15 7 xac dinh tinh vo khuan cho vx va sinh pham HT

15.7. XÁC ĐỊNH TÍNH VÔ KHUẨN CHO VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ
Quy định chung:
Một trong những thử nghiệm quan trọng được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo để kiểm
soát chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế là thử nghiệm vô trùng. Nhằm phát hiện tác nhân ngoại lai
là các vi sinh vật sống nhiễm vào sản phẩm, thử nghiệm vô trùng không chỉ thực hiện ở giai đoạn
thành phẩm mà phải thực hiện ở nhiều giai đoạn trong quá trình sản xuất.
Theo khuyến cáo của WHO, thử nghiệm vô trùng phải thực hiện dưới điều kiện hốt Biosafety
Cabinet class II đạt cấp độ A, trong nền phòng sạch cấp độ B. Phòng sạch phải được kiểm soát áp
xuất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí và giám sát vi sinh. Nhân viên thực hiện thử nghiệm vô
khuẩn phải là người được đào tạo, có hiểu biết và kinh nghiệm về thực hành, được trang bị phương
tiện bảo hộ vô trùng và tuân thủ mọi quy trình ra vào khu vực sạch.
Môi trường dùng cho thử nghiệm vô khuẩn:
Gồm 2 loại môi trường Thioglycolat và Soybean Casein Digest (SCD) dạng nước. Môi trường
Thioglycolat được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí. Môi trường Soybean Casein Digest
(SCD) dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm. Có thể dùng môi trường khác thay thế nếu những
môi trường này đã được thẩm định.
Lấy mẫu:
Mẫu để thử vô trùng phải mang tính đại diện cho toàn bộ lô sản xuất bao gồm các mẫu lấy tại những
phần có nguy cơ bị nhiễm cao nhất. Ít nhất ở giai đoạn bán thành phẩm cuối cùng và thành phẩm
phải lấy mẫu để kiểm tra vô trùng.
Phương pháp cấy trực tiếp để phát hiện nhiễm vi khuẩn và nấm:
Trước khi kiểm tra vô trùng cần phải xác định xem vắc xin, sinh phẩm đó có chứa hay không chứa chất
bảo quản có khả năng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Nếu có, cần phải áp dụng biện pháp
thích hợp chẳng hạn như tăng thể tích môi trường nuôi cấy hoặc lọc qua màng lọc.
Mẫu thử cần được khử trùng sơ bộ bên ngoài bằng xịt ethanol 70 0C đã được lọc vô trùng, trước khi
chuyển vào phòng sạch.
Ngay trước khi thực hiện thao tác cấy vô trùng, các mẫu thử cần được khử trùng lại.
Với vắc xin sinh phẩm đóng trong ống, phải dùng cưa, gạc vô trùng để cưa và bẻ ống mẫu thử.
Với vắc xin, sinh phẩm là vắc xin đông khô phải hồi chỉnh với dung dịch đi kèm trước khi cấy vào
môi trường.
Riêng đối với mẫu vắc xin BCG đông khô (dạng ampoule) trước khi khử trùng sơ bộ, cần kiểm tra

độ chân không để loại bỏ những ống không đạt tiêu chuẩn.
Với sinh phẩm là vắc xin phối hợp gồm nhiều thành phần (ví dụ: DTP- HB- IPV hoặc DTP- HBIPV – Hib) để kiểm tra tính vô khuẩn của sinh phẩm phải hỗn hợp các thành phần vắc xin lại với
nhau ngay trước khi cấy vào môi trường.
Với sản phẩm bột khô đóng dạng viên nén trước khi cấy phải hòa tan mẫu thử vào nước muối sinh
lý hoặc nước cất vô khuẩn. Sau đó cấy sang môi trường Thioglycolat và Soybean – Casein Digest.
Lượng môi trường đóng trong mỗi ống được quyết định bởi cơ quan kiểm định quốc gia, sau khi đã
qua thử nghiệm thẩm định. Số lượng các mẫu được cấy, nhiệt độ và thời gian theo dõi tương tự như
với vắc xin sinh phẩm dạng nước. Sau khi cấy, cần kiểm chứng lại dung dịch nước muối sinh lý
hoặc nước cất bằng cách lấy 4 ml, cấy 1 ml vào mỗi trong 2 ống thioglycolat và 2 ống SCD. Các
ống Thioglycolat kiểm chứng được ủ ở nhiệt độ 30 0C – 35 oC, còn các ống SCD ủ ở nhiệt độ 20 –
25 0C như với môi trường đã cấy mẫu kiểm tra..
Cách cấy: Lắc kỹ mẫu thử trước khi cấy vào môi trường, dùng quả bóp cao su hoặc pipet aid có
cắm pipét Pasteur vô trùng để hút mẫu thử. Đẩy hết khí thừa ở đầu pipét. Đưa pipét xuống tận đáy
ống môi trường, vừa phối hợp động tác bơm mẫu thử vừa kéo pipet ra khỏi môi trường thử.
Với vắc xin, sinh phẩm đóng sẵn trong bơm tiêm thì bơm trực tiếp sản phẩm đó vào môi trường nuôi
cấy.
Mỗi loạt môi trường được pha chế dùng trong thử nghiệm vô khuẩn đều phải kiểm tra chất lượng về
tính vô trùng, tính tăng sinh, khả năng trung hòa chất ức chế.


Kiểm tra vô khuẩn bán thành phẩm cuối cùng
Mỗi mẫu bán thành phẩm lấy ít nhất 10 ml, cấy vào hai loại môỉ trường Thioglycolat và SCD, mỗi ống
môi trường 1ml cho đến khi hết. Sau khi cấy xong các ống môi trường thioglycolat được chia ra để ủ ở 2
nhiệt độ 30 – 35 0C và 20 – 25 0C, các ống SCD ủ ở 20 – 25 0 C trong thời gian 14 ngày.
Kiểm tra vô trùng thành phẩm:
Lượng VX-SP
có trong 1 lọ

Lượng VX- SP được lấy
để cấy

Lượng VX- SP cấy vào
mỗi ống MT

Ít hơn 1 ml

Toàn bộ

Toàn bộ

Từ 1 ml đến < 2 ml

1ml

1ml

Từ 2 ml đến < 4 ml

½ thể tích

1ml

Từ ≥ 4 ml đến < 20 ml

2 ml

1ml

Từ ≥ 20 ml đến ≤ 100ml

10% thể tích

1ml

>100ml

10% hoặc 50 ml

1ml

Lưu ý:
Thể tích môi trường phải phù hợp để đảm bảo khi có mặt mẫu thử không ảnh hưởng đến dinh dưỡng
của môi trường.
Cấy chuyển
Đối với các sản phẩm không làm đục môi trường (globulin miễn dịch, dị nguyên gây bệnh và không gây
bệnh, các kháng nguyên, các dung dịch hồi chỉnh v.v.), các ống môi trường sẽ được theo dõi hàng ngày
trong vòng 14 ngày.
Đối với các sản phẩm làm đục môi trường nuôi cấy (những sản phẩm có chất hấp phụ, sinh khối
hoặc chứa tế bào não) sau khi cấy 3 -7 ngày phải cấy chuyển ít nhất 1 ml sang ống môi trường mới
tương ứng theo thứ tự và ủ tiếp ở nhiệt độ như quy định. Hàng ngày theo dõi và ghi chép. Đọc kết
quả cuối cùng vào ngày thứ 14.
Lưu ý:
Đối với vắc xin vi rút sản xuất trên nuôi tế bào hoặc mô động vật thí nghiệm, ngoài thử nghiệm vô
trùng để phát hiện sự nhiễm vi khuẩn và nấm đã nêu trên cần phải áp dụng phương pháp kiểm tra
đặc biệt để phát hiện sự có mặt của Mycoplasma và virus ngoại lai. Phương pháp kiểm tra này do cơ
quan Kiểm định quốc gia quy định.
Đối với vắc xin bất hoạt cần kiểm tra sự bất hoạt hoàn toàn của các vi sinh vật hoặc sự có mặt của vi
sinh vật ngoại lai theo phương pháp đặc biệt theo tiêu chuẩn riêng cho từng loại chế phẩm. Đọc kết
quả cuối cùng bằng cách quan sát đại thể, trong trường hợp có nhiễm khuẩn phải kiểm tra vi thể toàn
bộ nuôi cấy trong 14 ngày theo dõi.

Đánh giá
Sản phẩm được coi là vô trùng khi không có một ống môi trường nào bị nhiễm.
Trường hợp bị nhiễm phải làm đồ phiến nhuộm Gram soi kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn Gram
(+), Gram (-) hoặc nấm và nhắc lại thử nghiệm với mẫu lưu.
Nếu không bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ hai thì sản phẩm được coi là vô trùng. Nếu bị nhiễm ở lần
kiểm tra thứ hai, dù chỉ 1 ống có cùng loại vi sinh vật như lần thứ nhất thì loạt sản phẩm đó không
đạt yêu cầu về vô trùng, phải huỷ bỏ. Nếu kết quả nhuộm soi ở lần kiểm tra thứ nhất và thứ 2 không
cùng loại vi sinh vật, phải tiến hành kiểm tra lần thứ 3. Nếu ở lần kiểm tra thứ 3 kết quả không bị
nhiễm, chế phẩm được coi là vô trùng. Nếu lần thử thứ 3 bị nhiễm dù chỉ một ống, cho dù bất cứ
loại vi sinh vật nào thì sản phẩm coi như không đạt yêu cầu về vô trùng.


Lập hồ sơ
Người thực hiện phải ghi chép đầy đủ, chính xác toàn bộ quá trình tiến hành thử nghiệm bao gồm:
Giám sát môi trường làm việc: Áp suất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí và giám sát vi sinh.
Mẫu thử: Tên, số loạt, ngày sản xuất, hạn dùng, tên nhà sản xuất.
Môi trường nuôi cấy: Tên, số loạt, ngày pha chế, số lượng ống sử dụng, thể tích môi trường trong
một ống.
Tên người thực hiện, ngày bắt đầu thử nghiệm, lượng mẫu thử cấy vào mỗi ống môi trường, theo dõi
và giám sát: nhiệt độ, thời gian trong suốt quá trình thử nghiệm, ngày kết thúc (ngày đọc kết quả ),
kết luận.
Những số liệu này phải được lưu giữ cho đến khi hết hạn sử dụng của loạt sản phẩm đó và phải sẵn
sàng cung cấp đầy đủ cho cơ quan Kiểm định quốc gia khi cần thanh tra.