắc ký đồ huyết tương trắng thêm CFZ ..................................................... 36
Hình 3.12. Sắc ký đồ huyết tương trắng thêm CFZ và IS ............................................ 37


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ceftazidim (CFZ) là kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba có nhiều ưu điểm
như phổ rộng, tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram âm, kháng nhiều β-lactamase [28] [4]
[5]. Ceftazidim được sử dụng rộng rãi trong các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do vi
khuẩn Gram âm như: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não do vi khuẩn, nhiễm khuẩn
đường tiết niệu phức tạp, nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới. [1] [21] [4].
Chế độ điều trị kháng sinh thích hợp là một trong các yếu tố quyết định kết quả
điều trị của những bệnh nhân nhiễm khuẩn nặng [2]. Dược động học của thuốc trên từng
cá thể bệnh nhân, đặc biệt là bệnh nhân nặng như bệnh nhân suy giảm chức năng gan,
thận có sự dao động lớn. Các rối loạn chức năng và yếu tố cá thể của người bệnh cũng
khiến nồng độ thuốc trong huyết tương trở nên khó dự đoán. Đối với kháng sinh phụ
thuộc thời gian như penicillin, cephalosporin và carbapenem, thời gian trên nồng độ ức
chế tối thiểu (T > MIC) có liên quan đến tác dụng diệt khuẩn và quyết định hiệu quả
điều trị của thuốc [26] [2] [11]. Vì vậy, việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu của bệnh
nhân sử dụng thuốc quan trọng trong quá trình điều trị nhằm hạn chế tác dụng không
mong muốn của thuốc và tăng hiệu quả điều trị.
Định lượng ceftazidim trong huyết tương phục vụ cho giám sát nồng độ thuốc
trong máu (TDM) giúp tối ưu hóa chế độ liều và hạn chế kháng thuốc. Nồng độ
ceftazidim trong máu thấp, nền mẫu có nhiều thành phần phức tạp có thể gây ảnh hưởng
đến quá trình phân tích thuốc. Để phục vụ cho giám sát nồng độ thuốc trong máu,
phương pháp định lượng kháng sinh trong huyết tương đòi hỏi phải có tính thực tiễn
cao, chuẩn bị mẫu đơn giản và nhanh chóng, thời gian phân tích mẫu ngắn, LLOQ thấp,
ULOQ (giới hạn trên của định lượng) đủ cao, được thẩm định để đảm bảo độ tin cậy và
phù hợp với điều kiện thực tế để có thể áp dụng thành công trên lâm sang.
Xuất phát từ những lý do trên, khóa luận: “Thiết lập phương pháp định lượng ceftazidim
trong huyết tương phục vụ theo dõi điều trị” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng ceftazidim trong huyết
tương người bằng HPLC theo các hướng dẫn thẩm định phương pháp
phân tích thuốc trong dịch sinh học của US - FDA.

1


2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định nồng độ ceftazidim trong
huyết tương của bệnh nhân đang được điều trị bằng ceftazidim

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về kháng sinh ceftazidim

1.1.1. Công thức hóa học
- Công thức cấu tạo: xem hình 1.1.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ceftazidim
-

Tên

khoa

học:

(6R,7R)-7-[[(Z)-2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-[(1-carboxy-

1methylethoxy)imino]acetyl]amino]-8-oxo-3-[(1-pyridinio)methyl]-5-thia1azabicyclo[4.2.0]-oct-2-ene-2-carboxylate pentahydrate [4].
- Công thức phân tử:
Ceftazidim khan: C22H22N6O7S2(KLPT: 546,30)[17].
Ceftazidim pentahydrat: C22H22N6O7S2.5H2O(KLPT: 636,6 )[4].
Khoảng 1,16 g ceftazidim pentahydrat tương đương với 1 g ceftazidim khan [17].
1.1.2. Tính chất lý hóa, độ ổn định
- Bột màu trắng hoặc trắng ngà.
- Chuyển sang màu nâu đậm và phân hủy ở 135 – 137ºC [17].
- Hơi tan trong nước và trong methanol, thực tế không hòa tan trong aceton và trong
alcol (độ tan 5 mg/mL nước và dưới 1 mg/mL alcol) [4] [17]. Tan trong dung dịch acid
và kiềm [4].
- Góc quay cực riêng: + 24,5º.
- Ceftazidim có: pKa1= 1,9; pKa2= 2,7; pKa3= 4,1 [17].
- Hệ số phân bố: log P (octanol) = -1,6 [8].
3


- Dung dịch muối Natri của ceftazidim có pH 5 - 8 và có màu vàng nhạt đến hổ phách
tùy thuộc vào dung môi, nồng độ thuốc và thời gian bảo quản.
- Phổ hấp thụ UV trong H2SO4 0,1 N có cực đại hấp thụ ở 260 nm, trong nước ở 258 nm
và trong methanol ở 257 nm.
- Thuốc tương đối ổn định ở trạng thái khô và có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng nhưng
cần được bảo vệ tránh ánh sáng. Ceftazidim kém bền vững trong dung dịch Natri
bicarbonat [1].
1.1.3. Dược lý, dược động học
1.1.3.1. Chỉ định
Ceftazidim được sử dụng trong những nhiễm khuẩn rất nặng đã điều trị bằng các

kháng sinh khác phổ biến hơn nhưng không đáp ứng để hạn chế hiện tượng kháng thuốc.
Ceftazidim sử dụng trong những trường hợp nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm
như: nhiễm khuẩn huyết; viêm màng não; nhiễm khuẩn đường tiết niệu có biến chứng;
nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới; nhiễm khuẩn trong bệnh nhày nhớt; nhiễm khuẩn
xương và khớp; nhiễm khuẩn phụ khoa; nhiễm khuẩn trong ổ bụng; nhiễm khuẩn da và
mô mềm bao gồm nhiễm khuẩn bỏng và vết thương. Những trường hợp nhiễm khuẩn
kể trên đã xác định hoặc nghi ngờ do Pseudomonas hoặc Staphylococcus như viêm màng
não do Pseudomonas, nhiễm khuẩn ở người bị giảm bạch cầu trung tính cần phải phối
hợp ceftazidim với kháng sinh khác [1].
1.1.3.2. Dược động học
1.1.3.2.1 Hấp thu
Ceftazidim không hấp thu qua đường tiêu hóa, do vậy thường dùng tiêm tĩnh
mạch hoặc tiêm bắp ở dạng muối Natri. Nồng độ thuốc trong huyết thanh đạt được sau
khi tiêm được thể hiện trong bảng 1.1 [1] [17].

4


Bảng 1.1. Nồng độ thuốc trong huyết thanh sau khi tiêm ceftazidim
Tiêm bắp (sau 1 – 1,5

Tiêm TM (sau 5

Tiêm truyền TM không liên

giờ)

phút)

tục (sau 20 – 30 phút)

Mg

Khoảng 15 mg/L

Khoảng 45 mg/L

Khoảng 40 mg/L

1g

Khoảng 35 mg/L

Khoảng 85 mg/L

Khoảng 70 mg/L

2g

Không có báo cáo

Khoảng 170 mg/L

Khoảng 170 mg/L

500

1.1.3.2.2. Phân bố
Chỉ khoảng 10 % thuốc gắn với protein huyết tương. Ceftazidim phân bố rộng
rãi trong các mô của cơ thể, thấm vào các mô ở sâu và cả dịch màng bụng. Thuốc đạt

nồng độ điều trị trong dịch não tủy khi màng não bị viêm. Ceftazidim có thể qua nhau
thai và bài tiết vào sữa mẹ. Ceftazidim hấp thu sau liều tiêm qua màng bụng cho người
bệnh điều trị thẩm tách màng bụng.
1.1.3.2.3. Chuyển hóa
Ceftazidim không bị chuyển hóa trong cơ thể và bài tiết ở dạng không biến đổi
chủ yếu qua lọc cầu thận.
1.1.3.2.4. Thải trừ
Khoảng 80 – 90 % liều dùng bài tiết qua nước tiểu sau 24 giờ. Sau khi tiêm tĩnh
mạch 1 liều duy nhất 500 mg hay 1 g, khoảng 50 % liều xuất hiện trong nước tiểu sau 2
giờ đầu, 2 - 4 giờ sau khi tiêm bài tiết thêm 20 % liều vào nước tiểu và sau 4 – 8 giờ tiếp
theo lại thêm 12 % liều bài tiết vào nước tiểu. Hệ số thanh thải ceftazidim trung bình
của thận là 100 mL/phút; thuốc bài tiết qua mật dưới 1 %. Thời gian bán thải của
ceftazidim trong huyết tương ở người bệnh có chức năng thận bình thường xấp xỉ 2,2
giờ; thời gian này kéo dài hơn và nồng độ thuốc cao hơn ở người bệnh suy thận hoặc trẻ
sơ sinh [1] [17].
1.1.3.3. Liều lượng và cách dùng

5


Ceftazidim dùng tiêm bắp sâu, tiêm tĩnh mạch chậm trong 3 – 5 phút, hoặc tiêm
truyền tĩnh mạch. Người lớn trung bình 1 g tiêm bắp sâu hoặc tiêm tĩnh mạch (tùy mức
độ nặng của bệnh) cách nhau 8 – 12 giờ một lần. Liều dùng tăng lên 2 g/8 giờ trong viêm
màng não do vi khuẩn Gram âm và các bệnh suy giảm miễn dịch. Trường hợp nhiễm
khuẩn đường tiết niệu sử dụng liều 500 mg/12 giờ. Người trên 70 tuổi, liều 24 giờ giảm
xuống còn 1/2 liều của người bình thường, tối đa 3 g/ngày. Trẻ em trên 2 tháng tuổi, liều
thường dùng 30 – 100 mg/kg/ngày chia làm 2 – 3 lần, (cách nhau 8 hoặc 12 giờ). Có thể
tăng liều tới 150 mg/kg/ngày (tối đa 6 g/ngày) chia 3 lần cho các bệnh rất nặng. Trẻ sơ
sinh và trẻ nhỏ dưới 2 tháng tuổi, liều thường dùng 25 – 60 mg/kg/ngày chia làm 2 lần,
cách nhau 12 giờ. Trường hợp viêm màng não ở trẻ nhỏ trên 8 ngày tuổi, thường dùng

liều 50 mg/kg, 12 giờ một lần. Người bệnh suy giảm chức năng thận (có liên quan đến
tuổi), liều dựa vào độ thanh thải creatinin, khi độ thanh thải creatinin dưới 50 mL/phút,
nên giảm liều do sự thải trừ thuốc chậm hơn. Với người bệnh nghi có suy thận, thường
sử dụng liều đầu 1 g, sau đó thay đổi liều tùy thuộc vào độ thanh thải creatinin [1].
1.1.4. Dạng thuốc và hàm lượng
- Lọ 250 mg, 500 mg, 1 g, 2 g, 6 g bột vô khuẩn để pha tiêm hoặc tiêm truyền. Các thành
phần khác có thể là natri carbonat nồng độ 118 mg/g ceftazidim để tăng độ tan, hoặc Larginin nồng độ 349 mg/g ceftazidim hoạt tính để khắc phục tạo bọt.
- Dịch truyền tĩnh mạch (đã được đông băng) có chứa tương ứng với 20 mg và 40 mg
ceftazidim khan trong 1 ml dung dịch 4,4% và 3,2% dextrose.
1.2. Ứng dụng ceftazidim trong giám sát điều trị ceftazidim
1.2.1. Giám sát điều trị (TDM)
1.2.1.1. Khái niệm
Giám sát điều trị là việc sử dụng nồng độ thuốc trong huyết tương kết hợp với
kiến thức về dược động học và dược lực học nhằm đánh giá tình trạng bệnh nhân, cá thể
hóa liều dùng và tối ưu hóa hiệu quả điều trị.
TDM là quá trình theo dõi nồng độ thuốc trong dịch sinh học để đảm bảo nồng độ này
nằm trong giới hạn điều trị.
1.2.1.2. Mục đích
6


- Đánh giá thêm thông tin có ích và các dữ kiện lâm sàng để đánh giá tình trạng bệnh
nhân
- Làm nền tảng để cá thể hóa liều dùng cho bệnh nhân
- Phát hiện sự thay đổi dược động học của thuốc trong quá trình điều trị
- Đảm bảo rằng nồng độ thuốc hoặc chất chuyển hóa không quá cao để có thể gây độc
tính.
- Hỗ trợ cho việc xác định các thông số dược động học, dược lực học cho các thuốc mới
hoặc trong trường hợp các thông số này có sự thay đổi nhanh chóng.
- TDM cần thiết đối với các thuốc có giới hạn điều trị hẹp và thuốc có dược động học

không tuyến tính.
1.2.2. Ứng dụng HPLC trong phân tích thuốc phục vụ cho giám sát điều trị
ceftazidim
Một số phương pháp đã được phát triển để xác định nồng độ ceftazidim trong
huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector PDA hoặc MS.
Những phương pháp này phù hợp cho giám sát điều trị và độc tính do có thời gian phân
tích nhanh, độ nhạy, độ chính xác và chọn lọc cao với ceftazidim, yêu cầu lượng mẫu
nhỏ; nhiều phương pháp đã được ứng dụng trong thực tiễn lâm sàng cho kết quả tốt.
Phương pháp HPLC sử dụng detector PDA cho phép phân tích thuốc một cách
đơn giản, không tốn kém, thiết bị phân tích tương đối phổ biến so với thiết bị sử dụng
detector MS. Detector mảng diod được sử dụng cho phép xác định độ tinh khiết của pic
và sự phù hợp của phổ hấp thụ. Detector UV bước sóng duy nhất có thể sử dụng nếu chỉ
có một chất phân tích được quan tâm [16]. Để phân tích đồng thời nhiều chất có thể sử
dụng detector PDA đo tại nhiều bước sóng [27]. Phương pháp phân tích đơn giản, có độ
nhạy, độ chính xác và chọn lọc cao phù hợp cho giám sát điều trị trong lâm sàng [10]
[14] [16] [27].
Detector MS có độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn do đó có thể định lượng được ở
nồng độ thấp hơn. Tuy nhiên thiết bị LC-MS kém phổ biến và đắt tiền hơn so với HPLC.
Các chất phân tích được định lượng dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất cần phân tích
7


tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của chất đó. Dựa trên nguyên tắc này, ta có các kỹ
thuật định lượng hay dùng trong phân tích dịch sinh học:
• Phương pháp ngoại chuẩn: Là phương pháp định lượng dựa trên cơ sở so sánh diện
tích (hoặc chiều cao) pic của một hoặc nhiều mẫu chuẩn đối chiếu và mẫu thử được phân
tích trong cùng điều kiện sắc ký. Chất chuẩn ngoại là chất có bản chất là chính chất phân
tích, độ tinh khiết cao và đạt yêu cầu của chất chuẩn theo quy định. Khi phân tích các
chất trong dịch sinh học, nồng độ của các chất dao động lớn do đó phương pháp hay
được sử dụng là phương pháp đường chuẩn. Tuy nhiên phương pháp ngoại chuẩn chỉ

được sử dụng khi hiệu suất xử lý mẫu có độ lặp lại cao.
• Phương pháp nội chuẩn: thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng như nhau của một
chất chuẩn thứ hai được gọi là chuẩn nội. Các chất được định lượng dựa trên so sánh tỷ
lệ diện tích giữa chất phân tích và chất chuẩn nội (Sx/SIS) với tỷ lệ diện tích pic chất
chuẩn ngoại và chất chuẩn nội (SES/SIS). Chất chuẩn nội thường có cấu trúc, tính chất
gần giống với chất cần phân tích và đảm bảo yêu cầu của một chất chuẩn. Việc thêm
chất chuẩn nội vào sẽ làm giảm sai số của quá trình xử lý mẫu trải qua nhiều bước, hiệu
suất không lặp lại. Các chất được định lượng theo đường chuẩn thiết lập dựa trên mối
liên hệ giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn ngoại có nồng độ khác nhau và chuẩn nội với nồng
độ của chất chuẩn ngoại
1.2.3. Một số phương pháp định lượng ceftazidim trong huyết tương bằng HPLC
Trong những năm vừa qua, đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm định
lượng nồng độ ceftazidim trong huyết tương. Dưới đây là các phương pháp xử lý mẫu
và điều kiện sắc ký đã được sử dụng trong các nghiên cứu:

8


Bảng 1.2.Một số phương pháp định lượng CFZ trong huyết tương bằng HPLC
Xử lý mẫu

Điều kiện sắc ký

LLOQ
(µg/mL)

Chiết pha rắn
(thể tích tiêm 80
μL).

-

Cột C18 (300 mm × 3,9

1

mm; 10 μm).

-

TLTK
(năm)
[12]
(1998)

Pha động: Đệm phosphat

pH 5,5 - MeCN (91:9).

-

Tốc độ dòng: 1 mL/phút.

- Detector: PDA 255 nm.

-

TR = 13,1 phút.

Tủa protein bằng

-

Cột µBondapakTM C18

MeCN, ly tâm.

(300 mm x 3,9 mm; 10 µm).

Thêm
dichloromethan
vào lớp trên, lắc,

-

Tốc độ dòng: 2 mL/phút.

nước phía trên

- Detector: PDA 257 nm.

Chiết pha rắn
(thể tích tiêm 40
μL).

(2005)

4 - MeCN (90:10).

-

tích tiêm 50 μL).

[13]

Pha động: Đệm acetat pH

ly tâm. Lấy pha
tiêm sắc ký (thể

3

-

TR: 5,25 phút.

-

Cột Symmetry® C8 (250

mm × 4,6 mm; 5 μm).

-

Pha động: Đệm phosphat

pH 7,4 - MeCN (gradient nồng
độ).

-

Tốc độ dòng: 1 mL/phút.

- Detector: PDA 256 nm.

-

IS: ceforanid.
9

2,5

[10]
(2008)


-

TR: 11,5 phút.

Tủa protein bằng

-

Cột Waters X-bridge C18

MeCN, lắc, ly

(30 mm × 4,6 mm; 2,5 μm).

tâm. Dịch sau ly
tâm chiết bằng
chloroform, lắc, ly
tâm. Lấy lớp nước

-

10 μL).

Tủa protein bằng

tâm pha loãng với

(2010)

Pha động: đệm phosphat

(92:8).
Tốc độ dòng: 1 mL/phút.

-

Detector: PDA 260 nm.

-

IS: cefotaxim.

-

TR: 1,7 phút.

- Cột Atlantis T3 (150 mm × 4,6

MeCN, lắc, ly tâm mm;
ở 4°C. Dịch sau ly

[16]

(50 mM, pH 2,4) - MeCN

phía trên tiêm sắc ký (thể tích tiêm

5

Pha động: Acid

nước rồi tiêm sắc

-

ký (thể tích tiêm

phosphoric (10 mM, pH 2) -

20 μL).

MeCN (gradient nồng độ).
Tốc độ dòng: 2 mL/phút.

- Detector: PDA 230 nm.

-

[26]
(2011)

5 μm).

-

2

TR = 4,2 phút.

10


Tủa protein bằng

-

MeCN, lắc, ly

C18 (100 mm × 2,1 mm; 1,7

tâm. Dịch sau ly

μm).

tâm chiết bằng
dichloromethan,
lắc, ly tâm. Lấy

-

Cột Acquity UPLC BEH

0,5

[5]
(2012)

Nhiệt độ khay: 4°C; điều

nhiệt cột: 50°C.

lớp nước phía trên -

Pha động: A (0,1 % acid

tiêm sắc ký (thể

formic trong nước) và B (0,1 %

tích tiêm 10 μL).

acid formic trong MeCN)
(gradient nồng độ).

-

Tốc độ dòng: 0,4

mL/phút. - Detector: MS.

-

IS: Đồng vị deuteri hóa.

- TR: 2,02 phút.
Chiết pha rắn (thể tích tiêm 1 μL).

Cột Acquity HSS T3 (50

mm × 2,1 mm; 1,7 μm).

-

Điều nhiệt cột: 40°C.

-

Pha động: A (1 mM đệm

CH3COOH/ CH3COONH4 với
5 % MeCN) và B (MeCN)
(gradient nồng độ).

-

Tốc độ dòng: 0,6

mL/phút. - Detector: MS.

-

IS: đồng vị ổn định.

-

Thời gian phân tích: 5

phút.

11

0,76

[9]
(2013)


Tủa protein bằng

-

MeOH, lắc, ly

mm × 4,6 mm; 5 μm).

tâm. Bay hơi dung
môi, hòa tan cắn
bằng dung dịch

-

Cột YMC ODS AQ (250

2

[27]
(2013)

Nhiệt độ khay: 4°C; điều

nhiệt cột: 35°C.

đệm phosphat

-

(0,05 M pH 2,5)

(0,05 M, pH 3,8) - MeCN

rồi

(gradient nồng độ).

tiêm sắc ký (thể

-

tích tiêm 40 μL).

mL/phút.

Pha động: Đệm phosphat

Tốc độ dòng: 1,2

- Detector: PDA 260 nm.

-

IS: cefoperazon.

-

TR: 8,68 phút.

Tủa protein bằng

-

Cột Acquity UPLC BEH

MeCN, lắc, ly

C18 (100 mm × 2,1 mm; 1,7

tâm. Dịch sau ly

μm).

tâm pha loãng

-

Nhiệt độ khay: 8°C; điều

với pha động rồi

nhiệt cột:

tiêm sắc ký (thể

30°C.

tích tiêm 5 μL).

-

Pha động: Dung dịch

acid formic trong nước 0,01 % MeOH (gradient nồng độ).

-

Tốc độ dòng: 0,3

mL/phút. - Detector: MS.

-

TR: 1,15 - 1,5 phút.

12

0,1

[7]
(2014)


Tủa protein bằng
MeCN chứa 0,1
% acid formic,
lắc, ly tâm ở 4°C.
Dịch sau ly tâm
pha loãng với
nước chứa 0,1 %
acid formic rồi

-

Cột kinetex® C18 (50

mm × 2,1 mm; 2,6 μm).

-

-

Pha động: Nước chứa 0,1

% acid formic - MeCN chứa 0,1
% acid formic (gradient nồng
độ).

tích tiêm 20 μL).

mL/phút. - Detector: MS.

Tốc độ dòng: 0,3

-

IS: fluconazol.

-

TR: 3,4 phút.

Tủa protein bằng

-

Cột Kinetex C18 (100

MeOH, ly tâm.

mm x 4,6 mm; 2,6 µm).

Dịch sau ly tâm

-

Điều nhiệt cột: 40°C.

-

Pha động: A (0,1 % acid

μL).

(2014)

nhiệt cột: 35°C.

-

(thể tích tiêm 10

[23]

Nhiệt độ khay: 4°C; điều

tiêm sắc ký (thể

lọc rồi tiêm sắc ký

0,1

formic trong nước) và B
(MeCN) (gradient nồng độ).

-

Tốc độ dòng: 0,7

mL/phút. - Detector: MS.

-

IS: prasozin.

-

TR: 2,7 phút.

13

1,5

[3]
(2015)

Tủa protein bằng

-

MeCN, lắc, ly

C18 (100 mm × 2,1 mm; 1,7

tâm. Dịch sau ly

Cột Acquity UPLC BEH

0,62

[6]
(2015)

µm)

tâm pha loãng với -

Nhiệt độ khay: 4°C; điều

nước, trộn đều rồi nhiệt cột: 50°C.
tiêm sắc ký (thể
tích tiêm 40 μL).

-

Pha động: A (Nước chứa

0,1 % acid formic và 2 mM
amoni acetat) và B (MeOH chứa
0,1 % acid formic và 2 mM
amoni acetat) (gradient nồng
độ).

-

Tốc độ dòng: 0,4

mL/phút. - Detector: MS.

-

IS: chuẩn nội deuteri hóa.

-

Thời gian phân tích: 2,5

phút.
Tủa protein bằng

-

MeCN, lắc, ly

(100 mm × 2,1 mm; 1,9 μm).

tâm. Bay hơi dung
môi ở

-

Cột Hypersil® Gold PFP

Nhiệt độ khay: 4°C, điều

nhiệt cột: 40°C.

40°C, hòa tan cắn
bằng dung

-

Pha động: acid

phospohoric (10 mM) - MeCN
dịch acid

(gradient nồng độ).

phosphoric 10
Tốc độ dòng: 0,5

mM rồi tiêm sắc

-

ký (thể tích tiêm

mL/phút. - Detector: PDA 260

10 μL).

nm.

14

2

[14]
(2016)