NGHIÊN cứu đột BIếN TRêN một số VùNG TRọNG ĐIểM CủA GEN G6PD ở BệNH NHâN THIếU hụt ENZYM G6PD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN THỊ MAI ANH

NGHI£N CøU §éT BIÕN TRªN MéT Sè
VïNG TRäNG §IÓM CñA GEN G6PD ë BÖNH
NH©N THIÕU HôT ENZYM G6PD
Chuyên ngành : Xét nghiệm Y học
Mã ngành

: 8720601

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trần Vân Khánh
2. TS. Nguyễn Hoàng Việt


HÀ NỘI - 2019MỤC LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ARMS

Hệ thống khuyếch đại các đột biến bền với nhiệt
(Amplification Refractory Mutation System)

ASP

PCR đặc hiệu alen (Alelle Specific)

ASA

Khuếch đại allele đặc hiệu (allele specific amplification)

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylen diamin tetraacetic acid

G6P

Glucose – 6 - phosphat

G6PD

Glucose - 6 - phosphatase dehydrogenase

GSH

Glutathione dạng khử

GSHPx

Glutathion peroxidase

GSSG

Glutathione dạng oxi hóa

HMR

Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy
(High Melting Resolution)

MPTP

PCR using Mutliplex Tandem forward Primer

NADP+

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (dạng oxy hóa)

NADPH

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (dạng khử)

PASA

Khuếch đại PCR của các alen đặc hiệu
(PCR amplification of specification of specific alleles)

PCR

phản ứng khuếch đại gen (Polymerase chain reaction)

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới


DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG


5

ĐẶT VẤN ĐỀ
Glucose - 6 - phosphatase dehydrogenase (G6PD) là enzyme then chốt mở đầu
cho chu trình pentose phosphate trong chuyển hóa glucose, oxi hóa Glucose-6phosphate

thành

6-phosphogluconolactone,

đồng

thời

chuyển

NADP+

(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) thành NADPH. Trong tế bào hồng
cầu, NADPH tham gia vào phản ứng chuyển glutathione từ dạng oxi hóa (GSSG)
thành dạng khử (GSH) - giúp bảo vệ các nhóm sulphydryl của hemoglobin và màng
tế bào hồng cầu khỏi các tác nhân oxi hóa. Hồng cầu của người bị thiếu G6PD sẽ bị
tán huyết nhanh chóng dưới tác dụng của các tác nhân oxy-hoá.
Thiếu G6PD là bệnh lý về men thường gặp nhất ở người, ảnh hưởng đến hơn
400 triệu người trên thế giới. Đa số các trường hợp thiếu hụt G6PD không có biểu
hiện lâm sàng cho đến khi phơi nhiễm với các yếu tố nguy cơ dẫn đến biểu hiện lâm
sàng như vàng da ở trẻ sơ sinh, thiếu máu huyết tán. Enzyme G6PD là sản phẩm mã
hóa của gen G6PD nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq28,
gen có độ dài khoảng 18,5 kb, gồm 13 exon và 12 intron. Đột biến trên gen G6PD
sẽ dẫn đến việc giảm hoặc ngừng quá trình tổng hợp enzyme, gây ra bệnh thiếu
enzyme G6PD.
Đến nay, hơn 180 đột biến đã được xác định trên thế giới, trong đó hầu hết là
đột biến thay thế một nucleotide, phân bố dọc trên 13 exon của gen và tập trung chủ
yếu ở các exon 6, 8, 10, 13. Đột biên với số lượng cao nhất tại exon 10 [16]. Tuy
nhiên, theo các nghiên cứu điều tra về sự phân bố đột biến, các dạng đột biến tìm
thấy là khác nhau ở những quốc gia, vùng lãnh thổ khác nhau. Điểm nóng đột biến
(hot spot) ở các nước châu Á được cho là ở exon 9,11,12 [15].
Tại Việt Nam, thiếu enzyme G6PD là một bệnh khá phổ biến, chiếm tỷ lệ dao
động khoảng 0,3-9% [15]. Tỷ lệ bệnh cũng có sự khác nhau khá lớn tùy theo từng
khu vực và các nhóm dân tộc. Điều trị bệnh tạm thời dừng lại ở điều trị triệu chứng vì
vậy phát hiện sớm nhằm tư vấn giúp nâng cao chất lượng sống cho người bệnh, phòng
tránh được các biến chứng có thể xảy ra do thiếu enzyme G6PD là việc làm quan trọng
và ý nghĩa. Từ năm 1960 đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về G6PD điều tra tỷ lệ mắc


6

bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của đối tượng thiếu hụt enzyme G6PD. Một số

nghiên cứu gần đây tiến hành tập trung vào xác định các dạng đột biến thường gặp tuy
nhiên nghiên cứu áp dụng kĩ thuật giải trình tự gen để xác định đột biến G6PD được
tiến hành trên đối tượng dân tộc Kinh thuộc khu vực miền Bắc chưa nhiều. Nhằm góp
phần vào cơ sở dữ liệu về nghiên cứu bệnh thiếu enzyme G6PD và các đột biến tại
vùng trọng điểm của gen, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu:
Xác định đột biến trên exon 9, 10, 11, 12 của gen G6PD ở bệnh nhân thiếu
hụt enzym G6PD bằng kỹ thuật giải trình tự gen.


7

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1.

Những hiểu biết về G6PD

I.1.1. Đặc điểm cấu trúc của G6PD
Men G6PD lần đầu tiên được hai tác giả Otto Warburg và Christan phát hiện
vào năm 1930 trên hồng cầu ngựa và sau đó trên một số hồng cầu của động vật, vi
sinh vật, men bia và hồng cầu người [1]. Năm 1966, Yoshida và cộng sự tách chiết
được G6PD từ hồng cầu người. Từ những thông tin về cấu trúc ban đầu, trọng
lượng phân tử và các thông số động học của G6PD mới dần được làm sáng tỏ.

Hình 1.1. Cấu trúc G6PD
G6PD là enzyme có cấu trúc bậc 4 phức tạp, cấu tạo bởi nhiều monomer.
G6PD có hai đặc tính là tính không đồng nhất và tính chuyển dạng phân tử. G6PD
có thể tồn tại dưới nhiều dạng monomer, dimer, trimer, tetramer và hexamer. Các
cấu trúc này có thể chuyển dạng lẫn nhau trong invitro, nhưng dạng monomer gần

như không xuất hiện ở điều kiện sinh lý, hai dạng hoạt động là dimer và tetramer và
dạng dimer chiếm ưu thế trong hồng cầu người. Cấu trúc của enzyme được quyết
định bởi pH của môi trường. Enzyme tồn tại chủ yếu dưới dạng tetramer ở môi
trường pH thấp. Tại pH gần trung tính, enzyme tồn tại dưới dạng dimer và khi ở


8

môi trường trung tính thì dạng dimer và tetramer có tỷ lệ bằng nhau [2]. Sự trùng
hợp của các monomer thành các dimer và các dạng cao hơn có hoạt tính xúc tác cần
sự có mặt của NADP+. NADP+ được gắn với enzyme vừa như một phức hợp cấu
trúc ổn định G6PD nhờ việc ngăn cản sự chuyển dạng enzyme từ dimer thành
monomer không hoạt động, vừa như cơ chất của phản ứng, là chất cộng tác của
enzyme G6PD. Monomer G6PD gồm 515 acid amin, khối lượng phân tử là 59,256
dalton. Trên mỗi dimer có hai vị trí gắn NADP+, tại vị trí gắn NADP chức năng,
NADP gắn chặt chẽ hơn và cần thiết để duy trì cấu trúc oligo hoạt động của
enzyme. Tính đồng nhất của trình tự acid amin thay đổi tùy theo vùng. Vùng có tính
đồng nhất cao được cho là vùng có chức năng quan trọng, ở người, vùng này thuộc
acid amin 188-291.
I.1.2. Vai trò của G6PD trong chuyển hóa hồng cầu

Hình 1.2. Vai trò của G6PD trong hồng cầu
G6PD là một enzyme oxy hóa khử, có chức năng xúc tác phản ứng đầu tiên
của con đường pentose phosphate. Về mặt năng lượng, Hexose monophosphate là
con đường oxy hóa glucose xảy ra ở các mô song song với con đường đường phân
song con đường này cung cấp năng lượng không đáng kể vì chỉ có khoảng 7-10%
glucose được thoái hóa, nhưng con đường này về mặt sinh lý lại là nguồn gốc chủ
yếu cung cấp NADPH cho hồng cầu. NADPH là một coenzyme khử, cần cho phản
ứng của nhiều con đường sinh tổng hợp khác nhau và liên quan mật thiết với một

9

chuỗi phản ứng tiếp theo để bảo vệ hồng cầu như tái tạo glutathione dạng khử
(GSH) từ glutathione dạng oxy hóa (GSSG), khử MetHb thành Hb và có nhiệm vụ
cung cấp ribose-5-phosphat sử dụng cho quá trình tổng hợp acid nucleic. Đặc biệt
trước một tác nhân oxy hóa bất ngờ thì sự giáng hóa glucose theo con đường này lại
tăng lên gấp hai mươi đến ba mươi lần thậm chí cao hơn nữa. Trong con đường này,
G6PD oxy hóa G-6-P thành 6-phosphogluconolacton, với coenzyme là NADP+,
chất nhận hydro và trở thành NADPH [3]. Hồng cầu với chức năng chính là vận
chuyển oxy, do chứa nhiều oxy nên cấu trúc của hồng cầu thường xuyên có nguy cơ
bị oxy hóa và rất nhạy cảm với các quá trình oxy hóa, do đó chúng rất dễ bị hủy
hoại. NADPH hoạt động thông qua phản ứng chuyển GSSG thành GSH với sự tham
gia của enzyme glutathione reductase. GSH tạo thành sẽ ngăn cản quá trình
peroxide của các cấu tử hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu khỏi các tác nhân oxy
hóa [4]. Glutathion peroxidase (GSHPx) loại bỏ các chất oxy hóa ra khỏi hồng cầu
theo phản ứng:
ROOH+GSH (dạng khử) ------> GS-SG (dạng oxy hóa)+ROH+H2O
Ngoài ra, một cơ chế khác bảo vệ hồng cầu là: quá trình khử MetHb cùng
đồng thời diễn ra nhờ hệ thống enzyme methemoglobin reductase (MetHbR) mà cần
coenzyme là NADPH và NADH. Khi NADPH bị oxy hóa, GSSG bị khử thành
GSH, NADPH chuyển thành NADP+ và G6PD trở nên hoạt động, khử NADP+
thành NADPH. Khi hồng cầu thiếu G6PD, con đường hexose monophophat bị ngừng
trệ. NADPH sẽ không được tạo thành, dẫn đến GSH không đủ. Kết quả là việc bảo vệ
hồng cầu không hiệu quả. Hồng cầu dễ bị tấn công bởi các tác nhân oxy hóa, khi này
quá trình oxy hóa diễn ra rất mạnh và có nguy cơ làm tăng quá trình peroxide hóa các
cấu tử của nó. GSH sẽ càng không đủ cho nhu cầu của quá trình chuyển hóa, làm thay
đổi chức năng màng hồng cầu và hemoglobin bị biến tính. Hemoglobin bị oxy hóa
thành một hợp chất không bền với HbH2O2 với hàm lượng khá cao và rất độc cho
hồng cầu, dẫn đến màng hồng cầu bị tổn thương và bị vỡ [5].

10

I.2.

Bệnh lý thiếu hụt enzyme G6PD

I.2.1. Đặc điểm lâm sàng
Những đối tượng thiếu men G6PD thường không có biểu hiện triệu chứng lâm
sàng hoặc nếu có chỉ biểu hiện rất nhẹ. Tuy nhiên, khi tiếp xúc với các tác nhân oxi
hóa như một số loại thuốc, hóa chất và thức ăn có tính oxi hóa cao có thể dẫn đến
các hội chứng lâm sàng:
1) Tan máu sơ sinh

Tình trạng thiếu máu tán huyết và vàng da sơ sinh kéo dài là hai vấn đề
nghiêm trọng mà trẻ thiếu men G6PD gặp phải. Vàng da ở trẻ sơ sinh là một hiện
tượng sinh lý bình thường do vỡ hồng cầu trong những ngày đầu sau sinh. Các
trường hợp vàng da kéo dài có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó thiếu
G6PD được xem như một yếu tố nguy cơ dẫn tới vàng da bệnh lý. Bilirubin gián
tiếp tăng trong máu do hồng cầu bị vỡ gây vàng da. Mức độ vàng da phụ thuộc vào
mức độ tan máu. Nếu bilirubin tự do ứ nhiều sẽ thấm vào não gây ra biến chứng
thần kinh không hồi phục sẽ ảnh hưởng đến phát triển trí não của trẻ về sau . Hậu
quả nghiêm trọng của bệnh lý này là vàng da nhân [6]. Biểu hiện bởi các cơn tăng
trương lực cơ, xoắn vặn, mất các phản xạ sơ sinh, ngừng thở tím tái và có thể dẫn
tới tử vong. Nếu qua khỏi, có thể để lại bất thường về giác quan hay những di chứng
ảnh hưởng tới khả năng phát triển tinh thần và vận động của trẻ.
2) Tan máu khởi động do thuốc

Tình trạng tan máu xảy ra ở bệnh nhân sốt rét được điều trị bằng primaqine đã

được Ernest Beutler ghi nhận vào những năm 50 của thế kỉ trước [7]. Năm 1980,
Phạm Đình Vy đã báo cáo một trường hợp điều trị đái huyết sắc tố do tan máu cấp
trên bệnh nhân thiếu hoàn toàn men G6PD và bị ngộ độc thuốc sốt rét dẫn đến suy
thận cấp vô niệu, được tiến hành thay máu toàn bộ. Thuốc primaquine là một trong
những thuốc làm giảm tuổi thọ của hồng cầu ở người thiếu men G6PD, đã có
nghiên cứu sau khi cho bệnh nhân uống primaquine vài ngày đã cho thấy hàm
lượng hemoglobine giảm xuống rõ rệt, nước tiểu sậm màu, bệnh nhân có sốt cao,


11

vàng da. Một số thuốc khác cũng có thể gây nên tình trạng tan máu trên lâm sàng ở
người thiếu men G6PDH như acetaminophen, acid ascorbic, sulfaguanidine,
chloramphenicol,… Mức độ tán huyết và gây thiếu máu tùy thuộc vào nhiều yếu tố,
có thể là mức độ thiếu men G6PD, liên quan đến kiểu đột biến và loại tác nhân có
tính oxy hóa mạnh [8]. Ngoài ra, tan máu cấp có thể xảy ra sau nhiễm vi khuẩn,
virus, nhiễm toan cetonic là lí do dùng thuốc [9].
3) Ngộ độc đậu tầm (Fasvim)

Là bệnh lý thiếu máu tan máu cấp tính xảy ra sau khi ăn đậu tầm vài giờ hay
ngửi phấn hoa đậu tầm. Thành phần trong đậu fava có chất divicine (chủ yếu
convicine và vicine) có khả năng oxy hóa rất mạnh, khi vào cơ thể hai chất này gây
giảm glutathion khử rất nhanh và mạnh. Vì thế, những bệnh nhân thiếu hụt G6PD
khi ăn đậu tầm sẽ dẫn đến cơn tan máu cấp sau 24-48 giờ. Cơn tan máu rất mạnh, có
thể đe dọa tính mạng, vàng da, hemoglobin niệu, thường dẫn tới suy thận cấp. Đa số
các trường hợp tan máu xảy ra ở những cá thể thiếu hụt G6PD nặng, đôi khi cũng
gặp ở những cá thể thiếu G6PD thể nhẹ. Bệnh nhân mắc bệnh Favim luôn thiếu
G6PD tuy nhiên không phải tất cả bệnh nhân thiếu G6PD đều gặp triệu chứng sau
khi ăn đậu fava [4].
4) Thiếu máu tan máu mạn tính không phải hồng cầu hình cầu

Biểu hiện lâm sàng gồm thiếu máu mạn tính, vàng da nhẹ, lách to ít. Thiếu
máu tan máu mạn tính mức độ từ nhẹ đến nặng. Cơn tan máu tăng thêm khi có sốt,
dùng thuốc oxi hóa hoặc ngộ độc đậu tầm. Chủ yếu gặp nhiều ở người Bắc Âu [10,
107-112].
I.2.2. Phân loại
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã chia các biến thể của bệnh lý thiếu hụt G6PD
thành 5 lớp, dựa vào hoạt độ của enzyme trong hồng cầu và biểu hiện lâm sàng của
chúng. Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn rõ ràng.


12

Lớp

Lâm sàng

I

Nặng, thiếu máu tan máu hồng cầu không hình
cầu mạn tính
Nặng, thiếu máu tan máu cấp tính, từng đợt
Nhẹ và trung bình, có cơn tan máu cấp khi tiếp
xúc với các yếu tố oxi hóa
Thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu enzyme, không
có biểu hiện lâm sàng.
Không có biểu hiện lâm sàng

II
III

IV
V

Hoạt độ enzyme so với
bình thường
<10%
<10%
10 - 60 %
60 - 100%
>100%

I.2.3. Đặc điểm cận lâm sàng
−

Trong trường hợp không có tan máu, hemoglobin và hình ảnh hồng cầu

−
+
+
+
+

bình thường.
Khi xảy ra cơn tan máu:
Hemoglobin giảm vừa đến nặng,
Hồng cầu giảm, có hồng cầu hình cầu, hồng cầu có thể Heinz và đời sống ngắn.
Hồng cầu lưới tăng
Hoạt tính G6PD giảm

I.2.4. Điều trị

Thường thì triệu chứng sẽ tự hết sau khi những chất gây khởi phát bệnh được
thải trừ, trong những trường hợp tan máu do dùng thuốc hoặc hóa chất, ngay lập tức
dừng thuốc. Nếu tan máu nặng cần truyền máu. Truyền thay máu để đề phòng vàng
da nhân ở thể tan máu sơ sinh khi lượng bilirubin tự do quá ngưỡng.
I.2.5. Phòng bệnh
Phòng bệnh đóng vai trò quan trọng.
-

Đưa việc phát hiện thiếu G6PD vào chương trình sàng lọc sơ sinh. Giáo dục

-

tuyên truyền trong cộng đồng ý thức được ý nghĩa tầm soát bệnh.
Trang bị kiến thức cho cha mẹ của trẻ mắc bệnh về bệnh, các yếu tố nguy cơ

-

và những nguy hiểm có thể gặp phải và các biện pháp phòng tránh.
Tư vấn trước hôn nhân cho người bệnh, người mang gen về sự di truyền của

-

bệnh.
Người bị bệnh thận trọng trong việc sử dụng thực phẩm, thuốc có tính oxi
hóa trong danh mục khuyến cáo. Thông báo về tình trạng thiếu men G6PD
của bản thân cho bác sĩ trước khi sử dụng thuốc. Trường hợp bắt buộc phải


13

dùng các loại thuốc có nguy cơ thì cần theo dõi chặt chẽ vấn đề tan máu,
-

vàng da.
Đối với những vùng có tỷ lệ bệnh cao, vùng sốt rét lưu hành nên đưa xét
nghiệm hoạt độ enzyme G6PD trở thành xét nghiệm thường quy trước chỉ
định điều trị các thuốc có tính oxy hóa cao như Primaquine.

I.2.6. Cơ sở di truyền của bệnh thiếu hụt G6PD
I.2.6.1. Gen mã hóa tổng hợp G6PD
Vị trí gen mã hóa tổng hợp G6PD được định khu trên nhánh dài, vùng 2 băng
8 của NST X [2]. Vùng này gắn với rất nhiều gen khác như gen mã hóa hội chứng
nhiễm sắc thể X gãy, hemophilia, gen quy định màu sắc khi nhìn và nếu bị đột biến
sẽ gây bệnh mù màu. Gen G6PD dài khoảng 18-20kb, gồm 13 exon và 12 intron
gồm 25861 nucloetid, khung đọc mở dài 1545 nucleotid. Kích thước của các exon
mã hóa thay đổi rất nhiều, từ 38 – 236bp. Hầu hết các intron đều ngắn hơn 1kb, chỉ
có intron 2 dài hơn bình thường (khoảng 12kb). Exon 1 và đầu 5’ của exon 2 không
mã hóa. Bộ ba mã hóa đầu tiên nằm trên exon 2 [11]. Chức năng của từng exon có
sự khác nhau. Gen cấu trúc của G6PD gồm 20014 bp được mã hóa mRNA G6PD
gồm 2269 nucleotid, tương ứng với 2,4 kb. mRNA của G6PD có 1 đoạn đầu 3’ dài
655 bp và đoạn đầu 5’ dài 69 bp không mã hóa [12].


14

Hình 1.3. Vị trí gen G6PD trên nhiễm sắc thể X
1.2.6.2. Cơ sở di truyền bệnh thiếu G6PD
Thiếu hụt men G6PD là một bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính
X, không có alen trên Y. Nữ giới, mỗi tế bào đều có 2 alen mã hóa cho G6PD (một
alen nhận từ bố và 1 alen nhận tự mẹ). Những người nữ dị hợp tử vì mang gen đột

biến lặn nên có thể có kiểu hình bình thường, tuy nhiên có thể có các biểu hiện bệnh
lý ở mức độ nhẹ hoặc vừa, một số cá thể biểu hiện rất nặng. Nguyên nhân do một
trong hai nhiễm sắc thể X trong tế bào ở nữ đã bị bất hoạt từ giai đoạn sớm của thời
kỳ phôi thai, sau đó theo quá trình phân bào, nó được nhân lên tạo thành cơ thể
dạng khảm giữa những tế bào có nhiễm sắc thể lành và nhiễm sắc thể mang gen đột
biến với các tỷ lệ khác nhau. Do đó, những người nữ này có hai nhóm hồng cầu:
một nhóm bình thường và một nhóm hồng cầu có thiếu hụt G6PD, tỷ lệ của chúng
thay đổi trong phạm vi rộng 50:50 [8]. Một số ít trường hợp, các hồng cầu bất
thường chỉ chiếm 1%, nhưng cũng có khi lên đến 99%. Ngược lại, nam giới chỉ có
một nhiễm sắc thể X di truyền từ mẹ nên nếu thừa hưởng gen bị đột biến họ sẽ có
kiểu gen bán hợp tử và sẽ biểu hiện kiểu hình thiếu men G6PD. Có nhiều dạng đột
biến gây nên thiếu hụt G6PD nhưng chủ yếu là đột biến điểm, thay thế một
nucleotid, dẫn đến thay thế acid amin này bằng một acid amin kia và cuối cùng là
thay đổi cấu trúc protein. Khi gen cấu trúc bị đột biến sẽ gây nên thiếu men G6PD
về mặt chất lượng. Nếu đột biến xảy ra trên gen điều hòa hoặc gen khởi động sẽ làm
giảm số lượng enzyme G6PD. Sự biến đổi về mặt số lượng và chất lượng của phân
tử enzyme đều dẫn đến thay đổi hoạt độ của enzym.


15

Các xét nghiệm định tính và định lượng chẩn đoán thiếu G6PD được dựa trên
cơ sở đo tốc độ tạo thành NADPH từ NADP+ khi có G6P làm cơ chất, phục vụ cho
mục đích chẩn đoán nhanh, kỹ thuật ít phức tạp và chi phí thấp. Tuy nhiên đối với
trường hợp nữ giới mang gen dị hợp tử kết quả hoạt độ enzyme có thể vẫn nằm
trong giới hạn bình thường [8]. Ngoài ra, thời điểm xét nghiệm gần với cơn tan
máu, thời điểm này hồng cầu non và hồng cầu lưới là những tế bào có hoạt độ
enzyme cao chiếm ưu thế có thể dẫn tới xét nghiệm âm tính giả. Các xét nghiệm
G6PD dựa trên các kỹ thuật phân tử sẽ khắc phục những hạn chế của xét nghiệm
sinh hóa vì tính ổn định của DNA.

I.2.7. Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam
Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là lĩnh vực sinh học phân tử, cơ
sở gen học, các dạng đột biến của bệnh thiếu G6PD ngày càng được làm rõ. Bệnh
có thể gặp ở tất cả dân tộc, với khoảng hơn 400 triệu người trên thế giới thiếu men
G6PD [13] [14]. Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ thiếu G6PD cũng như các dạng đột
biến của bệnh có sự khác nhau giữa các dân tộc và vùng địa lý. Trên thế giới, tỷ lệ
bệnh cao nhất vẫn là các khu vực Địa Trung Hải, châu Phi và nam Á, ít nhất là ở
bắc Âu [13]. Tại Đông Nam Á, tỷ lệ thiếu hụt G6PD dao động trong khoảng từ 014%, một số quốc gia như ở Lào là 7.2%, Thái Lan 11.5%, Indonesia là 3.7% và
Myanmar là 5.4%, Việt Nam nằm trong vùng có tỷ lệ này dao động khoảng 0,3-9%
[15]. Theo thống kê năm 2012, số lượng đột biến gen G6PD được công bố trên thế
giới là 186 đột biến. Trong đó, 159 đột biến tìm thấy là đột biến điểm chiếm 85,4%,
15 (8%) đột biến thay thế 2 hay nhiều nucleotide, 10 (5,3%) đột biến xóa đoạn và 2
(1%) đột biến xảy ra trên intron. Hơn 442 biến thể được xác định dựa vào kỹ thuật
enzyme học, 68 đột biến thuộc phân lớp I chiếm tần số tương đối cao trên tổng số
đột biến điểm được xác định, tập trung chủ yếu ở các exon 6, 8, 10, 13, đột biên với
số lượng cao nhất tại exon 10 [16]. Mỗi dạng đột biến gây ra những bệnh cảnh và
mức độ nặng nhẹ khác nhau như thiếu máu tan huyết, vàng da, đái huyết sắc tố, suy
thận trước sự tấn công của các chất ô xy hóa như một số thức ăn, một số loại thuốc,
hay nhiễm khuẩn. Đột biến thuộc phân lớp I thường dẫn đến kiểu hình nghiêm
trọng, thiếu máu tan máu hồng cầu không hình cầu mạn tính với hoạt tính enzyme
dưới 10% so với người bình thường. Vì vậy việc xác định cá thể mắc bệnh thuộc


16

phân lớp này thường dễ dàng hơn so với phân lớp khác trong dân số nói chung. Các
loại đột biến được tìm thấy thường phân bố có tính khu vực. ở Myanmar, hơn 90%
trường hợp thiếu G6PD là đột biến G6PD Mahidol (487GA) và không gặp đột
biến G6PD Viangchan (871GA, 1311C T) [17]. Trái ngược với Myanmar, hơn
90% số ca mắc bệnh thiếu G6PD tại Campuchia là G6PD Viangchan, và không có

trường hợp của G6PD Mahidol [18], [19]. Viangchan là đột biến phổ biến nhất gặp
ở nhiều quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á như Lào, Thái Lan, Campuchia với
tần suất từ 9% đến 88,9% [11],[15], [18]. Theo phân loại của Tổ chức y tế thế giới
(WHO,1989), G6PD Viangchan nằm trong phân lớp II với hoạt tính enzyme từ 110% so với người bình thường.
Một số đột biến gen G6PD được tìm thấy tại Đông Nam Á
ST
T
1
2
3
4
5
6
7
8

Dạng đột biến
Gaohe
Viangchan
Chatham
Chinese - 5
Union
Silent
Canton
Kaiping

Vị trí biến đổi
Exon
Nucleocid
2

95 A  G
9
871 G  A
9
1003 G  A
9
1024 C  T
11
1360 C T
11
1311 C  T
12
1376 G  T
12
1388 G  A

Acid amin tương ứng
32 His  Arg
291 Val  Met
335 Ala  Thr
342 Leu  Phe
454 Arg  Cys
TAT TAC  Tyrosin
459 Arg  Leu
463 Arg His

Tại Việt Nam, thiếu G6PD đã được nghiên cứu từ những năm 1960, các
nghiên cứu tập trung vào cấu trúc, đặc tính của enzyme, xác định tỷ lệ thiếu hụt
G6PD, biểu hiện lâm sàng, đặc điểm xét nghiệm của người thiếu hụt G6PD và sự
phân bố của các dạng đột biến giữa các dân tộc, khu vực . Trong một nghiên cứu

của Trần Thị Chính và cộng sự (2005) trên 6.079 người thuộc 6 dân tộc của Việt
Nam thì tỷ lệ thiếu G6PD chung là 4,80% (292 trên 6.079 người) trong đó cao nhất
là người Rục - Quảng Bình là 18,92%, Mường - Hòa Bình 16%, Tày ở Cao Bằng và
Khánh Hòa 14,15%, Katu - Huế 10,96%, Raglai - Khánh Hòa 2,42% và thấp nhất
là người Kinh – Hà Nội 1,59% [20].
Các dạng đột biến thường gặp trong các nghiên cứu tại Việt Nam như:
Viangchan, Canton, Kaiping, Union thuộc lớp II; Gaohe, Chatham thuộc lớp III;
Chinese - 5 chưa phân lớp. Các đột biến trên thuộc các exon 2, 9, 11, 12. Một đột


17

biến khác dạng Silent cũng xuất hiện trên exon 11, 1311C>T bộ ba TAC TAT cùng
mã hóa cho Tyrosine nên không làm biến đổi thứ tự acid amin, đột biến này thường
xuất hiện đồng thời cùng một số đột biến khác như Viangchan và Canton với tần
suất tương đối cao [5], [6]. Năm 2013, Nguyễn Thị Huế và cộng sự nghiên cứu trên
30 trẻ sơ sinh nam thuộc dân tộc Kinh, 7 loại đột biến được tìm thấy. Trong đó
Viangchan và Canton là hai loại đột biến gặp nhiều nhất trong nghiên cứu với tỷ lệ
lần lượt là 43,33% và 26,6%. Các đột biến tập trung chủ yếu trên exon 9,11,12,
không tìm thấy đột biến trên các exon 3,4,6,7,10,13 [11]. Kết quả này phù hợp với
nhận định của một số nghiên cứu, nhận thấy điểm nóng đột biến (hot spot) ở các
nước châu Á là ở exon 9,11,12 [15]. Ngoài ra, Việt Nam cũng đã đóng góp vào cơ
sở dữ liệu đột biến gen G6PD với các đột biến phát hiện gặp lần đầu tiên như G6PD
Bao Loc (118 Tyr > His), Vietnam1 (3Glu > Lys),Vietnam2 (66Phe >Cys),
Vietnam3 (73Ser > Ser).
I.3.

Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen G6PD

Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR được phát triển bởi Kary Mullis vào những năm 1980. Đây là một
kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một hay vài đoạn
DNA thành nhiều bản sao. Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc biến tính, hồi
tính của DNA bởi nhiệt độ và khả năng của DNA polymerase tổng hợp chuỗi
DNA mới bổ sung cho chuỗi mẫu ban đầu.


18

Hình 1.4. Các giai đoạn của phản ứng PCR
1.Giai đoạn biến tính; 2.Giai đoạn gắn mồi; 3. Giai đoạn kéo dài

(Nguồn: />Phản ứng PCR bao gồm 3 giai đoạn


o

Giai đoạn biến tính: được thực hiện với nhiệt độ cao từ 94 - 95 C. Trong quá trình
này đã làm đứt các liên kết hidro, từ đó DNA mạch kép tách thành 2 mạch khuôn
cho quá trình tổng hợp.



Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ thấp xuống về nhiệt độ gắn mồi cho phép các
đoạn oligonucleotide gắn với sợi DNA khuôn. Enzyme DNA polymerase bền với
nhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi.



Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu nhất của enzyme Taq
polymerase xúc tác cho quá trình kéo dài.
Để khuếch đại thành công đoạn gen đích, chu kỳ nhiệt gồm 3 giai đoạn trên
được nhắc lại 25 – 40 lần. Số lượng chu kỳ tùy thuộc vào mục đích ứng dụng cụ
o

thể. Cuối cùng sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phòng hoặc 4 C,
tùy theo mục đích sử dụng và loại thiết bị tạo chu kỳ nhiệt được sử dụng.
Phản ứng PCR có độ nhạy cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA làm khuôn
cũng thu được sản phẩm. Vì vậy phản ứng này được ứng dụng rộng rãi và có những
biến đổi phù hợp với từng mục đích riêng. Trên cơ sở đó, có rất nhiều phương pháp
được sử dụng để xác định đột biến gây bệnh thiếu hụt G6PD như: phương pháp


19

MPTP – PCR, phương pháp đường cong nóng chảy HRM ( High Resolution Melt),
phương pháp phân tích cấu trúc đa hình chuỗi đơn SSCP ( Single – strand
comformation polymorphism analysis), hệ thống khuếch đại các đột biến bền với
nhiệt ARMS (Amplification refractory mutation system) và giải trình tự gen.
I.3.1. Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy (HRM)
Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy (melting curve) được ứng
dụng rộng rãi trong kỹ thuật realtime PCR giúp chẩn đoán các đột biến điểm trên
gen G6PD. Hệ thống realtime PCR cho phép theo dõi sự hình thành sản phẩm
PCR theo từng chu kỳ của phản ứng. Đây là một kỹ thuật “không đồng nhất” vì
trong kỹ thuật này, một hỗn hợp sản phẩm PCR được tạo ra chứ không phải từng
thành phần sản phẩm PCR được phát hiện như trong kỹ thuật điện di. Quy trình
phản ứng đơn giản nhất là bổ sung Ethidium Bromid vào hỗn hợp phản ứng. Khi
Ethidium Bromid xen kẽ vào trong cấu trúc chuỗi đôi của DNA, tín hiệu huỳnh
quang sẽ được tạo ra, mức độ tín hiệu này phụ thuộc vào lượng DNA chuỗi đôi

được tạo ra trong quá trình phản ứng.
1.3.2. Phương pháp MPTP (PCR using multiplex Tandem forward Primer)
Năm 1977, một nhóm tác giả Nhật Bản và Singapore đã triển khai phương
pháp phát hiện những đột biến của gen G6PD là MPTP. Nguyên tắc của phản ứng
này dựa trên nguyên lý của PCR.
Trước hết một vùng gen đích của G6PD được khuếch đại, sau đó sản phẩm
này được sử dụng làm khuôn mẫu để chạy MPTP. MPTP dựa trên cơ sở một
primer rất ngắn có khả năng nhận ra một nucleotid khác biệt trong vùng trình tự
đích, và như vậy việc lai sẽ không thực hiện được. Phản ứng MPTP được tiến
hành với nhiều primer xuôi chiều. Những primer xuôi chiều nối đuôi nhau phủ
toàn bộ vùng gen đích và một primer ngược thông thường làm khuếch đại từng
đoạn “theo bậc thang“. Sự thay đổi nucleotid trong vùng “rà soát“ của primer dẫn
đến việc thiếu một hay hai sản phẩm khuếch đại. Lợi ích của kỹ thuật này là hầu
hết trình tự đột biến trong vùng đích của gen trên nhiễm sắc thể có thể được khu
trú lại một vùng nhỏ và được phát hiện sau hai bước PCR.


20

1.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn SSCP (Single strand comformation polymorphism analysis)
Năm 1985, Maniatis và cộng sự đã chứng minh rằng bằng cách sử dụng gel
polyacrylamid ở trạng thái biến tính có thể phát hiện được sự thay thế một cặp
base đơn độc trong bộ gen do sự khác nhau về khả năng di chuyển, hậu quả của
sự thay đổi cấu trúc.
Về nguyên tắc, phương pháp gồm hai bước: Bước 1: Khuếch đại đoạn DNA
đích nhờ PCR, Bước 2: Sau đó sản phẩm được biến tính và phân đoạn nhờ điện di trên
gel polyacrylamid ở điều kiện không biến tính. Sau khi bị biến tính bởi nhiệt độ, khả
năng di chuyển của các phân đoạn DNA khi điện di trên gel polyacrylamid phụ thuộc
vào kích thước và cấu trúc bậc 2 nội phân tử của chuỗi đơn. Ưu điểm của phương pháp
này là chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn.

1.3.4. Phương pháp ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
ARMS do Newton và cộng sự nghiên cứu năm 1989, sáu năm sau khi PCR
được phát minh. Ngày nay, phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi trong
viêc xác định các đột biến điểm đã được biết trước đó.
Nguyên tắc của ARMS dựa trên sự khác biệt về các nucleotid của primer ở
đầu 3’ thiết kế cho các alen khác nhau. Chính vì vậy ARMS còn có một số tên
gọi khác nữa căn cứ vào bản chất của kỹ thuật: PCR đặc hiệu alen (allele specific
PCR - ASP), khuếch đại PCR của các alen đặc hiệu (PCR amplification of
specification of specific alleles - PASA) hay khuếch đại allele đặc hiệu (allele
specific amplification - ASA)
Ưu điểm của phương pháp ARMS là đơn giản, dễ áp dụng, rẻ tiền mà vẫn
đảm bảo độ chính xác cao.
1

Kỹ thuật giải trình tự gen
Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen mong muốn

để phục vụ nghiên cứu cho kỹ thuật giải trình tự gen ở bước sau.
Được phát minh nhờ Frederick Sanger vào năm 1977. Giải trình tự gen
là phương pháp xác định trình tự sắp xếp của 4 loại nucleotid: A (Adenin), T
(Thymine), G (Guanine), C (Cytosine) trên phân tử DNA. Thành phần của kỹ


21

thuật này bao gồm DNA sợi đơn cần được giải trình tự; enzyme DNA
polymerase; đoạn mồi deoxynucleotidetriphosphate (dNTPs) và một thành
phần đặc biệt là di- deoxynucleotidetriphosphate (ddNTPs). Là một phân tử
nhân tạo, cấu trúc của ddNTP tương tự như phân tử deoxynucleotid (dNTP),
tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là nhóm hydroxyl

(-OH) mà là –H. Các ddNTP có nhiệm vụ dừng việc tổng hợp mạch bổ sung
do không hình thành được liên kết phosphodiester. Các ddNTP tham gia vào
phản ứng tại nhiều thời điểm khác nhau và tạo ra các sợi đơn DNA có kích
thước khác nhau.

Hình 1.5. Cấu trúc của ddNTP
(Nguồn: )
Để thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen, đầu tiên khuếch đại đoạn DNA
cần giải trình tự. Sử dụng một đoạn mồi bổ sung với trình tự của vector và
gắn vào đầu 3’ của vector gần vị trí chèn DNA. Phản ứng sau đó được tiến
hành trong 4 ống nghiệm, mỗi ống được cung cấp thêm DNA polymerase, 4
loại dNTP tự do và một trong 4 dideoxynucleic (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP). Nồng độ của mỗi ddNTP được điều chỉnh thận trọng, với một lượng
nhỏ khoảng 1%. Trong quá trình tổng hợp chuỗi, enzyme DNA polymerase sẽ
gắn các dNTP vào để kéo dài chuỗi. Do hàm lượng rất thấp nên thỉnh thoảng
mới có 1 dideoxynucleotid được gắn vào chuỗi và lúc đó phản ứng tổng hợp
chuỗi bị dừng lại. Như vậy trong mỗi ống phản ứng chứa các mạch đơn DNA
có chiều dài khác nhau, và ở đầu 3’ của các đoạn DNA chứa một ddNTP
tương ứng đã cho vào ống đó. Tiến hành điện di 4 ống phản ứng trên 4 hàng
của một gel polyacrylamide để phân tách các đoạn DNA. Do một trong 4
dNTP có đánh dấu phóng xạ nên khi dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi, các mạch


22

đơn trên gel điện di sẽ tạo ra các vạch sáng trên phim X quang. Giải trình tự
Sanger có thể thực hiện với các đoạn DNA khoảng 400 – 900 cặp base.

Hình 1.6. Giải trình tự gen bằng phương pháp của Sanger
(Nguồn: )

Năm 1986 thiết bị giải trình tự tự động dựa trên phương pháp của
Sanger được phát minh bởi Lloyd M.Smith và được sản xuất bởi công ty
Applied Biosystems. Hệ thống điện di thường là điện di mao quản, máy gồm
nhiều mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu một
lần điện di. Các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang với 4 màu khác nhau,
nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể được thực hiện trong một ống nghiệm
và chỉ cần điện di trên một hàng. Hệ thống detector gồm các camera có chùm
tia sáng laser di qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, khi có một vạch
điện di đi qua chùm tia laser thì phân từ ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn
DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng và được camera ghi nhận lại
thành một cường độ đỉnh sáng trong biểu đồ. Dựa vào biểu đồ này, máy sẽ


23

phân tích các đỉnh cường độ sáng, so sánh với các màu, nhận diện được loại
nucleotid và cho ra trình tự DNA đích.

Hình 1.7. Giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động
(Nguồn: />Nghiên cứu được thực hiện trên máy giải trình tự gen tự động, đem lại
kết quả nhanh chóng và chính xác của các gen cần nghiên cứu, giúp phát hiện
chính xác các đột biến xảy ra trên gen. Đồng thời tăng khả năng phát hiện các
đột biến mới chưa được phát hiện.


24

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn.
Đối tượng nghiên cứu gồm 30 bệnh nhân thuộc dân tộc Kinh đã được chẩn
đoán thiếu men G6PD tại Bệnh viện Nhi Trung Ương bằng phương pháp định lượng
G6PD trên máy hóa sinh tự động.
Tiêu chuẩn đánh giá
Bình thường:

>200 U/1012HC.

Thiếu G6PD nhẹ:

120-200 U/1012HC.

Thiếu G6PD vừa:

20 – 120 U/1012HC.

Thiếu G6PD nặng:

<20 U/1012HC.

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
Không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang.
2.3.Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 06/2019 đến 06/2020.
Địa điểm nghiên cứu:

+ Bệnh viện Nhi Trung Ương.
+ Trung tâm Gen - Protein trường Đại học Y Hà Nội
2.4. Quy trình nghiên cứu
1) Thu thập mẫu máu được chống đông bằng EDTA của bệnh nhân được chẩn

đoán thiếu men G6PD thuộc dân tộc Kinh tại Bệnh viện Nhi Trung Ương.
2)

Tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng kit Wizard Geromic DNA purification
của hãng Promega. DNA tách chiết sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng
phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 260/280 nm. Bảo quản ở
nhiệt độ -20oC.

3) Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn exon thuộc vùng trọng điểm trên gen

G6PD, sử dụng cho phản ứng PCR.


25

4) Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các đoạn exon đích 9,10,11,12 trên gen

G6PD, chuẩn bị cho giải trình tự gen.
5) Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 1,5%.
Sản phẩm điện di được nhuộm với chất nhuộm Ethidium bromide và chụp
ảnh bằng máy chụp ảnh gel Bio-Rad. Kết quả được đánh giá bằng một vạch
sáng rõ, không có vạch phụ.
6) Sản phẩm PCR được sử dụng tiến hành giải trình tự trên máy giải trình tự
ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (USA)
7) Phân tích kết quả trình tự thu được bằng phần mềm CLC Mainworkbench, so

sánh trình tự gen của bệnh nhân với trình tự gen chuẩn của gen Bank (NCBI)
(NG_009015).
Sơ đồ nghiên cứu
Thu thập mẫu máu bệnh nhi đã được chẩn đoán
thiếu G6PD tại Bệnh viện Nhi Trung ương

Tách chiết DNA bằng kit Promega và kiểm
tra độ tinh sạch DNA bằng phương pháp đo
OD
Tiến hành phản ứng PCR khuyếch
đại các exon đích trên gen G6PD

Điện di trên gel Agarose 1.5%
kiểm tra sản phẩm PCR

Tiến hành giải trình tự xác định
đột biến.

Phân tích kết quả giải trình tự bằng phần mềm
CLC Mainworkbench
2.5. Dụng cụ trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu