Nghiên cứu đặc điểm thực vật và khảo sát hàm lượng nystose của Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NYSTOSE
CỦA BA KÍCH TẠI TÂY GIANG,
QUẢNG NAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ NGỌC ANH
MÃ SINH VIÊN: 1401016

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NYSTOSE
CỦA BA KÍCH TẠI TÂY GIANG,
QUẢNG NAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. DS. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực Vật

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân đối
với Ban giám hiệu cùng các thầy cô bộ môn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội đã
quan tâm và chỉ bảo tận tình em trong quá trình thực hiện đề tài.
Đặc biệt với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân
thành đến TS. Hoàng Quỳnh Hoa và DS. Phạm Thị Linh Giang, người đã dìu dắt,
động viên, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận này.
Em xin cảm ơn các chị kỹ thuật viên và các bạn sinh viên khóa 69 cùng nghiên
cứu tại bộ môn đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình
nghiên cứu và thực nghiệm.
Con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ, khích lệ, tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho con trong suốt 5 năm học và trong thời gian thực hiện khóa luận này.
Sau cùng, em xin kính chúc các thầy, các cô trong bộ môn Thực Vật thật dồi
dào sức khỏe, công tác tốt.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Đinh Thị Ngọc Anh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về loài Ba kích Morinda officinalis How. .......................................... 2

1.1.1. Đa dạng sinh học ........................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ......................................................................................... 2
1.1.3. Thành phần hóa học của rễ Ba kích .............................................................. 2
1.1.4. Tác dụng sinh học ......................................................................................... 3
1.1.5. Công dụng theo Y học cổ truyền .................................................................. 4
1.1.6. Tổng quan về nystose.................................................................................... 5
1.1.6.1. Công thức phân tử ................................................................................. 5
1.1.6.2. Tính chất của nystose ............................................................................ 5
1.1.6.3. Tác dụng sinh học .................................................................................. 5
1.1.6.4. Một số phương pháp xác định hàm lượng nystose trong rễ Ba kích ..... 6
1.2. Một số nghiên cứu về cây Ba kích tại Việt Nam ................................................. 6
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 9
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................................... 9
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................ 9
2.1.2. Dung môi, hóa chất ....................................................................................... 9
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ................................................................... 10
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 10
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật .................................................................... 10
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học.................................................................. 11
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 11
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái ................................................................... 11
2.3.2. Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu...................................................................... 11
2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm bột rễ ........................................................................ 11
2.3.4. Giám định tên khoa học .............................................................................. 11
2.3.5. Xây dựng và thẩm định phương pháp bán định lượng nystose trong rễ Ba
kích bằng HPTLC ................................................................................................. 12
2.3.5.1. Xây dựng phương pháp bán định lượng .............................................. 12
2.3.5.2. Thẩm định phương pháp bán định lượng ............................................ 13

2.3.5.3. Bán định lượng hàm lượng nystose trong các mẫu rễ Ba kích ............ 15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN.................................. 17
3.1. Kết quả thực nghiệm .......................................................................................... 17
3.1.1. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 17
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái mẫu BK2 .............................................................. 18
3.1.1.2. Đặc điểm hình thái mẫu BK4 .............................................................. 19
3.1.1.3. Đặc điểm hình thái mẫu BK6 .............................................................. 20
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu ........................................................................................ 21
3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu lá ............................................................................. 21
3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu thân ......................................................................... 22
3.1.2.3. Đặc điểm vi phẫu rễ ............................................................................. 24
3.1.3. Đặc điểm bột rễ ........................................................................................... 26
3.1.4. Giám định tên khoa học .............................................................................. 28
3.1.5. Bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC ............................. 28
3.1.5.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng
HPTLC .............................................................................................................. 28
3.1.5.2. Thẩm định phương pháp bán định lượng Nystose trong rễ Ba kích
bằng HPTLC ..................................................................................................... 29
3.1.5.3. Bán định lượng nystose trong các mẫu rễ Ba kích .............................. 33
3.3. Bàn luận .............................................................................................................. 34
3.3.1. Hình thái thực vật........................................................................................ 34
3.3.2. Bán định lượng và thẩm định phương pháp................................................ 40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU
AOAC

Association of Official Analytical Chemists – Hiệp hội các nhà
hóa phân tích chính thống

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

ELSD

Evaporative Light Scattering Detector- Detector tán xạ bay hơi

FOS
HPLC

Fructose Oligosaccharide
High Performance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

HPTLC

High Performance Thin Layer Chromatography- Sắc
ký lớp mỏng hiệu năng cao

ITS
RADP

Internal Transcribed Spacer- Vùng phiên mã bên trong
Random Amplified Polymorphic DNA- Đa hình phân đoạn ADN
nhân bản ngẫu nhiên

rDNA
Rf

Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid
Retention factor- Hệ số lưu giữ

RSD

Relative Standard Deviation- Độ lệch chuẩn tương đối

TLC

Thin Layer Chromatography- Sắc ký lớp mỏng

UV- VIS

Bức xạ tử ngoại- khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Ký hiệu của các mẫu Ba kích ..........................................................................9
Bảng 3.1. Một số đặc điểm khác biệt của vi phẫu lá các mẫu Ba kích .........................22
Bảng 3.2. Một số đặc điểm khác biệt của vi phẫu thân các mẫu Ba kích .....................24
Bảng 3.3. Kết quả tỷ lệ

Spic

m cân

của các dung môi chiết ................................................29

Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ tuyến tính ...................................................................31
Bảng 3.5. Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống .....................................................32
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại ............................................................................33
Bảng 3.7. Kết quả bán định lượng hàm lượng Nystose trong các mẫu nghiên cứu ......34


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của nystose ........................................................................5
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái mẫu BK2 ........................................................................18
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái mẫu BK4 ........................................................................19
Hình 3.3. Đặc điểm hình thái mẫu BK6 ........................................................................20
Hình 3.4. Đặc điểm vi phẫu lá BK4 ..............................................................................21
Hình 3.5. Đặc điểm vi phẫu thân BK6 ..........................................................................23
Hình 3.6. Đặc điểm vi phẫu rễ BK4 ..............................................................................25
Hình 3.7. Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK2................................................26
Hình 3.8. Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK4................................................27
Hình 3.9. Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK6................................................27
Hình 3.10. Hình ảnh bản mỏng của các hệ dung môi triển khai trên TLC sau khi phun
thuốc thử ........................................................................................................................28
Hình 3.11. Kết quả chồng pic của 3 mẫu: chuẩn, thử, trắng .........................................31
Hình 3.12. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và lượng chất của
nystose ...........................................................................................................................32
Hình 3.13. Đặc điểm hình thái rễ của các mẫu Ba kích ................................................35
Hình 3.14 . Đặc điểm hình thái thân của các mẫu Ba kích ...........................................36
Hình 3.15. Đặc điểm hình thái lá kèm của các mẫu Ba kích.........................................36
Hình 3.16. Đặc điểm hình thái lá của các mẫu Ba kích ................................................37

Hình 3.17. Đặc điểm hình thái cụm hoa của các mẫu Ba kích ......................................38
Hình 3.18. Đặc điểm hình thái tràng hoa của các mẫu Ba kích ....................................38
Hình 3.19. Đặc điểm hình thái bộ nhụy của các mẫu Ba kích ......................................38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ba kích là một trong những cây thuốc quý được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu
đời và được biết đến là có nhiều công dụng như bổ thận dương, mạnh gân cốt, trừ
phong thấp, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể [19]. Ngày nay, nhu cầu sử dụng Ba
kích trong đời sống hàng ngày cũng như trong các chế phẩm thuốc và thực phẩm
chức năng từ dược liệu ngày một tăng với mức trên 205 tấn/ năm [16]. Cũng chính vì
nhu cầu sử dụng tăng vọt đã giúp cho Ba kích giờ đây không chỉ là vị thuốc dân gian,
sử dụng nhỏ lẻ mà vươn lên thành cây chủ lực, là nguồn nguyên liệu, dược liệu quý
để sản xuất dược phẩm, phát triển nền kinh tế địa phương. Theo dải phân bố tự
nhiên, cây Ba kích mọc hoang trong rừng thưa hoặc rừng thứ sinh, hay gặp ở các tỉnh
miền núi phía Bắc như Quảng Ninh, Lạng Sơn, Yên Bái, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hà
Tây, Thanh Hóa. Thời gian gần đây, một số giống ba kích đã được phát hiện và trồng
trọt ở một số tỉnh miền Trung và miền Nam Việt Nam như Quảng Trị, Quảng Nam
và Phú Yên.
Tại huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam cây Ba kích bản địa sinh trưởng và
phát triển tốt ở vành đai ôn đới ở độ cao trên 700m, khác biệt so với Ba kích ở các
vùng miền núi phía Bắc mọc ở độ cao gần so với mực nước biển (< 500m). Đồng
thời, qua khảo sát ban đầu nhận thấy các giống Ba kích tại Tây Giang tương đối đa
dạng và có một số đặc điểm khác với cây Ba kích tại miền Bắc. Mặt khác, tại địa
phương, cây Ba kích từ rừng đã được người dân Cơ Tu nhân giống và trồng trọt, đem
lại giá trị kinh tế cao và được chính quyền địa phương chú trọng phát triển các sản
phẩm từ cây Ba kích trong khuôn khổ dự án OCOP (Mỗi làng xã một sản phẩm).
Nhằm bước đầu nghiên cứu về đa dạng và chất lượng của cây Ba kích tại Tây Giang,
Quảng Nam, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và khảo sát hàm lượng
nystose của Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam” đã được tiến hành với những

mục tiêu sau:
- Mô tả đặc điểm hình thái, vi học và giám định tên khoa học của một số mẫu
Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam.
- Xây dựng phương pháp bán định lượng và xác định hàm lượng nystose trong
rễ mẫu Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về loài Ba kích Morinda officinalis How.
1.1.1. Đa dạng sinh học
Ba kích mọc hoang trong rừng thứ sinh, trung du và miền núi. Cây cũng được
trồng nhiều nơi, trồng bằng những đoạn rễ trên đất nhiều màu, ẩm, mát, được che
bóng có giá tựa cho cây leo. Ba kích thường phân bố ở một số tỉnh trung du và vùng
núi thấp phía bắc như Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Phú Thọ, Bắc Kạn, Lạng
Sơn, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Yên Bái, Hòa Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh. Còn có
cả ở Trung Quốc [7], [8], [19].
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Morinda officinalis How., họ Cà phê: Rubiaceae.
Tên thường gọi: Ba kích.
Một số tên gọi khác: Ba kích thiên, Dây ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh),
Thau tày cáy (Tày), Chồi hoàng kim, Sáy cáy (Thái), Chày kiang dòi (Dao), Ba kích
nhục, Liên châu ba kích, Medicinal indian Mulberry (Anh) [17], [19].
Cây thảo sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét, sống lâu năm. Rễ
hình trụ, mập, vặn vẹo, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi. Thân non
có cạnh, màu tím, có lông, sau nhẵn bóng. Lá mọc đối, phiến lá hình mác hoặc bầu
dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14 cm, rộng 2.5- 6 cm, cuống ngắn , khi non có
lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân và mép lá, sau già ít lông hơn,
gân phụ 8-9 cặp. Lá kèm bé, mỏng, ôm sát vào thân. Hoa tập trung ở đầu cành thành

tán nhỏ, hoa lúc non có màu trắng sau hơi vàng, dài 0,3- 1,5 cm. Đài hình chén hay
hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều. Tràng hàn liền ở phía dưới
thành ống ngắn. Nhị 4, bầu hạ. Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi
chín màu đỏ, mang đài tồn tại ở đỉnh [2], [3], [6], [13], [19].
1.1.3. Thành phần hóa học của rễ Ba kích
Thành phần hóa học của rễ Ba kích được biết gồm có :
Các dẫn chất anthranoid: nhiều anthraquinon đã được phân lập từ Ba kích
như:

1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxy-anthraquinon,

methoxyanthraquinon,

methylisoalizarin,

1,6-dihydroxy-2-

methyliso-alizarin-1-methyl

ether,

physcion,, 1-hydroxyanthraquinon, 2-methylanthraquinon, rubiadin, rubiadin-12


methyl ethe, 2-hydroxy-3- hydroxymethyl- anthraquinone, 1-hydroxy-2- methylanthraquinone,

2-hydroxy-3-hydroxymethyl-anthraquinone,

tectoquinone,

2-

hydroxy-1-hydroxymethyl-anthraquinone, 1,3-dihydroxy-2- methoxy-anthraquinone,
1-hydroxy-2,3-dimethyl-anthraquinone, 1- hydroxy-3-methoxy-anthraquinone, 1,8dihydroxy-3-methoxy-6-methyl-anthraquinone,

3-hydroxy-1,

2-dimethoxy-

anthraquinone, 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone-monohydrate, 1,2- dihydroxy3-methyl-anthraquinone,

1,3,8-trihydroxy

−2-methoxy-anthraquinone,

2-

hydroxymethyl-3-hydroxy-anthraquinone, 2-methoxyanthraquinone, 1,2-dimethoxyanthraquinone,

alizarin-2-methyl

ether,

digiferruginol,

lucidinѡ-ethyl

ether,

anthraquinone-2-carboxylic acid, 1,2-dimethoxy-3- hydroxy-anthraquinone, 2hydroxy-1-methoxyanthraquinone.

Các iridoid glycosid bao gồm: asperulosid tetraacetat, monotropein,
morindolid và morofficinalosid, acid deacetyl asperulosidie, acid asperulosidic,
asperuloside…
Steroid tự do có sitosterol, 24- ethylcholesterol.
Các saccharide như là mannose, nystose, 1F-fructofuranosyl nystose, sucrose,
oligosaccharide kiểu inulin như hexasaccharid và heptasaccharid…
Ngoài ra còn có các thành phần khác như: coumarin (scopoletin), sterol (1 số
phytosterol: sigmasterol, daucosterol, β- sitosterol…), các acid hữu cơ (acid fumaric,
acid succinic…).
Lacton: (4R, 5S) 5- hydroxy hexan- 4- olid.
Acid hữu cơ: acid fumaric, acid succinic.
Các chất vô sơ gồm K, Na, Mg, Al, Fe, P, Na, Ba, Zn, Cu, Sr, Pb, Ti, Sn,...
Rễ tươi còn có vitamin C [4], [19], [42].
1.1.4. Tác dụng sinh học
Cao chiết Ba kích có nhiều tác dụng khác nhau, trong đó có tác dụng hướng
sinh dục nam là tác dục được quan tâm nhất. Dịch chiết rễ có tác dụng làm tăng nồng
độ testosterone, tăng hormone vùng dưới đồi, tuyến yên, tăng cường khả năng tình
dục và có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tinh trùng. Đây là một trong những cơ chế
chữa vô sinh và yếu sinh lý ở nam giới [30], [36], [44].

3


Tác dụng tăng lực: bằng phương pháp chuột bơi thực hiện trên chuột nhắt
trắng, Ba kích với liều 5- 10g/kg dùng liên tiếp 7 ngày trước lúc thí nghiệm có tác
dụng kéo dài thời gian chuột bơi [19].
Ngoài ra, Ba kích còn được chứng minh là có một số tác dụng khác: Phân
đoạn chiết nước của dịch chiết cồn Ba kích có tác dụng hạ đường huyết và giảm
stress oxy hóa trên chuột cống đái tháo đường giúp ngăn ngừa các biến chứng của
đái tháo đường [37].

Các hợp chất trong Ba kích có tác dụng bảo vệ xương, chống mất xương và có
tính chống oxy hóa do tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa của cơ thể, làm
giảm lượng MDA (Malodialdehyd) trong chuột cống thử nghiệm [22], [29], [31],
[39], [40].
Thành phần monotropein có tác dụng chống viêm [19], [25], [35].
Thành phần oligosaccharides từ Ba kích có tác dụng chống trầm cảm, làm
giảm đáng kể các biểu hiện của hành vi trầm cảm gây ra bởi mô hình stress trường
diễn không thể dự đoán (CUS- chronic unpredictable stress) trên thử nghiệm lựa
chọn Sucrose và thử nghiệm bơi cưỡng bức. Các oligosaccharid này cũng cải thiện
sự bất thường của con đường BDNF-GSK3β-β-catenin và sự suy giảm của các
protein synaptic gây bởi CUS ở vùng trung tâm vỏ não trước. Sự hoạt hóa của
GSK3β của LY294002 làm mất tác dụng chống trầm cảm của các oligosaccharid từ
ba kích trên thử nghiệm chuột bơi cưỡng bức. Chuột bình thường khi được điều trị
bằng các oligosaccharid này cũng làm tăng tính chịu đựng đối với CUS, đồng thời
làm tăng mức độ biểu hiện của BDNF, p-Ser9 GSK3β và β-catenin ở vùng trung tâm
vỏ não trước [41], [45].
1.1.5. Công dụng theo Y học cổ truyền
Theo Y học cổ truyền, Ba kích được coi là một vị thuốc bổ đã được nhân dân
ta dùng và ưa chuộng từ lâu.
Tính vị: vị cay, ngọt, tính ấm.
Quy kinh: vào kinh thận.
Công năng chủ trị: Bổ thận dương, mạnh gân cốt, chữa di tinh, liệt dương,
xuất tinh sớm, phụ nữ đau bụng dưới, không có con, người già đau lưng, gối mỏi.
Bổ tỳ vị, ích tinh tủy, điều huyết mạch.
4


Trị cao huyết áp của phụ nữ [5].
1.1.6. Tổng quan về nystose
Nhóm saccharide là một trong những thành phần quan trọng trong rễ cây Ba

kích. Rất nhiều các oligosaccharide đã được phân lập bao gồm bajijiasu, mannose,
nystose, 1F-fructofuranosyl nystose, inulintype hexasaccharide và heptasaccharide,
sucrose, inulin-type trisaecharide, inulotriose, inulotetraose, inulopentaose [42].
1.1.6.1. Công thức phân tử
Công thức phân tử của nystose C24H42O21 [48].

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của nystose

1.1.6.2. Tính chất của nystose
- Trọng lượng phân tử: 666,579 g/mol.
- Độ tan: 745 g/L.
- Nhiệt độ nóng chảy: 134 °C [48].
1.1.6.3. Tác dụng sinh học
Từ các nghiên cứu, thử nghiệm trên người và chuột cho thấy nhóm FOS (bao
gồm chủ yếu là 1-kestose, nystose và fructofuranosyl nystose) có tác dụng kích thích
sự phát triển của các vi sinh vật có lợi như bifidobacteria và giảm số lượng vi khuẩn
gây hại, đặc biệt là Clostridia perfringens. FOS còn có thể cải thiện sự hấp thu và lưu
giữ khoáng chất, chủ yếu là calci, magnesi ở ruột. FOS giúp tăng cường miễn dịch hệ
tiêu hóa, giảm khả năng viêm ruột và ung thư ruột kết nhờ cải thiện cấu trúc niêm
mạc, làm dày lớp chất nhầy bảo vệ, phát triển hệ bạch huyết và các nang Peyer [32],
[34].
5


Hơn nữa, các nghiên cứu đã chứng minh rằng FOS làm giảm tổng hợp
cholesterol, triglycerid máu, cholesterol toàn phần và LDL cholesterol nhờ cơ chế
giảm tổng hợp chất béo ở gan bằng cách giảm sự biểu hiện của các gen mã hóa cho
các enzyme lipogen. Điều này rất có lợi cho bệnh nhân mắc bệnh tim mạch [32],
[34].
Theo các nghiên cứu, oligosaccharide trong rễ Morinda officinalis How. cho

thấy có tác dụng bảo vệ DNA của tinh trùng người khỏi bị phá hủy bởi H2O2, góp
phần trong điều trị vô sinh [23]. Oligosaccharide còn được chứng minh có thể cải
thiện khả năng ghi nhớ trên chuột - được gây mất trí nhớ bằng beta-amyloid [24],
chống trầm cảm [41], [45], bảo vệ xương, chống mất xương [25], [27].
Hiện nay nystose đang được dùng làm chất chuẩn định lượng nhằm xác định
tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu Ba kích và các chế phẩm từ Ba kích trong
chuyên luận Dược điển của một số quốc gia và vùng lãnh thổ như Trung Quốc, Hồng
Kông [9].
1.1.6.4. Một số phương pháp xác định hàm lượng nystose trong rễ Ba kích
Nystose trong cây Ba kích có thể được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác
nhau như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12]; sắc ký lỏng siêu hiệu năng
(UPLC) [27], [46]; sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [11], [33]. Tuy kết quả
có độ chính xác thấp và có nhiều yếu tố tác động hơn, nhưng bán định lượng bằng
HPTLC cũng có nhiều ưu điểm so với HPLC như: cách tiến hành khá đơn giản, thực
hiện được trên số lượng mẫu lớn, chuẩn bị mẫu đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi
phí cho hóa chất và vật tư tiêu hao, độ nhạy cao, có tính kinh tế, có thể phân tích
đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích, phù hợp với
cả nghiên cứu định tính và định lượng [1].
1.2. Một số nghiên cứu về cây Ba kích tại Việt Nam
Một số nghiên cứu về Ba kích đã được thực hiện ở Việt Nam và trên thế giới:
Trên thế giới, có rất nhiều các nghiên cứu về tác dụng dược lý, sinh học, phân
lập các chất, giải trình tự gen đã được thực hiện trên cây Ba kích. Tuy nhiên vẫn chỉ
tập trung chủ yếu ở cây Ba kích ở Trung Quốc, Hàn Quốc [25], [26], [28], [43], [47].

6


Tại Việt Nam, các nghiên cứu về cây Ba kích được nhiều tác giá tiến hành với
các nội dung chính liên quan đến đa dạng hình thái, di truyền, phân lập và xây dựng
phương pháp định lượng một số hoạt chất quan trọng.

Năm 2015, Mai Thị Phượng đã tiến hành nghiên cứu cây Ba kích tím ở Ba
Chẽ, Quảng Ninh. Đề tài tiến hành mô tả đặc điểm hình thái các mẫu Ba kích tím tại
Ba Chẽ, Quảng Ninh với các đặc điểm về dạng sống; thân ( non, già; màu sắc; lông);
lá, lá kèm ( cách mọc; hình dạng; thể chất; lông); hoa ( màu sắc; đài; tràng; nhị;
nhụy); quả; rễ ( hình dạng, màu sắc). Đồng thời tiến hành mô tả đặc điểm vi học .
Đối chiếu các đặc điểm với khóa phân loại thực vật, xác định mẫu phân tích là
Morinda officinalis F.C.How.
Đề tài đã tiến hành định tính dịch chiết methanol toàn phần bằng phương pháp
sắc ký lớp mỏng, kết quả sắc ký đồ thu được cho thấy hệ dung môi pha động:
Toluen: Ethylacetat: Acid acetic (4:1:0,05) có hiệu lực tách tốt nhất.
Năm 2016, Thạc sĩ Ngô Thị Thu Hiền đã tiến hành phân tích đa dạng hình
thái và đoạn trình tự ITS của 11 mẫu cây thuộc loài Morinda officinalis How tại nhiều
địa phương khác nhau thuộc miền Bắc Việt Nam bao gồm Đông Bắc ( Bắc Cạn, Thái
Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh); Tây Bắc (Lào Cai) được thu thập ngẫu nghiên từ
tháng 1/2014 - 4/2014. Kết quả phân loại các mẫu Morinda officinalis How bằng
phép phân loại đa biến TWINSPAN cho thấy 11 mẫu nghiên cứu được phân loại chủ
yếu dựa vào đặc điểm bề mặt dưới phiến lá, các mẫu được phân vào 2 nhóm chính:
nhóm 1 gồm các mẫu có lông, nhóm 2 gồm các mẫu không có lông. Đặc điểm có
lông hay không thường bảo thủ trong một giống trên tất cả các bộ phận của thân, lá,
lá kèm và hoa. Đồng thời với việc xác định đa dạng về mặt hình thái, nghiên cứu
cũng đã tiến hành định tính nystose trong rễ Ba kích bằng phương pháp sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao với dịch chiết methanol toàn phần và hệ pha động Ethylacetat :
Nước : Acid formic : Acid Acetic (6,5:2,5:2:2). Sắc ký đồ của các mẫu phân tích cho
các vạch sắc ký tương đồng nhau khi quan sát ở cả hai bước sóng 366nm và ở điều
kiện ánh sáng trắng tuy nhiên độ đậm nhạt của các vạch sắc ký trong từng mẫu là
khác nhau giữa các mẫu khác nhau. Tất cả các sắc ký đồ của 11 mẫu đều xuất hiện
vết sắc ký tương ứng với vết chuẩn nystose [11].
Năm 2017, Nguyễn Thị Hiền và cộng sự đã tiến hành đánh giá sinh trưởng
7

cây Ba kích nuôi cấy in vitro trồng thử nghiệm tại Trà Lĩnh (Cao Bằng) và Sông
Hinh (Phú Yên) trong 4 năm. Kết quả trồng thử nghiệm giống ba kích nuôi cấy in
vitro cho thấy: sau 4 năm trồng tỷ lệ cây sống khá cao, ở cả 2 địa điểm cây đều sinh
trưởng nhanh và phát triển ổn định theo thời gian, các chỉ số sinh trưởng, phát triển
tương đương với cây giống Ba kích gieo hạt. Song song với đó, nghiên cứu cũng tiến
hành định lượng nystose trong cây Ba kích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết
hợp đo mật độ hấp thụ quang (TLC-scanner) với dịch chiết methanol 70%, sử dụng
hệ dung môi Ethyl acetat: Nước: Acid formic: Acid acetic (6:3:2:2). Kết quả phân
tích cho thấy các mẫu rễ củ Ba kích đều có hàm lượng nystose khá cao, đều đạt trên
3,0%. Trong đó, mẫu rễ củ ba kích trồng tại Phú Yên có hàm lượng nystose trung
bình đạt cao nhất 5,90%, mẫu trồng tại Cao Bằng hàm lượng nystose trung bình thấp
hơn ở mức 4,69%. So sánh với tiêu chuẩn trong Dược điển Trung Quốc (hàm lượng
nystose không được thấp hơn 2,0%, theo phương pháp HPLC-ELSD), có thể thấy ba
kích giống in vitro trồng tại Cao Bằng và Phú Yên đều đạt về hàm lượng nystose so
với quy định trong Dược điển Trung Quốc [12].
Năm 2018, Lê Hoàng Khẩn đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng di truyền
cây Ba kích tại Quảng Nam và Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử RAPD. Đồng thời xác
định tính đa dạng về mặt hình thái. Kết quả cho thấy các mẫu cây Ba kích được thu
thập tại Quảng Nam và Đà Nẵng được phân loại dựa trên 4 đặc điểm hình thái chính
( màu sắc lá non – tím hay xanh; hình dạng lá – tròn hay thuôn nhọn; bề mặt dưới
của lá già – nhiều lông hay trơn nhẵn). So sánh giữa kết quả về mặt di truyền và hình
thái nhận thấy có sự khác biệt: các mẫu mặc dù có cùng kiểu hình thái nhưng lại
khác xa nhau về khoảng cách di truyền [15].
Như vậy, việc nghiên cứu đa dạng hình thái và di truyền của các mẫu Ba kích
thuộc loài Morinda officinalis How đã cho thấy loài có sự đa dạng nhất định về hình
thái cũng như di truyền trong một khu vực và giữa các khu vực khác nhau. Sự đa
dạng về hình thái và kiểu gen dẫn đến sự khác biệt về chất lượng giống thể hiện qua
hàm lượng các hoạt chất chính. Do đó, khi nghiên cứu lựa chọn giống để phát triển
loài này ở một địa phương nào đó, việc nghiên cứu đa dạng và lựa chọn được giống

phù hợp thổ nhưỡng cho năng suất, chất lượng cao là rất cần thiết.

8


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
Mẫu Ba kích được thu thập từ các quần thể mọc tự nhiên từ vùng Tây GiangQuảng Nam và trồng cố định tại vườn trồng Ba kích của anh Phạm Bá Hiển, xã
Lăng, Tây Giang, Quảng Nam. Thời gian thu mẫu trong giai đoạn từ ngày
06/04/2019- 12/04/2019. Có 3 mẫu được thu thập, được ký hiệu lần lượt là BK2,
BK4, BK6.
Bảng 2.1. Ký hiệu của các mẫu Ba kích
STT

Ký hiệu mẫu

Địa điểm thu mẫu

Số hiệu tiêu bản

1

BK2

xã Lăng, huyện Tây Giang,

HNIP/18566/19

tỉnh Quảng Nam

2

BK4

xã Lăng, huyện Tây Giang,

HNIP/18567/19

tỉnh Quảng Nam
3

BK6

xã Lăng, huyện Tây Giang,

HNIP/18568/19

tỉnh Quảng Nam

Mẫu phân tích đặc điểm hình thái: Toàn cây.
Mẫu phân tích thành phần hóa học: Rễ cây. Các mẫu rễ được rửa sạch, bỏ lõi,
cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 55- 60oC, xay hoặc nghiền thành bột, rây qua rây 250µm,
lấy phần bột dưới rây. Bảo quản trong túi ni-lông kín, cho vào bình hút ẩm.
Các mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học và lưu mẫu tại Phòng Tiêu
bản Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP).
2.1.2. Dung môi, hóa chất
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam V.
Hóa chất: dung dịch javen, cloran hydrat, acid acetic, xanh methylene, đỏ son
phèn, nước cất.

9


Dung môi hữu cơ: ethyl acetat, propanol, methanol, ethanol, acid formic, acid
acetic,…
Thuốc thử: Thuốc thử hiện màu sắc ký vanillin/ H2SO4.
Dung môi phân tích, các hoá chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích.
Chất chuẩn nystose, độ tinh khiết 99,81% (CAS: 13133-07-8, LOT:
BRF1002724) hãng Biopurify Phytochemicals Ltd.
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Phân tích hình thái
Kính lúp soi nổi Leica EZ4, máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D, Canon
SD4000IS tại - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Kính hiển vi Leica.
Nghiên cứu hóa học
Tủ sấy SHELLAB.
Tủ sấy WiseVen (R) WOF.
Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01g.
Cân phân tích Shimadzu (AY 220), độ chính xác 0,1 mg.
Máy xác định hàm ẩm AND MF-50.
Bể siêu âm WISD.
Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: Máy chấm sắc
ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm
phân tích winCAT và VideoScan.
Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck).
Dụng cụ: Các dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác dùng trong phòng thí
nghiệm (Dao cắt, cốc có mỏ, đĩa petri, pipet chính xác các loại, bình nón, lam kính,
chày cối, cốc chạy sắc ký…).
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật

Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu.
Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu:
- Vi phẫu: rễ, thân, lá.
- Soi bột: rễ.
10


Xác định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
Xây dựng phương pháp bán định lượng nystose trong rễ cây Ba kích bằng
phương pháp HPTLC: Khảo sát hệ dung môi khai triển và dung môi chiết xuất.
Thẩm định phương pháp bán định lượng nystose trong rễ cây Ba kích bằng
phương pháp HPTLC: độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ thích hợp hệ thống, độ lặp lại.
Bán định lượng nystose trong các mẫu phân tích bằng HPTLC dựa trên các
điều kiện đã được lựa chọn.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái được ghi chép lại bao gồm: dạng sống; lá (cuống lá:
hình dạng cuống lá, kích thước cuống lá, bề mặt cuống lá; gốc lá: hình dạng gốc lá;
phiến lá: hình dạng; chỉ số lá, hình dạng gân lá- gân chính, gân phụ), số lượng gân lá;
bề mặt lá- bề mặt trên và dưới; hình dạng mép lá; hình dạng ngọn lá; lá kèm: cách
đính, màu sắc, hình dạng, bề mặt, độ dài; thân: bề mặt thân, màu sắc thân non, màu
sắc thân già; quả: cách mọc, bề mặt, số hạt. Các đặc điểm hình thái được chụp qua
máy ảnh và hệ thống tích hợp với kính lúp soi nổi.
2.3.2. Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu
Rễ, thân, lá của các mẫu được cắt, tẩy và nhuộm kép theo phương pháp làm
tiêu bản vi học thực vật [18]. Tiêu bản được soi qua kính hiển vi, chụp ảnh lại bằng
hệ thống tích hợp với kính hiển vi và máy ảnh. Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của
rễ, thân, lá được quan sát, phân tích và mô tả lại bằng văn viết, ảnh chụp.
2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm bột rễ

Rễ được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ 55- 60oC, nghiền hoặc xay thành
bột. Bột mịn được đưa lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi. Các đặc điểm bột
rễ được ghi chép, mô tả và phân tích bằng văn viết, ảnh chụp.
2.3.4. Giám định tên khoa học
Tên khoa học được giám định bằng phương pháp so sánh đặc điểm hình thái,
dựa trên khóa phân loại trong Thực vật chí Trung Quốc (Flora of China, volume 19Rubiaceae) [49], [50] và mô tả về loài trong các tài liệu thực vật trong nước và ngoài
nước [7], [13]. Các mẫu sau khi tra khóa phân loại, được so sánh đối chiếu với các
11


tiêu bản tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trường
Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3.5. Xây dựng và thẩm định phương pháp bán định lượng nystose trong rễ Ba
kích bằng HPTLC
2.3.5.1. Xây dựng phương pháp bán định lượng
* Chuẩn bị mẫu:
Rễ Ba kích tươi sau khi thu hái được rửa sạch, bỏ lõi, cắt nhỏ và sấy ở nhiệt
độ 55oC cho đến khô, xay thành bột và rây qua rây 0,25µm để tiến hành bán định
lượng.
Quy trình chiết mẫu chung: Cân chính xác khoảng 0,25 g bột dược liệu vào
bình định mức 50ml. Thêm 20 ml dung môi thích hợp, đậy nút kín, chiết có hỗ trợ
siêu âm trong thời gian 30 phút. Gạn lấy dịch trong cho vào bình nón nút mài đậy
kín. Tiến hành chiết thêm 2 lần nữa với 10 ml cùng dung môi. Gộp tất cả dịch chiết,
cho ngược trở lại vào bình định mức 50 ml ban đầu, tráng sạch bình nón và bổ sung
dung môi đến vạch. Dịch chiết được lọc, bỏ dịch lọc đầu, ly tâm và sử dụng để chấm
sắc ký [33].
Mẫu chuẩn: Cân chính xác 1 mg nystose chuẩn pha trong bình định mức 20
ml, thu được mẫu chuẩn nystose có nồng độ thích hợp.
Bản mỏng: bản mỏng TLC silicagel GF254 (Merk) được hoạt hóa ở 110oC
trong 30 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký.

Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu
Linomat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 8,0 mm, khoảng cách giữa
vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 10,0 mm. Độ rộng của vết chấm là 8,0
mm. Thể tích chấm: Mẫu thử: 2 µl; Mẫu chuẩn: 4 µl.
Điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng:
- Điều kiện môi trường: nhiệt độ 24oC; độ ẩm tương đối 65%.
- Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml.
- Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút.
- Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút.
- Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút.
- Quãng đường di chuyển của pha động: 80,0 mm.
12


- Bản mỏng được phun thuốc thử valinin/acid sulphuric (pha theo DĐVN V),
sau đó sấy ở 105oC trong 10 phút và hiện màu dưới ánh sáng thường.
* Khảo sát hệ dung môi khai triển:
Các hệ dung môi khai triển sử dụng để phân tích Ba kích đã được nghiên cứu
nhiều. Đề tài đã tiến hành khảo sát lại 3 hệ dung môi khai triển thường gặp nhất. Lần
lượt là:
Hệ 1 [33] : Ethyl acetat: Propanol: Nước: Acid acetic ( 1: 1: 0,5: 0,5 )
Hệ 2 [11] : Ethyl acetat : Nước : Acid formic : Acid Acetic ( 6,5: 2,5: 2: 2 )
Hệ 3 [38] : Ethyl acetat: Nước: Acid formic: Acid acetic ( 30: 15: 10: 10 )
Tiến hành triển khai sắc ký, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực phù hợp,
cho hiệu năng tách vết tốt, đồng thời vết được tách lên gọn, tròn, không bị kéo,
không bị lẫn vết phụ.
* Khảo sát dung môi chiết xuất:
Sau khi lựa chọn được hệ dung môi khai triển, đề tài tiến hành khảo sát dung
môi chiết xuất.
Nystose thuộc nhóm oligosaccharide, có độ tan là 745 g/L [48], dễ tan trong

nước và các dung môi phân cực, không tan trong dung môi không phân cực, không
bay hơi. Do đó, đề tài tiến hành khảo sát quá trình chiết siêu âm với các dung môi
sau: nước cất, methanol, ethanol 40%, ethanol 60%, ethanol tuyệt đối (ký hiệu lần
lượt là Nước cất, MeOH, EtOH 40, EtOH 60, EtOH tđ) theo quy trình chiết chung
được trình bày ở mục trên.
Tiến hành triển khai sắc ký, lựa chọn dung môi chiết cho tỷ lệ

𝑆𝑝𝑖𝑐
𝑚 𝑐â𝑛

lớn nhất,

vết nystose đậm, gọn, tròn vết.
(Trong đó: Spic là diện tích pic của vết nystose, mcân là khối lượng bột dược liệu)
2.3.5.2. Thẩm định phương pháp bán định lượng
Sau khi đã xây dựng được phương pháp bán định lượng nystose bằng HPTLC,
đề tài tiến hành thẩm định phương pháp với những nội dung thẩm định sau: Độ đặc
hiệu, tính tuyến tính, độ thích hợp hệ thống và độ lặp lại của phương pháp [14], [20].
* Độ đặc hiệu

13


Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác
định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất
khác có trong mẫu thử [14].
Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:
1. Mẫu chuẩn nystose hòa tan trong MeOH.
2. Mẫu thử: dịch chiết dược liệu được chuẩn bị theo quy trình chiết chung.
3. Mẫu trắng: Dung môi chiết xuất đã chọn ( mục khảo sát dung môi chiết xuất).

Triển khai sắc ký với 3 mẫu trên bằng hệ dung môi khai triển đã chọn ( mục
khảo sát hệ dung môi khai triển). Soi và chụp ảnh các vết tại ánh sáng trắng, sau khi
đã phun thuốc thử hiện màu. Quan sát số lượng vết, hình dạng các vết, sử dụng phần
mềm VideoScan để phân tích dữ liệu sắc ký đồ; chồng phổ và nhận xét.
Đánh giá: Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối
với chất cần phân tích nếu:
- Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị
Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ của các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết
chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn [21].

* Khoảng tuyến tính
Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân
tích thu được tỷ lệ với nồng độ/lượng chất ( trong khoảng nhất định) của chất phân
tích trong mẫu thử [14].
Cách tiến hành: Chấm sắc ký dãy chuẩn các vết có thể tích lần lượt là: 1, 3, 6,
9, 12 µl. Tiến hành triển khai sắc ký với các thông số khảo sát được. Xây dựng
phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa lượng nystose có trong mẫu và
đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [20].
Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến
tính. Thông thường với giá trị r > 0,90 có thể kết luận phương pháp có tương quan
tuyến tính tốt [14].
* Độ thích hợp hệ thống
14


Khái niệm: Độ thích hợp hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết
bị, dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích. Độ thích hợp của hệ
thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành
thử nghiệm [14].

Cách tiến hành: Tiêm 6 lần mẫu chuẩn, triển khai HPTLC theo quy trình đã
xây dựng được.
Đánh giá: Tính giá trị RSD của diện tích pic, Rf. Giá trị RSD của diện tích pic,
Rf giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0% [20].
Công thức tính RSD:
𝑛

2

∑
(𝑋𝑖−𝑋)
√ 𝑖=0
𝑛−1

RSD =

𝑋

Trong đó:
n : số lượng mẫu nghiên cứu (n=3)
i : chỉ số chạy có giá trị 1, 2, 3
Xi: là giá trị Rf tại mẫu thử i
𝑋 : là giá trị trung bình của các Rf
* Độ lặp lại
Cách tiến hành: Chấm sắc ký dãy chuẩn với thể tích lần lượt là: 1, 3, 6, 9, 12
µl. Chuẩn bị dịch chiết mẫu thử BK4 với 5 lần chiết khác nhau. Tiến hành triển khai
sắc ký theo quy trình đã xây dựng được.
Đánh giá: Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng nystose (%) thu
được giữa các lần phân tích. Giới hạn độ lặp lại đối với một phương pháp theo
AOAC là RSD ≤ 2% ở nồng độ chất phân tích ≥ 1% và RSD ≤ 3% ở nồng độ chất

phân tích ≥ 0,1% [21].
2.3.5.3. Bán định lượng hàm lượng nystose trong các mẫu rễ Ba kích
Chấm sắc ký dãy chuẩn với các thể tích lần lượt là 1, 3, 6, 9, 12 µl. Chuẩn bị
dịch chiết mẫu thử BK2, BK4, BK6.
Tiến hành chiết và triển khai HPTLC với quy trình đã xây dựng.
Xử lý kết quả: Sử dụng phần mềm winCAT và VideoScan để phân tích cường
độ màu vết nystose của các mẫu chuẩn và mẫu thử trên bản mỏng đã khai triển. Vết
15


được quan sát dưới ánh sáng trắng, sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin/ H2SO4 .
Xây dựng đường chuẩn bán định lượng dựa trên diện tích pic và lượng nystose trong
vết của mẫu chuẩn. Xác định lượng nystose trong các mẫu thử. Từ đó tính hàm lượng
nystose trong dược liệu theo công thức sau:

%𝑛𝑦𝑠𝑡𝑜𝑠𝑒 =

m′ × 50
𝑚′ × 250
× 0,1 (%) =
(%)
2 × 𝑚 × (100 − 𝑎)/100
𝑚(100 − 𝑎)
Trong đó:
m’: Lượng nystose có trong vết của mẫu thử (µg)
m: Khối lượng cân bột dược liệu (g)
a: Hàm ẩm của bột dược liệu (%)

16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả thực nghiệm
3.1.1. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm chung:
Cây dây leo bằng thân cuốn. Rễ phình to thành củ, hình trụ, mập, vặn vẹo, từ
1 củ chính phân thành 2 - 3 nhánh cấp 2; từ nhánh cấp 2 phân thành 3 - 5 nhánh cấp
3, có thể phân tới nhánh cấp 5. Đường kính củ chính từ 4 - 8 mm; chiều dài củ từ 15
- 40 cm. Củ thường hơi thắt lại tạo thành các đốt có chiều dài từ 1 - 3 cm, trông
giống ruột gà. Vỏ ngoài màu vàng trắng, thịt màu trắng hơi vàng, trên mặt vỏ có
nhiều vân dọc, giữa có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác nhau.
Thân leo hình trụ, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau. Thân non
thường phủ lông, màu xanh hoặc tím. Thân già có màu nâu hoặc tím đậm, lông rụng
dần. Mỗi gióng dài 4-15 cm.
Lá đơn, mọc đối; cuống dài 6 - 9 mm, đường kính 1 -2 mm, phủ lông dài và
dày; phiến lá có hình trứng hoặc bầu dục thuôn nhọn ở ngọn lá, dài 5-11 cm, rộng 2,5
- 4 cm, chỉ số lá 2- 3; gốc lá tròn hoặc nhọn, mép nguyên hay lượn sóng; ngọn lá
nhọn; mặt trên và mặt dưới nhẵn hoặc có lông ngắn; thường có hốc Domatia- hốc
giữa gân chính và phụ có phủ lông; gân lá hình lông chim, gồm 6-9 cặp gân phụ rời
hoặc nối tiếp nhau ở gân mép lá; gân chính nổi rõ và có lông; gân cấp 3 hình mạng.
Lá kèm mỏng, ôm lấy thân, hàn liền, dài 2- 4 mm, màu trắng xanh hay tím, có phủ
lông ngắn và thưa.
Cụm hoa dạng tán, gồm 4-5 tán mọc ở nách lá hay đầu cành, mỗi tán mang 510 hoa; cuống tán dài 0,3-4 cm, đường kính 1-2 mm, có phủ lông. Hoa nhỏ, đều,
lưỡng tính, khi mới nở màu xanh, trắng, sau ngả sang vàng. Đài 3-4, hơi dính nhau ở
dưới, dài 1-4 mm, rộng 1-3 mm, đài hàn liền hình ống, rộng 2-3 mm, dài 3-4 mm,
màu xanh, phủ lông. Tràng 3-4, có phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum
hoặc hình trụ, đường kính 2- 3mm, cao 5mm, phủ lông ở mặt ngoài; phần phiến rời,
hình tam giác, dài, rộng khoảng 3mm, mặt ngoài nhẵn hay phủ lông, mặt trong có
một vòng lông dày đặc, thẳng, màu trắng, dài khoảng 1 mm, ở phía trên họng tràng.
Bộ nhị 3-4, dính vào họng tràng. Chỉ nhị rất ngắn. Bao phấn 2 ô, dài 1mm, thuôn hai

đầu, nứt dọc.
17