BƯỚC đầu ĐÁNH GIÁ tác DỤNG của CRILIN t lên sự BIỂU HIỆN một số GEN SINH UNG THƯ và ức CHẾ UNG THƯ TRÊN mô HÌNH CHUỘT NUDE MANG tế bào UNG THƯ PHỔI NGƯỜI

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, tỷ lệ người mới mắc và tử vong do ung thư
có xu hướng ngày càng tăng ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, nhất là ở các
nước nghèo, các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Theo Globocan
2012, trên thế giới hàng năm có có khoảng 14,1 triệu người mới mắc bệnh
ung thư và 8,2 triệu người tử vong do ung thư. Tại Việt Nam hằng năm có
khoảng 125000 trường hợp ung thư mới mắc và 97400 người tử vong do ung
thư, 5 loại ung thư hay gặp tính chung cho cả hai giới là ung thư gan, phổi, dạ
dày, vú, đại trực tràng [1]. Trong đó ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu trong
các tử vong do ung thư. Đến nay, phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu là những chiến
lược điều trị chủ yếu dành cho ung thư. Tuy nhiên, hiệu quả của các phương
pháp điều trị bị hạn chế và có thể dẫn đến một số tác dụng phụ. Trong thập kỷ
qua, tỷ lệ tử vong do ung thư phổi vẫn cao, với tỷ lệ sống 5 năm <15% [2]. Do
đó, việc nghiên cứu phương pháp trị liệu mới là một hướng quan trọng, nhằm
nâng cao chất lượng và thời gian sống cho bệnh nhân.
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu các loại thuốc hỗ trợ điều trị
ung thư có nguồn gốc từ các cây thảo dược ngày càng được chú ý với mục
tiêu nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế các tác dụng phụ và giảm bớt gánh
nặng về kinh tế. Trinh nữ hoàng cung có tên khoa học Crinum latifolium L là
cây thuốc thảo mộc từ lâu đã được sử dụng để chữa các bệnh u xơ, ung thư tử
cung, ung thư tuyến tiền liệt và uống dưới dạng nước sắc [3]. Hiện nay, người
ta đã phát hiện có khoảng 130 loài khác nhau phân bố ở vùng nhiệt đới với
hơn 150 alcaloid được chiết tách từ loài cây này. Cây Trinh nữ Crila Crinum
latifolium L. var. crilae Tram & Khanh, var. n đã được phát hiện và nuôi trồng
từ năm 1990 cho đến nay [4]. Kết quả của chùm các công trình nghiên cứu in
vivo và in vitro của các tác giả đã chứng minh một số phân đoạn alcaloid và


2

phân đoạn flavonoid được chiết xuất từ cây là có tác dụng chống oxy hóa và
tăng cường miễn dịch chống khối u gián tiếp hay có tác dụng gây độc tế bào
ung thư trực tiếp.
Viên nang Trinh nữ Crila được chiết từ lá cây trinh nữ hoàng cung, thuốc
đã được đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi ở Việt Nam để điều trị phì đại lành
tính tuyến tiền liệt, u xơ tử cung. Ngoài ra, viên Crila còn được nghiên cứu sử
dụng để điều trị thực nghiệm các tế bào dòng ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi,
tuyến tiền liệt và trên một số bệnh nhân ung thư tự nguyện.
Viên nang Crilin T, là một sản phẩm mới của cây Trinh nữ Crila có
chứa các alcaloid và các flavonoid. Crilin T có tác dụng tăng cường chức
năng miễn dịch chuyên nhiệm chống ung thư in vitro [5] và cũng làm tăng chế
tiết các cytokin IL-2 và TNFα in vitro của tế bào lympho người bình thường
về lâm sàng và của người bệnh ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn [6].
Tiếp nối kết quả này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng in vivo
của Crilin T lên tế bào ung thư phổi bằng cách cấy ghép tế bào ung thư phổi
của người lên chuột BALB/c nude, theo dõi cân nặng, thể tích khối u, đặc
điểm mô bệnh học và sự biểu hiện một số gen sinh ung thư (Bcl-2, Bcl-xl) và
gen ức chế ung thư (Bax và Bak) ở mức độ mRNA bằng phương pháp RTPCR. Đề tài này nhằm mục tiêu:
1. Đánh giá sự biểu lộ mRNA của gen sinh ung thư Bcl-2 và Bcl-xl trên mô
hình chuột Nude mang tế bào ung thư phổi người sau điều trị Crilin T.
2. Đánh giá sự biểu lộ mRNA của gen ức chế ung thư Bax và Bak trên mô
hình chuột Nude mang tế bào ung thư phổi người sau điều trị Crilin T.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Những hiểu biết cơ bản về bệnh ung thư

1.1.1. Khái niệm cơ bản về bệnh ung thư
Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào dưới tác động của một số tác nhân
gây ung thư làm tế bào tăng sinh vô hạn, không có tổ chức và không tuân theo
các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể. Người ta đã biết được có hơn
200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người [7].
1.1.2. Gen học và ung thư
Quá trình sinh bệnh ung thư liên quan chặt chẽ đến tổn thương 2 nhóm
gen, đó là gen sinh ung thư và gen ức chế ung thư. Bình thường hai nhóm gen
này có vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản, biệt hóa và chết
theo chương trình của tế bào, giúp cho sự ổn định sinh học của cơ thể.
1.1.2.1. Gen sinh ung thư (oncogene)
Năm 1911 Peyton Rous đã phát hiện ra virut sinh sarcom ở cơ gà và đến
những năm 60 người ta mới tìm thấy gen sinh u đó trong virut Rous và được
đặt tên là src. Sau đó hàng chục gen sinh u khác ở nhiều virut khác được phát
hiện. Giữa những năm 1970, các nhà vi sinh Mỹ John Michael Bishop và
Harold Varmus thử nghiệm giả thuyết cho rằng các tế bào cơ thể khỏe mạnh
có chứa gen gây ung thư của virut không hoạt động, khi được kích hoạt sẽ gây
ung thư. Họ đã cho thấy rằng gen sinh ung thư được bắt nguồn từ gen tiền ung
thư (proto-oncogene) trong các tế bào cơ thể vật chủ của chúng. Ở người, gen
tiền ung thư có thể được chuyển đổi thành gen sinh ung thư bởi đột biến,
khuếch đại gen và sắp xếp lại nhiễm sắc thể [8]. Người ta cho rằng đột biến ở
các gen này có thể là nguyên nhân làm mất khả năng khiểm soát quá trình
phân bào và do đó mà sinh u, chính đó là lí do tại sao lại có tên là oncogen
[9]. Có 3 giả thuyết cho việc hình thành oncogen [10].


4

- Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăng
trưởng (growth factor). Do rối loạn cơ chế điều hòa, yếu tố tăng trưởng hoạt

hóa mạnh kích thích oncogen sinh ung thư.
- Oncogen là những đoạn DNA bị tổn thương bởi các tác nhân gây bệnh
như: Hóa học, sinh học, vật lý. Cơ thể đã có những cơ chế sửa chữa những
DNA này nhưng không sửa chữa được hoàn hảo nên cùng một tác nhân ung
thư nhưng có người bị ung thư có người lại không bị ung thư.
- Oncogen là do các bộ gen của virut sinh ra trong tế bào nhiễm, vì người
ta thấy các oncogen này giống với DNA của virus. Ví dụ: HPV (cổ tử cung,
dương vật), EBV (Burkitt) và HBV (ung thư gan) [11].
1.1.2.2. Gen ức chế ung thư (tumor suppressor)
Gen ức chế ung thư là gen điều hòa sự phân chia tế bào bằng cách làm
chậm sự phân bào, sữa chữa các sai sót của DNA, lệnh cho tế bào chết đi
(chết tế bào theo chương trình). Khi gen này hoạt động không bình thường
hay bị bất hoạt, làm các tế bào phát triển không kiểm soát được và có thể dẫn
đến ung thư. Các nghiên cứu về ung thư đã xác định và mô tả đặc điểm của
nhiều gen ức chế khối u. Năm 1971, nhà nghiên cứu Mỹ Alfred Knudson mặc
nhiên công nhận rằng một dạng hiếm của ung thư mắt là nguyên bào võng
mạc gây ra bởi đột biến ở một gen Rb [12], [13]. Nghiên cứu tiếp theo cho
thấy các đột biến ở gen này cũng đóng một vai trò trong bệnh ung thư xương,
phổi, vú, cổ tử cung, tuyến tiền liệt và bàng quang. Một số gen ức chế khối u
khác (chẳng hạn như TP53, mã hóa một protein gọi là p53) đã được xác định.
Các dạng đột biến của TP53 đã được liên quan đến hơn 50% của tất cả các
bệnh ung thư. Các đột biến trong hai gen ức chế khối u khác là BRCA1 và
BRCA2 trong ung thư vú, chúng được tìm thấy trong 5-10% của tất cả các
trường hợp và trong khoảng 85% của tất cả các trường hợp ung thư vú di
truyền [14].


5

1.1.3. Quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis)

Trong nhiều thập kỷ qua, những nghiên cứu cơ bản về ung thư đã cho thấy
sự tiến bộ đáng kể trong sự hiểu biết của chúng ta về sinh học ung thư và ung
thư di truyền. Trong số những điểm quan trọng nhất của những tiến bộ này là
sự nhận thức rằng quá trình chết tế bào theo chương trình và các gen kiểm
soát nó có ảnh hưởng sâu sắc đến kiểu hình ác tính [15].
Chết tế bào theo chương trình là một hiện tượng có tính di truyền của các
tế bào có nhân. Chết tế bào theo chương trình được Kerr, Wyllie và Curie mô
tả năm 1972, đó là một hiện tượng phổ biến và cần thiết cho cuộc sống. Từ sự
phát triển bình thường của cơ thể, sự hằng định của các mô cho đến việc loại
trừ các tế bào bị viêm nhiễm hay sự dung nạp về miễn dịch học [16]. Nếu
hoạt động có sự thiếu hụt thì sẽ phát sinh ung thư và các dị tật trong cơ thể.
Ngược lại, hoạt động quá mức sẽ gây ra các biến đổi thoái hóa cơ và thần
kinh cũng như những rối loạn khác nữa. Chết tế bào theo chương trình có thể
được xem như một rào cản quan trọng để phát triển bệnh ung thư, chống lại
chết tế bào theo chương trình là một đặc tính của tế bào ung thư và là một
nguyên nhân chính của thất bại trong điều trị.
Quá trình chết tế bào theo chương trình diễn ra theo 2 con đường chính,
bao gồm con đường ngoại sinh hay con đường thông qua thụ thể chết và con
đường nội sinh hay con đường qua trung gian ty thể [16].


6

Hình 1.1. Sơ đồ các con đường hoạt hóa chết tế bào theo chương trình
(Nguồn />Con đường thông qua thụ thể chết (the death receptor pathway) hay con
đường ngoại sinh, khác với con đường của ty thể. Con đường này được khởi
động bởi các kích thích ngoại bào, chẳng hạn như phóng thích các yếu tố tăng
trưởng kích thích sự gắn của thụ thể chết xuyên màng (một tập hợp thụ thể
TNF bao gồm cả TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL-1 và 2) [17] với các phân
tử tín hiệu (ligand) cùng nguồn gốc với chúng. Các phức hợp ligand/thụ thể sẽ

được trimer hóa và các vùng thụ thể chết sẽ gắn với các protein FADD nhờ sự
tương tác với các vùng tương đồng trong bộ chuyển đổi này. Ngoài ra, các
FADD còn chứa một vùng hiệu ứng chết tương đồng với nó trong caspase khởi
đầu. Do gắn với thụ thể chết nên vùng này được lộ ra và được gắn với tiền


7

caspase khởi đầu, thường là với tiền caspase 8 hoặc tiền caspase 10, phức hợp
này còn có tên gọi là “phức hợp tín hiệu cảm ứng chết” (DISC). Chức năng của
nó trong chết tế bào theo chương trình là chuyển các phân tử tiền caspase tới
trạng thái dimer hóa và kích hoạt lẫn nhau. Các caspase 8 hoặc 10 kích hoạt
khởi đầu sau đó sẽ kích hoạt caspase thực hiện như caspase 3, 6, 7 làm cho
phức hợp thực hiện hoạt động ly giải protein chất nền và chết tế bào.
Con đường ty thể (mitochondria pathway) là con đường nội sinh liên
quan đến tính toàn vẹn của màng ti thể, được kích hoạt bởi các yếu tố như bức
xạ, thiếu yếu tố tăng trưởng, thiếu cytokin, thuốc gây độc tế bào. Tiến triển
thông qua con đường này dẫn đến sự ra đời của cytochrom c từ ty thể bị tổn
thương, sau đó liên kết với các phân tử chuyển đổi Apaf-1 (yếu tố cảm ứng
chết tế bào theo chương trình) và caspase “khởi động” chưa hoạt động, tiền
caspase 9, trong một phức tạp multiprotein gọi là apoptosom. Điều này dẫn
đến việc kích hoạt các caspase 9, sau đó khởi phát một chuỗi các caspasekích
hoạt (caspases 3 và 7) dẫn đến những thay đổi về hình thái và sinh hóa gắn
liền với quá trình chết tế bào theo chương trình [18]. Cơ chế điều hòa con
đường này rất tinh vi thông qua các hệ thống kích thích và ức chế phức tạp
mà hiện nay y học phân tử đang khám phá. Đây là một cơ chế bị chi phối bởi
2 nhóm protein: Một nhóm chống lại quá trình chết tế bào theo chương trình
như Bcl-2, Bcl-xl và Mcl-1 và một nhóm protein làm tăng hiệu ứng chết tế
bào theo chương trình như Bax và Bak. Ngoài ra còn có một số các protein có
liên quan như Bim, Bad, puma và noxa [19], [20].

Chết tế bào theo chương trình giúp cho cơ thể loại bỏ những tế bào
không còn cần thiết, hoặc các tế bào bị tổn thương, sai hỏng có thể dẫn tới
ung thư [21], [22]. Do đó, các tác giả cho rằng sự tránh chết tế bào theo
chương trình là một điều kiện tất yếu cho sự thay đổi và tăng trưởng bền vững
của các tế bào ung thư đã được chấp nhận rộng rãi [23]. Có rất nhiều cách để


8

một tế bào ác tính có thể có được giảm quá trình chết hoặc chống lại chết tế
bào theo chương trình. Nhìn chung, cơ chế để tránh chết tế bào theo chương
trình bao gồm: Sự mất cân bằng của các protein chống chết tế bào theo
chương trình và kích thích chết tế bào theo chương trình, sự giảm chức năng
caspase và sự giảm biểu hiện của các thụ thể chết.

Hình 1.2. Cơ chế tham gia tránh chết tế bào theo chương trình và ung thư
(Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12209154)
Do vậy, một sự hiểu biết chi tiết về cái chết của tế bào theo chương trình sẽ
giúp hiểu rõ hơn về sự phức tạp của khối u và cải tiến phương pháp điều trị ung
thư dựa trên sự hoạt hóa các thành phần của chết tế bào theo chương trình.


9

1.1.4. Một số gen liên quan
Gia đình gen Bcl-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chết tế
bào theo chương trình, đến nay được biết có 25 gen khác nhau. Hầu hết
chúng đều chứa một vùng vận chuyển màng đầu tận cùng C kỵ nước làm
nhiệm vụ neo chúng vào màng. Tuy nhiên, cũng có vài thành viên họ này
xuất hiện ở tế bào chất. Các protein họ Bcl-2 được đặc trưng bởi các vùng

BH tương ứng Bcl-2 [24].
Có 4 vùng BH khác nhau và một số protein họ Bcl-2 có chứa tất cả 4
vùng. Đặc biệt là vùng BH1 và BH2 cho phép sự dimer hóa dị loại
(heterodimerization) với Bax để làm thoái lui sự chết tế bào theo chương trình
[25]. Vùng BH3 xuất hiện với chức năng cho phép sự dimer hóa dị loại giữa
Bcl-xl và Bcl-2 với các thành viên tiền chết tế bào theo chương trình (Bax,
Bak) để thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình. Vùng BH4 được duy trì
trong các thành viên chống chết tế bào theo chương trình (Bcl-xl), nhưng
có xu hướng vắng mặt trong các thành viên kích thích chết tế bào theo
chương trình. Vùng BH4 đã được chứng minh là rất quan trọng đối với việc
dimer hóa dị loại với Bax và cho hoạt động chống chết tế bào theo chương
trình [26]. Thành viên của Bcl-2 có thể được phân thành các protein chống
chết tế bào theo chương trình và kích thích chết tế bào theo chương trình và
giữa chúng có sự tương tác với nhau trong việc tăng hiệu ứng hay ức chế
chết tế bào theo chương trình. Protein chống chết tế bào theo chương trình
như Bcl-2, Bcl-xl, và Bcl-W. Chúng ngăn chặn sự chết tế bào bằng cách ức
chế các protein kích thích chết tế bào theo chương trình gồm Bax và Bak.
Ngoài ra còn có các thành viên của “chỉ có vùng BH3”, các thành viên này
hiển thị trình tự tương đồng chỉ trong vùng BH3 và cho đến nay đều là tiền
chết tế bào theo chương trình [27], [28], [29].


10

Hình 1.3. Các thành viên họ Bcl-2
(Nguồn: )
1.1.4.1. Gen Bcl-2
Bcl-2 là từ viết tắt của B-cell lymphoma/leukemia-2. Lần đầu tiên được
phát hiện ở nang lympho B. Đây là thành viên thứ hai của một loạt các protein
ban đầu được mô tả trong sự hoán vị NST bao gồm NST số 14 và 18 trong

nang lympho. Phần NST số 18 có chứa vị trí của Bcl-2 đã xảy ra hiện tượng
hoán vị với phần của NST số 14 có chứa kháng thể ở vị trí chuỗi nặng [30].


11

Hình 1.4. Sự chuyển vị của gen Bcl-2
(Nguồn:www.biology.com)
Bcl-2 có cấu trúc gồm một lõi kị nước bao quanh bởi một vỏ xoắn, có
trọng lượng phân tử là 27000 dalton. Nó được tạo nên từ 4 vùng BH (Bcl-2
homology) được đánh số từ BH1-4. Các vùng BH được biết là rất quan trọng
trong chức năng của Bcl-2. Bcl-2 thường được tích hợp trong các màng ngoài
ty thể, nhưng cũng có thể có trong bào tương hoặc lưới nội chất.
Vaux cùng các cộng sự (1988) là những người đầu tiên báo cáo rằng
Bcl-2 có thể ức chế các tế bào chết. Sau kích thích chết tế bào theo chương
trình, các protein tiền chết theo chương trình được hoạt hóa thông qua các sửa
đổi sau tổng hợp hoặc thông qua những biến đổi về cấu trúc của chúng. Bcl-2
tạo dị dimer với các thành viên họ Bcl-2 tăng hiệu ứng chết tế bào theo
chương trình, dẫn đến sự bất hoạt của chúng. Bax là một protein liên quan với
Bcl-2, thúc đẩy chết tế bào theo chương trình và là đích sao chép của hạ
nguồn của p53. Protein Bcl-2 dị dimer hóa với Bax do vậy mà ức chế chết tế
bào theo chương trình. Mặt khác Bax lại được kích thích bởi các thành viên
“chỉ có vùng BH3” trong khi Bcl-2 lại có tác dụng ức chế các gen này nên khi
Bcl-2 tăng biểu hiện thì các gen “chỉ có vùng BH3” bị ức chế, do vậy giảm


12

khả năng kích hoạt Bax. Hơn nữa, protein Bcl-2 lại có thể can thiệp vào
những bước quan trọng trong quá trình hợp nhất các tín hiệu tiền chết tế bào

theo chương trình ở mức độ ty thể, qua đó bãi bỏ việc giải phóng cytochromec. Bcl-2 cũng có thể điều chỉnh sự hoạt hóa của nhiều caspase như caspase-2.
Trong lưới nội sinh chất Bcl-2 điều chỉnh lưu trữ canxi, ở mức độ nội bào đã
được chứng minh là ảnh hưởng đến quá trình chết tế bào theo chương trình.
1.1.4.2. Gen Bcl-xl
Bcl-xl (B – cell lymphoma – extra large) là protein đầu tiên được tìm ra
có cùng chức năng với Bcl-2 và cùng thuộc nhóm chống lại chết tế bào theo
chương trình. Cấu tạo của Bcl-xl cũng bao gồm có 4 vùng BH từ 1 đến 4 nằm
ở vị trí NST 20q11.21. Protein Bcl-2 và Bcl-xl có 43% acid amin giống nhau
và có nhiều đoạn tương tự nhau. Bcl-2 và Bcl-xl có cùng chức năng trên một
giai đoạn của chết tế bào theo chương trình [31]. Vị trí nằm ở màng ngoài ty
thể và quy định sự điều hòa đối với việc mở các kênh ở màng ngoài ty thể.
Kênh này quy định điện thế của màng ty thể và do đó kiểm soát việc sản xuất
của các chất oxy hóa và giải phóng cytochrom c của ty thể, cả hai đều là chất
gây cảm ứng mạnh của chết tế bào theo chương trình. Có tác giả cho rằng,
Bcl-xl cũng có thể ức chế chết tế bào theo chương trình bằng cách gắn vào
Apaf-1, do đó ngăn cản sự kết hợp với caspase 9 và cytochrom c và sự kích
hoạt tiếp theo của các caspase hiệu ứng hạ lưu, mặc dù vấn đề này hiện nay
đang gây tranh cãi [32]. Mặc dù Bcl-2 và Bcl-xl dường như không thể phân
biệt được chức năng, có bằng chứng rằng chúng khác nhau trong khả năng
của mình để bảo vệ tế bào khỏi tác nhân kích thích chết tế bào theo chương
trình khác nhau [33], [34], [35].


13

1.1.4.3. Gen Bax

Hình 1.5. Vị trí của gen Bax
Bax (BCL2-associated X) nằm trên NST 19, có kích thước 21kDa. Bax được
mã hóa bởi sáu exon và được tạo nên từ ba vùng BH là BH1, BH2 và BH3.

Bax được xác định là yếu tố kích thích chết tế bào theo chương trình đầu
tiên chống lại chức năng của Bcl-2. Vùng BH3 của Bax đã được chứng minh
là rất quan trọng trong việc hình thành dimer. Bax có thể hình thành đồng
dimer hoặc dị dimer với Bcl-2, Bcl-xl [36], [37]. Trong các tế bào động vật có
vú khỏe mạnh, phần lớn Bax được tìm thấy trong bào tương nhưng khi bắt
đầu các tín hiệu tự hủy hoại, Bax trải qua một sự thay đổi cấu tạo và chèn vào
các màng bào quan, chủ yếu là màng ngoài ty thể. Bax và Bak có thể hình
thành các lỗ trên màng ngoài ti thể và làm thay đổi tính thấm của nó. Điều này
dẫn đến sự ra đời của cytochrom c và các yếu tố tiền chết tế bào theo chương
trình khác từ các ty lạp thể, dẫn đến hoạt hóa caspase. Bax cũng có mặt trong
mạng lưới nội sinh chất nơi mà chúng kiểm soát quá trình chết tế bào theo
chương trình thông qua các mức lưu trữ canxi.
Bax được kích hoạt bởi nhóm protein “chỉ có BH3”. Sự biểu lộ của Bax
cũng được quy định bởi protein ức chế khối u p53 (TP53) và Bax đã được
chứng minh có liên quan trong quá trình chết tế bào theo chương trình được
điều hòa bởi p53. Các protein p53 là một yếu tố phiên mã, khi được kích hoạt
như là một phần của phản ứng của tế bào với stress, điều hòa rất nhiều gen
mục tiêu bao gồm Bax. Protein p53 tương tác với Bax thúc đẩy Bax kích hoạt
và chèn Bax vào màng ty thể [38].


14

1.1.4.4. Gen Bak

Hình 1.6. Cấu trúc của gen Bak
(Nguồn: )
Bak nằm trên NST 6p21.31, là một tiền gen chết tế bào theo chương
trình thuộc họ protein Bcl-2. Ở tế bào khỏe mạnh Bak là một protein màng
đơn có một phần cấu trúc nằm ở màng ngoài ty thể trong khi Bax di chuyển đến

ty thể trong quá trình chết tế bào theo chương trình. Bak tương tác và làm tăng
tốc độ mở của kênh anion điện áp phụ thuộc vào ty thể, dẫn đến mất sự toàn vẹn
của màng ty thể, thay đổi tính thấm màng và giải phóng ra cytochrom c. Protein
này cũng tương tác với gen ức chế khối u P53 sau khi tế bào bị tổn thương. Bak
được điều chỉnh bởi các thành viên khác của gia đình Bcl-2. Ví dụ, một số
protein “chỉ có vùng BH3” (Bim và Bid) được báo cáo trực tiếp ràng buộc Bak
để chuyển đổi nó thành các dạng kích hoạt, trong khi protein tiền chết tế bào
theo chương trình (ví dụ như Bcl-xl và MCL-1) có thể cô lập sự hoạt động của
Bak và do đó ngăn ngừa Bak homo-oligomerization và hình thành lỗ thẩm thấu.
Vai trò của Bak ở mạng lưới nội chất là không rõ ràng [39], [40].


15

Hình 1.7. Sự tương tác chức năng của các thành viên họ
protein Bcl-2 ở màng ty thể
(Nguồn: )
1.1.4.5. Các nghiên cứu về Bcl-2, Bcl-xl, Bax và Bak trong ung thư
Một nghiên cứu trên 70 trường hợp dạ dày mạn tính, 49 trường hợp dị sản
ruột, 64 trường hợp loạn sản và 81 trường hợp ung thư biểu mô tuyến dạ dày
cho thấy: Tỷ lệ (+) của Bcl-2 và Bax cao nhất trong loạn sản vừa. Trong dị
sản ruột và loạn sản tỷ lệ (+) của Bcl-2 và Bax cao hơn trong viêm loét dạ dày
mạn tính và ung thư biểu mô tuyến dạ dày. Như vậy sự biểu lộ của Bcl-2 cũng
như Bax có thể có giá trị trong dự báo sớm bệnh ung thư dạ dày cũng như
trong những tổn thương tiền ung thư [41]. Trong khi Fulda và cộng sự đã báo
cáo rằng Bcl-2 biểu hiện quá mức dẫn đến ức chế chết tế bào theo chương
trình trong các tế bào ung thư biểu mô nguyên bào thần kinh, glioblastoma và
vú [42]. Ở bệnh nhân u lympho mạn tính, khi các tế bào này được nuôi cấy
trong ống nghiệm, chết tế bào theo chương trình do thuốc trong các tế bào
lympho B mạn tính tỷ lệ nghịch với tỷ lệ Bcl-2/Bax [29], [43]. Cùng với đó,

các nghiên cứu khác của Raffo và Mackey đã cho thấy biểu lộ quá mức của
Bcl-2, tế bào ung thư tuyến tiền liệt được bảo vệ trước kích thích chết tế bào


16

theo chương trình trong ống nghiệm [44] và tỷ lệ Bcl-2/Bax cao làm tăng
nguy cơ ung thư không đáp ứng với xạ trị vì vậy nghiên cứu này cho thấy giá
trị tiên lượng của tỉ lệ Bcl-2/Bax như một dấu ấn phân tử tiềm năng để dự
đoán khả năng đáp ứng với xạ trị của các khối u tuyến tiền liệt. Các nghiên
cứu khác đã cho thấy đánh giá của các trạng thái biểu hiện của Bcl-2 bởi khối
u có thể cung cấp thông tin tiên lượng về các biểu hiện lâm sàng của ung thư
phổi không phải tế bào nhỏ [45]. Kết luận này cũng phù hợp với các nghiên
cứu khác đánh giá giá trị tiên lượng của sự biểu lộ Bcl-2 [46], [47].
Nghiên cứu hồi cứu được thực hiện trên những bệnh nhân có khối u hắc tố
ác tính lan tỏa bề mặt (SSM, n = 44) hoặc khối u ác tính dạng nốt (n = 16) có
độ dày 1,5-4 mm. Ba mươi bệnh nhân đã sống sót qua theo dõi 10 năm, trong
khi 30 bệnh nhân khác được phát triển di căn. Phần khối u đã được phân tích
bằng hóa mô miễn dịch cho sự biểu hiện của các chất điều hòa của chu kỳ tế
bào. Trong SSM, giảm Bax và Bak được tương quan với tiên lượng xấu: Tỉ lệ
Bax cao có liên quan đến tỷ lệ sống sót trong 10 năm, cụ thể: Bax cao tỉ lệ
sống sót trong 10 năm là 68%, trong khi Bax thấp chỉ có 26% sống sót, và
Bak cao tỉ lệ sống sót trong 10 năm là 62%, trong khi Bak thấp chỉ có 10%
sống sót. Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò đặc biệt của con đường chết tế
bào theo chương trình ty thể và các protein Bcl-2 liên quan cho sự tiến triển
khối u ác tính [48].
Trong nghiên cứu của Olopade, Bcl-xl được biểu hiện quá mức 18 trong
42 (43%) bệnh ung thư vú xâm lấn khi so sánh với biểu mô vú bình thường
liền kề. Phân tích protein bằng kỹ thuật Western blot với tám bệnh ung thư vú
nguyên phát, năm dòng tế bào ung thư vú cho thấy Bcl-xl biểu lộ chiếm ưu

thế. Sự biểu lộ quá mức của protein Bcl-xl ở khối u này liên quan với tăng cấp
độ u và tăng số lượng di căn hạch. Không có sự tương quan giữa mức độ biểu
hiện protein Bcl-xl và tuổi tác, kích thước khối u, và tình trạng TP53. Tại một
trung tâm, người ta theo dõi trong thời gian 216 tuần, thời gian sống nói


17

chung giảm ở bệnh nhân có khối u biểu hiện tốt Bcl-xl. Như vậy những phát
hiện này cho thấy rằng biểu hiện của protein Bcl-xl được tăng lên đáng kể ở
bệnh ung thư vú xâm lấn. Ngược lại với biểu hiện Bcl-2, tăng điều chỉnh của
Bcl-xl có thể là một dấu hiệu của sự tiến triển của khối u [49].
1.2. Những hiểu biết cơ bản về ung thư phổi
Ung thư phổi được chia làm hai loại chính: Ung thư phổi tế bào nhỏ và
ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, tùy thuộc vào hình dạng tế bào dưới kính
hiển vi. Mỗi loại ung thư phát triển và lan theo những hướng khác nhau.
Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ thường gặp hơn ung thư phổi tế bào
nhỏ và nó thường phát triển và lan chậm hơn. Có ba loại ung thư không phải
tế bào nhỏ chủ yếu. Chúng được đặt tên theo týp tế bào từ đó ung thư phát
triển: Ung thư biểu mô tế bào vẩy (còn được gọi là ung thư biểu mô dạng biểu
bì), ung thư biểu mô tuyến và ung thư biểu mô tế bào lớn.
Ung thư phổi tế bào nhỏ ít gặp hơn ung thư phổi không phải tế bào nhỏ.
Loại ung thư này phát triển nhanh hơn và hay lan các bộ phận khác trong cơ thể.
 Những yếu tố nguy cơ của ung thư phổi
Ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên toàn thế
giới. Nguyên nhân gây ra ung thư phổi cho tới nay chưa được hiểu đầy đủ,
qua các tài liệu nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy có một số yếu tố liên
quan đến nguy cơ phát triển bệnh này. Những yếu tố này bao gồm [50]:
Thuốc lá: Hút thuốc lá là nguyên nhân hàng đầu gây ung thư phổi. Các
chất có hại được gọi là tác nhân gây ung thư, có trong thuốc lá làm tổn hại tới

các tế bào ở trong phổi. Dần dần, những tế bào này có thể trở thành ung thư.
Khói thuốc lá đến nay là yếu tố nguy cơ chính và quan trọng nhất đối với
bệnh ung thư phổi. Nó gây ra hơn 80% của tất cả các ung thư phổi trên toàn
thế giới. Các chất độc hại trong khói thuốc làm tổn thương các tế bào phổi.
Theo thời gian, các tế bào bị tổn thương có thể trở thành ung thư. Đây là lí do
tại sao hút thuốc lá có thể gây ung thư phổi. Hít phải khói thuốc lá cũng có thể


18

gây ung thư phổi ở những người không hút thuốc. Một người tiếp xúc càng
nhiều với khói thuốc lá, nguy cơ bị ung thư phổi càng cao. Ngoài thuốc lá, xì
gà và thuốc lá tẩu cũng là một yếu tố nguy cơ. Số năm hút thuốc, số lượng xì
gà và thuốc lá tẩu hút mỗi ngày, mức độ hít khói thuốc đều ảnh hưởng đến
nguy cơ bị ung thư phổi.
Các yếu tố môi trường khác như khí radon, amiăng, ô nhiễm môi trường:
Khi làm việc trong môi trường có tiếp xúc với khí radon, amiăng và các chất
gây ung thư như asen, niken, crom, nhựa đường cũng có thể làm tăng nguy cơ
nguy cơ ung thư phổi phát triển, đặc biệt nếu là một người hút thuốc. Các nhà
nghiên cứu đã tìm ra mối liên hệ giữa bệnh nhân ung thư phổi và sự tiếp xúc
với một số chất gây ô nhiễm không khí nhất định, ví dụ như các sản phẩm phụ
sinh ra trong quá trình đốt dầu diesel và những nhiên liệu hóa thạch khác. Tuy
nhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và vẫn đang
được tiếp tục nghiên cứu.
Các bệnh phổi và tiền sử bản thân: Một số bệnh phổi như bệnh lao, bệnh
phổi tắc nghẽn mạn tính làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư phổi. Bỏ hút thuốc
lá sau khi được chẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thư
phổi lần hai.
1.3. Tổng quan về trinh nữ hoàng cung
Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC) tên khoa học Crinum latifolium L. Thuộc

họ thủy tiên: Amaryllidaceae, có khoảng 130 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới. Chi
Crinum L ở châu Á có 17 loài, trong đó có 6 loài hay gặp ở Việt Nam là Crinum
Latifolium L; Crinum amabile Donn; Crinum asiaticum L; Crinum giganteum
Andr; Crinum Ensifolium Roxb; Crinum morei Hoob. F [51], [52].
Theo tài liệu của Trung Quốc, TNHC còn gọi là: Thập bát học sĩ, Tây nam
văn lang, Châu lan, Tỏi lơi lá rộng, náng lá rộng [51], [52]. Ở Việt Nam cây
mọc tự nhiên và trồng nhiều ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và các tỉnh phía
nam: Quảng Nam, Bình Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng Tàu. Nhân dân ta


19

dùng lá tươi hoặc phơi khô, một số dùng cả thân và củ để điều trị bệnh u xơ
tử cung, u xơ tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư tiền liệt
tuyến [3], [52]. Cây TNHC có nhiều ở các nước Đông Nam Á và Nhật Bản,
gồm Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin,
Campuchia, Lào. Ở Vân Nam (Trung Quốc) lá được dùngtrị sang lở độc,
viêm tuyến vú, lở trĩ [52], [53].
1.3.1. Giới thiệu về cây trinh nữ hoàng cung
Trinh nữ hoàng cung (TNHC) là cây thuốc thảo mộc đã được dùng để
điều trị bệnh trong dân gian. Cây có thân như củ hành tây to cao khoảng 4060cm, đường kính 10-15mm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài khoảng
10-15cm, có chiều lá mỏng kéo dài từ 80-100cm, rộng 3-8cm, hai bên mép lá
lượn song. Gân lá song song mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một
sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm
6-18 hoa, trên một cán dài 30-36cm. Cánh hoa màu trắng có điểm màu đỏ tím.
Bao hoa có 2 phần: Phần dưới hàn liền thành ống hơi cong, màu lục nhạt, dài
8-10cm, rộng 5-7mm. Phần trên là các thùy của đài và tràng gần giống nhau,
hình thoi, đầu nhọn, màu trắng, dài 9-11cm. Ba lá đài ở vòng ngoài rộng 1,72,2cm, mặt trong có vệt màu đỏ tía nhạt chạy dọc ở giũa. Ba cánh hoa xếp xen
kẽ ở vòng trong rộng 2,3-2,7 cm, cả 2 mặt đều có vệt đỏ tía nhạt. Sáu nhị đính
ở họng của bao hoa. Chỉ nhị mảnh và cong, dài 7-8 cm. Bao phấn mảnh, đính

lung, dài 1-2 cm. Bầu dưới, hình trụ đến hình trứng ngược, dài 1,2-1,8 cm, rộng
1-8 mm. Vòi nhụy mảnh, dài 19-20 cm, núm nhụy không rõ; phần đầu của vòi
nhụy và chỉ nhụy đều có màu đỏ tía [52], [53].


20

Hình 1.8. Cây trinh nữ hoàng cung
(Nguồn: )
1.3.2. Các công trình nghiên cứu về Trinh nữ hoàng cung
Năm 1984 Ghosal (Ấn Độ) đã phân lập và xác định từ cánh hoa TNHC một
Gluco-ancaloid có tên là Latisolin. Thủy phân bằng enzym thu được aglycon có
tên Latisodin. Năm 1986 Ghosal còn công bố tách được một số dẫn chất
ancaloid có tác dụng chống ung thư crinafolin và crinafolidin từ TNHC. Năm
1989 ông còn chiết xuất từ dịch ép của cán hoa TNHC được 2 alcaloid mới có
nhân pyrrolophennanthridin là: 2-epilycorin và 2-epipancrassidin.
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành
phần hóa học của cây náng có tên khoa học lá Crinum latifolium L. Nguyễn
Thị Ngọc Trâm và cộng sự (1991) đã nghiên cứu chi tiết về cây TNHC: Xác
định được 43 alcaloid trong lá cây TNHC sau khi ra hoa, 23 alcaloid trong lá
cây thời kỳ cây ra hoa, 10 alcaloid thời kỳ đầu của cây. Alcaloid Lycorin là
chất chính lấy từ Crinum Latifolium L, có tác dụng kích thích tế bào lympho
T trên in vitro và chuột thực nghiệm và làm giảm khả năng sống của các tế
bào u. Tách và làm sạch, xác định cấu trúc 2 chất: crinafolin, 1,2 beta epoxy
ambellin có tác dụng mạnh ở tế bào ung thư và hệ miễn dịch. Nước sắc
TNHC có tác dụng làm giảm khối u trên chuột thực nghiệm. Các thí nghiệm


21

in vitro của các phân đoạn chiết cho kết quả dương tính với cả 3 dòng tế bào:
ung thư gan, ung thư cơ tim và ung thư biểu mô [54].
Trần Công Khánh (1998) đã tổng kết các công dụng và hoạt chất của cây
TNHC theo các tác giả Ấn Độ và Nhật Bản. Tùy các bộ phận lá, thân hoa, rễ
hay toàn thân cây có các hoạt chất sau: Glucan, acid hữu cơ, saponin, acid
amin, alcaloid [51], [52], [55].
Ngoài ra các nhà nghiên cứu như Nguyễn Công Hào, Trần Thị Việt Hoa,
Nguyễn Thị Thùy Dương đã có nghiên cứu chi tiết về TNHC [54].
Nguyễn Xuân Hướng (2001) dùng trà nhúng trinh nữ hoàng cung điều trị
phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Kết quả điều trị 97% có tác dụng tốt [56].
Nguyễn Ngọc Dung, dùng trà trinh nữ hoàng cung điều 200 bệnh nhân
trong thời gian 3 năm cho nhận xét: 80% bệnh nhân u xơ tuyến tiền liệt có kết
quả tốt. Đối với u xơ tử cung, có giảm kích thước, giúp bệnh nhân cầm máu,
giảm đau, cơ thể khỏe lên là 100% [57].
1.3.3. Giới thiệu về Crilin T
Cụm công trình nghiên cứu về cây Trinh nữ Crila đã tạo ra sản phẩm
thuốc Crila và một số thực phẩm chức năng khác.
Nguyễn Thị Ngọc Trâm cùng các cộng sự đã dày công khảo sát về thực
vật, nuôi trồng, thu hái cây TNHC, đặc biệt là đã định lượng được alcaloid
toàn phần trong lá cây TNHC. Chiết suất ở lá cây đang nở hoa và sau khi nở
hoa (tháng 4 đến tháng 9) để chế tạo thành viên nang Crila.
Viên nang Crila đã được thử đã được thử độc tính tại Phòng nghiên cứu
Khoa y học cổ truyền của Trường đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
(2002). Tháng 8/2003 thử độc tính bán trường diễn tại Phòng Đông y thực
nghiệm Bệnh viện Y học cổ truyền Trung Ương. Kết quả không có sự thay đổi
đáng kể về các chỉ tiêu sinh hóa, huyết học ở các lô thực nghiệm trước và sau
2 tháng thử thuốc Trinh nữ hoàng cung [58].
Ngày 30/7/2004. Cục quản lý Dược - Bộ Y tế đã có quyết định số 93/QĐQLD cho phép sản phẩm viên nang Crila được phép lưu hành trong các nhà

22

thuốc bệnh viện [59]. Lê Anh Thư (2004), dùng viên nang Trinh nữ hoàng cung
điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt kết quả tốt là 96,1% giảm kích thước
tuyến tiền liệt, tăng lượng nước tiểu, giảm nhu cầu tiểu tiện [58].
Bệnh viện Phụ sản Trung Ương (2005) đã thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1
và 2 về tác dụng của viên nang Crila trong điều trị u xơ tử cung đã có kết luận:
Thuốc an toàn, không có tác dụng phụ, hiệu quả điều trị bệnh nhân có u xơ tử
cung là 65,6%, giảm các triệu chứng rong kinh, rong huyết do u xơ gây ra [60].
Viên nang Crilin T, một sản phẩm mới của cây Trinh nữ Crila (Crinum
latifolium L.var. Crilae Trâm vs Khanh, var.n) có chứa các alcaloid và các
flavonoid của cây Trinh nữ Crila. Crilin T có tác dụng tăng cường chức năng
miễn dịch chuyên nhiệm chống ung thư in vitro bởi làm tăng số lượng tế bào
Lympho T (đặc biệt là TCD8, TCD4) [5] và cũng làm tăng chế tiết các
cytokin IL-2 và TNFα in vitro của tế bào lympho người bình thường về lâm
sàng và của người bệnh ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn [6].
Sản phẩm này vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu và chưa được công bố.
1.4. Giới thiệu về mô hình nghiên cứu trên chuột BALB/c Nude
Chuột BALB/c Nude là chuột không có tuyến ức, trụi lông được mô tả
lần đầu tiên vào năm 1966 bởi Flanagan [61]. Một đột biến gen duy nhất đã
gây nên sự trụi lông vì vậy chúng thường được gọi là chuột “nude”. Ngoài ra,
đột biến này cũng gây ra sự thiếu hụt tuyến ức và dẫn đến hậu quả là sự suy
giảm miễn dịch do sự thiếu hụt trầm trọng lympho T, do vậy dòng chuột này
thường được sử dụng trong nghiên cứu sinh học gồm các bệnh lý ung thư và
ghép các ung thư dị gen bằng cách cấy các tế bào ung thư của người để tạo
khối u và nghiên cứu in vivo với nhiều mục đích khác nhau.
Trên thế giới và tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu được
thực hiện trên mô hình chuột Nude [62], [63], [64] như công trình nghiên cứu
của Lin Song và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của HGC-MSC
từ mô ung thư dạ dày của con người lên sự phát triển, xâm lấn và quá trình

23

chuyển đổi biểu mô-trung mô trong mô khối u của ung thư dạ dày trên chuột
Nude [65]. Tại Việt Nam, các nhà khoa học của Học viện Quân y đã nghiên
cứu, ứng dụng thành công quy trình tạo khối ung thư vú, phổi, gan, và tuyến
tiền liệt của người trên chuột nude. Mô hình này đã được áp dụng trong nhiều
công trình nghiên cứu và bước đầu đã thu được những kết quả nhất định.


24

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2016 - 8/2017
Các mô sinh thiết khối u chuột được thu thập tại Học viện Quân y và bảo
quản tại Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch, Trường Đại học Y Hà Nội.
Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, chiết tách và phân tích RNA được thực
hiện tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch, Trường Đại
học Y Hà Nội.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
- Tế bào ung thư phổi người được cấy ghép trên chuột BALB/c nude để
tạo khối u, lấy mẫu sinh thiết khối u ở các nhóm chuột nghiên cứu vào ngày
thứ 60 kể từ ngày tiêm tế bào ung thư phổi người vào chuột. Có 10 chuột chia
làm 3 nhóm nghiên cứu:
+ Nhóm chứng: Nhóm không được tiêm Crilin T
+ Nhóm dự phòng: Nhóm được tiêm Crilin T với liều 80mg/kg cân

nặng/ngày x 7 ngày. Thời gian bắt đầu tiêm cùng ngày với tiêm tế bào ung thư
phổi người.
+ Nhóm điều trị: Nhóm được tiêm Crilin T với liều 80mg/kg cân
nặng/ngày x 7 ngày. Thời gian bắt đầu tiêm khi khối u đã phát triển đến kích
thước nhất định (20-270mm3).
- Tế bào dòng phổi người bình thường: Tế bào CRL-2079 được nuôi
cấy trong môi trường keratinocyte_SFM và các điều kiện cần thiết khác.


25

2.3. Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu bệnh chứng, mô tả cắt ngang.
2.4. Vật liệuvà dụng cụ nghiên cứu
2.4.1. Vật liệu nghiên cứu
- Chuột
BALB/c nude, thiếu hụt miễn dịch, thuần chủng, không có tuyến ức,
không sản xuất được tế bào T, trụi lông, da bạch tạng. Chuột nude và thức ăn
nuôi chuột được mua từ Hoa Kỳ, chuột được nuôi trong điều kiện vô khuẩn
tại Học viện Quân y (có màng lọc khuẩn không khí phòng chuột và mọi thao
tác, dụng cụ, vật liệu xử dụng đều vô khuẩn).
- Thuốc
Viên nang Crilin T có hàm lượng 250mg do Công ty TNHH Thiên dược
cung cấp được dùng đường tiêm phúc mạc với nồng độ cao là 0.08mg/ml môi
trường nuôi cấy (tương ứng liều 80mg/kg cân nặng).
2.4.2. Dụng cụ nghiên cứu
- Máy PCR
- Máy điện di
- Máy chụp kết quả điện di
- Máy lắc Vortex

- Kính hiển vi ngược
- Máy li tâm lạnh
- Cối nghiền
- Tủ lạnh sâu -30, -800 C
- Các thiết bị khác: Tủ cấy vô trùng, pipet, effendof, găng tay…