Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn
Xuân Thành, người đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2; các
thầy, cô giáo trong khoa Sinh - KTNN cùng toàn thể các thầy cô trong Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong
suốt quá trình làm thực nghiệm hoàn thành khóa luận của mình.
Vì chưa có nhiều cơ hội tham gia nghiên cứu khoa học nên em còn
nhiều bỡ ngỡ cũng như kinh nghiệm của em còn nhều hạn chế do đó không
tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý, xây dựng của
các thầy cô và các bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn
thiện hơn nữa. Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 10 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Thủy


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện và dưới sự hướng
dẫn của TS. Nguyễn Xuân Thành. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong
khóa luận này là hoàn toàn trung thực và không trùng lặp với những kết quả
đã công bố. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm!
Hà Nội, Ngày 10 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Thủy


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CVK

Cellulose vi khuẩn

A. xylinum

Acetobacter xylinum

HS

Hestrin - Schramm

MT1

Môi trường 1

MT2

Môi trường 2

MT3

Môi trường 3


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu....................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4

Chương 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1.Cellulose vi khuẩn (CVK) và sinh vật tổng hợp cellulose.......................... 4
1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK)....................................................................... 4
1.1.1.1. Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn (CVK). ........................................... 4
1.1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn. ............................................. 4
1.1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn.......................................................... 5
1.1.1.4. Đặc tính của màng CVK ...................................................................... 5
1.1.1.5. Ứng dụng của CVK.............................................................................. 6
1.1.2. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum ..................................... 7
1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum ............................................. 7
1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................. 7
1.2. Thuốc omeprazole ...................................................................................... 8
1.2.1. Cấu trúc ................................................................................................... 8
1.2.2. Tính chất vật lí và hóa học ...................................................................... 9
1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng..................................................................... 9
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định ................................................................... 10
1.2.5. Liều dùng và cách dùng: ....................................................................... 10
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 11
1.3.1. Trên thế giới .......................................................................................... 11
1.3.1.1. Màng CVK ......................................................................................... 11
1.3.1.2. Omeprazole ........................................................................................ 11


1.3.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 13
1.3.2.1. Màng CV ............................................................................................ 13
1.3.2.2. Omeprazole ........................................................................................ 13
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 15
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 15
2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu ................................. 15
2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 15

2.1.3. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK .............. 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.2.1. Tạo màng CVK ..................................................................................... 15
2.2.2. Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc, đánh giá độ tinh khiết của
màng CVK....................................................................................................... 16
2.2.2.1. Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc......................................... 16
2.2.2.2. Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK .............................................. 17
2.2.3. Xây dựng đường chuẩn Omeprazole .................................................... 18
2.2.4. Xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK..................................... 19
2.2.5. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ
thống được thiết kế.......................................................................................... 20
2.2.6. Nghiên cứu giải phóng thuốc từ hệ CVK nạp thuốc với các loại màng
CVK có kích thước khác nhau và điều kiện môi trường khác nhau ............... 20
2.2.7. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc ..... 21
2.2.8. Xử lý thống kê....................................................................................... 22
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 23
3.1. Tạo màng CVK ........................................................................................ 23
3.1.1. Thu màng CVK từ môi trường HS........................................................ 23
3.1.2. Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc............................................ 23
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK sau xử lý.................................. 24
3.1.3.1. Xác định sự hiện diện của glucose trong màng CVK tinh chế .......... 24


3.1.3.2. Xác định sự hiện diện của protein trong màng CVK tinh chế........... 24
3.2. Kết quả quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của
Omeprazole ..................................................................................................... 24
3.3. Xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK........................................ 29
3.4. Lượng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trường pH khác nhau.
......................................................................................................................... 29
3.4.1. Mật độ quang của Omeprazole khi tiến hành giải phóng thuốc tại các

thời điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau .............................. 29
3.4.2. Tỉ lệ giải phóng dược chất của các màng ở các môi trường pH khác
nhau trong các khoảng thời gian khác nhau.................................................... 32
3.5. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc ........ 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 40


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần môi trường chuẩn tạo màng CVK .............................. 16
Bảng 3.1. Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ..... 24
Bảng 3.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ ở pH
= 2.................................................................................................................... 26
Bảng 3.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ ở pH
= 4,5................................................................................................................. 27
Bảng 3.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ ở pH
= 6,8................................................................................................................. 28
Bảng 3.5. Lượng thuốc hấp thụ vào màng ...................................................... 29
Bảng 3.6. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau ....................................................... 31
Bảng 3.7. Tỉ lệ giải phóng thuốc Omeprazole từ màng CVK trong các độ dày,
thời gian và môi trường pH khác nhau (n=3).................................................. 33
2

Bảng 3.8. Hệ số tương quan (R ), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số
mũ
giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau ..................................... 36


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn........................................... 4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của omeprazole ................................................... 9
Hình 3.1. Màng CVK thô lên mên từ môi trường HS.................................... 23
Hình 3.2. Màng CVK tinh khiết...................................................................... 23
Hình 3.3. Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M.... 25
Hình 3.4. Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M ở
pH = 2.............................................................................................................. 26
Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M ở
pH = 4,5........................................................................................................... 27
Hình 3.6. Phương trình đường chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M ở
pH = 6,8……………………………………………………………………..28
Hình 3.7. Hiệu chỉnh pH ................................................................................. 30
Hình 3.8. Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ
0
0
37 C ± 0,5 C.................................................................................................... 30
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK
......................................................................................................................... 32
Hình 3.10. Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK........... 34


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum (A. xylinum). Màng sinh học (CVK) có
cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose thực vật (gồm các phân tử glucose
liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit) [3]. Ngày nay, màng CVK đã
được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như: dùng màng CVK làm
môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, làm chất mang đặc biệt cho
các pin và năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học,

trong thực phẩm hay thay thế thực phẩm, dùng để thiết kế hệ thống vận tải
phân phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [17]. Trong lĩnh vực y học, màng
CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời để thay thế da trong điều trị bỏng,
loét da, làm mạch máu nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da,… [7,17]. Theo nghiên
cứu cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại,
làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. [9,10,13].
Ở nước ta việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK vẫn còn khá mới
mẻ nhưng cũng đã đạt được một số thành tựu ban đầu. Đề tài của Nguyễn
Văn Thanh – Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh 2006 [5] đã “ Nghiên
cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Kết quả cho
thấy màng CVK được tạo nên từ các nguyên liệu có giá thành rẻ, dễ kiếm, có
thể sản xuất trên quy mô lớn. Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn
nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay
phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn,
trọng lượng thấp, khả năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ, chứa nhiều
dưỡng chất [12]. Đồng thời là một hàng rào cản oxy và các sinh vật khác,
ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của
UV, ổn định về kích thước, màng CVK còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải

1


phóng thuốc kéo dài [13,19], có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ
thống vận chuyển thuốc, cho cả thấm qua da, qua đường miệng,…
Omeprazole là chất ức chế đặc hiệu tác dụng bằng cách khóa hệ thống
enzyme của Hydrogen-potassium Adenodine Triphosphatase. Omeprazole
thuộc nhóm thuốc được gọi là chất ức chế bơm proton. Omeprazole có khả
năng làm giảm lượng acid sản xuất trong dạ dày. Omeprazole được sử dụng
để điều trị các triệu chứng của bệnh trào ngược dạ dày thực quản (GERD) và
các bệnh khác gây ra bởi acid dạ dày dư thừa,…Tuy nhiên, omeprazole có

một số nhược điểm như không bền trong môi trường acid, dễ bị sinh biến đổi
ở gan và trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những tác dụng
phụ nhẹ của thuốc như: sốt, hắt hơi, đau dạ dày, ợ nóng, buồn nôn,…
Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của màng CVK
nhằm làm chậm quá trình giải phóng thuốc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã
chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm (HS).
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK
lên men từ môi trường chuẩn nhằm tìm ra hệ thống giải phóng thuốc kéo dài.
- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc Omeprazole nhờ màng CVK trong
một số trường hợp khác nhau về kích thước, độ dày màng, pH. Đánh giá khả
năng giải phóng thuốc trong các trường hợp đó.
3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên quy mô của phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
- Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng CVK trong việc giải phóng


thuốc.
- Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK nhằm khắc phục hạn chế của
Omeprazole sẽ mang lại lợi ích cho việc điều trị.
- Đánh giá những ưu nhược điểm của giải phóng omeprazole của màng
CVK để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc khác.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Tạo ra hệ thống giải phóng Omerazole kéo dài từ màng CVK.
- Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

NỘI DUNG
Chương 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Cellulose vi khuẩn (CVK) và sinh vật tổng hợp cellulose
1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK)
1.1.1.1. Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn (CVK).
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với
nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Cấu trúc CVK phụ thuộc rất nhiều vào điều
kiện nuôi cấy. Trong nuôi cấy tĩnh, CVK có nhiều tính chất rất đặc biệt như:
độ tinh sạch cao, đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, không độc và
không gây dị ứng, chịu nhiệt tốt và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [12]. Cấu
trúc hóa học của CVK được trình bày trên hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn
1.1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.
Ngày nay, nhờ có các kỹ thuật và công nghệ hiện đại mà các nhà khoa
học đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Các kỹ thuật như phồ
hồng ngoại, phổ Raman, phổ cộng hưởng từ hạt nhân,…đã giúp xác định
được dạng kết tinh của cellulose.
CVK được tạo thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể là cellulose Iα và Iβ.
Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinh thể này.


Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa
có cách nào thu nhận được tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này. Cấu trúc CVK
chứa nhiều tinh thể Iα hơn ở cellulose thực vật.
Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi là một yếu tố rất quan trọng
trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù đến nay vẫn có rất ít
các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính
riêng biệt của cellulose được thực hiện.

1.1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn
- Cellulose vi khuẩn trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, tỉ lệ Iα cao.
- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.
- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.
- Độ tinh sạch cao hơn so với các loại cellulose khác, không chứa ligin
và hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số loại vi sinh vật.
- Là nguồn tài nguyên có thể phục hồi.
- Khả năng kết sợi và tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt và khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn
có độ bền cao, trọng lượng nhẹ,... [5,12].
1.1.1.4. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường lỏng thành
lớp mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tương tự như
giấy da với độ dày 0,01 – 0,05mm. Sản phẩm này có những tính chất rất đặc
biệt như:
- Độ tinh kết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không chứa lignin hay hemicelluloses nên có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn
toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
- Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, trọng lượng nhẹ.


- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm.
Màng CVK có bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không
o

gây dị ứng, chịu nhiệt tốt (khoảng 100 C không ảnh hưởng lớn đến tính chất
của CVK nhưng nhiệt độ thấp có thể làm tăng tính mềm dẻo của nó). Đặc biệt
có khả năng cản khuẩn. Với đặc tính này, CVK đã được ứng dụng làm màng
lọc vô khuẩn [22].

1.1.1.5. Ứng dụng của CVK
CVK được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công
nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ pin,…và đặc biệt trong lĩnh vực y học.
Trong y học, màng CVK thu được từ nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử
dụng làm da nhân tạo để trị bỏng, đắp lên các vết thương hở. Ở Brazil, màng
CVK ướt tinh sạch và được bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng
để đắp lên vết thương [3]. Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
cũng đã nghiên cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng
được thực hiện ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng màng CVK giúp vết thương mau
lành và tránh bị nhiễm trùng [5]. CVK còn được ứng dụng làm màng băng vết
thương trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan nội tạng,… Dựa vào đặc tính
trương nở của CVK người ta đã ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc,
dùng làm huyền phù CVK để ổn định các tá dược dạng nước, làm cho chúng
không bị tách khi bảo quản lâu ngày [3].
Ngoài ra CVK còn được ứng dụng trong các lĩnh vực như: Trong công
nghiệp giấy màu, CVK được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao.
Trong công nghiệp môi trường đã sử dụng CVK làm màng phân tách để xử lí
nước và biến đổi độ nhớt của nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi
pin và tế bào năng lượng [5], làm các sợi truyền quang, là một môi trường cơ
chất trong sinh học được sử dụng để cố định protein [3].


1.1.2. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Preudomonadaceae, sống hiếu khí bắt buộc, sản xuất cellulose ngoại bào.
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc họ Preudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [8].
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 – 0,8µm, dài khoảng 2 – 3 µm, có thể di động hay không di động
và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng đặc điểm nhuộm

gram có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Chúng
có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi [8].
1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum
o

Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 25 – 30 C và pH từ 5,4 –
6,3. A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 –
o

35 C và nồng độ ethanol có thể tới 10% [6].
Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của A.xylinum bao gồm: oxy hóa
ethanol thành acid acetic, CO2, H2O, phản ứng catalase dương tính, không
tăng trưởng trên môi trường Hoyer. Chuyển hóa glucose thành acid, chuyển
hóa glyxerol thành dihydroxyacetol, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp cellulose
[6].
1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố
tăng trưởng và các yếu tố vi lượng. Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là
rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất
nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công
nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa già, nước mía,... để làm nguyên liệu
trong nuôi cấy A. xylinum.


Môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum tạo CVK được trình bày trong
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần của các môi trường lên men thu màng CVK
Thành phần

Các loại môi trường
MT1

MT2

MT3

Glucose

20g

20g

20g

Pepton

5g

10g

10g

Dinatri phosphat (khan) (Na2HPO4)

2,7g

Acid citric

1,15g

Diamoni photphat

0,3g

0,3g

Amoni sulfat

0,5g

0,5g

Nước dừa già

1.000ml

Cao nấm men

5g

Nước cất 2 lần

1.000ml

Nước vo gạo

1.000ml

Thêm dịch giống vào từng môi trường với lượng như nhau và tối thiểu

bằng 10% thể tích môi trường. pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh
bằng 4-6 (pH tốt nhất cho sự phát triển của A. xylinum là 6. pH thấp sẽ giúp
tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác).
Môi trường chuẩn (Hestrin và Schramm (HS)) là môi trường nuôi cấy
thường được sử dụng để sản xuất CVK, dù là nuôi cấy tĩnh hoặc động, được
mô tả lần đầu tiên vào năm 1954 bởi Schramm và Hestrin.
1.2. Thuốc omeprazole
1.2.1. Cấu trúc
- Công thức phân tử: C17H19N3O3S.
- Phân tử lượng: 345,4.


- Tên khoa học: 5-methoxy-2-[(RS)-[4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2yl)methyl]-sulphinyl]-1H-benzimidazol[2].
- Công thức cấu tạo của omeprazole được trình bày trên hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của omeprazole
1.2.2. Tính chất vật lí và hóa học
- Lý tính: Omeprazole dưới dạng bột trắng hoặc gần như trắng. Nóng
o

chảy ở khoảng 155 C kèm theo sự phân hủy, khó tan trong nước, khó tan
trong acetol và isopropanol, tan trong dicloromethan, methanol và ethanol
[11,22].
- Hóa tính: Omeprazole vừa có tính acid, vừa có tính base, hấp thụ
mạnh bức xạ tử ngoại. Các tính chất này được ứng dụng trong định tính, định
lượng và trong bào chế omeprazole. Độ ổn định của omeprazole phụ thuộc
vào pH. Trong môi trường acid, omeprazole nhanh chóng bị phân hủy, trong
môi trường kiềm omeprazole khá bền vững [11].
1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng
Omeprazole là một dẫn suất của benzimidazole không có hoạt tính ức

chế enzyme ở môi trường trung tính, nhưng ở pH ≤ 5 Omeprazole được
proton hóa thành 2 dạng acid sulphenic và sunphenamic. Hai chất này gắn
+

+

thuận nghịch với nhóm sulfohydryl của enzyme H - K - ATPase ở tế bào
thành nên có khả năng ức chế bài tiết acid trên 48 giờ. Do vậy omeprazole
được dùng điều trị trong các trường hợp: trào ngược dạ dày thực quản, loét dạ
dày tá tràng, hội chứng Zollinger-Ellison.


Dược động học [3]: Omeprazole là một chất ức chế bài tiết dịch vị dạ
dày do ức chế bơm proton ở các tế bào thành dạ dày. Thuốc có tác dụng
nhanh, kéo dài. Omeprazole được hấp thụ tốt ở ruột non sau khi uống từ
khoảng 3 đến 6 giờ. Sinh khả dụng sau khi uống liều đầu tiên đạt khoảng 35%
và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều. Sự hấp thụ của thuốc phụ thuộc vào
liều dùng, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn. Thuốc liên kết cao với protein
huyết tương (khoảng 95%) và được phân bố vào các mô đặc biệt ở các tế bào
thành dạ dày. Thời gian bán thải của thuốc khá ngắn (khoảng 40 phút), nhưng
tác dụng ức chế bài tiết kéo dài, nên có thể chỉ cần dùng một liều mỗi ngày.
Omeprazole hầu như chuyển hóa hoàn toàn tại gan, đào thải nhanh
chóng, chủ yếu qua nước tiểu (80%), phần còn lại theo phân. Các chất chuyển
hóa không có hoạt tính nhưng lại tương tác với nhiều thuốc khác do tác dụng
ức chế enzyme CYT.P450 của tế bào gan. Dược động học của thuốc thay đổi
không có ý nghĩa ở người già hoặc người có chức năng thận suy giảm. Với
những người suy giảm chức năng gan, sinh khả dụng của thuốc tăng và độ
thanh thải giảm, nhưng không có biểu hiện tích lũy thuốc trong cơ thể.
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định
Chỉ định:

- Trào ngược dạ dày – thực quản
- Loét dạ dày – tá tràng
- Hội chứng Zollinger-Ellison
Chống chỉ định: Mẫn cảm với thuốc.
Phản ứng bất lợi: Một số phản ứng thường gặp có thể xảy ra khi điều trị
với Omeprazole như: rối loạn tiêu hóa, buồn nôn, nôn, đau bụng, trướng
bụng. Hiếm gặp hơn là các phản ứng như mất ngủ, chóng mặt, mày đay, ra
mồ hôi,…
1.2.5. Liều dùng và cách dùng:


Liều thường dùng cho người lớn là 20 – 40mg/lần/ngày, thời gian điều
trị là từ 4 – 8 tuần.
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
1.3.1.1. Màng CVK
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có một số nghiên cứu ứng
dụng CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [13], trong đó có
9 nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi
màng CVK và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite.
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown. E. (2007)
[4] dùng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm
chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (2007),
Jonas và Farah, (1998) [18] dùng CVK để sản xuất giấy chất lượng cao.
Tuy nhiên, những ứng dụng chủ yếu trên thế giới của màng CVK lại là
trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả Wan và Millon (2009) [23],
Czafa và cộng sự (2007) [14] sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở,
vết bỏng đã thu được các kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) [23] đã
được đăng kí bản quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các

tác giả Jonas và Farad (1998) [18], Crafa và cộng sự (2007) [14] đã dùng
màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
1.3.1.2. Omeprazole
Viên nang omaprazole lần đầu tiên được công ty Astra (nay là
AstraZeneca) nghiên cứu sử dụng làm thuốc điều trị và đăng ký lưu hành từ
năm 1988 với tên biệt dược Losec (được công nhận là thuốc phát minh,
Innovator), với doanh số khoảng 8 tỷ USD mỗi năm. Tuy nhiên, khi chưa hết
hạn bản quyền (1997), AstraZaneca đã xin rút đăng ký sản phẩm này ở một số


nước thành viên chính của EU và cho ra đời viên nén và viên nang Losec
MUPs (omeprazole + magnesi). Mặc dù chế phẩm mới đã được đánh giá
tương đương sinh học với chế phẩm Losec gốc nhưng nhiều nước không coi
Losec MUPs là chế phẩm innovator. Từ đó, trên thị trường chỉ còn lưu hành
chế phẩm generic của omeprazole đã được đánh giá tương đương sinh học với
Losec hoặc chế phẩm được cấp phép ở các nước Losec không được đăng kí
bản quyền, như Apo – omeprazole, (Apotec – Canada), Probitor (Biochemie –
Áo).
Sayed Aboflazl Mostafavi (Iran) [20] đã nghiên cứu đánh giá tương
đương sinh học của 2 sản phẩm viên nang Omeprazole sản xuất tại Iran:
Omeprazole (Abidi) và Lorsec (Lorestan) so với thuốc chứng là viên nang
Losec của Astra, Sweden. Nghiên cứu thực hiện trên 12 người tình nguyện,
thiết kế chéo theo ô vuông latin, mở, liều đơn, 3 thuốc, 3 giai đoạn với thời
gian nghỉ giữa các giai đoạn là 7 ngày. Phân tích nồng độ thuốc trong huyết
tương bằng HPLC. Kết quả đánh giá qua các giá trị dược động học AUC và
Cmax cho thấy 3 chế phẩm này là tương đương sinh học.
Elkoshi Z. [16] và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá tương đương sinh
học của viên Omepradex so với thuốc đối chứng là viên Losec trên 2 mô hình
invitro (thử độ hòa tan) và in vivo (dược động học). Nghiên cứu in vivo với
thiết kế chéo, ngẫu nhiên, đơn liều kết hợp với đa liều, thực hiện trên 40

người tình nguyện khỏe mạnh. Hai chế phẩm nghiên cứu cho thấy không
tương đương, sự sai khác sau khi dùng đa liều lớn hơn. Các tác giả đã nhận
định rằng nghiên cứu tương đương sinh học Omeprazole nên thực hiện với
thiết kế đơn liều kết hợp đã liều.
Nghiên cứu so sánh khả dụng của 2 chế phẩm Omeprazole dạng uống:
Pepticum (thuốc thử) và Mopral (thuốc chứng), Duvauchelle T. và cộng sự
[15] đã nhận thấy không có sự khác nhau có ý nghĩa về diện tích dưới đường


cong (AUC) của 2 chế phẩm cả khi dùng đơn liều và đa liều. Tuy nhiên có
nhận thấy sự khác nhau về giá trị Cmax (p<0,05) và Tmax(p<0,01) của thuốc
thử so với thuốc đối chứng ở tình trạng ổn định (sau khi dùng thuốc 5 ngày).
Kết quả này khẳng định thêm rằng sau khi dùng liều nhắc lại, AUC và Cmax
tăng lên so với khi dùng đơn liều và sự biến thiên giữa các cá thể là đáng kể.
1.3.2. Ở Việt Nam
1.3.2.1. Màng CV
Năm 2006 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự
đã có một công trình nghiên cứu về màng CVK, là cơ sở để chế tạo màng sinh
học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [8].
Mới đây nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung cũng đã bước đầu ứng
dụng màng CVK trong điều trị bỏng trên thỏ. Công tác điều trị bỏng hiện
đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc sử dụng một số màng
trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitissan, sử dụng các
chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng. Theo tác giả Huỳnh
Thị Ngọc Lan [5], màng trị bỏng CVK với các hoạt chất tái sinh mô và các
chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên vì thế nó không chứa các yếu tố
nguy cơ như không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng, không có yếu tố lây
lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thương.
1.3.2.2. Omeprazole
Tình hình nghiên cứu về omeprazole ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.

- Đã có 1 số đề tài nghiên cứu liên quan đến thuốc Omeprazole như:
Phùng Thị Vinh, Trịnh Văn Lẩu (2007) “Nghiên cứu đánh giá tương đương
sinh học viên nang Helinzole (Omeprazol 20G) theo mô hình đơn liều kết hợp
đa liều”, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế. Nguyễn Nam Hương (2009)
“Nghiên cứu bào chế viên nang chứa pellet omeprazol tan trong ruột”,...
- Omeprazole được sử dụng nhiều trong chữa trị các bệnh như: trào


ngược dịch dạ dày - thực quản, loét dạ dày - tá tràng, hội chứng Zollinger Ellison… nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu nhằm hạn chế các tác dụng phụ
cũng như yếu điểm của thuốc.
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, Bộ Y tế đã cấp phép cho khoảng 42
chế phẩm của omeprazole lưu hành ở Việt Nam. Hiện nay, 37 sản phẩm có số
đăng kí còn hạn, trong đó có 25 sản phẩm nước ngoài và 12 sản phẩm trong
nước.


Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
- Omeprazole (95%) xuất xứ từ Ân Độ.
- Dung môi là NaOH 0,1M và chất phản ứng khác được cung cấp từ
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Màng CVK lên men từ môi trường chuẩn.
2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612);
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ);
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức);
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);

- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh);
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);
- Ngoài ra còn nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.3. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK
Đường glucose, peptone, chiết cao nấm men, Dinatri hidrophotphat
(Na2HPO4), axit citric, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo màng CVK
Tạo màng CVK từ môi trường HS. Quá trình lên men thu màng CVK
thô được thực hiện theo các bước sau [8,21]
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1


Bảng 2.1: Thành phần môi trường chuẩn tạo màng CVK
Thành phần

Trọng lượng

D – glucose

20g

Peptone

5g

Cao nấm men

5g

Dinatri hidrophotphat (khan) (Na2HPO4)

2,7g

Axit citric

1,15g

Nước cất 2 lần

1000ml
o

- Bước 2: Hấp khử trùng môi trường ở 113 C trong 15 phút.
- Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia cực tím trong 15
phút rồi để nguội môi trường.
- Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% axit acetic, lắc đều tay cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng bình, ủ tĩnh trong khoảng từ 4o

14 ngày ở 28 C.
- Bước 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
2.2.2. Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc, đánh giá độ tinh khiết của
màng CVK
2.2.2.1. Xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích: Loại bỏ được các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.
Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tạo thành màng dày ở mặt

môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong
0

NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113 C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử


trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội
độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ.
+ Sau khi ngâm NaOH, vớt màng và đặt dưới vòi nước chảy đến khi
màng trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng BC cần đạt
là trung tính, ta thu được CVK tinh khiết [21].
2.2.2.2. Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
Mục đích: Nhằm đảm bảo màng CVK sau khi được xử lý đã loại được
các tạp chất có thể gây độc hại. Chất được khảo sát là đường glucose và
protein của vi khuẩn.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong màng CVK tinh chế
Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện
của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling rồi ngâm trong cốc nước nóng.
+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong màng CVK tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo
kết tủa của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: Màng CVK tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất,
lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng dung dịch acid triclo acetic

1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng. Mẫu chứng
âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử
dụng để nuôi cấy vi khuẩn). Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục. So sánh
với mẫu chứng âm không chứa protein.