Nghiên cứu hiệu quả điều trị loét da mạn tính của bài thuốc GTK108 trên động vật thực nghiệm

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Loét da mạn tính (chronic skin ulcer - CSU) là những vết loét da tồn tại
trên 4 tuần [1],[2] do rối loạn trật tự và thời gian sửa chữa về mặt giải phẫu và
chức năng tại vị trí tổn thương [3]. Loét da mạn tính rất thường gặp, gây tác
động tiêu cực về tâm lý và chất lượng sống của bệnh nhân. Việc điều trị kéo
dài làm tăng gánh nặng tài chính đối với mỗi bệnh nhân và cả hệ thống chăm
sóc sức khỏe. Tại Mỹ, loét da mạn tính ảnh hưởng đến khoảng 6,5 triệu bệnh
nhân và chi phí mỗi năm dành cho điều trị lên tới 25 tỷ USD, con số này có
xu hướng ngày càng tăng do chi phí y tế tăng, dân số già cùng với sự tăng lên
của bệnh tiểu đường và béo phì trên toàn cầu [3]. Tại Anh, theo thống kê của
Vụ Sức khỏe Quốc gia (National Health Service – NHS), trung bình hằng
năm có 575.600 người mắc vết thương mạn tính và chi phí điều trị trung bình
là 4000 – 5400 bảng Anh/bệnh nhân [4].
Với sự phát triển của y học, các trung tâm nghiên cứu và điều trị loét da
mạn tính và vết thương lâu liền trên thế giới và tại Việt Nam ngày càng được
chú trọng phát triển. Ngoài các phương pháp y học hiện đại đã được áp dụng,
các bài thuốc y học cổ truyền ngày càng đóng vai trò quan trọng để góp phần
làm giảm áp lực về bệnh tật của mặt bệnh này.
Từ xa xưa, Dầu lòng đỏ trứng gà được Tuệ Tĩnh sử dụng để trị liệu các
chứng lở, nhọt lở ở trẻ em và phỏng [5], đồng thời cũng đã được chứng minh
có tác dụng liền vết loét da mạn tính trên động vật thực nghiệm và lâm sàng
với cơ chế: giảm hoại tử, kích thích mô hạt và biểu mô hóa, giảm sự hình
thành mô sẹọ [6],[7],[8].
Đại hoàng và Hoàng đằng từ lâu đã được sử dụng trong điều trị các
bệnh da liễu, là những vị thuốc có khả năng kháng khuẩn, đặc biệt là các
chủng vi khuẩn thường gặp trên da [9],[10],[11],[12].


2

Với sự kế thừa những thành tựu của y học cổ truyền đã được nghiên
cứu chứng minh bằng phương pháp khoa học, chúng tôi hi vọng bài thuốc
GTK108 – một chế phẩm điều trị tại chỗ, gồm Dầu lòng đỏ trứng gà, Đại
hoàng và Hoàng đằng, có thể làm tăng khả năng điều trị loét da mạn tính
thông qua điều chỉnh các rối loạn gây chậm liền vết thương.
Bài thuốc GTK đã được nghiên cứu chứng minh không có độc tính và
kích ứng da trên động vật thực nghiệm. Để làm rõ hiệu quả điều trị loét da
mạn tính và xác định cơ chế tác dụng của thuốc, trước khi được áp dụng trên
người, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu hiệu quả điều trị loét da mạn tính
của bài thuốc GTK108 trên động vật thực nghiệm” với 02 mục tiêu:
1.

Xác định hiệu quả điều trị tại chỗ của bài thuốc GTK108 đối với các
vết loét da mạn tính trên động vật thực nghiệm.

2.

Đánh giá đặc điểm cấu trúc, siêu cấu trúc và hóa mô miễn dịch các
vết loét da mạn tính trên động vật thực nghiệm được điều trị bằng
bài thuốc GTK108.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Quá trình liền vết thương sinh lý

Da là cơ quan phủ ngoài cơ thể gồm 3 lớp: thượng bì, chân bì và hạ bì.

Ngoài chức năng giữ nhiệt, miễn dịch, da còn có khả năng tự liền lại khi tổn
thương (các loại vết thương, bệnh lý như tiểu đường, bệnh lý tĩnh mạch...)
[13],[14].
Quá trình liền vết thương sinh lý gổm 4 giai đoạn liên tục, nối chồng
nhau và được lập trình chính xác: xung huyết, viêm, tăng sinh và tái tạo. Sự
gián đoạn, bất thường hoặc kéo dài quá trình này có thể dẫn đến việc chậm
hoặc không lành vết thương (trở thành mạn tính) (Bảng 1.1) [14],[15].
Bảng 1.1. Quá trình liền vết thương sinh lý (Nguồn: Guo S. 2010) [15]
Giai đoạn
Xung huyết

Sự kiện về tế bào và sinh lý học
1. Co mạch
2. Tập trung tiểu cầu, giải phóng các hạt, hình
thành cục máu đông
Viêm
1. Sự xâm nhập của bạch cầu trung tính
2. Sự xâm nhập của bạch cầu đơn nhân và đại
thực bào
3. Sự xâm nhập của bạch cầu lympho
Tăng sinh
1. Tái biểu mô hóa
2. Tăng sinh mạch
3. Tổng hợp collagen
4. Hình thành chất nền ngoại bào (ECM)
Tái tạo
1. Tái tạo collagen
2. Trưởng thành và giảm số lượng mạch máu

Trong cả quá trình liền vết thương, mỗi sự kiện đều có sự tham gia của
các tế bào (nguyên bào sợi, tế bào sừng, tế bào biểu mô, tế bào viêm) và các
phân tử (ECM, intergrins, yếu tố tăng trưởng và MMPs). Các thành tố này
giúp cho các sự kiện diễn ra một cách tuần tự và điều hòa. Vết thương mạn


4

tính được cho là sự kéo dài giai đoạn viêm vốn thường chỉ kéo dài 1-2 ngày
(Hình 1.1) [16],[17].

Hình 1.1. Các tế bào và yếu tố tham gia vào các sự kiện của quá trình liền
vết thương (Nguồn: Trung T. Nguyen 2016) [18]
 Matrix metalloproteinase (MMPs)

MMPs là các enzyme chứa kẽm phụ thuộc calci, liên quan đến quá trình
sửa chữa ECM, huy động tế bào và tái tạo mô; tuy nhiên sự có mặt quá mức
của MMPs có thể ức chế quá trình liền vết thương [19].
MMP-9 (gelatinase B) đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm, sự
di chuyển của tế bào sừng (keratinocyte) ở mép vết thương, điều hòa sự tăng
sinh mạch thông qua sự hoạt hóa các cytokine tiền sinh mạch (gồm TNF-α và
VEGF) và tạo ra các peptide chống sinh mạch [19],[20].
 Vimentin

Vimentin là một protein sợi trung gian type III tham gia cấu thành khung
xương của các tế bào sửa chữa ở mép vết thương. Vimentin, được điều hòa
bởi TGFβ1, trực tiếp tham gia vào 4 hoạt động quan trọng của tế bào trong


5

kiểm soát liền vết thương: tăng sinh nguyên bào sợi, tích lũy collagen, biệt
hóa tế bào sừng và tái biểu mô hóa. Thiếu vimentin có thể dẫn đến làm chậm,
kém và không liền vết thương hoàn toàn [21].
 CD34

CD34 là một marker có trên bề mặt của tế bào gốc tạo máu, biểu hiện
bởi tế bào sợi. Tế bào gốc CD34 + thường di chuyển đến các vết thương, khối
u và các vùng thiếu máu, giúp liền vết thương thông qua thúc đẩy quá trình
liền biểu bì và tân tạo mạch ở mô hạt in vivo [22]. Các tế bào sợi CD34 + còn
hoạt động như tế bào trình diện kháng nguyên và tiết ra các cytokin [23].
Trong quá trình liền vết thương sinh lý, MMP-9, Vimentin và CD34 đều
giảm dần, được xác định bằng các phương pháp nhuộm đặc hiệu và quan sát
dưới kính hiển vi.
1.2. Loét da mạn tính
1.2.1. Theo quan điểm của Y học hiện đại
1.2.1.1.

Khái niệm

Loét da mạn tính là một vết thương trên da về giải phẫu và chức năng
không phục hồi trong vòng 4 tuần hoặc tái phát nhiều lần [1],[2].
Sự hình thành vết loét mạn tính xảy ra do mất cân bằng giữa các yếu tố
sửa chữa và tổn thương mô trong quá trình liền vết thương [16], dẫn đến rối
loạn, gián đoạn hoặc kéo dài quá trình liền vết thương thông thường [14],[16].
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng
Có nhiều yếu tố cản trở quá trình liền vết thương và được chia thành 2
nhóm: yếu tố toàn thân và yếu tố tại chỗ. Trong khi yếu tố tại chỗ (giảm phân
áp oxy, nhiễm khuẩn, dị vật, viêm tắc tĩnh mạch) trực tiếp ảnh hưởng đến các
đặc điểm của vết loét thì yếu tố toàn thân (tuổi, giới, stress, nội tiết,…) lại

mang tính cá thể, khác nhau ở từng bệnh nhân [14],[16].


6

Việc sử dụng corticoid toàn thân hay tại chỗ đều làm trì hoãn quá trình
biểu mô hóa tại vết thương. Điều này được ứng dụng để gây vết thương lâu
liền hay loét da mạn tính trên động vật [24],[25],[26].
1.2.3. Phân độ và đánh giá
1.2.3.1. Phân độ

Cho đến nay, việc phân độ của loét da mạn tính vẫn chủ yếu dựa vào
phân độ của NPUAP và EPUAP về loét da mạn tính do tỳ đè. Theo đó, có 2
nhóm chính (Hình 1.3) [27]:
•

Nhóm có thể phân loại (4 độ): Độ I - Ban đỏ không mất màu trên da còn
nguyên vẹn; Độ II - Loét nông; Độ III - Tổn thương sâu nhưng chưa vượt qua
lớp cân; Độ IV - Tổn thương sâu, xâm nhập cân, cơ, xương.

•

Nhóm không thể phân loại: không thể phân giai đoạn (a) và nghi ngờ tổn
thương mô sâu (b).
(d)

Độ I

Độ II

Độ III

Độ IV

a

b

Hình 1.2. Phân độ loét da mạn tính do tỳ đè (Nguồn: NPUAP. 2017 [27])
1.2.3.2. Đánh giá và theo dõi liền vết thương

Có nhiều công cụ được sử dụng để theo dõi quá trình liền vết thương:
Thang điểm đánh giá liền vết loét do tỳ đè (Pressure Ulcer Scale for Healing –
PUSH); Công cụ đánh giá vết thương Bates-Jensen (Bates-Jensen Wound
Assessment Tool – BWAT); DESIGN/DESIGN-R... [28].
Năm 2002, Hiệp hội loét do tỳ đè Nhật Bản (the Japanese Society of
Pressure Ulcers - JPSU) giới thiệu thang điểm DESIGN được sử dụng trong
phân loại và theo dõi quá trình liền vết thương mạn tính trên lâm sàng (Bảng


7

2.1), gồm 7 chỉ tiêu: Độ sâu (Depth); Tiết dịch (Exudate); Kích thước ( Size);
Nhiễm trùng (Infection); Mô hạt (Granulation); Mô hoại tử (Necrotic tissue);
Hốc (Pocket) [29]. Với ưu thế tương đối đơn giản, dễ dàng sử dụng trong quá
trình đánh giá và theo dõi vết thương, thang điểm DESIGN đã đươc sử dụng
trong rất nhiều nghiên cứu [7],[30].
1.2.3.3.

Điều trị

Điều trị loét da mạn tính là một quá trình toàn diện, gồm có điều trị
nguyên nhân, chăm sóc toàn thân, điều trị tại chỗ (Bảng 1.2) [31],[32].
Bảng 1.2. Chăm sóc vết loét do tỳ đè (Nguồn: Sibbald R. 2011) [33]
Loét giường 2011
Điều trị nguyên nhân

Khuyến cáo
- Xác định tình trạng tưới máu
- Xác định/điều trị nguyên nhân (nếu có thể) để
xác định khả năng liền vết thương
- Chú ý các yếu tố/bệnh tật phối hợp để cá thể
hóa chăm sóc
Chăm sóc theo nhu cầu Đánh giá, hỗ trợ, giáo dục với từng khó chịu của
bệnh nhân
bệnh nhân
(Đau, hoạt động hằng ngày, trạng thái tinh thần,
cai thuốc lá, kết nối với hệ thống y tế)
Chăm sóc tại chỗ vết loét - Rửa, đánh giá các đặc điểm và theo dõi tại chỗ
(DIM+E)
vết loét
- Cắt lọc hoại tử (Debridement)
- Chống viêm và nhiễm khuẩn (Infection)
- Duy trì cân bằng độ ẩm (Moisture balance)
- Cân nhắc các phương pháp tích cực (Edge)


8

1.2.4. Theo quan điểm của Y học cổ truyền
1.2.4.1. Bệnh danh

Theo quan điểm Y học cổ truyền, không có bệnh danh loét da mạn tính,
mà tùy vào triệu chứng, nguyên nhân có thể thuộc phạm vi các chứng như:
kim thương (kim khí gây rách da – cơ), ngoan sang, sang thương (tổn thương
rách đứt da, cơ, mạch máu...), ung thư [34],[35].
1.2.4.2. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

Nguyên nhân gây bệnh của ngoan sang nhấn mạnh nguyên nhân gây
bệnh là chính khí hư suy, với sự tổn hao của vệ khí, dinh khí và thận tinh (tinh
tiên thiên). Loét da phát triển là kết quả của chính tà giao tranh. Dinh vệ bất
túc biểu hiện da lâu lành, tinh khí suy là chính khí hư đạt đến cực điểm, biểu
hiện loét da mạn tính. Người bệnh lâu ngày, chính khí hư tổn thì bệnh từ lúc
bắt đầu đã có chiều hướng mạn tính [36].
Sách Linh khu có viết, ung thư do “dinh khí trệ lưu trong kinh mạch,
khiến huyết dịch ngưng trệ không tuần hoàn, vệ khí theo đó bị cản trở mà
không thông suốt, tắc nghẽn ở trong, lúc này gây nóng. Nhiệt lớn không dứt,
nhiệt thịnh sẽ khiến cơ thịt hoại tử hóa mủ” [35]. Mô hoại tử là yếu tố chính
góp phần tiến triển bệnh của loét da mạn tính [2], do đó mới nói “hủ nhục bất
khứ, tân nhục bất sinh” [37]. Bệnh biểu hiện chứng trạng của nhiệt và ứ, lâu
ngày ảnh hưởng đến công năng của ngũ tạng, gây chứng hư trên lâm sàng.
Trong điều trị vết thương phần mềm, thầy thuốc không những cần chú ý
tới tổn thương tại chỗ mà còn phải chú ý tới điều trị toàn thân [34].
1.2.4.3. Thể bệnh

Theo sách Bệnh học Ngoại – Phụ Y học cổ truyền do Bộ Y tế ấn hành
[34], sang thương được chia làm 4 thể: Thể huyết ứ (không nhiễm trùng), Thể
nhiệt độc (nhiễm trùng thời kỳ đầu), Thể thấp nhiệt, Thể khí huyết hư.


9

Nhiều tác giả lại chia loét da mạn tính thành 3 thể: Khí huyết hư, Tỳ hư
thấp trệ, Khí hư huyết ứ [2], [38], [39].
• Thể khí huyết hư: Vết thương có màu thâm hoặc tím, da xung quanh cứng,
người mệt mỏi, nói nhỏ.
• Thể tỳ hư thấp trệ: Vết thương sưng nề, ẩm ướt, vàng nhạt và lớp mủ mỏng,
da có màu xám, đại tiện nát.
• Thể khí hư huyết ứ: Vết thương nhiều dịch mủ, nóng đau hoặc đau ngứa ở
trung tâm vết loét, da ấm hoặc nóng nhẹ, hơi đỏ quanh vết loét.
1.2.4.4. Điều trị
Điều trị bệnh trong Y học cổ truyền là tác động đa kênh, đa mục tiêu, đa
liên kết và đa vai trò, vừa sửa chữa tổn thương, vừa không làm ảnh hưởng đến
mô lành, cải thiện khả năng tự sửa chữa của cơ thể, tạo môi trường sinh lý để
thúc đẩy lành vết thương, giảm hình thành sẹo [39].
Như đã phân tích ở phần trên, hủ (mô hoại tử) khiến tổn thương loét da
tiến triển nặng hơn, theo đó “khứ hủ” (làm sạch hoại tử) đóng vai trò then
chốt trong điều trị. Một số nguyên lý trong điều trị loét da mạn tính như: “ổi
nùng trưởng nhục” (giữ lượng dịch mủ phù hợp trên bề mặt vết loét để kích
thích tạo mô hạt), “khứ hủ sinh tân” (làm sạch mô hoại tử để tạo da mới), “cơ
bình bì trưởng” (ức chế viêm để kích thích liền da). Bên cạnh đó, các pháp
thanh (nhiệt), hóa (ứ), bổ (hư) cũng được được sử dụng linh hoạt trong điều
trị các giai đoạn của bệnh [2],[35]:
- Giai đoạn đầu: Nguyên tắc điều trị là thanh nhiệt trừ thấp, điều hòa
dinh phận, dùng bài Tứ diệu hoàn kết hợp Tỳ giải thẩm thấp thang.
- Giai đoạn giữa: Hành khí hoạt huyết, trừ thấp trệ, có thể dùng bài Đào
hồng tứ vật thang gia giảm.
- Giai đoạn sau: Lý khí hoạt huyết và bổ hư sinh cơ, có thể dùng bài Bổ
dương hoàn ngũ thang.

10

Đối với các thuốc dùng ngoài, vẫn trên nguyên lý “khứ hủ sinh cơ” và
“cơ bình bì trưởng” cũng có rất nhiều bài thuốc và dạng bào chế:
- Dạng nước rửa: Tứ hoàng sắc rửa, Nước đun lá trầu không hòa bột
phèn phi [34].
- Dạng mỡ: Shiunko [40], [41], [42], mỡ Thanh đại [2]
- Dạng cao: Cao lá cỏ lào [34], [43], Dầu lòng đỏ trứng gà [7],[8].
- Dạng bột: Bảo sinh cơ, Cửu nhật tán, Kim tử đan [34], bột Sinh cơ [2]
Tóm lại, điều trị loét da mạn tính cần chú ý nguyên tắc toàn diện phổ
biến trong Y học cổ tuyền: cân nhắc các yếu tố toàn thân (bệnh kèm theo, thể
trạng, tuổi, giới...), theo thể bệnh, giai đoạn bệnh, phối hợp điều trị toàn thân
và tại chỗ, điều trị cả trong (thuốc uống) và ngoài (thuốc bôi, thuốc đắp,
châm, cứu), điều trị cả nguyên nhân và triệu chứng [2],[34].
1.3. Bài thuốc GTK108
1.3.1. Thành phần bài thuốc
1.3.1.1. Đại hoàng (Rheum palmatum Baill)

Thành phần hoá học: Trong Đại hoàng có 2 loại hoạt chất có tác dụng
ngược nhau. Hoạt chất có tác dụng tẩy là các dẫn chất của anthraquinonoid
tổng lượng chiếm khoảng 3 – 5% phần lớn ở trạng thái kết hợp gồm có
chrysophanol emodin, aloe-emodin, rhein và physcion. Hoạt chất có tác dụng
thu liễm là các hợp chất có tanin (rheotannoglycosid) [9], [44].
Tính vị, công năng: Vị đắng, tính hàn, qui kinh Tỳ, Vị, Đại tràng, Can,
Tâm. Khứ hủ sinh tân, tả hạ công tích, tả hỏa, thanh nhiệt giải độc, hoạt huyết
hóa ứ, lợi thủy thanh nhiệt hóa thấp [9].
Đại hoàng có tác dụng kháng khuẩn rộng, cả vi khuẩn Gram âm và Gram
dương. Thành phần ức chế vi khuẩn chủ yếu là dẫn chất của Anthraquinone
[12]. Thuốc còn có tác dụng ức chế một số nấm gây bệnh và virút cúm [11],
[45]. Emodin trong Đại hoàng thúc đẩy sửa chữa các vết thương trên chuột

11

thông qua một cơ chế phức tạp liên quan đến kích thích tái tạo mô và điều
chỉnh con đường tín hiệu TGF-β qua protein Smads [11].
Chủ trị: Chứng sốt cao gây táo bón, tích trê thức ăn, bụng đầy trướng,
vật vã, mê sảng; hỏa độc gây sốt cao, xuất huyết; thấp nhiệt hoàng đản; thống
kinh, bế kinh; mụn nhọt, lở loét miệng [9].

1.3.1.2. Hoàng đằng (Fibraurea recisa Pierre hay F. tinctoria Lour)

Thành phần hoá học: Alcaloid (3%), chủ yếu là palmatine 1-3,5%
ngoài ra còn có jatrorrhizin, columbamin và berberin, fibrecisine [44].
Tính vị, công năng: Vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải
độc, tiêu viêm, lợi thấp thông tiện, sát trùng. Palmatine có tác dụng ức chế sự
phát triển của S. hemolyticus và Staph. aureus. Palmatine và berberin hoạt
động như kháng sinh ức chế bơm thải kháng sinh ở vi khuẩn, có thể kết hợp
với các kháng sinh khác để giảm tình trạng kháng kháng sinh của P.
aeruginosa phân lập từ vết thương bỏng [10]. Fibrecisine có tác dụng chống
nấm [46].
Chủ trị: Làm giảm viêm, chữa viêm ruột, viêm bàng quang, viêm gan,
đau mắt, mụn nhọt, sốt nóng, kiết lỵ, hồi hộp, mất ngủ.
Rễ Hoàng đằng mài với nước dùng bôi ngoài chữa mụn nhọt, bỏng;
nước sắc Hoàng đằng dùng rửa vết thương.
1.3.1.3. Dầu lòng đỏ trứng gà

Thành phần hóa học: chủ yếu là các acid béo (omega-3, omega-6,
omega-7, omega-9, DHA) và một số kim loại (Mg, Zn) [7],[8].
Tính vị, công năng: cam, ôn, không độc, tác dụng kích thích tăng sinh

mô hạt, giảm hoại tử, kích thích biểu mô hóa, giảm hình thành mô sẹo [5],[6],
[7].


12

Chủ trị: Mạch lươn hàng năm hàng tháng không khỏi, nước mủ dầm dề,
chỗ lở không liền miệng, không sinh da non và mọi chứng ác sang; phỏng [5].
Tác giả Lương Thị Kỳ Thủy và cộng sự (2015) nghiên cứu điều trị tại chỗ các
vết loét da mạn tính bằng dầu lòng đỏ trứng gà, hiệu quả liền da rất cao [7].
1.3.2. Cơ chế và tác dụng của bài thuốc GTK108
Thuốc GTK108 bao gồm các thành phần cơ bản của dầu lòng đỏ trứng gà
và các hoạt chất chiết được từ Đại hoàng và Hoàng đằng. Trong đó, dầu lòng
đỏ trứng gà chủ yếu là các acid béo, các yếu tố vi lượng. Dầu lòng đỏ trứng gà
có chứa các acid béo không no như linoleic (ω6), linolenic (ω3) là những chất
chống oxy hóa mạnh, eicosenoic, và các acid béo không no 20 carbon là tiền
chất tạo thành các eicosanoid (các phân tử dẫn truyền, chống viêm) [47]. Trong
thành phần của Đại hoàng có các dẫn chất anthraquinone và Hoàng đằng với
các dẫn chất palmatin và berberin đều có tính kháng sinh [12], [44].
Cho tới nay, các vị thuốc trong thành phần của GTK108 được sử dụng
rộng rãi để điều trị bỏng, eczema, các chứng viêm da, loét miệng, loét da.
Bước đầu điều trị trên các bệnh nhân loét da mạn tính (hoàn toàn tự nguyện),
chúng tôi nhận thấy, các vết loét da mạn tính có thời gian liền nhanh hơn, mô
hạt mọc đều, màu sắc tươi nhuận, thành và miệng vết thương được biểu mô
hóa hoàn toàn, mật độ sẹo mềm, màu sáng gần tương đương với da xung
quanh. Như vậy, theo chúng tôi, thuốc GTK108 có thể ngăn chặn các rối loạn
quá trình viêm tại vết loét, thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào, tăng sinh
mạch, tăng sinh tế bào biểu mô, đồng thời có khả năng kháng khuẩn tại vết
loét, từ đó làm tăng hiệu quả điều trị đối với các vết loét da mạn tính.
1.4. Phương pháp gây loét da mạn tính trên thực nghiệm

Trong lịch sử y học, nhiều tác giả đã đưa ra các phương pháp gây loét
da trên các động vật thực nghiệm khác nhau. Cho đến nay, chưa có mô hình


13

gây loét mạn tính nào được cho là tối ưu để áp dụng trong nghiên cứu do sự
khác biệt giữa người và động vật về sự lão hóa, hormone, khả năng và tình
trạng nhiễm khuẩn... [48].
1.4.1. Mô hình gây loét da lâu liền với corticosteroid
Năm 2002, Singer A.J. và cộng sự [49] nghiên cứu tác dụng của steroid
tại chỗ trên vết thương da do bỏng ở lợn. Tác giả đã xây dựng mô hình gây
loét như sau: lợn cái nặng 20 - 30kg được an thần bằng Talazine 5mg/kg tiêm
bắp, sau đó được gây mê bằng isoflurane 0,5 – 2,5%. Động vật được cạo lông
và sát khuẩn bằng povidone vùng hông và lưng. Một thanh nhôm nặng 150g,
kích thước 2,5 x 2,5 cm, được làm nóng bằng nước 80oC và lau khô, sau đó áp
lên vùng da đã chuẩn bị bằng trọng lực trong 20 giây. Các vết loét được bôi
Clobetasol propionate 0,05% (Temovate, Durapharmaceuticals, USA).
1.4.2. Mô hình gây loét da do bỏng sâu và tỳ đè
Năm 2006, Kaneko T. và cộng sự [50] đã áp dụng hai mô hình gây loét
da trên chuột:
- Mô hình gây bỏng sâu: Chuột sau khi được gây mê, một miếng sắt
nặng 52 – 54g (100W, 302 – 303oC; đường kính 10mm; lực tiếp xúc 63,7 –
76,4 g/cm2) áp lên vùng da (đã cạo sạch lông) sau nách phải 2cm và cách cột
sống 1,5cm trong 10 giây để gây vết bỏng độ III (tổn thương đến mô dưới da
[51]). Sau 2 ngày, da hoại tử được cắt bỏ dưới gây mê.
- Mô hình gây loét da do tỳ đè: Chuột được làm sạch lông vùng mấu
chuyển lớn bên phải bằng nhíp và dao cạo, sau đó tiến hành gây mê và cố
định lên đĩa gỗ. Một que thép không gỉ (nặng 1,02 – 1,03kg, dài 50cm, đường
kính 19mm với nắp đậy cao su đường kính 12mm) được đặt lên vùng da đã

chuẩn bị trong 24 giờ, lực ấn tăng dần (902,3 – 911,2 g/cm 2). Sau 2 ngày, da
hoại tử được cắt bỏ dưới gây mê.


14

1.4.3. Mô hình gây loét da bằng Adriamycin
Năm 1979, Rudolph R. [52] và cộng sự đưa ra mô hình gây loét da mạn
tính trên chuột bằng cách tiêm Adriamycin (25mg/ml) trong da với liều 50 –
500 µg cho 1 vị trí và có thể được chia thành 4 vị trí trí trên một động vật,
mỗi vị trí tiêm 50 – 100 µg. Hoại tử da sẽ phát triển qua 14 ngày với một phản
ứng viêm nhẹ nhưng dai dẳng. Tổn thương tiếp tục kéo dài > 50 ngày. Một trở
ngại của mô hình gây loét da mạn tính bằng Adriamycin trên chuột là khi tổng
liều trên trọng lượng cơ thể > 5 mg/kg sẽ gây tác dụng toàn thân [52].
Mô hình này áp dụng trên thỏ tương tự trên chuột nhưng liều gây loét
(100 – 2000 µg/vị trí) không gây ảnh hưởng toàn thân. Tổn thương tồn tại từ
45 – 65 ngày [24].
1.5. Các nghiên cứu có liên quan
1.5.1. Nghiên cứu trong nước
Lương Thị Kỳ Thủy và cộng sự (2015) đã nghiên cứu về tác dụng của
dầu lòng đỏ trứng gà (Cao TG) trên vết loét da mạn tính. Dầu lòng đỏ trứng
gà chứa các acid béo mạch dài không no và không gây độc tính. Thuốc có
hiệu quả điều trị đối với loét da mạn tính cả trên thực nghiệm và lâm sàng. Cơ
chế tác dụng của thuốc là kích thích tăng sinh mô hạt, giảm hoại tử, tăng tỷ lệ
và rút ngắn thời gian biểu mô hóa [6],[7].
Trần Hữu Hiệp (2012) nghiên cứu tác dụng của cao lỏng Bạch đàn trong
điều trị vết thương phần mềm nhiễm khuẩn nhận thấy: Cao lỏng Bạch đàn có
tác dụng kháng khuẩn và kích thích mô hạt tại vết thương phần mềm nhiễm
khuẩn tốt hơn so với dung dịch NaCl 10% [53], [54].
Nghiêm Đình Phàn và cộng sự nghiên cứu tác dụng của cao lá Cỏ lào

trong điều trị vết thương phần mềm nhiễm khuẩn và lâu liền: nhóm điều trị
bằng cao lá cỏ lào có tác dụng làm sạch tổ chức hoại tử nhanh hơn, kích thích


15

mô hạt, rút ngắn thời gian điều trị so với nhóm chứng. Nghiên cứu siêu cấu
trúc thấy cao lá cỏ lào giúp đẩy nhanh quá trình collagen hóa. Cao lá cỏ lào
còn có tác dụng ức chế vi khuẩn in vivo và in vitro đối với các chủng vi
khuẩn gây nhiễm khuẩn vết thương như: Staph. aureus, E. coli, Proteus, P.
aeruginosa... [43], [55], [56].
1.5.2. Nghiên cứu nước ngoài
Hou Q. và cộng sự (2014) nghiên cứu tác dụng của bài thuốc ANBP gồm
Long nha thảo (Agrimonia Eupatoria), Liên nhục (Nelumbo Nucifera
Gaertn), Nhũ hương (Boswellia Carteri) và Bồ hoàng (Pollen Typhae
Angustifoliae) khi điều trị loét da trên tai thỏ. Các tác giả nhận thấy bài thuốc
ANBP điều trị tại chỗ không những có tác dụng thúc đẩy liền da do làm giảm
viêm, tăng hình thành mô hạt và biểu mô hóa, mà còn giảm hình thành mô sẹo
do giảm sản xuất collagen, giảm thể tích và chiều dày mô sẹo, tăng trưởng
thành collagen. Cơ chế tác dụng của bài thuốc liên quan đến các con đường
truyền tín hiệu trung gian qua TGF-β1 phụ thuộc Smad [57].
Wu X. và cộng sự (2012) nghiên cứu tác dụng của tinh chất Cốt khí củ
(Polygonum cuspidatum) trên quá trình liền vết thương ở chuột. Kết quả: Tỷ
lệ liền vết thương cao hơn đáng kể ở nhóm điều trị so với nhóm chứng (p <
0,05). Nghiên cứu mô học cho thấy, nhóm điều trị có các bó sợi collagen được
tổ chức tốt hơn, nhiều nguyên bào sợi và nang lông hơn, ít tế bào viêm hơn.
Kết quả hóa mô miễn dịch ghi nhận TGF-β1 tăng cao hơn ở nhóm điều trị (p
< 0,05) [58].
Rastegar F. và cộng sự (2011) nghiên cứu tác dụng của dầu lòng đỏ trứng
gà điều trị vết thương bỏng độ III trên chuột. Kết quả: các vết bỏng ở nhóm

chuột được điều trị bằng dầu lòng đỏ trứng gà giảm kích thước nhanh hơn,
biểu mô hóa tốt hơn và không để lại sẹo khi so sánh với nhóm điều trị bằng


16

silver sulfadiazine 1% và nhóm chứng. Tuy nhiên, nghiên cứu không giải
thích được cơ chế tác dụng của dầu lòng đỏ trứng gà [8].


17

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Chất liệu nghiên cứu
2.1.1. Thuốc nghiên cứu
Thuốc GTK108 được sản xuất tại khoa Dược – Bệnh viện Trung ương
Quân đội 108, dạng cao lỏng được đóng lọ 10ml với tỷ lệ 10g dược liệu / ml
(Phụ lục 1).
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
a) Hóa chất

Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học, xét nghiệm siêu
cấu trúc (Electron Microscopy Sciences, Mỹ).
- Kháng thể kháng CD34, vimentin (Chem-Mate EnVision Detection System
Peroxidase/HPR; DAKO Cytomation).
- Kháng thể kháng MMP9 (rabbit anti-mouse MMP-9, CHEMICON®
International, Inc).
- Mỡ silver sulfadiazine (SSD): lọ 125ml dùng ngoài (Mundipharma).
- Clobetasol propionate 0,05% (Dermovate® Cream, GlaxoSmithKline - Anh).

- Dung dịch NaCl 0,9%: chai 500ml dùng ngoài.
- Dung dịch pha mẫu định lượng vi khuẩn.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (thạch).
b) Thiết bị

- Sắc ký khối phổ GC/MS (Trace GC ultra-ITQ 900, Thermo Sci)
- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AA200-Series + GTA 120
(Agilent).
- Máy đo quang phổ UV-Vis Specord 210 (Analytik Jena).
- Thiết bị Seven Easy đo pH.


18

- Máy cắt siêu mỏng (Ultramicrotome LKB4, Đức)
- Tủ ẩm nuôi cấy vi khuẩn
- Máy đếm khuẩn lạc tự động
- Chương trình phân tích hình ảnh tế bào Image Plus 4.5, Mỹ
- Kính hiển vi quang học (Nikon E600, Nhật)
- Phần mềm Image Pro Plus (Mỹ)
- Kính hiển vi điện tử quét (JEM 510 LV, Nhật)
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM 1400, Nhật)
- Băng vô trùng các loại và bộ dụng cụ vô trùng rửa, thay băng vết loét
- Tăm bông và ống nghiệm vô trùng có nắp
- Dụng cụ biopsy punch
2.2. Đối tượng nghiên cứu
30 thỏ chủng Newzealand White, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng
1,8 – 2,2kg, thỏ cái chưa có con, không mang thai, do Trung tâm chăn nuôi,
Viện Kiểm nghiệm cung cấp.
2.3. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm đối chứng tự thân trên động vật
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Khoa Sinh lý bệnh – Học viện Quân y.
2.5. Thời gian nghiên cứu: 10 tháng (09/2017 – 07/2018)
2.6. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
2.6.1. Cỡ mẫu
Sử dụng công thức tính cỡ mẫu so sánh hai tỷ lệ phần trăm hiệu quả
giữa hai nhóm can thiệp – kiểm định 2 phía:
n1=κn2
Trong đó:

α = 0,05: sai lầm loại I;
β = 0,05: sai lầm loại II: 1 - β: độ mạnh của mẫu


19

p1 = 0,967: tỷ lệ có hiệu quả của phương pháp tương tự
p2 = 0,55: tỷ lệ có hiệu quả của phương pháp cũ (SSD)
κ = n1/n2 : tỷ lệ của mẫu giữa hai nhóm
Số thỏ tối thiểu cho so sánh 2 nhóm GTK và SDD là n = 21. Ở đây
chúng tôi chọn nhóm điều trị GTK n1 = 30 thỏ, nhóm chứng n2 = 30 thỏ với
nhóm silver sulfadiazine (SSD) = 21 thỏ và nhóm NaCl 0,9% = 09 thỏ.
2.6.2. Thiết lập mô hình gây loét trên thỏ
Nghiên cứu của chúng tôi áp dụng phương pháp gây vết thương lâu liền
hay vết thương mạn tính của Singer [49] tại khoa Sinh lý bệnh - Học viện
Quân y.
Đối tượng: 30 thỏ chủng Newzealand White, cả 2 giống, khỏe mạnh,
trọng lượng 1,8 – 2,2kg, thỏ cái chưa có con và không mang thai, do trung
tâm Viện Kiểm nghiệm cung cấp.

Chăm sóc: Các động vật được nhốt riêng, nhiệt độ 22 oC (± 3oC), độ ẩm
30 – 70%, chiếu sáng nhân tạo với 12 giờ sáng và 12 giờ tối [59]. Thức ăn
chuẩn do công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN sản xuất, uống nước không
hạn chế.
Mô hình: Gây mê cho thỏ bằng Thiophental, liều 50mg/kg. Cạo bỏ lông
vùng sống lưng, sau đó cố định tư thế sấp trên bàn. Đổ đầy nước sôi (100 oC)
vào ống gây bỏng có đường kính 5 cm (lau khô bề mặt ống gây bỏng), đặt
ống gây bỏng vuông góc mặt da, tiếp theo đặt quả cân nặng 1kg lên ống trong
vòng 30 giây. Mỗi thỏ được gây 2 vết bỏng vùng hông, đối xứng nhau qua
sống lưng. Tất cả các vết bỏng đều nhất về độ sâu và diện rộng: Độ sâu vết
bỏng đồng nhất độ III (vùng rìa tổn thương) đến độ IV (vùng trung tâm vết
bỏng); diện tích mỗi vết bỏng tương đương 5% diện tích cơ thể thỏ.
Vết bỏng được che bằng gạc vô khuẩn và được cắt lọc hoại tử sau 3 ngày
dưới gây mê. Sau đó, Clobetasol propionate 0,05% (Dermovate® Cream,
GlaxoSmithKline - Anh) được bôi vào tất cả các vết loét 1 lần/ngày trong 7


20

ngày, kết thúc quá trình gây vết loét da mạn tính hay vết thương lâu liền. Tiến
hành sinh thiết để làm xét nghiệm mô bệnh học, hóa mô miễn dịch và siêu cấu
trúc để đánh giá đặc điểm vết loét thực nghiệm.
2.6.3. Thiết lập mô hình điều trị thực nghiệm GTK108
Sau khi gây loét da mạn tính thực nghiệm, thỏ được lựa chọn ngẫu nhiên
để tiến hành đồng thời 2 phương pháp điều trị trên 2 vết loét, trong đó 1 vết
loét chứng và 1 vết loét nghiên cứu:
- Vết loét chứng: được chia thành 2 nhóm:
Nhóm 1 (09 vết loét): thay băng, rửa và đắp ổ loét bằng gạc tẩm dung
dịch NaCl 0,9%, sau đó băng lại.
Nhóm 2 (21 vết loét): thay băng, rửa vết thương bằng dung dịch NaCl

0,9%, sau đó bôi mỡ silver sulfadiazine (SSD) và băng lại.
- Vết loét nghiên cứu (30 vết loét): bôi đều một lớp mỏng thuốc
GTK108 trên toàn bộ bề mặt vết loét, che phủ bằng 2 lớp gạc mỏng, sau đó
băng lại.
Nguyên tắc thay băng và rửa vết thương sạch và sạch nhiễm theo hướng
dẫn của WHO (2009) [60], quy trình cụ thể theo quy trình thay băng rửa vết
thương của Bệnh viện 103 (Phụ lục 2).
Thời gian thay băng: 2 ngày/lần.
Theo dõi, đánh giá diễn biến hình thái vết thương bằng ảnh chụp tại chỗ
mỗi lần thay băng. Tính từ khi bắt đầu điều trị đến ngày thứ 7 và ngày thứ 14,
tiến hành lấy mẫu cấy khuẩn; Ngày thứ 1, ngày thứ 14 và ngày thứ 22, thực
hiện sinh thiết mẫu tại 2 vết loét để làm các xét nghiệm mô bệnh học, hóa mô
miễn dịch, siêu cấu trúc. Cuối cùng, lấy toàn bộ mô tại vết loét để làm mẫu
nghiên cứu.
2.7. Phương pháp đánh giá kết quả
2.7.1. Đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của GT108


21

Để phân loại, theo dõi và đánh giá hiệu quả điều trị loét da mạn tính
trên động vật thực nghiệm, chúng tôi sử dụng hệ thống tính điểm DESIGN
(Bảng 2.1) [30], thời gian liền vết loét hoàn toàn và định lượng vi khuẩn tại ổ
loét theo thời gian.
 Đo kích thước vết loét

Đặt thước chuẩn (cm, mm) (Askina®, B.Braun) cạnh vị trí vết loét, chụp
ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon ED 600D (Nhật).
Việc chụp ảnh vết thương được tiến hành mỗi lần thay băng (2 ngày/lần)
cho đến khi kết thúc nghiên cứu (ngày thứ 22).

Diện tích vết loét được đo qua ảnh chụp bằng phần mềm Image Pro Plus
4.5 (Mỹ), chế độ polygon (Khoa Hình thái – Viện 69, Bộ Tư lệnh Bảo vệ
Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh).
Việc đánh giá thay đổi diện tích vết loét được thực hiện ở thời điểm ngày
thứ nhất, ngày thứ 14 và ngày thứ 22.
Hiệu quả điều trị của bài thuốc GTK108 đã được đánh giá ở các thời
điểm nêu trên gồm:
- Kích thước vết loét (mm2)
- Tỷ lệ giảm kích thước vết loét
Công thức tính tỷ lệ giảm kích thước vết loét:
Tỷ lệ giảm kích thước vết loét (%) = (kích thước vết loét ở khởi đầu
thực nghiệm – kích thước vết loét ở thời điểm kiểm tra) x 100 / (kích thước
vết loét ở khởi đầu thực nghiệm).

 Thời gian liền vết loét hoàn toàn

Vết loét được coi là liền hoàn toàn khi kích thước ≤ 100 mm2


22

Công thức tính thời gian liền vết loét:
Thời gian liền vết loét hoàn toàn (ngày) = ngày xác định vết loét liền
hoàn toàn – ngày bắt đầu điều trị + 1
 Các thay đổi điểm chi tiết theo DESIGN

Các chỉ tiêu vết loét được tính điểm theo DESIGN để xác định điểm chi
tiết vết loét và tổng điểm vào ngày 1, ngày 14 và ngày 22.
Công thức sau xác định thay đổi các điểm chi tiết:
Thay đổi các điểm chi tiết của vết loét = điểm lúc kiểm tra – điểm ở

lúc ban đầu.
 Tỷ lệ điều trị hiệu quả đối với các vết loét

Ở thời điểm cuối/kết thúc thực nghiệm (ngày thứ 22), đánh giá hiệu quả
điều trị loét theo công thức sau:
Tỷ lệ hiệu quả (%) = Số thỏ hiệu quả / (số thỏ hiệu quả + số thỏ không
hiệu quả) x 100
Số thỏ hiệu quả: giảm ≥ 50% tổng số điểm so với lúc bắt đầu điều trị
Số thỏ không hiệu quả: giảm < 50% tổng số điểm so với bắt đầu điều trị
Tỷ lệ liền vết thương hoàn toàn (%) = số vết loét có kích thước ≤ 100
mm2 khi kết thúc điều trị x 100 / tổng số vết loét
 Thay đổi về số lượng vi khuẩn tại vết loét

Lấy bệnh phẩm:
Lau sạch vùng da lành chung quanh với cồn 70%. Lau sạch bề mặt vết
thương bằng gạc vô trùng thấm nước muối sinh lý vô trùng. Dùng tăm bông
vô trùng lấy mẫu để quệt lấy mủ, chất dập nát, hay mô (ngay dưới lớp dịch đã
chùi sạch) cho vào ống nghiệm vô trùng rồi gửi ngay đến phòng thí nghiệm.
Vị trí lấy mẫu: đáy, thành và bờ ổ loét. (Khoa Vi sinh vật – Học viện Quân y).
Nuôi cấy:
- Pha loãng mẫu bằng dung dịch chuyên dụng


23

- Cấy mẫu vào các hộp thạch phân lập, ủ mẫu trong tủ ấm CO2 (35 – 37oC).
- Tiến hành định danh và đếm số khuẩn lạc hình thành từ đó tính ra được
số lượng vi khuẩn có trong mẫu bệnh phẩm.
Việc đánh giá thay đổi số lượng vi khuẩn được thực hiện ở thời điểm 7
ngày, 14 ngày từ khi bắt đầu điều trị.

Hiệu quả giảm vi khuẩn tại vết loét của bài thuốc GTK108 đã được đánh
giá ở các thời điểm nêu trên gồm:
- Số lượng vi khuẩn (CFU/ml hay CFU/g)
- Tỷ lệ giảm số lượng vi khuẩn tại vết loét
Công thức tính tỷ lệ giảm số lượng vi khuẩn:
Tỷ lệ giảm số lượng VK (%) = (số lượng VK ở khởi đầu thực nghiệm – số
lượng VK ở thời điểm kiểm tra) x 100 / (số lượng VK ở khởi đầu thực nghiệm)


24

Bảng 2.1. Hệ thống tính điểm DESIGN (Nguồn: Sanada H. 2004 [30])
Chỉ tiêu DESIGN

Giá trị
- Không có tổn thương khác biệt trên da
Depth – Độ sâu (được đo và không đỏ
ở điểm sâu nhất của vết
- Tổn thương đến chân bì
loét)
- Tổn thương đến mô dưới da
- Tổn thương đến cơ, cân, xương
- Không có
Exudate – Tiết dịch
- Ít đến trung bình
(dịch thấm băng)
- Nhiều
0
< 400
Size – Kích thước (chiều 400 đến < 1600

dài* x chiều rộng*) mm2 1600 đến < 3600
3600 đến < 6400
6400 đến < 100.000
≥ 100.000
Không
Infection/Inflamation –
Triệu chứng không rõ ràng hoặc nhiễm
Nhiễm trùng/Viêm
trùng tại chỗ
Mô hạt không thể xác định vì vết
thương bị liền hoặc quá nông
Mô hạt khỏe mạnh chiếm ≥ 50% diện
Grannulation – Mô hạt
tích vết loét
Mô hạt khỏe mạnh chiếm < 50% diện
tích vết loét
Không có
Necrotic – Mô hoại tử
Có
Không có
Pocket – Hốc
Có
* Đo tại chỗ dài và rộng nhất

Điểm

0
3
6
0

3
6
8
9
12
15
0
3
0
3
6
0
3
0
6


25

Nghiên cứu cấu trúc, siêu cấu trúc và hóa mô miễn dịch
Sinh thiết da vùng vết loét bằng dụng cụ biopsy punch.
Thời gian, số lần sinh thiết: mỗi vết loét được sinh thiết 3 lần bằng
dụng cụ biopsy punch: Lần 1 – Ngày thứ 1 (khi hoàn thành mô hình gây loét,
trước khi bắt đầu điều trị); Lần 2 – Ngày thứ 14; Lần 3 – Ngày thứ 22 (lấy
toàn bộ chiều dày da vết loét).
Mẫu sinh thiết được lấy trên vết loét từ bờ vào đến trung tâm, cố định
bằng glutaraldehyde 1% trong đệm cacodylate. Sau khi cố định, mỗi mẫu sinh
thiết được chia thành 4 mảnh nhỏ để chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu: mô bệnh
học, nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử
truyền qua (TEM) và hóa mô miễn dịch.

 Xét nghiệm mô bệnh học

Các mẫu sinh thiết được đúc trong paraffin, cắt lát

4 - 6µm trên

microtom. Đặt các lát cắt trên lam kính. Nhuộm các lát cắt bằng phương pháp
nhuộm HE (hematoxylin – oesin). Đọc tiêu bản trên kính hiển vi quang học ở
các độ phóng đại khác nhau.
(Khoa Hình thái – Viện 69, BTL Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh)
 Xét nghiệm siêu cấu trúc

- Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét
Các mẫu sau khi sinh thiết được:
Rửa 2 lần bằng dung dịch đệm cacodylate (pH 7,3)
Cố định bằng dung dịch glutaraldehyde 2% trong đệm cacodylate pH 7,3
với 1/10 thể tích mẫu /thể tích dung dịch. Thời gian 2 – 3 ngày (phụ thuộc
kích thước mẫu).
Pha mẫu thành mảnh nhỏ kích thước 5x2x2mm
Rửa bằng đệm cacodylate 2-3 lần trong 1 giờ.
Cố định lại bằng acid osmic 1% trong đệm cacodylate pH 7,3 trong 1 giờ.