Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn miễn dịch trong lơxêmi cấp dòng lympho ở trẻ em bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy tại viện huyết học truyền máu TW

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơxêmi (LXM) cấp là nhóm bệnh thường gặp nhất trong các bệnh cơ
quan tạo máu. Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi, biểu hiện bệnh đa dạng. Tại
Việt Nam, tác giả Đỗ Trung Phấn và Trần Thị Minh Hương (2002) đ`ã nghiên
cứu tình hình bệnh máu tại viện Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai
thấy bệnh LXM cấp gặp với tỷ lệ cao nhất (chiếm 38,5%) trong số các bệnh
máu gặp tại Bệnh viện Bạch Mai [1].
Ở trẻ em, Lơxêmi cấp cũng là loại ung thư khá phổ biến, chiếm khoảng
31% tổng số các ca ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi trong những năm từ
1990-1995 ở Mỹ, trong đó Lơxêmi cấp dòng lympho chiếm đến 3/4.Ước
tính mỗi năm ở Mỹ có khoảng 3250 trường hợp trẻ em được chẩn đoán
Lơxêmi cấp, trong đó khoảng 2400 trường hợp là Lơxêmi cấp dòng
lympho. Tỷ lệ mới mắc của LXM cấp dòng lympho ở trẻ em tại Mỹ là 3.74.9/100000 người mỗi năm [2],[3].
Từ nhiều năm nay, với sự phát triển của phương pháp hình thái học,
phương pháp hóa học tế bào, việc chẩn đoán LXM cấp dòng lympho đã có
nhiều thuận lợi. Tuy nhiên vẫn còn có một số khó khăn nhất định do phụ
thuộc nhiều yếu tố chủ quan trong phân tích kết quả, một số sai sót có thể gặp
trong quá trình thực hiện kỹ thuật,… làm ảnh hưởng đến công tác chẩn đoán
thể bệnh, qua đó ảnh hưởng đến việc điều trị và tiên lượng.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của phương pháp
Đếm tế bào dòng chảy trên thế giới cũng như ở Việt Nam, việc chẩn đoán
LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng lympho ở trẻ em nói riêng đã có
những bước tiến rõ rệt. Phương pháp này có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn,
đem lại hiệu quả cao, giúp chẩn đoán thể bệnh chính xác hơn, từ đó giúp ích
cho việc điều trị và tiên lượng bệnh.


2

Đã có một số nghiên cứu xếp loại MDH trong LXM cấp sử dụng
phương pháp Đếm tế bào dòng chảy tại Việt Nam, tuy nhiên chưa có nhiều
nghiên cứu tiến hành trên đối tượng trẻ em. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn miễn dịch trong Lơxêmi cấp dòng lympho
ở trẻ em bằng phương pháp Đếm tế bào dòng chảy tại Viện Huyết họcTruyền máu Trung ương” với mục tiêu:
1.

Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn miễn dịch để xếp loại Lơxêmi cấp dòng
lympho ở trẻ em tại Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương từ
tháng 10/2013 đến tháng 8/2014.

2.

Bước đầu tìm hiểu mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với
đáp ứng điều trị sau đợt điều trị cảm ứng.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về các dấu ấn trong quá trình sinh sản và biệt hóa tế bào máu.
1.1.1. Các dấu ấn biệt hóa tế bào máu.
Trong quá trình sinh sản, biệt hóa tế bào máu, tế bào lần lượt trải qua
các thay đổi về cấu trúc của nhân, nguyên sinh chất và đặc biệt là có sự hình
thành những dấu ấn mang tính chất đặc trưng cho từng dòng, thậm chí cho từng
loại tế bào và các dấu ấn này tương ứng với từng giai đoạn biệt hóa. Việc xác
định các dấu ấn biệt hóa này đã cho phép nhận dạng chính xác các tế bào máu.
Dấu ấn màng đầu tiên đặc trưng cho tế bào gốc tạo máu là CD34. Sau
đó cùng với quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào gốc thành các tế bào gốc

định hướng dòng tủy hay định hướng dòng lympho, mật độ các dấu ấn CD34
trên màng tế bào gốc giảm dần và dần dần xuất hiện thêm các dấu ấn khác đặc
trưng và đánh dấu quá trình biệt hóa.
Năm 1981, một hội nghị quốc tế về kháng nguyên màng bạch cầu đã
thống nhất đặt tên các dấu ấn màng là CD (Cluster of Differentiation - cụm
biệt hóa). Cho đến nay người ta đã phát hiện ra khoảng trên 360 CD. Các CD
này không chỉ xuất hiện trên màng tế bào mà một số CD còn xuất hiện trong
bào tương và nhân tế bào [4].
1.1.2. Sự trưởng thành và các dấu ấn biệt hóa của tế bào dòng lympho.
Tế bào mẹ của dòng lympho chung (CFU-L) được phát triển từ tế bào
gốc sinh máu. Từ đây, chúng phân chia (theo chức năng) thành 3 nhóm chính
là lympho T (85%), lympho B (10%) và NK- Natural Killer cell (5-10%) [5].
Dòng lympho B: trưởng thành từ tế bào mẹ của lympho chung (CFUL), trải qua giai đoạn biệt hóa khác nhau ở tủy xương, song song với việc xuất


4

hiện, thay đổi mức độ biểu hiện hoặc mất đi các CD để trở thành tế bào
trưởng thành ở máu ngoại vi. Sự có mặt của các tế bào đệm trong tủy xương
tiết các cytokine cần thiết cho quá trình biệt hóa này [6]. Trong đó, các CD
hiện diện sớm và ổn định trong tất cả các giai đoạn biệt hóa là cyCD79a,
cyCD22, smCD22, CD19, HLA-DR. Các dấu ấn trưởng thành hơn là CD20,
cyIgM, sIgM, Igµ hoặc Igλ [7].
Dòng lympho T: quá trình biệt hóa và trưởng thành xảy ra ở tủy xương
và tuyến ức, trải qua nhiều giai đoạn với sự hình thành và biến mất của các
CD đặc trưng, với sự hỗ trợ của các tế bào biểu mô, tế bào đuôi gai và các đại
thực bào tại tuyến ức [6]. Có 3 giai đoạn phát triển chính [7]:
- Giai đoạn T sớm: xảy ra ở tủy xương, tế bào được gọi là tế bào tiền T
(Pro-T), xuất hiện chủ yếu CyCD3 và CD7.
- Giai đoạn T trung gian: xảy ra ở vỏ tuyến ức, tế bào T được gọi là tế

bào tuyến ức (T-thymocyte). Đặc trưng là sự xuất hiện CD1a+. Các CD khác
lần lượt xuất hiện: CD3yếu, CD4+, CD8+, CD2+, CD5+.
- Giai đoạn T chín: xảy ra ở tủy tuyến ức, tế bào xuất hiện tương đối
đầy đủ các CD của dòng lympho T, trong đó CD3+ là biểu hiện đặc trưng.


5

Sơ đồ 1.1. Xếp loại tế bào máu bằng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với
dấu ấn miễn dịch (Hoffbrand 1995) [8].
1.2. Tóm tắt về Lơxêmi cấp và Lơxêmi cấp dòng lympho ở trẻ em và các
phương pháp chẩn đoán.
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu.
Lơxêmi cấp là một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy

trong tủy xương và máu ngoại vi của những tế bào non ác tính. Những tế bào


6

này dần sẽ thay thế và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các tế
bào bình thường trong tủy xương.
Bệnh LXM cấp được Velpeau ghi nhận lần đầu từ năm 1827. Đến năm
1845, Bennett đã đặt tên cho bệnh LXM cấp là leucocythemia (tăng bạch
cầu). Sau đó, Virchow gọi bệnh này là bệnh máu trắng (white blood), rồi
chính ông đặt tên cho bệnh cái tên mà cho đến bây giờ vẫn đang được sử
dụng, đó là leukemia (tiếng Hy Lạp có nghĩa là máu trắng). Năm 1887, phải
nhờ có phát minh nhuộm tiêu bản của Ehrlich thì mới có thể phân biệt được
những dạng khác nhau của dòng bạch cầu. Tới năm 1900 thì các cụm từ dòng
tủy và dòng lympho đã bắt đầu được sử dụng để xếp loại LXM cấp [6]. Ngày

nay, cùng với những tiến bộ trong các phương pháp chẩn đoán, đặc biệt là các
tiến bộ trong phương pháp miễn dịch học (MDH) và di truyền phân tử
(DTPT), việc chẩn đoán thể LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng lympho ở
trẻ em nói riêng cũng được cải tiến rõ rệt. Các thể LXM ở trẻ em được thống
kê rõ ràng hơn với tỷ lệ LXM cấp dòng lympho chiếm đến 80%, tiếp theo là
LXM cấp dòng tủy, chiếm khoảng 15%, còn lại 3-5% là LXM kinh dòng BC
hạt [9]. Nhiều nghiên cứu trên các cộng đồng người khác nhau cũng đã chỉ ra
LXM cấp dòng lympho ở trẻ em chiếm tỷ lệ cao nhất trong các LXM nói
riêng và các ung thư nói chung [10]. Ở Mỹ, nghiên cứu về LXM cấp dòng
lympho cũng chỉ ra rằng đây là loại LXM cấp hay gặp nhất ở trẻ em, với tần
suất mắc bệnh cao nhất ở độ tuổi từ 2-5 tuổi. Trong đó, LXM cấp dòng
lympho B chiếm hơn 80% số trường hợp, LXM cấp dòng lympho T chiếm
khoảng 10-15% số trường hợp [2],[11].
1.2.2. Các phương pháp chẩn đoán, xếp loại LXM cấp dòng lympho ở trẻ em.
1.2.2.1. Phương pháp hình thái học (HTH).
Bằng phương pháp nhuộm giêmsa tiêu bản máu ngoại vi và dịch hút
tủy xương, dựa vào đặc điểm hình thái tế bào để xác định tỷ lệ tế bào blast,
ngoài ra có thể nhận biết một số khác biệt giữa các dòng tế bào ác tính. Đây là
phương pháp cơ bản để chẩn đoán xác định Lơxêmi cấp.


7

1.2.2.2. Phương pháp hóa học tế bào (HHTB).
Từ những năm 1940 - 1970, các phát hiện về rối loạn chuyển hóa đặc
trưng cho từng dòng tế bào đã được áp dụng hình thành các kỹ thuật nhuộm
hóa học tế bào, các kỹ thuật phổ biến hiện nay đang sử dụng cho xếp loại
LXM cấp như: Myeloperoxydase (MPO), Sudan đen (SB: Sudan Black),
Periodic Acid Schiff (PAS), Esterase không đặc hiệu có và không có ức chế
bằng NaF, Esterase đặc hiệu [12].

Kỹ thuật nhuộm MPO (myeloperoxidase): Myeloperoxydase là
enzym tồn tại trong các hạt nguyên phát ưa azua của các tế bào dòng tủy.
Phản ứng dương tính với các tế bào dòng hạt. Các tế bào dòng mono có thể
dương tính, nhưng ở mức thấp hơn, dòng lympho không chứa enzym này
nên phản ứng sẽ âm tính.
Kỹ thuật nhuộm Sudan đen B (SB) đã được nghiên cứu và phân tích
mức độ dương tính ở các dòng tế bào máu khác nhau và thống nhất nhận định
dòng bạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương tính ở các mức
độ khác nhau còn dòng lympho thường âm tính. Trên cùng một tế bào thì mức
độ dương tính của SB thường mạnh hơn MPO.
Kỹ thuật nhuộm Esterase: Esterase là nhóm enzyme đa dạng, trong đó
một số loại được sử dụng để phân biệt bạch cầu hạt trung tính và bạch cầu
mono. NASDCA (Napthol ASD chloroacetate) là cơ chất được sử dụng để
nhận biết các esterase đặc hiệu có trong bạch cầu hạt trung tính; các tế bào
khác như bạch cầu ưa acid, mono, lympho, nguyên hồng cầu và mẫu tiểu cầu
thường âm tính. Ngược lại, esterase không đặc hiệu được sử dụng để nhận
biết bạch cầu mono do bị ức chế bởi Sodium fluoride (NaF).
Kỹ thuật nhuộm PAS sử dụng periodic (HIO4.2H2O) dùng để phát hiện
blast dòng lympho trong xếp loại LXM cấp. Các tế bào non dòng lympho cho


8

phản ứng dương tính hạt, cục. Kỹ thuật này có ý nghĩa trong chẩn đoán phân
biệt với LXM cấp dòng tủy, tuy nhiên không có ý nghĩa trong chẩn đoán dưới
nhóm dòng lympho B hay lympho T. [13]
Dựa trên đặc điểm hình thái học và HHTB của tế bào non ác tính, xếp
loại FAB 1986 (French-American-British 1986) đã và đang được sử dụng
trong xếp loại LXM từ nhiều năm nay.
Bảng 1.1. Xếp loại LXM cấp dòng lympho theo FAB 1986 [5]

Hình thái TB
Kích thước

L1

Nhỏ chiếm đa số Lớn, không đều

Chất nhiễm sắc Đồng nhất, mịn
Hình dạng nhân

Hạt nhân

L2

Không đồng nhất

L3
TB lớn, không đều
Mịn và đồng nhất

Đều đặn, đôi khi Không đều, thường Đều đặn hình bầu dục
có rãnh, khía

có rãnh, khía

hoặc tròn

Không thấy hoặc Một hay nhiều hạt Một hay nhiều hạt
nhỏ

nhân to

nhân hình túi

Tỷ lệ nhân/NSC Thấp

Khá cao, thay đổi

Cao

Độ kiềm NSC

Thay đổi

Vừa hoặc đậm

Rất đậm

Không bào

Thường không có Thường không có

Hốc to và nhiều

 Hóa học tế bào: Âm tính với MPO, SB, esterase không đặc hiệu.
Khoảng 50% các trường hợp dương tính với PAS.
1.2.2.3. Phương pháp di truyền tế bào- di truyền phân tử.
Nghiên cứu bệnh sinh LXM cấp nhận thấy có liên quan đến tổn thương
di truyền trong các tế bào gốc tạo máu làm tăng sinh và tích tụ các tế bào non
gây lấn át các dòng tế bào tạo máu bình thường gây bệnh cảnh lâm sàng

9

LXM. Việc phát hiện các bất thường di truyền có ý nghĩa quan trọng trong
chẩn đoán, tiên lượng cũng như theo dõi điều trị.
Bảng 1.2. Ý nghĩa tiên lượng của các bất thường di truyền hay gặp trong
LXM cấp dòng lympho trẻ em [14]
Bất thường nhiễm sắc thế

Sống 5 năm không bệnh

Đa bội thể
> 50 NST

80% (65-90%)

47-50 NST

90% (50-98%)

Tam bội thể, 66-73 NST

Không rõ, có thể tốt

Tứ bội thể, 82-94 NST

Không rõ, có thể dưới 60%

Lưỡng bội thể bình thường, 46 NST

80% (65-90%)

Thiểu bội thể, < 46 NST

71% (55-85%)

Giả lưỡng bội (pseudodiploid)

73% (55-85%)

t(1;19)

53%

t(4;11)

45%

t(9;22)

14%

1.2.2.4. Phương pháp miễn dịch học (MDH).
Từ đầu những năm 1970, một số nhà nghiên cứu đã bắt đầu áp dụng
phương pháp MDH trong xếp loại LXM cấp. Từ đó đến nay đã có rất nhiều
tiến bộ, từ việc xếp loại miễn dịch trên kính hiển vi (KHV) huỳnh quang, đến
nay đã xếp loại miễn dịch (XLMD) bằng kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy
(Flow Cytometry) một cách thường xuyên ở nhiều trung tâm trên thế giới.
 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, gián tiếp.

Dựa trên nguyên lý phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể (KNKT) để phát hiện các KN biệt hóa tế bào khi cho chúng kết hợp đặc hiệu với
KT đơn dòng có gắn huỳnh quang và phát quang khi đọc kết quả trên KHV
huỳnh quang. Kỹ thuật này đã mang lại giá trị bổ sung cho phương pháp


10

HTH-HHTB (hình thái học-hóa học tế bào). Tuy nhiên còn có một số hạn chế
đó là: Kết quả phụ thuộc vào người làm, người đọc, chưa tách biệt được tuyệt
đối quần thể tế bào non ác tính (Blast) cần nghiên cứu, chỉ phân tích được
từng dấu ấn riêng biệt do đó độ chính xác chưa cao.
 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch.
Hóa mô miễn dịch là một phương pháp được áp dụng từ khá lâu trong
việc chẩn đoán, xếp loại bệnh lý LXM cấp cũng như các bệnh lý ác tính khác
của hệ tạo máu. Phương pháp này dựa trên cơ sở các kháng thể đơn dòng gắn
chất nhuộm màu liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bề mặt tế bào,
sau đó quan sát trên kính hiển vi để xác định nguồn gốc, đặc tính tế bào.
Phương pháp này có một số nhược điểm là phân tích được số lượng ít các dấu
ấn tế bào, độ nhạy thấp hơn do phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật nhuộm, phụ
thuộc chủ quan người phân tích kết quả…
 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry).
Đếm tế bào dòng chảy là phương pháp đo và phân tích đồng thời nhiều
thông số, đặc điểm của một phần tử (tế bào) cần nghiên cứu bao gồm: Kích
thước, tính chất hạt trong NSC, độ phức tạp của bào tương và nhân, mức độ
gắn huỳnh quang (mức độ kết hợp KT với KN- dấu ấn cần nghiên cứu).
Phương pháp này sẽ được trình bày cụ thể trong mục 1.3 dưới đây.
1.3. Tóm tắt về phương pháp Đếm tế bào dòng chảy
KT đơn dòng (Monoclonal antibody): là các KT đặc hiệu cho một đáp
ứng KN. Các kỹ thuật sinh học cho phép xác định các tế bào mang các dấu ấn
đặc trưng có mặt trên bề mặt hoặc trong nhân tế bào bạch cầu người. Các tế

bào này được dùng để gây miễn dịch cho động vật thu được các tế bào
lympho B mẫn cảm của cá thể động vật đó. Lai tế bào lympho B đã được mẫn
cảm này với một tế bào u plasmo thu được một tế bào lai có khả năng sinh
một lượng không giới hạn kháng thể đơn dòng chống lại dấu ấn đặc trưng của


11

tế bào bạch cầu người ban đầu. Kháng thể đơn dòng là công cụ quan trọng để
xếp loại miễn dịch LXM cấp cũng như thực hiện nghiên cứu về nhiều biểu
hiện protein tế bào khác nhau, mở ra một kỷ nguyên mới cho nền y học.
Cấu tạo của hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy: bao gồm có 3 hệ
thống chính.
+ Hệ thống lưu động lỏng: Có chức năng tạo thành dòng chảy từng tế
bào riêng rẽ qua chùm tia laser để phân tích các thông số trên mỗi tế bào;
+ Hệ thống quang học bao gồm: Nguồn phát laser, bộ phận lọc quang
học để chuyển các tín hiệu ánh sáng tới bộ phận nhận cảm thích hợp, bộ phận
nhận cảm này thu nhận ánh sáng và chuyển thành tín hiệu điện.
+ Hệ thống máy tính điện tử: thu nhận các tín hiệu điện từ hệ thống
chuyển đổi tín hiệu quang kết nối với các bộ phận nhận cảm của hệ thống
quang, phân tích bởi các phần mềm;


12

Hệ thống máy tính

Bộ chuyển đổi tín hiệu

Hệ thống lưu động lỏng

Cảm biến ánh sáng vàng

Cảm biến ánh sáng đỏ

Cảm biến ánh sáng xanh

Cảm biến tán xạ bên

Cảm biến tán xạ thẳng

Sơ đồ 1.2. Mô tả hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy và sơ lược nguyên lý
hoạt động [15]
Nguyên lý của phương pháp
Hoạt động của thiết bị dựa trên nguyên lý thủy động lực học (hydrodynamic) thực hiện bởi hệ thống lưu động lỏng, tạo ra một dòng chảy tế bào
liên tục qua một khe đếm. Dòng chảy này được duy trì đảm bảo tại một thời


13

điểm chỉ có một tế bào riêng lẻ đi qua khe đếm, tại khe đếm này có ánh sáng
laser đi qua. Phương pháp Đếm tế bào dòng chảy được thực hiện với tế bào
trong huyền dịch (máu, tủy xương, dịch cơ thể hoặc huyền dịch tế bào tổ
chức), các tế bào này được ủ với các KT gắn huỳnh quang, KT này đặc hiệu
với các KN (dấu ấn) tương ứng trên bề mặt tế bào hoặc trong bào tương và
nhân tế bào. Khi đi qua khe đếm, các tế bào tác động đến việc tán xạ của ánh
sáng laser tới, đồng thời các chất huỳnh quang gắn với KT bị ánh sáng laser
kích thích, phát ra ánh sáng huỳnh quang. Các ánh sáng thu được bao gồm:
+ Ánh sáng tán xạ thẳng (FS): là ánh sáng tán xạ cùng chiều với tia
laser tới. Tán xạ thẳng cho biết kích thước tế bào.

+ Ánh sáng tán xạ bên (SS): ánh sáng tán xạ 90º so với tia laser tới. Tán
xạ bên cho biết mức độ phức tạp của nhân và nguyên sinh chất, mức độ hạt
trong nguyên sinh chất [16],[17].
Cảm biến
tán xạ bên

Nguồn sáng laser

Cảm biến
tán xạ thẳng

Hình 1.1: Cơ chế tán xạ của ánh sáng laser khi đi qua tế bào [17]
+ Ánh sáng huỳnh quang: là ánh sáng do chất huỳnh quang phát xạ
dưới tác động của tia laser tới. Ánh sáng này chỉ có thể thu được trong trường
hợp tế bào có tồn tại KN (dấu ấn) tương ứng với kháng thể gắn chất huỳnh
quang. Ánh sáng này có bước sóng đặc trưng cho từng chất huỳnh quang.
Chúng được thu nhận bởi hệ thống các bộ phận nhận cảm đặc biệt của hệ


14

thống quang, tương ứng với từng bước sóng, rồi chuyển thành tín hiệu điện,
qua đó cho phép đánh giá có sự hiện diện và mật độ hiện diện của KN cần
khảo sát trên bề mặt tế bào, trong bào tương hay trong nhân tế bào [16].
Do có sự khác biệt về hai thông số FS và SS giữa các quần thể tế bào
sinh máu bình thường, biểu đồ 2 thông số FS và SS cho phép ta phân biệt 3
quần thể tế bào lớn là mono, lympho, bạch cầu hạt. Tuy nhiên, do không có
sự khác biệt rõ rệt giữa các tế bào non ác tính với các tế bào tiền thân của các
quần thể tế bào bình thường nên trên biểu đồ FS và SS, người ta không nhận
biết được rõ quần thể tế bào non ác tính. Từ năm 1993, bằng việc sử dụng

CD45 (hay LCA) là KN phổ biến dòng bạch cầu, kết hợp với thông tin có
được từ chùm ánh sáng tán xạ bên (SS), Borowitz và cs đã phân tách được
quần thể tế bào non ác tính với các quần thể tế bào bình thường [18]. Cơ sở
của phương pháp sử dụng CD45 và SS này đã được Shah VO và cs mô tả.
Trong đó, các tế bào non ác tính bắt nguồn từ hệ tạo máu và các tế bào tiền
thân dòng tủy trong tủy xương có biểu hiện CD45 ở mức thấp và trung bình,
các tế bào mono và lympho có mức biểu hiện cao hơn, đồng thời chúng có SS
thấp hơn so với các tế bào dòng bạch cầu hạt [18],[19]

Hình 1.2. Phân bố các quần thể tế bào trên Đếm tế bào dòng chảy [15]


15

Ứng dụng của phương pháp trong xếp loại LXM cấp
 Xếp loại miễn dịch bệnh Lơxêmi cấp bằng phương pháp Đếm tế

bào dòng chảy có vai trò rất quan trọng giúp xác định dòng tế bào và mức độ
biệt hóa. Việc lấy bệnh phẩm sử dụng cho phương pháp này cũng dễ dàng
hơn, do có thể thực hiện với bệnh phẩm là máu ngoai vi (trong trường hợp
bệnh nhân không thực hiện được xét nghiệm huyết tủy đồ).
 Xác định quần thể tế bào blast bằng cửa sổ CD45 và SSC: Quần thể

blast có đặc tính là có SS thấp (thấp hơn quần thể lymphocytes bình thường)
và có CD45(+) mức độ nhẹ cho tới âm tính. Đó là đặc điểm khác biệt với
quần thể blast dòng hạt. Sử dụng các phần mềm phân tích kết quả từ các dữ
liệu thu được trên chương trình phân tích LXM cấp máy Cytomic Navios của
hãng Beckman Coulter (Mỹ) và máy Canto II của hãng BD (Mỹ)

Bạch cầu hạt

Cửa sổ Mono
Dương tính nhẹ CD45

Vùng
blast

Vùng lympho

CD45
Sơ đồ 1.3.Các vùng cửa sổ blast trên cửa sổ kết hợp CD45 và SSC bằng
phương pháp đếm tế bào dòng chảy [20]


16

 Phân tích dấu ấn biệt hóa tế bào máu trong quần thể tế bào blast.
+ Tiêu chuẩn chẩn đoán dương tính của các CD trên Đếm tế bào dòng
chảy: (Theo EGIL).
Dương tính khi: Có  20% tế bào trong quần thể tế bào blast dương tính
với dấu ấn biệt hóa tương ứng và ≥ 10% đối với kháng nguyên nhân TdT.
 Dựa vào đặc điểm xuất hiện các dấu ấn miễn dịch theo dòng để xác
định các dưới nhóm.
1.4. Tóm tắt về điều trị LXM cấp dòng lympho ở trẻ em.
1.4.1. Mục tiêu điều trị.
Mục tiêu điều trị Lơxêmi cấp nói chung và Lơxêmi cấp dòng lympho ở
trẻ em là làm lui bệnh tới khỏi bệnh, gồm:
- Làm lui các biểu hiện lâm sàng và huyết học;
- Duy trì tình trạng lui bệnh bằng hóa trị liệu hệ thống và điều trị dự
phòng thâm nhiễm thần kinh trung ương;

- Điều trị các biến chứng của bệnh và biến chứng do điều trị.
1.4.2. Các phương pháp điều trị.
1.4.2.1. Điều trị hóa chất.
Điều trị hóa chất là phương pháp điều trị tiên phong (front-line) và chủ
yếu trong LXM cấp ở trẻ em. Có nhiều phác đồ điều trị, song tất cả các phác
đồ đều bao gồm 4 giai đoạn với các mục đích khác nhau: điều trị cảm ứng kéo
dài 4-5 tuần để đạt lui bệnh, điều trị củng cố để tăng cường lui bệnh hoặc
giảm tồn dư tối thiểu của bệnh, điều trị dự phòng bệnh lý LXM ở hệ thống
thần kinh trung ương, và điều trị duy trì để kéo dài tình trạng lui bệnh, giảm
tái phát [21],[22]. Điều trị cảm ứng với 3 hay 4 thuốc (như Vincristin,
Prednisolon, L-asparaginase, Methotrexat tiêm tủy sống) đã đạt được tỷ lệ lui
bệnh 95% [21].


17

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của các công ty và nhà phân phối
dược phẩm, sự lựa chọn thuốc cho điều trị theo đúng và đủ các phác đồ chuẩn
đã trở nên dễ dàng hơn. Đã có nhiều phác đồ được áp dụng trong điều trị
LXM cấp dòng lympho ở Việt Nam như phác đồ CCG1991 cho nhóm nguy
cơ thường, phác đồ MSKCC- New York 2 cho nhóm nguy cơ cao, phác đồ
MSKKC cho nhóm tái phát tủy xương, phác đồ FRALLE2000...[21]. Trong
đó, phác đồ FRALLE2000 và phác đồ CCG1991 đã được áp dụng rộng rãi ở
các cơ sở điều trị huyết học nhi khoa trên cả nước nói chung và tại Khoa Nhi
Viện Huyết học- Truyền máu Trung Ương nói riêng từ năm 2010 tới nay.
1.4.2.2. Ghép tế bào gốc tạo máu
Trong khoảng hơn 40 năm qua trên thế giới, điều trị LXM cấp dòng
lympho đã đạt được nhiều thành công, chất lượng điều trị đã có những cải
thiện rõ rệt. Hầu hết bệnh nhi ngày nay được điều trị thành công, đạt được
tình trạng lui bệnh mà không cần sử dụng đến phương pháp ghép tế bào gốc

tạo máu [23]. Tuy nhiên, bên cạnh đó, ghép tế bào gốc tạo máu được đặt ra
với nhóm bệnh nhân nguy cơ cao, không đạt được tình trạng lui bệnh hoặc tái
phát, đặc biệt tái phát sớm sau khi hoàn thành hóa trị liệu [22]. Ghép tế bào
gốc tạo máu ở những bệnh nhi này gíúp kéo dài thời gian sống thêm 5 năm
không bệnh (EFS) và thời gian sống thêm chung (OS). Trong khoảng thời
gian từ năm 1995 đến năm 2000, dưới sự phối hợp của Nhóm nghiên cứu
Quốc tế Berlin- Frankfurt- Munster (I-BFM) với Nhóm nghiên cứu nhi khoa
của Hiệp hội Ghép tủy xương Châu Âu (EBMT), một nghiên cứu lâm sàng
ngẫu nhiên đã được thực hiện trên 357 bệnh nhi. Mục đích của nghiên cứu là
so sánh việc ghép tế bào gốc sử dụng nguồn người cho cùng huyết thống cho
bệnh nhi nhóm nguy cơ cao sau đợt lui bệnh hoàn toàn đầu tiên (CR1) với hóa
trị liệu đơn thuần. Kết quả cho thấy, thời gian sống thêm 5 năm không bệnh ở
nhóm ghép tế bào gốc được cải thiện đáng kể (56,7%) so với nhóm hóa trị


18

liệu đơn thuần (40,6%) [24]. Trong một nghiên cứu tương tự của các tác giả
Italia mới được công bố gần đây, phân tích kết quả điều trị trên 211 bệnh nhi
thuộc nhóm nguy cơ cao được ghép tế bào gốc đồng loại ở lần lui bệnh hoàn
toàn đầu tiên từ năm 1990 đến năm 2005, cũng cho thấy xác suất sống thêm
toàn bộ 10 năm và sống thêm 10 năm không bệnh lần lượt là 63,4% và 61%.
Cũng trong nghiên cứu này, tỷ lệ tử vong và tỷ lệ tái phát tích lũy 10 năm liên
quan đến ghép cũng rất thấp, tương ứng là 15% và 24% [25]
1.4.2.3. Điều trị nhắm đích
Điều trị hóa chất có nhược điểm chung, đó là cùng một lúc làm tổn
thương cả tế bào ác tính và tế bào lành, dẫn đến một số hạn chế trong hiệu quả
điều trị và khả năng phục hồi sau điều trị. Từ nhiều năm nay, các nhà khoa
học đã tiến hành nhiều nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tác
dụng chọn lọc trên tế bào ác tính, hoặc trên một số phân tử đặc hiệu có tính

quyết định trong cơ chế bệnh sinh của bệnh, gọi là điều trị nhắm đích
(targeted therapies). Một bước tiến quan trọng trong điều trị LXM cấp dòng
lympho là hiệu quả của điều trị nhắm đích, tấn công vào các bản dịch mã đặc
hiệu, như phân tử protein lai BCR-ABL bởi các chất ức chế tyrosine kinase
(TKIs), hoặc các kháng nguyên bởi các kháng thể đơn dòng đặc hiệu. Các tế
bào blast trong LXM cấp dòng lympho biểu hiện nhiều kháng nguyên đặc
hiệu khác nhau như CD19, CD20, CD22 và CD52; đây chính là các đích
nhắm của các kháng thể đơn dòng. Cho đến nay, kháng thể đơn dòng kháng
CD20 (rituximab) có nhiều dữ kiện sử dụng lâm sàng nhất, được sử dụng phối
hợp trong các phác đồ đa hóa trị liệu điều trị LXM cấp dòng B trưởng thành/
U lympho Burkitt. Một kháng nguyên khác là CD19, với tần xuất biểu hiện
cao trong LXM cấp dòng lympho B, cũng đã có kháng thể đặc hiệu, đó là
blinatumomab, tấn công trực tiếp CD19 và CD3. Ngoài ra, cũng đã có những
nghiên cứu nhỏ hơn, hoặc các báo cáo ca bệnh được ghi nhận về kháng thể


19

đơn dòng kháng CD52 (alemtuzumab), kháng CD22 (epretuzumab), và kháng
CD33 (gemtuzumab)...[26]. Việc áp dụng phương pháp điều trị nhắm đích
này càng cho thấy vai trò quan trọng của xếp loại miễn dịch trong việc xác
định chính xác các dấu ấn đặc hiệu để có quyết định chính xác trong việc sử
dụng thuốc đúng và hợp lý.
1.5. Tình hình nghiên cứu xếp loại và đặc điểm, mối liên quan giữa các
dấu ấn miễn dịch với đáp ứng điều trị trong LXM cấp ở trẻ em trên thế
giới và Việt Nam.
1.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới.
Đầu những năm 1970, Greaves, Borella đã sử dụng những kháng thể
đặc hiệu để xếp loại ALL. Đến năm 1986, phương pháp MDH đã được ứng
dụng tại nhiều trung tâm huyết học lớn và mang lại những kết quả tốt, bổ sung

những hạn chế của xếp loại FAB (xếp loại dựa trên hình thái và hóa học tế
bào). PB Neame và cộng sự đã nghiên cứu LXM cấp bằng phương pháp miễn
dịch trên 138 BN LXM cấp thấy xếp loại miễn dịch đóng vai trò quan trọng ở
22% trường hợp không phân biệt được AML hay ALL bằng HHTB, 13% thể
LXM cấp hỗn hợp và ông đưa ra khuyến cáo phương pháp tốt nhất xếp loại
LXM cấp phải kết hợp giữa HTH, HHTB và MDH [27]. Ngày nay kỹ thuật
này đã trở thành thường quy để chẩn đoán xếp loại bệnh lý ác tính cơ quan tạo
máu ở nhiều trung tâm huyết học trên thế giới và đã có rất nhiều công trình
nghiên cứu về XLMD ở bệnh nhân LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng
lympho ở trẻ em nói riêng bằng kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy. Wan S và cs
(2002) nghiên cứu trên 86 trường hợp LXM cấp dòng lympho cho kết quả
95.3% số trường hợp là LXM cấp dòng lympho B, trong đó LXM cấp dòng B
chung và tiền B lần lượt chiếm 76.8% và 6.1%. Dấu ấn CD34(+) gặp trong
57.0% số trường hợp và số trường hợp có biểu hiện kháng nguyên dòng tủy
chiếm 34.9%. Trong các trường hợp LXM cấp dòng tiền B, các trường hợp có


20

CD33(+) gặp phổ biến hơn so với CD13(+), song sự khác biệt này không xuất
hiện ở các dưới nhóm khác của LXM cấp dòng lympho [28]. Năm 2003, tác
giả Shen HQ và cs công bố trên tạp chí Nhi khoa Trung Quốc, nghiên cứu xếp
loại miễn dịch trên 222 bệnh nhi LXM cấp sử dụng phương pháp đếm tế bào
dòng chảy đa màu, có 124 bệnh nhi LXM cấp dòng lympho, trong đó 75.8%
là LXM cấp dòng lympho B và 24.2% là LXM cấp dòng lympho T. CD13 là
kháng nguyên dòng tủy hay biểu hiện bất thường nhất trong nhóm này
(18.5%), tiếp đến là CD15 (11.3%), CD11b (6.5%) và CD33 (4.3%) [29].
Nghiên cứu tương tự của nhóm nghiên cứu gồm các tác giả Khurram M và cs
(2010) trên 100 bệnh nhân LXM cấp cho kết quả LXM cấp dòng lympho chiếm
73%, dòng tủy chiếm 27%, trong đó có 26% các trường hợp có biểu hiện các

kháng nguyên bất thường [30]. Một nghiên cứu khác ở Nhật Bản do
Iwwamoto.S và cs tiến hành trên 1174 bệnh nhi được chẩn đoán mới LXM cấp
dòng lympho, kết quả cho thấy LXM cấp dòng lympho B chiếm 87%, dòng
lympho T chiếm 13%. Trong nhóm LXM cấp dòng lympho B, dưới nhóm LXM
cấp dòng B sớm chiếm tỷ lệ cao nhất (81%). Hơn 90% các trường hợp này có
biểu hiện CD19, CD79a, CD22, CD10 và TdT. CD34 biểu hiện ở 3/4 các trường
hợp. Với nhóm LXM cấp dòng lympho T, CyCD3 và CD7 có biểu hiện dương
tính ở tất cả các trường hợp. Hơn 80% các trường hợp có CD2, CD5 và TdT
dương tính.Trong 2 nhóm LXM cấp dòng lympho B và LXM cấp dòng lympho
T, CD13 và CD33 biểu hiện dương tính bất thường gặp ở nhóm LXM cấp dòng
lympho B nhiều hơn [31].
Liên quan giữa các dấu ấn miễn dịch với vấn đề điều trị và tiên
lượng trong LXM cấp dòng lympho ở trẻ em.
Trong nhiều năm trở lại đây, đã có hàng loạt các nghiên cứu khác nhau
trên thế giới đã đưa ra những lập luận về mối tương quan giữa sự biểu hiện
của các dấu ấn miễn dịch khảo sát được trên Đếm tế bào dòng chảy với vấn


21

đề điều trị và tiên lượng cho bệnh nhân LXM cấp nói chung và LXM cấp
dòng lympho ở trẻ em nói riêng. Nghiên cứu trên 335 bệnh nhi mới mắc LXM
cấp dòng lympho năm 1993 của Pui CH và cs cho thấy, nhóm bệnh nhi LXM
cấp dòng lympho B có CD34+ có thời gian sống thêm 5 năm không triệu
chứng (EFS) cao hơn (83% ± 6%) so với nhóm bệnh nhi có CD34- (63% ±
10%). Ở nhóm bệnh nhi LXM cấp dòng lympho T, kết quả ngược lại. Nhóm
bệnh nhi LXM cấp dòng lympho T có CD34+ có tỷ lệ thâm nhiễm thần kinh
cao hơn so với nhóm bệnh nhi không có CD34+, đây là một trong những tiên
lượng rất xấu cho nhóm bệnh nhi có không CD34+ [32]. Trong nghiên cứu
của Sébastien M và cs năm 2010 tiến hành trên 143 bệnh nhân LXM cấp dòng

lympho B không có NST Philadelphia, kết quả cho thấy ở tháng thứ 42, nhóm
bệnh nhân có CD20+ và số lượng BC máu ngoại vi >30G/l có tỷ lệ tái phát cao
hơn, tỷ lệ sống không triệu chứng thấp hơn so với nhóm không có CD20+ [33].
Một nghiên cứu khác gần đây của Cario G, Rhein P và cs tiến hành trên 1065
bệnh nhi mới được chẩn đoán, được điều trị bằng phác đồ BFM2000, chia bệnh
nhi thành 2 nhóm: nhóm có biểu hiện dương tính mạnh với CD45 và nhóm có
biểu hiện dương tính yếu với CD45; giá trị phân chia là 75% quần thể dương
tính với CD45; phân tích số liệu trên 2 nhóm LXM cấp dòng B và LXM cấp
dòng T độc lập. Kết quả cho thấy ở cả hai nhóm LXM cấp dòng B và LXM cấp
dòng T, CD45+ mạnh có liên quan đến tỷ lệ đáp ứng với prednisolone thấp hơn,
thời gian sống thêm không triệu chứng thấp hơn và tỷ lệ tái phát cao hơn [34].
1.5.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam.
Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về LXM cấp kể cả về
triệu chứng lâm sàng, xếp loại và theo dõi điều trị. Từ năm 1980, tác giả Bạch
Quốc Tuyên và cộng sự đã ứng dụng phương pháp hình thái học và hóa học tế
bào để xếp loại LXM cấp tại bệnh viện Bạch Mai, kết quả cho thấy LXM cấp
dòng lympho chiếm 29,54%. Năm 1986, tác giả Nguyễn Ngọc Minh tổng kết


22

trên 200 bệnh nhân LXM cấp tại BV TW Huế, trong đó đã sử dụng phương
pháp hình thái học tế bào để xếp loại [35]. Tác giả Nguyễn Công Khanh,
Dương Bá Trực năm 1987 đã sử dụng phương pháp nghiên cứu hình thái họchóa học tế bào để xếp loại cho 321 bệnh nhi theo FAB cho thấy thể lympho
chiếm 65% trường hợp [36]. Tác giả Đỗ Trung Phấn và Trần Thị Minh
Hương (2002) nghiên cứu tình hình bệnh máu tại viện Huyết học-Truyền
máu, Bệnh viện Bạch Mai thấy bệnh LXM cấp gặp với tỷ lệ cao nhất (chiếm
38,5%) trong số các bệnh máu gặp tại Bệnh viện Bạch Mai [1]. Nguyễn Công
Khanh, Dương Bá Trực, Trần Thị Hồng Hà và cs nghiên cứu xếp loại LXM
cấp ở 142 BN trẻ em từ 2002 đến 2004 nhận thấy ALL chiếm 62% (tế bào B

chiếm 68,2% BN ALL) và đã đưa ra một số đặc điểm dấu ấn miễn dịch trong
các thể LXM cấp [37]. Tác giả Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Triệu Vân đã nghiên
cứu áp dụng phương pháp MDH để xếp loại LXM cấp tại viện Huyết họcTruyền máu trong 10 năm từ năm 1996 cho kết quả về tỷ lệ AML là 67%,
dòng lympho 20,2%, các thể LXM khác là 12,8% [38]. Tác giả Trần Văn Bé,
Lê Hữu Tài nghiên cứu sử dụng phương pháp MDH để xếp loại LXM cấp tại
bệnh viện Truyền máu- Huyết học TP.HCM cho thấy phương pháp MDH có
giá trị trong xếp loại chính xác các thể bệnh LXM cấp, điều chỉnh, bổ sung tốt
cho phương pháp HTH-HHTB [39].
Như vậy đến nay trên thế giới và Việt Nam, Đếm tế bào dòng chảy đã
và đang được xem như một công cụ bổ sung cho phương pháp hình thái họchóa học tế bào trong xếp loại LXM cấp. Không những là một phương tiện
chẩn đoán hữu hiệu, nhiều nghiên cứu cũng đã bước đầu cho thấy mối tương
quan giữa vấn đề đáp ứng điều trị và tiên lượng với các thông tin thu được từ
Đếm tế bào dòng chảy.


23

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu bao gồm 94 bệnh nhi trong độ tuổi từ 1 tháng
đến 15 tuổi được chẩn đoán lần đầu LXM cấp dòng lympho, điều trị tại khoa
lâm sàng Bệnh máu trẻ em, Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương từ tháng
10/2013 đến tháng 8/2014
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân.
 Bệnh nhân độ tuổi từ 1 tháng tuổi đến ≤ 15 tuổi;
 Bệnh nhân vào viện được chẩn đoán xác định LXM cấp dòng lympho;
 Bệnh nhân tự nguyện đồng ý tham gia vào nghiên cứu.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ.
Loại ra những bệnh nhân không đủ tiêu chuẩn lựa chọn (quá độ tuổi,

chẩn đoán LXM cấp thể tủy hoặc thể lai,…)
2.2. Phương tiện nghiên cứu.
2.2.1. Bệnh phẩm.
 Máu ngoại vi:
o 1 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA K3 để đếm các chỉ
số huyết học máu ngoại vi và làm tiêu bản máu đàn.
o 1 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA K3 để làm xếp loại
miễn dịch bằng kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy.
 Dịch hút tủy xương: Lấy tủy ở gai chậu sau trên của bệnh nhân.
o 0,5 ml dịch tủy có chống đông bằng EDTA K3 để làm xét nghiệm
HTĐ, nhuộm HHTB
o 1 ml dịch tủy hoặc máu ngoại vi có chống đông bằng EDTA K3
để làm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy.


24

2.2.2. Phương tiện nghiên cứu.
 Kính hiển vi quang học;
 Máy đếm tế bào ADVIA;
 Ống chống đông EDTA;
 Ống nghiệm các loại, pipet, đầu côn, giá xét nghiệm;
 Máy ly tâm;
 Máy Vortex;
 Máy hút;
 Hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy Navios của hãng BD, và hệ thống
máy FC500 của Beckman Coulter.
2.2.3. Hóa chất và sinh phẩm.
 Hóa chất nhuộm hóa học tế bào: Giemsa, MPO, SBB, PAS
 Các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang (PA, FITC, ECD, PC5)

sử dụng trong xét nghiệm xếp loại miễn dịch: CD34, HLA-DR, CD2, CD3,
CD19, CD13, CD33, CD15, CD117, CD45; CyCD79a, CD10, CD8, CD5,
CD7, CyCD3, TdT;
 Dung dịch ly giải hồng cầu;
 Dung dịch đệm PBS;
 Dung dịch cố định tế bào Flowfix;
 Dung dịch phá tế bào Cytofix để thực hiện xét nghiệm nội bào.;
 Dung dịch chạy máy (Sheath), dung dịch rửa máy.
2.2.4. Công cụ nghiên cứu.
Panel xếp loại miễn dịch.
 Panel 1: Là panel tối thiểu áp dụng cho tất cả các trường hợp LXM cấp
Bao gồm có 12 dấu ấn sau: CD45, CD13, CD33, CD15, CD117, CD2,
CD3, CD19, CD34, HLA-DR, CD20, CD22.


25

 Panel 2: Dựa vào kết quả ở panel 1 mà ta lựa chọn panel thứ 2 để xác
định dưới nhóm LXM cấp.
o Panel cho dòng lympho B: CD10, CyCD79a
o Panel cho dòng lympho T: CD5, CD7, CD8, CyCD3
Quy trình nhuộm kháng thể trong xét nghiệm xếp loại miễn dịch:
gồm các bước cơ bản sau:
 Pha loãng mẫu bằng dung dịch PBS;
 Ly giải hồng cầu bằng dung dịch Lysing;
 Rửa mẫu sau ly giải hồng cầu;
 Ủ mẫu với kháng thể;
 Rửa mẫu sau ủ kháng thể;
 Thêm PBS và phân tích trên máy Đếm tế bào dòng chảy Navios.
2.3. Phương pháp nghiên cứu.

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu.
Nghiên cứu thuộc loại nghiên cứu mô tả cắt ngang, hồi cứu và tiến cứu
có can thiệp lâm sàng.
Cách chọn mẫu: chọn mẫu ngẫu nhiên thuận tiện cho đến thời điểm kết
thúc nghiên cứu.