Nghiên cứu điều chế cao rễ đan sâm giàu hoạt chất sử dụng nhựa hấp phụ Macroporous

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ
CAO RỄ ĐAN SÂM GIÀU HOẠT CHẤT
SỬ DỤNG NHỰA HẤP PHỤ
MACROPOROUS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN HUY HOÀNG
Mã sinh viên: 1401247

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ
CAO RỄ ĐAN SÂM GIÀU HOẠT CHẤT
SỬ DỤNG NHỰA HẤP PHỤ
MACROPOROUS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS Bùi Thị Thúy Luyện
NCS Nguyễn Thị Phương Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
TS. Bùi Thị Thúy Luyện, NCS Nguyễn Thị Phương Dung đã trực tiếp hướng
dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn DS.Trần Trọng Biên đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi
tháo gỡ những khó khăn trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô Trường Đại học Dược Hà
Nội đã dạy dỗ và chỉ bảo tận tình trong suốt năm năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã luôn ủng hộ
và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những
thiếu sót, tôi rất mong có được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Đoàn Huy Hoàng

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................v
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ...............................................................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................2

1.1. Tổng quan về Đan sâm .......................................................................................2
1.1.1. Tên gọi & phân bố .........................................................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ..........................................................................................2
1.1.3. Bộ phận sử dụng ............................................................................................2
1.1.4. Tác dụng .........................................................................................................3
1.1.5. Thành phần hóa học [2], [11], [12], [23] .....................................................3
1.1.5.1. Acid salvianolic B .....................................................................................4
1.1.5.2. Tanshinon IIA ...........................................................................................5
1.1.6. Một số phương pháp tinh chế và làm giàu hoạt chất trong cao rễ Đan sâm
..................................................................................................................................5
1.1.6.1. Phương pháp CO2 siêu tới hạn ................................................................ 5
1.1.6.2. Phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................6
1.1.6.3. Phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) .............6
1.1.6.4. Phương pháp sắc ký hấp phụ kết hợp phương pháp sắc ký ngược dòng
tốc độ cao (HSCCC) .............................................................................................. 6
1.2. Tổng quan về nhựa macroporous ......................................................................7
1.2.1. Định nghĩa & phân loại.................................................................................7
1.2.2. Bản chất hóa học ...........................................................................................7
1.2.3. Bản chất của quá trình làm giàu hợp chất bằng nhựa macroporous .........8
1.2.4. Các nghiên cứu tinh chế cao đan sâm bằng nhựa macroporous đã làm....9
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................12
2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................12
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................ 12
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ ..........................................................................13
2.1.2.1. Hóa chất .................................................................................................13
ii


2.1.2.2. Thiết bị ....................................................................................................13
2.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................14

2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................14
2.3.1. Phương pháp định tính hoạt chất của Đan sâm ........................................14
2.3.2. Phương pháp định lượng ASB và tanshinon IIA bằng HPTLC ...............14
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................................ 15
2.3.4. Phương pháp chiết và xử lý dịch chiết .......................................................16
2.3.5. Phương pháp xử lý hạt nhựa ......................................................................17
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu quá trình hấp phụ ............................................17
2.3.6.1. Khảo sát lựa chọn nhựa macroporous ...................................................17
2.3.6.2. Khảo sát tỷ lệ khối lượng nhựa và thể tích của dịch chiết .....................18
2.3.6.3. Phương pháp tiến hành quá trình hấp phụ ............................................18
2.3.7. Phương pháp nghiên cứu quá trình giải hấp phụ hoạt chất Đan sâm từ
hạt nhựa macroporous D101 ................................................................................19
2.3.7.1. Khảo sát lựa chọn dung môi giải hấp phụ .............................................19
2.3.7.2. Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ ...............................................19
2.3.8. Xây dựng và đánh giá quy trình làm giàu hoạt chất cao rễ đan sâm sử
dụng nhựa macroporous .......................................................................................20
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 21
3.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng bằng TLC-scanning .............21
3.1.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng ASB ....................................21
3.1.1.1. Độ đặc hiệu ............................................................................................ 21
3.1.1.2. Khoảng tuyến tính ..................................................................................22
3.1.1.3. Độ thích hợp hệ thống ............................................................................23
3.1.1.4. Độ lặp lại phương pháp .........................................................................24
3.1.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng tanshinon IIA ....................25
3.1.2.1. Độ đặc hiệu ............................................................................................ 25
3.1.2.2. Khoảng tuyến tính ..................................................................................26
3.1.2.3. Độ thích hợp hệ thống ............................................................................27
3.1.2.4. Độ lặp lại phương pháp. ........................................................................27
3.2. Kết quả khảo sát quá trình chiết xuất ............................................................. 28
3.2.1. Lựa chọn dung môi chiết Đan sâm ............................................................. 28

3.2.2. Lựa chọn kích thước tiểu phân bột ............................................................. 29
iii


3.2.3. Lựa chọn số lần chiết ..................................................................................30
3.2.4. Kết quả xác định hàm lượng ASB và tanshinon IIA trong dược liệu.......31
3.3. Kết quả nghiên cứu quá trình hấp phụ ...........................................................31
3.3.1. Lựa chọn nhựa hấp phụ macroporous .......................................................31
3.3.2. Khảo sát tỷ lệ khối lượng hạt và thể tích dịch chiết ...................................33
3.4. Kết quả nghiên cứu quá trình giải hấp phụ hoạt chất Đan sâm từ hạt nhựa
macroporous D101 ...................................................................................................34
3.4.1. Khảo sát dung môi giải hấp phụ .................................................................34
3.4.1.1. Khảo sát dung môi giải hấp phụ tiến hành bằng kỹ thuật mẻ ................34
3.4.1.2. Khảo sát dung môi giải hấp phụ tiến hành bằng kỹ thuật cột................34
3.4.2. Kết quả khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ .......................................36
3.4.2.1. Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ đồng thời ASB và tanshinon IIA
............................................................................................................................. 36
3.4.2.2. Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ từng thành phần ASB và Tan
IIA ........................................................................................................................36
3.5. Đề xuất quy trình làm giàu hoạt chất trong cao rễ Đan sâm ứng dụng nhựa
macroporous D101 ...................................................................................................38
3.6. Bàn luận .............................................................................................................42
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................44
4.1. Kết luận. .............................................................................................................44
4.2. Đề xuất................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASB : Acid salvianolic B
Tan IIA : Tanshinon IIA
EtOH : Ethanol
MeOH: Methanol
EtOAc: Ethyl acetat
NXB: Nhà xuất bản
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
TKHH: Tinh khiết hóa học
KTTP: Kích thước tiểu phân
TT: Thứ tự
HSCCC: High speed countercurrent chromatography

v


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
TT Danh mục hình vẽ, đồ thị

Trang

1

Hình 1.1: Cây và rễ Đan sâm

2

2

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học acid salvianolic B

4

3

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA

5

4

Hình 1.4: Một phần mạng lưới polymer liên kết chéo

8

5

Hình 2.1: Nguyên liệu Đan sâm

12

6

Hình 2.2: Hạt nhựa macroporous D101

12

7

Hình 2.3: Hạt nhựa macroporous HPD826

12

8

Hình 2.4: Hạt nhựa macroporous H103

12

9

Hình 3.1: Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định lượng
ASB

10 Hình 3.2: Hình ảnh pic sắc ký của ASB trong mẫu thử và mẫu chuẩn
11

12

13

14

Hình 3.3: Đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ
ASB
Hình 3.4: Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định lượng
Tan IIA
Hình 3.5: Hình ảnh pic sắc ký của Tan IIA trong mẫu thử và mẫu
chuẩn

Hình 3.6: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng
độ Tan IIA

21
22
23

25

25

26

15 Hình 3.7: Khảo sát dung môi chiết Đan sâm bằng SKLM

28

16 Hình 3.8: Theo dõi quá trình chiết xuất Đan sâm bằng SKLM

30

17 Hình 3.9: SKLM khảo sát lựa chọn nhựa macroporous

32

18

19

20

Hình 3.10: Mối liên hệ giữa khối lượng nhựa /50mL dịch chiết và
hiệu suất hấp phụ ASB
Hình 3.11: SKLM khảo sát nồng độ dung môi giải hấp phụ hoạt chất
bằng kỹ thuật mẻ
Hình 3.12: SKLM khảo sát nồng độ dung môi giải hấp phụ hoạt chất
bằng kỹ thuật cột

21 Hình 3.13: Khảo sát thể tích giải hấp phụ đồng thời ASB và Tan IIA
vi

33

34

35
36


22 Hình 3.14: Khảo sát thể tích giải hấp phụ ASB

37

23 Hình 3.15: Khảo sát thể tích giải hấp phụ Tanshinon IIA

37

24 Sơ đồ quy trình làm giàu hoạt chất Đan sâm trong cao rễ Đan sâm

39

25 Hình 3.16: Cao I

40

26 Hình 3.17: Cao IIa

40

27 Hình 3.18: Cao IIb

40

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
TT Danh mục các bảng

Trang

1

Bảng 2.1: Danh sách hóa chất sử dụng

13

2

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định

23

lượng ASB
3

Bảng 3.2: Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp

24

định lượng ASB
4

Bảng 3.3: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng ASB

24

5

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng tanshinon IIA

26

6

Bảng 3.5: Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp

27

định lượng tanshinon IIA

7

Bảng 3.6: Kết quả đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng

28

tanshinon IIA
8

Bảng 3.7: Kết quả định lượng khảo sát lựa chọn KTTP

29

9

Bảng 3.8: Hàm lượng ASB và tanshinon IIA trong dịch chiết rễ Đan

31

sâm
10

Bảng 3.9: Kết quả định lượng ASB để lựa chọn nhựa hấp phụ

32

11

Bảng 3.10: Khối lượng ASB bị hấp phụ và hiệu suất hấp phụ ASB của

33

nhựa D101
12

Bảng 3.11: Hàm lượng ASB và tanshinon IIA sau quá trình làm giàu

41

13

Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi ASB và tanshinon IIA sau quá trình làm
giàu

41

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Rễ Đan sâm đã được sử dụng từ rất lâu trong y học làm thuốc hoạt huyết,
thông kinh, giảm đau, thanh tâm lương huyết[4]. Với sự có mặt của các nhóm hoạt
chất có tác dụng sinh học chính bao gồm: các hợp chất diterpen và các hợp chất acid
phenolic, dịch chiết Đan sâm cho hiệu quả tốt trên hệ tim mạch, viêm gan cấp, viêm
gan mạn, suy thận, bệnh mạch vành, bệnh lý mạch máu não, xơ cứng bì, ung thư
lympho.
Nhận thấy việc làm giàu các hoạt chất cao rễ Đan sâm không những làm tăng
tác dụng sinh học, hiệu quả điều trị mà còn giúp tăng tính tiện dụng, dễ dàng ứng
dụng trong công nghệ dược phẩm & bào chế. Bởi vậy cho nên hiện nay đã có một
số nghiên cứu làm giàu hoạt chất từ rễ Đan sâm bằng nhiều phương pháp khác nhau

như: phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng, sắc ký lọc gel, sắc ký ngược dòng hiệu
năng cao. Tuy nhiên , các phương pháp này trải qua nhiều bước, chi phí cao, tốn
thời gian, sử dụng nhiều dung môi hữu cơ độc hại và rất khó nâng quy mô. Ngày
nay, phương pháp hấp phụ sử dụng nhựa hấp phụ macroporous đang được ứng dụng
rất nhiều trong phân lập, tinh chế các hợp chất tự nhiên do có khả năng hấp
phụ/phản hấp phụ chọn lọc nhiều nhóm phân tử mục tiêu, hiệu suất cao, dễ tái sử
dụng, độ lặp lại tốt và hầu hết đều sử dụng các dung môi "xanh" như nước và
ethanol.
Nhận thấy hiện nay các nghiên cứu đa phần là phân lập từng hoạt chất hay
làm giàu riêng từng nhóm hoạt chất (thân nước hoặc thân dầu) chưa có nghiên cứu
nào làm giàu đồng thời tất cả các nhóm hoạt chất của rễ Đan sâm. Vì thế,từ những
ưu điểm của hạt nhựa macroporous và tính cấp thiết trong việc làm giàu hoạt chất từ
rễ Đan sâm để ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm , phục vụ nhu cầu phòng và
điều trị bệnh của người dân, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều
chế cao rễ Đan sâm giàu hoạt chất sử dụng nhựa macroporous” với những mục
tiêu sau:
1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trìnhlàm giàu hoạt chất cao rễ Đan
sâm bằng nhựa macroporous.
2. Xây dựng quy trình ứng dụng hạt nhựa macroporous trong làm giàu hoạt chất cao
rễ Đan sâm với quy mô phòng thí nghiệm và định lượng bằng TLC scanning.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Đan sâm
1.1.1. Tên gọi & phân bố
Đan sâm hay còn gọi là Huyết sâm, Xích
sâm, Huyết căn.
Tên khoa học: Salvia miltiorrhiza Bunge,

thuộc Chi Salvia, Họ hoa môi Lamiaceae,Bộ
Labiatae.
Cây có nguồn gốc từ Trung Quốc, mới được
di thực vào nước ta. Hiện nay, Đan sâm đã
được gây giống ở Tam Đảo, Hưng Yên, Hà
Giang, Sa Pa [3].

Hình 1.1: Cây và rễ Đan sâm

1.1.2. Đặc điểm thực vật
Đan sâm là loại cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, đường kính 0,5-1,5 cm,
màu đỏ nâu. Lá kép mọc đối, gồm 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7, mặt trên lá chét
màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng
dài hơn. Cụm hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay ở kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm.
Hoa mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím
nhạt, 2 môi, môi trên hình lưỡi liềm, môi dưới xé 3 thùy.Hai nhị ở hai môi dưới, bầu
có vòi dài lồi ra ở môi trên. Quả nhỏ dài 3 mm, rộng 1,5 mm [2], [3] .
1.1.3. Bộ phận sử dụng
Dược liệu Đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô hay sấy khô
của cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) [4].
Rễ ngắn, thô, đôi khi ở đầu rễ còn sót lại gốc của thân cây. Rễ hình trụ dài,
hơi cong, một số có nhánh, có rễ dạng tua nhỏ, dài 10-20 cm, đường kính 0,3-1 cm.
Bên ngoài màu nâu đỏ hoặc nâu nhạt, thô, có vân nhăn dọc. Vỏ rễ già bong ra, chủ
yếu là màu tím thường bị vẩy. Kết cấu cứng và dễ vỡ, giòn, không chắc, có vết nứt,
hơi phẳng hoặc đặc, có vỏ màu nâu sẫm và phần gỗ màu vàng xám hoặc nâu tía, cho
thấy các bó mạch màu vàng nhạt, xuyên tâm. Mùi nhẹ, vị đắng và tương đối cay,
2


đường kính 5-15 cm. Mặt ngoài nâu nhạt, có nếp nhăn dọc, phần vỏ bám chặt vào

gỗ không dễ bóc ra. Chất chắc, mặt bẻ gãy tương đối phẳng, hơi có dạng chất
sừng[4].
1.1.4. Tác dụng
- Theo y học cổ truyền:
+ Đan sâm vị đắng, tính mát, quy kinh tâm, can; công năng hoạt huyết, thông kinh,
giảm đau, thanh tâm lương huyết; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế
tắc, hành kinh đau bụng, huyền tích hòn cục, tâm phiền mất ngủ, đau thắt ngực [4].
- Theo y học hiện đại:
+ Đan sâm có tác dụng trên hệ tim mạch, làm giãn các động mạch và tĩnh mạch
nhỏ, mao mạch, tăng cường tuần hoàn vi mạch, làm giảm mức độ nhồi máu cơ tim,
có tác dụng bảo vệ trong chứng thiếu máu cơ tim cục bộ, bảo vệ tim, chống lại
những rối loạn về chức năng và chuyển hóa gây ra bởi thiếu hụt oxy.
+ Đan sâm cũng có tác dụng ổn định màng hồng cầu, tăng sức đề kháng của hồng
cầu, chống huyết khối.
+ Tác dụng chống oxy hóa của Đan sâm thể hiên trên cơ sở: loại các gốc tự do có
hại cho cơ thể, ức chế sự oxy hóa LDL, ức chế tổng hợp cholesterol ở tế bào giúp hạ
lipid máu, an thần, hỗ trợ điều trị chứng mất ngủ và hạ đường huyết.
+ Ngoài ra Đan sâm còn dùng chữa bệnh vàng da, rối loạn kinh nguyệt, chảy máu tử
cung, vô kinh, đau kinh, có tác dụng an thai, chữa viêm đau khớp cấp, có tác dụng
an thần, giảm đau, ức chế sự phát triển của vi khuẩn: lao, E. Coli, thương hàn [2].
1.1.5. Thành phần hóa học [2], [11], [12], [23]
Các thành phần hóa học của Đan sâm đã được nghiên cứu từ đầu những năm
30 của thế kỉ trước.Hiện tại có hơn 100 chất hóa học được tách chiết và xác định từ
Đan sâm.Dựa vào tính tan của các chất hóa học thì có thể chia các nhóm thành phần
trong đan sâm làm 3 loại: thành phần tan trong dầu, thành phần tan trong nước và
các thành phần khác.
- Thành phần tan trong dầu: Chủ yếu là các diterpenoid gồm nhiều cấu trúc khác
nhau chia làm 4 nhóm: abietan diterpenoid, clerodan diterpenoid, pimaran
diterpenoid, lapdan diterpenoid. Trong rễ Đan sâm chủ yếu là nhóm abietan

3


diterpenoid với thành phần chính là các tanshinon I, II và III. Ngoài còn có
isotanshinon I, II…
- Thành phần tan trong nước: Các thành phần tan trong nước của Đan sâm chủ yếu
là các acid phenolic và dẫn chất .Hơn 30 hợp chất acid phenolic đã được tách ra từ
đan sâm bao gồm danshensu, acid salvianolic A, B, C, acid protocatechuic,
protocatechualdehyd, acid rosmarinic, carnosol và các dẫn xuất khác.
- Các hợp chất khác: Là các hợp chất khó phân loại như β-sitosterol, balcalin, acid
ursolic và daucosterol tìm thấy trong cao chiết ethanol, vitamin E và tannin tìm thấy
trong dịch chiết ethyl acetat [2],[11], [12], [23].
1.1.5.1. Acid salvianolic B

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học acid salvianolic B
- Tính chất vật lí: Bột không màu dạng vô định hình, dễ tan trong nước , ethanol,
methanol, aceton và ethylacetat. Hấp thụ UV-VIS. Phân tử có carbon bất đối nên có
đồng phân quang học .Góc quay cực trong ethanol là +92 [11].
- Tính chất hóa học: ASB có nhóm carboxylic và nhóm OH phenol nên có tính acid
(pKa=2,77) và có đầy đủ tính chất của OH phenol. Mặt khác trong phân tử có các
liên kết ester nên ASB không bền dưới tác động của nhiệt và độ ẩm (thủy phân). Do
vậy bảo quản ở nhiệt độ thường , tránh ẩm [34].
- Tác dụng sinh học: Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy acid salvianolic B có
hiệu quả trên một số bệnh về thần kinh và tim mạch:
+ Thúc đẩy, bảo vệ và phục hồi các chức năng thần kinh thông qua việc bảo vệ bao
myclin quanh sợi trục thần kinh tủy sống [35].
+ Cải thiện tình trạng thiếu máu cục bộ, tưới máu lại trong chấn thương thông qua
ức chế TLR4 (Toll-like receptor 4 – thụ thể liên quan đến khả năng tự miễn dịch và
một số phản ứng viêm) [27].
4

+ Bảo vệ tim mạch khi bị nhồi máu cơ tim cấp tính nhờ thúc đẩy autophagy (quá
trình tự thực bào), neovascularization (quá trình hình thành vi mạch) và ức chế
apoptosis (quá trình tự chết theo chương trình tế bào )[17].
+ Giảm mỡ máu và ức chế hoạt động của HMGB1 (enzyme đóng vai trò quan trọng
trong bệnh sinh của bệnh gan nhiễm mỡ không do dùng đồ uống có cồn) giúp cải
thiên tình trạng gan nhiễm mỡ [33].
1.1.5.2. Tanshinon IIA

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA
- Là bột màu đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042mg/L ở 25˚C), tan tốt trong các dung
mội hữu cơ, nhất là các dung môi kém phân cực như ethanol, methanol, ethylacetat
và dimethyl sulfoxid [22].
- Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid do có khung terpenoid. Ngoài ra trong
phân tử còn có lacton và ceton. Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy đủ tính
chất của terpenoid [12].
- Tanshinon IIa không bền vững ở nhiệt độ cao, ánh sáng, độ ẩm và tiếp xúc với
oxy. Dưới tác động của các tác nhân trên, nó có xu hướng bị phân hủy. Đó có thể là
lí do chính trong việc giảm hàm lượng tanshinon IIA trong toàn bộ quá trình chiết,
cô đặc, xát hạt, sấy khô [19], [7].
- Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính, định lượng
tanshinon IIA. Tanshinon IIA hấp thụ mạnh UV ở bước sóng từ 254-280nm [7].
1.1.6. Một số phương pháp tinh chế và làm giàu hoạt chất trong cao rễ Đan sâm
1.1.6.1. Phương pháp CO2 siêu tới hạn
“Ba tashinon từ rễ cây Đan sâm đã được chiết xuất bằng phương pháp chiết
CO2 siêu tới hạn, sử dụng đồng dung môi ethanol 95% làm dung môi chiết xuất, với
tốc độ dòng 10mL/phút, áp suất 20Mpa, nhiệt độ chiết xuất 45oC và nhiệt độ tách
5

35oC. Dịch chiết được tinh chế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử
dụng cột Nova Pak C18, pha động methanol : nước (80:20) tại bước sóng 280nm.
Các hệ số tương quan là 0,9994-0,9998 và độ lệch chuẩn tương đối là 2,37% 3,47%. Giới hạn phát hiện là 0,473 mg/L [15].
1.1.6.2. Phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Acidsalvianolic B (ASB) là một trong những hợp chất chính của rễ Đan sâm
(Salvia miltiorrhiza) có tác dụng tốt trong điều trị bệnh tim mạch. Bởi vậy việc
phân lập hợp chất này trên quy mô lớn với độ tinh khiết cao là rất cần thiết. Nhóm
nghiên cứu của Lee Jae Hyoung đã tinh chế dịch chiết methanol của rễ Đan sâm
bằng cách lắc chiết phân bố với chloroform thu lấy pha nước. Sau đó điều chỉnh pH
của lớp nước này đến 3 bằng acid triflouroacetic và tiếp tục chiết phân bố với
EtOAc. Tinh chế qua cột Sephadex LH-20 và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao sử dụng cột octadecylsilane thu được kết quả 1,08 g ASB được phân lập, hiệu
suất 75%, với độ tinh khiết lớn hơn 99,2% [13].
1.1.6.3. Phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao(HSCCC)
Phương pháp được thực hiện nhờ lực ly tâm để giữ một chất lỏng trong hệ
thống làm pha tĩnh và chất lỏng còn lại được bơm vào hệ thống pha động. Thiết bị
HSCCC bao gồm 1 ống nhựa Teflon với 1 đầu ống được dung làm đầu vào còn đầu
kia là đầu ra của hệ thống. Ống này đã được cuộn hình nón thay vì kiểu xoắn ốc và
lò xo thông thường để phân lập và tinh chế tanshinon từ Đan sâm. Với hệ dung
môin-hexan : ethylacetat : methanol : nước (HEMW) theo tỷ lệ thể tích 5 : 5 : 7 : 3,
bốn tanshinon : cryptotanshinon, tanshinon I, 1,2-dihydrotanshiquinon và tanshinon
IIA, được phân lập từ 500mg đến 1g mẫu thô với độ tinh khiết cao. Phương pháp
này cững được sử dụng để phân lập và tinh chế acid salvianolic A (ASA) và acid
salvianolic B (ASB) từ Đan sâm. Hệ dung môi n-hexan : ethylacetat : methanol :
nước theo tỷ lệ thể tích 3 : 6 : 6 : 10 đã được sử dụng thu được 4,27 mg ASA và
32,09 mg ASB từ 260mg mẫu thô. Độ tinh khiết của ASA và ASB lần lượt là
96,67% và 97,43%.
1.1.6.4. Phương pháp sắc ký hấp phụ kết hợp phương pháp sắc ký ngược dòng tốc
độ cao (HSCCC)

6


Phát triển phương pháp tách và tinh chế tanshinon từ Salvia miltiorrhizabằng
cách kết hợp phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và sắc ký ngược
dòng tốc độ cao (HSCCC). Dịch chiết Đan sâm được phân tách qua cột sắc ký silica
gel thu được 2 phân đoạn F1 và F2. Hai phân đoạn này sau đó được tinh chế bằng
HSCCC với hệ dung môi hai pha bao gồm n-hexan :diethylether : methanol : nước
theo tỷ lệ 4: 3: 4: 2 và 8: 5: 8: 3 tương ứng với pha động và pha tĩnh, với tốc độ
dòng 2,0 mL/phút, thiết bị quay với tốc độ 850 vòng/phút và phát hiện chất rửa giải
ở bước sóng 254nm. Từ 80 mg F1 thu được ba chất với tanshinone I (14 mg),
dihydrotanshinone I (22 mg) và tanshinone II A (26 mg). Dihydrotanshinone (11
mg), trijuganone B (15 mg) và cryptotanshinone (30 mg) đã được phân lập từ 80mg
phân đoạn F2. Độ tinh khiết của 6 chất được xác định bởi HPLC đều hơn 96%. Việc
kết hợp sắc ký hấp phụ và HSCCC là một phương pháp hiệu quả để tách tanshinone
khỏi S. miltiorrhiza [24].
1.2. Tổng quan về nhựa macroporous
1.2.1. Định nghĩa & phân loại
Nhựa macroporous hay nhựa hấp phụ macroporous là một nhóm các hạt
polyme hình cầu, có cấu trúc xốp với các lỗ lớn trên bề mặt, có cấu trúc mạng và
diện tích tiếp xúc lớn, được ứng dụng chủ yếu để tách các nhóm chất khác nhau
[32].Một số ứng dụng nổi bật của nhựa macroporous có thể kể đến như: bất động
enzyme, nuôi cấy mô, sắc ký cột, kiểm soát giải phóng thuốc. Những ứng dụng trên
đều yêu cầu sự kiểm soát ở mức độ cao về cấu trúc không gian ba chiều và các đặc
tính của lỗ xốp [21].
Theo tính phân cực và độ phân cực nhựa macroporous được phân loại thành
4 nhóm: Không phân cực (D101, D1400, X5, H103), phân cực yếu (HP-20,
HPD826), phân cực trung bình (XDA-8), phân cực mạnh (DA201).
1.2.2. Bản chất hóa học
Hiện nay, nhựa macroporous không ion hóa thường được sản xuất bằng các

polymer hóa styrene divinyl benzen (DVB) hoặc dẫn chất của acid acrylic. Hình 1.4
biểu diễn một phần mạng lưới polymer polystyrene liên kết chéo. Quá trình tổng
hợp có sự hiện diện của “porogenin” như: toluene, n-heptan, isooctan, isobutanol.
Porogen có thể trộn lẫn với hỗn hợp monomer nhưng không hòa tan polymer.
7


Porogen, trong quá trình polymer hóa, đi vào khoảng trống trong hỗn hợp monome
và khi kết thúc quá trình polyme hóa, bay hơi để lại những lỗ hổng trong hạt nhựa
[21].

Hình 1.4: Một phần mạng lưới polymer liên kết chéo [25]
Hàm lượng DVB cao ( tới 20% (kl/kl)) khiến hạt nhựa macroporous nhiều
liên kết chéo hơn, do vậy có khả năng chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt
hơn như: áp suất thẩm thấu cao, các chất oxy hóa mạnh, nhưng đồng nghĩa với việc
làm giảm độ xốp hạt nhựa, giảm dung lượng hấp phụ [14].Ngoài ra, trong quá trình
tổng hợp polymer, các yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính lỗ xốp còn có: bản chất, nồng
độ chất pha loãng; bản chất của chất mồi và nhiệt độ của quá trình polymer hóa
[21].
1.2.3. Bản chất của quá trình làm giàu hợp chất bằng nhựa macroporous
Quá trình làm giàu hợp chất đích bằng nhựa macroporous thực chất là quá
trình chiết pha rắn (SPE). Nguyên tắc của SPE:
- Chất cần tách lúc đầu ở dạng lỏng (pha nước hay hữu cơ), còn chất hấp phụ ở dang
rắn (pha tĩnh) và là các hạt nhỏ, xốp, được nhồi vào một cột chiết. Chất hấp phụ có
thể là silicagel trung tính hoặc đã được alkyl hóa nhóm –OH, oxyd nhôm…
- Đầu tiên, dung dịch chất mẫu được dội lên cột chiết. Pha tĩnh lúc này sẽ tương tác
với các chất và giữ nhóm chất phân tích lại trên cột, còn các nhóm chất khác sẽ đi ra
khỏi cột với dung môi hòa tan mẫu. Sau đó dùng một dung môi thích hợp hòa tan
các chất phân tích để rửa giải chúng ra khỏi pha tĩnh (cột chiết), thu được dung dịch
có chất phân tích [5].

8


Đối với ứng dụng phân tách hợp chất thiên nhiên, hạt nhựa macroporous đóng
vai trò pha tĩnh: sau khi được hấp phụ hoạt chất từ dịch chiết , cột nhựa sẽ được rửa
giải với dung môi như nước, methanol, ethanol hay aceton ở các nồng độ khác nhau
để giải hấp phụ hoạt chất [32].
1.2.4. Các nghiên cứu tinh chế cao đan sâm bằng nhựa macroporous đã làm
Năm 2004, Wang ZP và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu khả năng hấp thụ
và làm giàu các hợp chất hiệu quả của danshensu và protocatechualdehyd từ chiết
xuất nước Danshen bằng nhựa macroporous D301. Nhựa macroporous D301 cũng
cho thấy được khả năng hấp phụ và làm giàu các hợp chất hiệu quả của danshensu
và protocatechualdehyd từ dich chiết nước của rễ Đan sâm [29]. Năm 2007, He
Wei, Li Yong và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu các điều kiện tối ưu để phân lập
và tinh chế acid salvianolic B từ Salvia miltiorrhiza. Kết quả của nghiên cứu cho
thấy nhựa macroporous XDA-5 có hiệu quả tốt trong việc tinh chế acid salvianolic
B và các điều kiện tối ưu đã được lựa chọn là nồng độ ASB trong dịch chiết là 18
mg/ml, pH là 4 và dung môi rửa giải là ethanol 70% với thể tích rửa giải là 3
BV. Bằng phương pháp này, hiệu quả rửa giải của axit Salvianolic B vượt quá 90%.
Acid salvianolic B thể hiện khả năng được làm giàu bằng việc sử dụng nhựa XDA-5
với hiệu quả giải hấp phụ hàm lượng ASB lớn hơn 90% [10].Năm 2008, Wang YY
và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu hấp thụ và phân lập năm axit salvianolic
(danshensu, acid rosmarinic, protocatechualdehyd, acid salvianolic B, acid
salvianolic A) từ Salvia mitiorrhiza bằng nhựa macroporous. Nghiên cứu cho kết
quả nhựa macroporous HP20 phù hợp để tinh chế các acid salvianolic B với dung
lượng hấp phụ của acid rosmarinic, acid salvianolic B và acid salvianolic A là
30.506 mg/g nhựa khô; 36,996 mg/g nhựa khô; 43,85 mg/g nhựa khô tương ứng.
Ngoài ra còn thu được thông tin là danshensu và protocatechualdehyd không phù
hợp làm chỉ số đánh giá quá trình làm giàu [28]. Năm 2009, trong nghiên cứu của
X. Wu và cộng sự đã sử dụng các nhựa trao đổi anion D495R, D392, D380 và các

nhựa hấp phụ macroporous không ion hóa X-5, AB-8, NKA-9, SP825 để tách và
tinh chế các thành phần thân nước trong Salvia miltiorrhiza. Nhựa SP825 hấp phụ
tốt nhất nên đã được áp dụng cho nghiên cứu này. Kết quả chỉ ra rằng rửa giải nhựa
macroporous SP825 có thể tách danshensu với độ tinh khiết cao (95,32%) và acid
9


salvianolic. Với các thông số tối ưu của quá trình hấp phụ và giải hấp phụ, hiệu suất
thu hồi của danshensu, acid lithospermic, acid rosmarinic, acid salvianolic A và acid
salvianolic B lần lượt là 36,92%; 80,39%; 82,45%; 43,07% và 41,03% [30]. Năm
2010, D Luo, W He, J Guo đã nghiên cứu các điều kiện tối ưu để tinh chế acid
salvianolic bằng nhựa macroporouscũng cho kết quả là nhựa hấp phụ macroporous
HPD-300 cho hiệu quả tinh chế làm giàu ASB tốt với khả năng hấp phụ là 172,4
mg/g, pH là 3,5 và giải hấp phụ bằng ethanol 70% với thể tích giải hấp phụ là 3 BV.
Hiệu suất của acid salvianolic B là 88,11% và độ tinh khiết là 72,80% [18]. Thông
qua các nghiên cứu trên thấy được nhựa macroporous có tiềm năng tinh chế, làm
giàu các hợp chất nhóm acid phenolic như danshensu, protocatechualdehyd, acid
lithospermic, acid rosmarinic, acid salvianolic A và acid salvianolic B.
Năm 2007, Cao L và cộng sự đã nghiên cứu tinh chế các tanshinon bằng
nhựa macroporous. Nhựa macropious X5 có hiệu quả hấp phụ tốt nhất khi làm giàu
các thành phần tanshinon trong rễ S. miltiorrhiza so với hai nhựa AB-8, XAD- 4. Sự
hấp phụ đạt đến trạng thái cân bằng sau 4h với việc sử dụng nhựa X -5. Dung lượng
hấp phụ của nhựa X - 5 trên tổng số tanshinon là nhựa 1,2 mg/g và tỷ lệ hấp phụ đạt
92,4% [16]. Năm 2009, XiCheng JIANG và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sự hấp
phụ tĩnh của tanshinone IIA sử dụng nhựa macroporous. Kết quả cho thấy nhựa
không phân cực HPD-100, cho thấy hiệu suất hấp phụ và giải hấp cao hơn đối với
tanshinon IIA so với các loại nhựa khác và tỷ lệ hấp phụ, tỷ lệ giải hấp và khả năng
hấp phụ của nó là 72,24%, 69,31% và 15mg/g nhựa khô tương ứng. Người ta đã kết
luận rằng nhựa HPD-100 là nhựa macropious lý tưởng cho sự hấp phụ của
tanshinone IIA [31]. Năm 2018, trong nghiên cứu “Đồng thời tinh chế

dihydrotanshinon, tanshinon I, cryptotanshinon và tanshinon IIA từ Salvia
miltiorrhiza và kiểm tra tác dụng chống viêm” của Gao H và cộng sự đã chiết xuất
Danshen (cồn 95%) được chia làm 3 phân đoạn với nồng độ cồn khác nhau (0%,
45% và 90%) và tinh chế bằng nhựa macroporous. Khả năng hấp phụ của
macroporous không chỉ liên quan đến tính phân cực hoặc cấu trúc hóa học của
chất hấp phụ, mà còn với các đặc tính của chất hấp phụ như diện tích bề mặt duy
nhất, đường kính lỗ rỗng, thể tích lỗ rỗng, và thậm chí với môi trường hấp
phụ. Đối với bốn tanshinon, nhựa không phân cực được áp dụng nhiều hơn để hấp
phụ của chúng. Trong nghiên cứu này, bảy nhựa macroporous đã được sử dụng để
10


xác định khả năng hấp phụ và giải hấp tĩnh. Theo các thí nghiệm, nhựa không
phân cực D101 và HPD100 cho thấy khả năng hấp phụ cao hơn các loại nhựa
khác, cho thấy độ phân cực tương tự với tanshinon và kích thước lỗ nhỏ hơn của
nhựa để hấp phụ là tối ưu. Bảy loại nhựa được xếp hạng như sau: D101 =
HPD100> HPD600> XDA-6> LX-11 LX-38> AB-8. Do đó, D101 và PHD100 đã
được chọn về mặt hấp phụ và giải hấp tĩnh để kiểm tra khả năng hấp phụ và giải
hấp động. Và nghiên cứu sử dụng nhựa macroporous D101 và thu được kết
quả hàm lượng tổng tanshinone của dung môi rửa giải ethanol 90% (TTS) là hơn
97% [9]. Như vậy từ kết quả các nghiên cứu này cho thấy nhựa macroporous có
tiềm năng tinh chế, làm giàu các tanshinon.
Cho đến hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu công bố về phương pháp tinh
chế và làm giàu hoạt chất từ rễ Đan sâm nhưng đa phần chỉ là phân lập một chất
hay tinh chế các hợp chất acid phenolic hoặc các tanshinon, chưa có nghiên cứu
nào làm giàu đồng thời hoạt chất trong cao rễ Đan sâm.Vì thế, khóa luận này
hướng tới làm giàu đồng thời các hoạt chất trong cao rễ Đan sâm. Nhận thấy
phương pháp hấp phụ sử dụng nhựa macroporous đã và ngày càng được ưa
chuộng hơn cả do nhiều ưu điểm của nó như: dung lượng hấp phụ lớn, giá rẻ, sử
dụng dung môi xanh, có thể tái sử dụng và hoàn toàn có thể áp dụng trong sản

xuất công nghiệp ở Việt Nam.Từ những ưu điểm trên của nhựa macroporous
được lựa chọn để làm giàu hoạt chất trong khóa luận này.Thêm vào đó, nguồn
dược liệu Đan sâm ở Việt Nam hiện nay khá dồi dào và có thể cung cấp thường
xuyên cho sản xuất. Do đó để phát huy được hết các tác dụng sinh học tốt của
loại dược liệu này thì việc nghiên cứu xây dựng một quy trình chiết xuất, làm
giàu hoạt chất bằng phương pháp hiệu quả, thích hợp cho sản xuất công nghiệp là
rất cần thiết.

11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
- Rễ Đan sâm được mua của Công ty cổ phần Nông dược Sapa.
- Hạt nhựa macroporous D101, HPD826, H103 được cung cấp bởi công ty Anhui
sanxing resin technology Co Ltd, Trung Quốc.

Hình 2.1: Nguyên liệu Đan sâm

Hình 2.2: Hạt nhựa

Hình 2.3: Hạt nhựa

Hình 2.4: Hạt nhựa

macroporous D101

macroporous HPD826

macroporous H103

12


2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
2.1.2.1. Hóa chất
Bảng 2.1: Danh sách hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất
1

Chất chuẩn acid salvianolic
B

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Trung Quốc

Độ tinh khiết 98%

Trung Quốc

Độ tinh khiết 99%

Việt Nam

TKHH

2

Chất chuẩn tanshinon IIA

3

Ethanol 96%

4

Methanol

Trung Quốc

TKHH

5

Toluen

Trung Quốc

TKHH

6

Diclomethan

Trung Quốc

TKHH

7

Ethylacetat

Trung Quốc

TKHH

8

Acid formic

Trung Quốc

TKHH

9

Acid acetic

Trung Quốc

TKHH

10

Natri hydroxyd

Trung Quốc

TKHH

11

Hydro Chlorua

Trung Quốc

TKHH

2.1.2.2. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG: Bộ phận chấm mẫu
bán tự động Linomat, bộ phận khai triển sắc ký ADC2, bộ phận phát hiện và xử lý
kết quả (videoscan: buồng chụp ảnh sắc ký TLC VISUALIZED, phần mềm xử lý
kết quả VideoScan: desninometer: máy quét vết TLC Scanner 4).
- Máy cất quay Buchi scientific, Daihan scientific (Hàn Quốc).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thụy Sỹ)
- Cân phân tích Wisd (Thụy Sỹ)
- Tủ sấy Memmert (Đức)
- Tủ hốt, Máy lắc, Bể điều nhiệt
- Hệ thống lọc hút chân không Buchner
- Máy siêu âm Daihan scientific (Hàn Quốc)
- Máy soi UV
2.1.2.3. Dụng cụ
13


- Cột thủy tinh (đường kính 1cm; 4cm)

- Pipet paster: pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL
- Ống đong: 100mL, 250mL, 1000mL, 2000mL
- Bình cầu: 100mL, 250mL, 1000mL, 2000mL
- Phễu thủy tinh, cốc thủy tinh, giấy lọc
- Bình định mức: 10mL, 25mL, 100mL
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1.Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm giàu hoạt chất của
dịch chiết rễ Đan sâm bằng nhựa macroporous
- Khảo sát quá trình chiết xuất với các yếu tố: KTPT dược liệu, dung môi chiết xuất,
số lần chiết xuất.
- Khảo sát lựa chọn nhựa macroporous từ 3 loại nhựa D101, HPD826, H103.
- Khảo sát tỷ lệ khối lượng nhựa hấp phụ và thể tích dịch chiết.
- Khảo sát quá trình giải hấp phụ :nồng độ và thể tích dung môi rửa giải.
2.2.2. Xây dựng quy trình làm giàu hoạt chất cao rễ đan sâm sử dụng nhựa
macroporous với quy mô phòng thí nghiệm và định lượng bằng TLC scanning.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định tính hoạt chất của Đan sâm
+ Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử là dịch chiết dược liệu.
+ Chuẩn bị mẫu chuẩn: Hòa tan acid salvianolic B và tanshinon IIA trong methanol
thu được lần lượt dung dịch ASB nồng độ 0,515 mg/mL và dung dịch tanshinon IIA
nồng độ 0,511mg/mL.
+ Điều kiện dung môi sắc ký:
Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 GF254
Pha động:
Toluen : Diclomethan : Ethylacetat : Methanol : Acid formic = 4 : 6 : 8 : 1 : 4.
+ Phát hiện vết: UV 254nm [36].
2.3.2. Phương pháp định lượng ASB và tanshinon IIA bằng HPTLC
- Chuẩn bị mẫu chuẩn ASB và tanshinon IIA:
14

+ Cân 5,15mg acid salvianolic B hòa tan bằng methanol rồi thêm MeOH cho đủ
10mL trong bình định mức thu được dung dịch chuẩn ASB có nồng độ 0,515
mg/mL.
+ Cân 5,11mg tanshinon IIA hòa tan bằng MeOH rồi them MeOH cho đủ 10mL
trong bình định mức thu được dung dịch chuẩn tanshinon IIA có nồng độ 0,511
mg/mL.
- Chuẩn bị mẫu thử: Dịch chiết dược liệu.
- Điều kiện dung môi sắc ký:
+ Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 GF254
+ Pha động: hệ dung môi thích hợp theo từng chất.
- Tiêm mẫu thử và mẫu chuẩn lên trên bản mỏng. Sau khi khai triển, bản mỏng
được làm khô trong không khí điều kiện phòng, sau đó phát hiện vết trên bản mỏng
ở bước sóng 254nm. Sau đó Scanner đo quang và thu được các diện tích pic.
+ Tính toán kết quả: Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và
nồng độ chất chuẩn. Xác định nồng độ tương ứng trong mẫu thử tính theo phương
trình hồi quy.
Phương trình đường chuẩn: y = Ax + B. Hệ số tương quan R2
Trong đó y : Diện tích pic,x: Nồng độ chất(mg/mL)
+ Nồng độ chất đó trong mẫu thử được tính theo công thức: C =

S-B
(1)
A

C*V

+ Hàm lượng chất đó trong mẫu thử : m *100% (2)
Trong đó:
+ m là khối lượng dược liệu hoặc khối lượng cao (g)

+ C là nồng độ chất đó trong dược liệu, dịch chiết hoặc trong cao (mg/mL)
+ V là thể tích dịch chiết hoặc thể tích pha loãng (mL)
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định các chỉ tiêu: độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng
tuyến tính, độ lặp lại đối với phương pháp định lượng acid salvianolic B, tanshinon
IIA bằng TLC-scanning.
+ Độ đặc hiệu: Triển khai sắc ký 4 mẫu sau với hệ dung môi pha động thích hợp:
mẫu trắng (dung dịch methanol), mẫu chuẩn acid salvianolic B có nồng độ
15