Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN THỊ CHÂM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI
TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học:
ThS PHẠM THỊ KIM DUNG

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thị Kim Dung,
người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học
và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp em
hoàn thành được khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trường
ĐHSP Hà Nội 2. Đặc biệt, xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm, động
viên em trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian hoàn thành
khóa luận này. Do bước đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học cũng như

hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu
sót, em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn
chỉnh hơn.
Một lần nữa, em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 02 tháng 05 năm 2018.
Sinh viên

Nguyễn Thị Châm


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận “Nghiên cứu khả năng
giải phóng thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi
trường chuẩn” là kết quả nghiên cứu của cá nhân được thực hiện tại “Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội II”. Các
số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực, khách quan và
không trùng lặp với bất kì khóa luận nào.
Hà Nội, ngày 02 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Châm


MỤC LỤC

Mở đầu .............................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2

4. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
Nội dung............................................................................................................ 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Tổng quan về BC ....................................................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum ............................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn A. xylinum ............................... 4
1.1.3. Đặc tính của màng BC ............................................................................ 5
1.1.4. Sinh tổng hợp BC.................................................................................... 5
1.1.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................. 6
1.2. Diclofenac .................................................................................................. 6
1.2.1. Công thức ................................................................................................ 6
1.2.2. Dược động học ........................................................................................ 7
1.2.3. Phân bố - chuyển hoá .............................................................................. 7
1.2.4. Thải trừ................................................................................................... 7
1.2.5. Tác dụng.................................................................................................. 7
1.2.6. Rủi ro và tác dụng phụ ........................................................................... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước................................................ 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới ......................................... 9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu màng BC tại Việt Nam ...................................... 10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 11
2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 11
2.2.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 11
2.2.2. Dụng cụ, hóa chất.................................................................................. 11
2.2.3. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................... 11
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 12
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12

2.4.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 12
2.4.2. Chuẩn bị màng BC ................................................................................ 12
2.4.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng .......................................................... 15
2.4.4. Phương pháp dựng đường chuẩn .......................................................... 15
2.4.5. Chế tạo màng BC nạp Diclofenac......................................................... 20
2.4.6. Pha dung dịch đệm ................................................................................ 21
2.4.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc
Diclofenac ....................................................................................................... 21
2.4.8. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả................................................ 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 23
3.1. Tạo màng BC ........................................................................................... 23
3.1.1. Màng BC lên men từ môi trường chuẩn ............................................... 23
3.1.2. Quá trình tinh chế màng........................................................................ 23
3.1.3. Màng BC nạp thuốc Diclofenac............................................................ 24
3.2. Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng ra khỏi màng BC.............. 24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 33
Tài liệu tham khảo........................................................................................... 34


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần nuôi cấy môi trường chuẩn ........................................ 13
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 276 nm ..................................................................... 16
Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 278nm ...................................................................... 17
Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 281nm ...................................................................... 18
Bảng 3.1. Mật độ quang (OD) khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời
điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng giữ nguyên
......................................................................................................................... 26

Bảng 3.2. Mật độ quang (OD) khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời
điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng ép50%... 27
Bảng 3.3: Tỉ lệ giải phóng thuốc (%) của các màng giữ nguyên ở các môi
trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ............. 29
Bảng 3.4: Tỉ lệ giải phóng thuốc (%) của các màng ép 50% ở các môi trường
pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ......................... 30


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Diclofenac.................................................... 7
Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng BC........................................................... 14
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276 nm.. 17
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278 nm.. 18
Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281 nm.. 18
Hình 3.1. (a). Màng BC thô 1cm thu được sau 10 ngày ................................ 23
(b). Màng BC được nuôi cấy trong môi trường chuẩn .................. 23
Hình 3.2. Màng được cho vào 900ml dung dịch đệm dùng máy khuấy từ gia
nhiệt ................................................................................................................. 25
Hình 3.3. Mẫu được rút ra để đo quang phổ lúc 8 giờ ................................... 25
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng
0,5cm và 1cm giữ nguyên trong các môi trường pH khác nhau (n = 3)......... 28
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng
0,5cm và 1cm ép 50% trong các môi trường pH khác nhau (n = 3)............... 28


Mở đầu
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, Acetobacter xylinum cũng như BC là đối tượng của nhiều
nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài.
Đây là một loại nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như

thực phẩm, y học, mỹ phẩm...Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC
được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô
công nghiệp. BC có cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng
có một số tính chất hóa lí đặc biệt như độ tinh sạch lớn, có thể phân hủy sinh
học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra BC còn có độ bền tinh thể cao,
sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng [11]. BC còn
là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, có tính xốp, độ
ẩm cao, lực bền cơ học cao và đặc biệt có khả năng cản khuẩn [8].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC đang được quan
tâm và đã đạt được một số thành tựu nhất định. Trường Đại học Y Dược TP.
Hồ Chí Minh đã nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng trị
bỏng thử nghiệm trên thỏ. Kết quả cho thấy màng BC giúp vết thương mau
lành và ngăn sự nhiễm trùng [3]. Ngoài ra, màng BC cũng được ứng dụng
trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [4],[ 5].
Diclofenac là dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh.
Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm
giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là
những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con
đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu.

1


Diclofenac được chứng minh có tác động giảm đau mạnh trong những
cơn đau từ trung bình cho đến trầm trọng. Khi có viêm, ví dụ như viêm do
chấn thương hay do can thiệp phẫu thuật, thuốc nhanh chóng làm giảm chứng
đau tự nhiên và đau do vận động, và giảm phù nề do viêm và phù nề ở vết
thương.
Với mục đích tạo ra màng BC dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A.

xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự giải phóng thuốc qua
màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác dụng phụ, kháng lại
tác động của acid và khả dụng sinh học của BC trong việc điều trị bệnh. Đó là
lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Diclofenac
của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của màng Cellulose
vi khuẩn (BC) lên men từ môi trường chuẩn nhằm tạo ra hệ thống giải phóng
thuốc kéo dài.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của màng
Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật
khoa Sinh- KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2; Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu
khoa học và Chuyển giao công nghệ Trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Nội dung nghiên cứu
- Tạo và thu màng BC lên men từ môi trường chuẩn.

2


- Nạp Diclofenac vào màng BC.
- Thử nghiệm khả năng giải phóng Diclofenac của màng BC.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
- Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc giải phóng
thuốc. Việc nghiên cứu ứng dụng màng BC nhằm khắc phục hạn chế của
Diclofenac sẽ mang lại lợi ích cho việc điều trị.

- Đánh giá những ưu nhược điểm của giải phóng Diclofenac của màng
BC để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc khác.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Tạo ra hệ thống giải phóng Diclofenac kéo dài từ màng BC.

3


Nội dung
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về BC
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum
Chủng Acetobacter xylinum này có nguồn gốc từ Philippin, A. xylinum
thuộc nhóm khuẩn Axetic. Theo phân loại của các nhà khoa học Bergey thì A.
xylium thuộc lớp Schizomycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonaceae.
A. xylinum là trực khuẩn dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6-0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, hiếu khí
bắt buộc, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng
hemicellulose khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. Tùy điều
kiện nuôi cấy mà các vi khuẩn này có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác
biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra [6].
A. xylinum thường sống chung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi là
“thủy hoài sâm” [9].
A. xylinum sinh trưởng ở điều kiện pH <5, nhiệt độ khoảng 28-32°C và
có thể tích lũy 4-5% acid acetic, nhưng khi nồng độ acid vượt quá mức cho
phép, chúng sẽ quay lại ức chế hoạt động của vi khuẩn.
1.1.2. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát
0

0

triển từ 28 – 32 C. Ở nhiệt độ 37 C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn.
A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và

4


cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho
hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose.
Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ
sung acid acetic vào môi trường.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa
thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 – 48h
lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày.
1.1.3. Đặc tính của màng BC
Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 – 0,5 nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh
và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt
là khả năng cản khuẩn. Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều
trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học [7].
1.1.4. Sinh tổng hợp BC
- Quá trình lên men: + Pha sinh trưởng
+ Pha tích tụ sản phẩm
- Quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum
Cellulose được tổng hợp từ một số nhóm vi khuẩn và đặc biệt là A.

xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng cacbon, phụ thuộc vào
trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu
trình Krebs, kết hợp với quá trình tạo glucose. Ngày nay, quá trình tổng hợp
cellulose ở A. xylinum gồm nhiều bước và thường trải qua 2 giai đoạn chính

5


là giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh. Có 2 kiểu nuôi cấy: lên men
tĩnh và lên men động (có khuấy đảo).
1.1.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường được tổng hợp từ các
nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho,
các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
A. xylinum có nhu cầu sử dụng đường rất lớn vì vậy có rất nhiều nghiên
cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp
khác để làm nguyên liệu nuôi cấy A. xylinum như: rỉ đường, chất thải nhà máy
sản xuất phomat, nước dừa già, nước mía, ...
Trong đó môi trường chuẩn trong nuôi cấy A. xylinum gồm: 2% (wt)
glucose, 0,5% (wt) cao nấm men, 0,5% (wt) peptone, 0,27% (wt) disodium
phosphate, và 0,15% (wt ) axit citric.
1.2. Diclofenac
Diclofenac được dùng chủ yếu dưới dạng muối natri. Muối
diethylamoni và muối hydroxyethylpyrolidin được dùng bôi ngoài. Dạng base
và muối kali cũng có được dùng làm thuốc uống.
1.2.1. Công thức
Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
Tên IUPAC hệ thống: 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid
Phân tử lượng: 296,148 g/mol
Công thức cấu tạo: Được mô tả ở hình 2.1

6


Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Diclofenac
1.2.2. Dược động học
Diclofenac được hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hoá sau khi uống,
hấp thu tốt hơn nếu uống lúc đói. Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương là
1,5mg/l xuất hiện hai giờ sau khi uống. Nồng độ thuốc trong bao hoạt dịch đạt
mức cao nhất sau khi uống khoảng 4 đến 6 giờ. Tác dụng của thuốc xuất hiện
30 – 60 phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng, 20 – 30 phút sau khi tiêm bắp
và 60 – 120 phút sau khi uống.
1.2.3. Phân bố - chuyển hoá
Diclofenac gắn nhiều protein huyết tương, chủ yếu là albumin (99%).
Khoảng 50% liều thuốc uống được chuyển hoá qua gan lần đầu, sinh khả
dụng của thuốc trong máu tuần hoàn xấp xỉ khoảng 50% so với liều tiêm tĩnh
mạch.
1.2.4. Thải trừ
Thời gian bán thải của thuốc trong huyết tương khoảng 1 - 2 giờ. Thời
gian bán thải trong bao hoạt dịch là 3 - 6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng được thải
trừ qua thận dưới dạng chất chuyển hoá còn một phần hoạt tính và 1% dưới
dạng thuốc nguyên vẹn. Phần còn lại thải trừ qua mật và phân.
1.2.5. Tác dụng
Diclofenac dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh.

7


Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm

giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là
những chất trung gian của quá trình viêm. Ngoài ra, Diclofenac cũng điều hòa
con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu.
1.2.6. Rủi ro và tác dụng phụ
Theo Dược thư quốc gia (2009), cũng giống như các thuốc chống viêm
không steroid khác, Diclofenac gây hại đường tiêu hóa do giảm tổng hợp
prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin (chất có tác dụng bảo vệ đường tiêu
hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tưới máu thận. Các thuốc chống viêm
không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin nên có thể gây viêm thận kẽ,
viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hư đặc biệt ở những người bị
bệnh thận hoặc suy tim mãn tính. Với những người bệnh này, các thuốc chống
viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp và suy tim cấp [2].
* Các triệu chứng thường gặp:
- Toàn thân: Nhức đầu, bồn chồn, ù tai.
- Tiêu hóa: Ðau vùng thượng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trướng bụng,
chán ăn, khó tiêu.
- Gan: Tăng các transaminase.
* Ít gặp:
- Toàn thân: Phù, dị ứng (đặc biệt co thắt phế quản ở người bệnh hen),
choáng phản vệ kể cả tụt huyết áp, viêm mũi, mày đay.
- Tiêu hóa: Ðau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, làm ổ loét tiến triển,
nôn máu, ỉa chảy lẫn máu, kích ứng tại chỗ (khi đặt thuốc vào trực tràng).

8


- Hệ thần kinh: Buồn ngủ, hay ngủ gật hoặc mất ngủ, trầm cảm, lo âu,
khó chịu, dễ bị kích thích.
- Da: Mày đay.
- Hô hấp: Co thắt phế quản.

- Mắt: Nhìn mờ, điểm tối thị giác, đau nhức mắt, nhìn đôi.
* Hiếm gặp:
- Toàn thân: Phù, phát ban, hội chứng Stevens - Johnson, rụng tóc.
- Hệ thần kinh: Viêm màng não vô khuẩn.
- Máu: Giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính, tăng
bạch cầu ái toan, giảm bạch cầu hạt, thiếu máu.
- Gan: Rối loạn co bóp túi mật, chức năng gan bất thường, nhiễm độc
gan (vàng da, viêm gan).
- Tiết niệu: Viêm bàng quang, đái máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ, hội
chứng thận hư.
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới
Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực
công nghệ khác nhau. Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên
cứu ứng dụng BC trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo, trong đó
có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi
màng BC và 7 với các vật liệu Nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này
cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu.

9


Tác giả Brown (1989), Jonas và Farad (1998) sử dụng màng như một
chất để biến đổi độ nhớt, tạo ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm, sản xuất giấy chất lượng
cao [3].
Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu
được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn;
Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị
2

diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm , và tác dụng của thuốc kéo
dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S.aureus và B.subtilis [10].
Luan J. et al. (2012), đã nghiên cứu màng BC nạp sulfadiazine bạc, một
loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do
bỏng.
1.3.2.. Tình hình nghiên cứu màng BC tại Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí
nghiệm.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả
cho thấy màng BC tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi cellulose nhỏ,
dai, bền, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị
bỏng [3].
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và
thu màng cellulose vi khuẩn (VCK) từ A. xylinum và đạt hiệu quả cao [8].

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Khả năng giải phóng Diclofenac của màng BC.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguyên liệu
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC: Đường
glucose, nước vo gạo, acid acetic, axit citric, peptone, disodium phosphate,
HCl, NaOH, cao nấm men… đạt tiêu chuẩn phân tích.

- Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi
khuẩn A. xylinum (Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường ĐHSP
Hà Nội 2) lên men trong môi trường chuẩn.
2.2.2. Dụng cụ, hóa chất
* Dụng cụ:
Hộp nhựa để lên men tạo màng BC, ống nghiệm, đũa thủy tinh, cốc đong
thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, bình tam giác, gạc vô trùng, lọ
penicilin, đèn cồn, bình hút ẩm, giấy lọc, kẹp gỗ, giấy quỳ tím, giấy bạc, bình
định mức loại 100ml, 500ml, 1000ml, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml,
micropipet, thước kẹp,... và nhiều dụng cụ hóa sinh khác.
* Hóa chất:
- Diclofenac (sản xuất tại Việt Nam).
- Dung môi là metanol được mua tại Việt Nam.
- Nước cất
- NaOH, HCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 và một số hóa chất khác.
2.2.3. Thiết bị nghiên cứu
- Máy đo quang phổ UV- Vis 2450 (Shimadru - Nhật Bản),

11


- Cân phân tích (Sartorius – Thụy Sĩ),
- Tủ lạnh,
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA (Nhật Bản),
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus),
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức),
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức), và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng
khác.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo và thu màng BC lên men từ môi trường chuẩn.

- Nạp Diclofenac vào màng BC.
- Thử nghiệm khả năng giải phóng Diclofenac của màng BC.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Cho màng BC nạp Diclofenac giải phóng thuốc trong
các điều kiện pH khác nhau rồi tính tốc độ thuốc giải phóng ở mỗi pH.
- Thí nghiệm 2: Trong cùng một pH cho màng BC có độ dày khác nhau
đã nạp diclfenac giải phóng thuốc rồi tính tốc độ giải phóng thuốc.
2.4.2. Chuẩn bị màng BC
- A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường chuẩn Hestrin–Schramm
(được trình bày trong bảng 2.1) : 2% (wt) glucose, 0,5% (wt) cao nấm men,
0,5% (wt) peptone, 0,27% (wt) disodium phosphate, và 0,15% (wt ) axit
citric.
- Chuẩn bị môi trường như bảng 2.1

12


Bảng 2.1: Thành phần nuôi cấy môi trường chuẩn
Thành phần

Khối lượng

D - Glucose

20g

Peptone

5g

Disodium phosphate hydro

2,7g

Cao nấm men

5g

Axid citric

15g

Axid acetic

2%

Nước cất 2 lần

1000ml

Dịch giống A.xylinum

10%

- Môi trường được hấp khử trùng ở 113°C trong 15 phút. Tiếp tục khử
trùng bằng tia UV trong 15 phút.
- Để nguội môi trường sau đó bổ sung 10% dịch giống và 2% acid
axetic, lắc đều tay.

13


- Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng
cụ.
- Sau khi ủ tĩnh ở 28°C cho 4 ~ 14 ngày, màng BC thô thu được ngâm
vào nước cất trong 2 ngày, và sau đó các màng BC được tinh chế bằng cách
rửa nhiều lần theo quy trình như hình 2.1:

14


Tách màng BC thô
Ép loại nước

Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu BC tinh chế

Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng BC
+ Tách BC: Trong nuôi cấy tĩnh BC tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy phải hấp màng trong
NaOH 3%, nhiệt độ 113°C để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội
độc tố của vi khuẩn.
+ Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước tới khi

màng trắng rồi ép màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48h để trung hòa
hết NaOH.


+ Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nước rồi ép
màng. Ngâm nước để trung hòa hết acid trong khoảng 48h ta thu được BC
tinh chế.
BC tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 90°C, áp suất thường trong khoảng
4 giờ đến khối lượng không đổi, ta được khối lượng BC tạo thành [6].
2.4.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng
2.4.3.1. Mục đích
Kiểm tra sự hiện diện của đường glucose trong màng BC.
2.4.3.2. Nguyên tắc
Dùng thuốc thử Fehling để phát hiện sự hiện diện của đường D glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
2.4.3.3. Tiến hành
Dịch thử của màng BC các loại sau khi đã xử lý hóa học. Mẫu đối chứng
là nước cất và dung dịch D – glucose.
Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử
Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút. Quan sát tủa xuất hiện
trong ống nghiệm [10].
2.4.4. Phương pháp dựng đường chuẩn
- Pha thuốc Diclofenac ở các nồng độ 10%, 20%, 40%, 60%, 80%,
100%.


- Sử dụng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD)
của các dung dịch mẫu chứa thuốc Diclofenac ở bước sóng 276 nm, 278 nm,
281nm.
- Tiến hành đo 3 lần lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
Diclofenac để xây dựng đường chuẩn của thuốc.

- Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau
thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 276 nm
STT

Nồng độ

Giá trị OD 276nm (n = 3)

Giá trị trung bình

(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

1

10

0,105

0,108

0,108

0,107 ± 0,001

2

20

0,213

0,214

0,215

0,214 ± 0,001

3

40

0,426

0,42

0,444

0,43 ± 0,008

4

60

0,643

0,638

0,645

0,642 ± 0,003

5

80

0,85

0,86

0,87

0,86 ± 0,006

6

100

1,06

1,075

1,075

1,07 ± 0,006

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm Excel
2010, kết quả được đồ thị như hình 2.3.