thu vo khuan

13.7 Thử vô khuẩn
Qui định chung
Kỹ thuật này áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn,
nấm mốc và nấm men trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu
chuẩn riêng cần phải vô khuẩn. Thử vô khuẩn phải đợc tiến hành trong điều kiện
vô khuẩn nh trong buồng thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử
không bị ô nhiễm. Trong quá trình thử, mẫu không đợc tiếp xúc với các tác nhân
có ảnh hởng đến vi khuẩn, nấm mốc, nấm men (nh: tia tử ngoại, chất sát khuẩn,
nhiệt độ cao ...). Các dụng cụ, dung môi, môi trờng nuôi cấy phải đợc diệt khuẩn
trớc khi dùng.
Phơng pháp thử
Nguyên tắc
Nếu vi khuẩn, nấm mốc, nấm men đợc cấy vào môi trờng có chất dinh dỡng và nớc, đợc giữ ở điều kiện nhiệt độ thích hợp thì chúng sẽ phát triển. Sự có mặt
của vi sinh vật làm cho môi trờng biến đổi trạng thái từ trong sang đục, hoặc
có cặn lắng ở đáy môi trờng, hoặc thay đổi màu sắc môi trờng.
Chọn một trong hai phơng pháp thử thờng dùng là phơng pháp màng lọc hoặc phơng pháp cấy trực tiếp. Khi tiến hành thử phải làm sạch bề ngoài của ống (hoặc
chai, lọ, bình ...) đựng chế phẩm bằng một chất sát khuẩn thích hợp. Sau đó lấy
một lợng chế phẩm đủ dùng theo qui định, cấy trực tiếp vào môi trờng (nếu
theo phơng pháp cấy trực tiếp) hoặc theo phơng pháp màng lọc: Đem chế phẩm
sau khi đã đợc hoà loãng với dung môi thích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các
màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vào môi trờng, ủ môi trờng đã cấy chế
phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian qui định.
Chuẩn bị môi trờng và dung môi
Môi trờng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trờng thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và
trong).
Môi trờng thioglycolat không có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm
đặc hoặc đặc sền sệt dạng cao).
Môi trờng Soybean - casein (để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc)
Cả hai loại môi trờng trên phải đợc pha chế và kiểm tra chất lợng theo đúng qui
định ở mục "Cách pha chế và kiểm tra chất lợng các môi trờng" trớc khi dùng.

Dung môi dùng để hoà loãng
Khi những mẫu thử không ở dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thử nghiệm.
Chỉ đợc dùng làm dung môi hoà loãng là một chất lỏng bất kỳ không có tính
kháng khuẩn và không tác động đến độ xốp của màng lọc. Thờng dùng các dung
môi sau đây:
Dung môi A: Hoà tan 1 g pepton vào nớc cho vừa đủ 1 lít. Lọc (hoặc ly tâm) cho
trong. Điều chỉnh pH bằng 7,1 0,2. Đựng vào nhiều bình, mỗi bình khoảng
100 ml. Hấp ở 1210 C trong 18 - 20 phút.
Dung môi B: Nh dung môi A, nhng thêm 1 ml polysorbat 80 cho 1 lít dung môi,
dùng để hoà loãng những chế phẩm thử có lecithin.
Dung môi C: isopropyl myristat
Dùng để pha loãng những chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu.


Tiến hành thử theo phơng pháp màng lọc
Dụng cụ
Các dụng cụ dùng trong thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm:
- Các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trờng.
- Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, và các phụ kiện để ghép
nối; hệ thống hút chân không.
- Màng lọc: Thờng dùng loại có dờng kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 àm. Loại màng
Cellulose nitrat đợc dùng cho các chế phẩm dạng nớc, dạng dầu và các dung dịch
có lợng cồn thấp độ. Loại màng lọc dạng cellulose acetat đợc dùng cho các chế
phẩm dạng có nồng độ cồn cao. Đặc biết đối với các chế phẩm kháng sinh cần
phải chọn loại màng lọc thích hợp đảm bảo không còn d lợng kháng sinh trên
màng sau khi lọc.
- Kéo cắt màng lọc.
Lợng mẫu thử cần dùng cho một lần thử nghiệm
Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lợng thích hợp theo qui định ở bảng 1.
Bảng 1.

STT
1

Loại mẫu thử
Dung dịch thuốc tiêm có chứa
trong
một đơn vị đóng gói:
- Dới
1 ml
- Có từ 1 đến ít hơn
4 ml
- Có từ 4 đến ít hơn 20 ml
- Có từ 20 đến
100 ml
- Lớn hơn
100 ml

2
Dung dịch thuốc nhỏ mắt và
các chế phẩm lỏng không tiêm
3
Những mẫu thử là chất rắn,
dịch treo, nhũ dịch, kem,
hoặc thuốc mỡ.

Lợng tối thiểu chế phẩm cần lấy
Toàn bộ một đơn vị đóng gói
1/2 đơn vị đóng gói
2
ml

2 - 10 ml
1/2 đơn vị đóng gói
5 - 10 ml của dung dịch đã hoà
loãng đến 10 lần (tt/tt) bằng dung
môi thích hợp nêu ở (mục c)
0,5 - 1 g mẫu thử đã đợc hoà loãng
thành dung dịch với tỉ lệ 1%
(kl/tt) bằng dung môi thích hợp
(nêu ở mục dung môi dùng để hoà
loãng)

Kỹ thuật thử
Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ớt màng lọc. Rót lên màng lọc một lợng mẫu cần
thử nh qui định ở bảng 1. Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian lọc. Rửa
màng lọc ít nhất 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn. Lấy
màng lọc ra khỏi giá đỡ trong phễu lọc. Cấy màng lọc vào môi trờng bằng nhúng
chìm vào loại môi trờng để phát hiện nấm hoặc vi khuẩn (mục chuẩn bị môi trờng
và dung môi ).
Khi mẫu thử có tính kháng khuẩn, rửa màng lọc ít nhất ba lần bằng cách lọc qua
màng dung môi tiệt trùng đã chọn dùng cho thử nghiệm.Làm thí nghiệm kiểm tra
để biết chắc chắn không còn tác dụng kháng khuẩn của mẫu thử hấp thụ trên


màng. Chuyển toàn bộ màng lọc vào môi trờng nuôi cấy thích hợp để phát hiện
vi khuẩn, nấm mốc.
Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng, ủ môi trờng thyoglycolat ở 300C
đến 350C và ủ môi trờng soybean - casein ở 200C đến 250C ít nhất 14 ngày.
Nếu mẫu thử là dụng cụ (bộ dây truyền, túi lọc máu...) thì dùng 100 ml dung
môi B cho chảy qua dụng cụ. Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đã đợc thấm ớt
bằng dung môi A, rồi làm tiếp theo kỹ thuật ghi ở mục kỹ thuật thử.

Tiến hành thử theo phơng pháp cấy trực tiếp
Dụng cụ:
Các dụng cụ dùng cho thử nghiệm đều phải đảm bảo vô khuẩn mới đợc sử dụng
vào thử nghiệm. Dụng cụ dùng cho phơng pháp cấy trực tiếp gồm: Bơm tiêm,
pipet, các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trờng.
Lợng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm
Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy lợng chế phẩm thích hợp theo qui định ở bảng 2.
Kỹ thuật thử
Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử cấy vào hai loại môi trờng theo số liệu ở
bảng 2. Nếu mẫu thử là chất rắn thì cấy trực tiếp vào môi trờng và chú ý lắc
để mẫu thử phân tán đều trong môi trờng. Nếu không có chỉ dẫn ở chuyên
luận riêng thì ủ môi trờng phát hiện vi khuẩn ở 30 0C - 350C ; ủ môi trờng phát
hiện nấm mốc ở 200C - 250C, thời gian ít nhất 14 ngày; thờng xuyên theo dõi các
môi trờng đã cấy. Nếu chế phẩm làm đục môi trờng, để có thể dễ dàng quan
sát sự mọc của vi khuẩn, sau khi ủ môi trờng 3 - 7 ngày nên chuyển một phần
nhỏ môi trờng này sang một loạt môi trờng mới cùng loại. Tiếp tục ủ các ống môi
trờng đã cấy lại ít nhất 7 ngày.
Trờng hợp mẫu thử là băng, gạc, chỉ khâu phẫu thuật: Nếu kích thớc và hình
dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trờng tơng ứng. Khi mẫu
thử là dụng cụ (dây truyền, ống lọc máu, ...) thì dùng dung môi A hoặc B (mục
chuẩn bị môi trờng và dung môi) cho chảy qua để thu đợc ít nhất 15 ml dịch
rửa, cấy vào ít nhất 100 ml mỗi loại môi trờng nuôi cấy. ủ và đọc kết quả nh đã
ghi ở trên.
Bảng 2
STT
Lợng tối thiểu
Thể tích
Loại mẫu thử
chế phẩm cần lấy
tối thiểu

Ghi chú
môi trờng
cần lấy
1
Mẫu thử là chất lỏng
Nếu mẫu thử là
chứa trong một đơn
dầu hay dung
vị đóng gói loại:
dịch dầu phải
Dới 1 ml
Toàn bộ đơn vị
15 ml
thêm vào môi trTừ 1 ml đến ít hơn đóng gói
15 ml
ờng
1%
5 ml
1/2 đơn vị đóng
20 ml
polyethoxyTừ 5 ml đến ít hơn gói
40 ml
ethanol
hoặc
20 ml
2 ml
80 ml
1%
polysorbat
Từ 20 ml đến ít

5 ml
để nhũ hoá.
hơn 50 ml
10 ml
Từ 50 ml đến 100 ml


2

Mẫu thử là chất rắn,
thuốc mỡ hay kem,
chứa trong một đơn
vị đóng gói loại:
Toàn bộ 1 đơn vị
Dới 50 mg
đóng gói

40 ml
80 ml

Từ 50 mg đến 200 1/2 khối lợng của
mg
1 đơn vị đóng
gói
Lớn hơn 200 mg
100 mg

80 ml

Nếu mẫu thử là

thuốc mỡ hay
kem thì cần
hoà loãng với
dung môi B theo
tỷ lệ 1/10 (kt/tt)
trớc khi cấy vào
môi trờng.

Theo dõi và đánh giá kết quả
Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát các môi trờng đã cấy màng lọc
hoặc mẫu thử . Nếu không thấy có vi khuẩn, nấm mốc mọc trong suốt thời gian
qui định, mẫu thử đợc coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Nếu có từ 1 trở lên trong số các môi trờng nuôi cấy, có vi khuẩn hoặc nấm mốc
mọc, cần phải:
Rà soát lại qui trình thử.
Thử lại các mẫu thử nghi ngờ.
Giữ lại các môi trờng có vi khuẩn, nấm mốc mọc.
Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn hoặc nấm trên môi trờng, cấy lại với vi
khuẩn hoặc nấm đã mọc ở môi trờng cũ.
Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu bản làm lần
đầu, mẫu thử đợc coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thí
nghiệm đầu tiên, cần thực hiện phép thử lặp lại với số lợng mẫu gấp đôi. Nếu
không phát hiện thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thử đợc coi là đạt tiêu
chuẩn vô khuẩn. Nếu vẫn thấy vi khuẩn (hoặc nấm) mọc ở lần lặp lại này, mẫu
thử đợc coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Cách pha chế và kiểm tra chất lợng các môi trờng
Môi trờng để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trờng thioglycolat:
Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và

trong
L - Cystin
0,50 g
Natri clorid
2,50 g
Dextrose (C6H12O6.H2O)
5,50 g
Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%)
0,75 g
Cao men bia (có khả năng tan trong
5,00 g
nớc)
15,00 g
Casein pancreatic
0,50 g
Natri thioglycolat
(hoặc acid thioglycolic
1,0 ml
0,3 g )
1000 ml
Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)
Nớc cất


pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2

Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin và thioglycolat)
trong cối nghiền, thêm vào một ít nớc nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích
hợp. Thêm số nớc còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạo thành dung dịch
trong. Thêm natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1 N điều chỉnh

sao cho môi trờng sau khi tiệt khuẩn có pH7,1 0,2. Đun nóng lại dung dịch
(tránh đun sôi). Lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ớt, rồi thêm dung dịch
resazurin trộn đều. Đóng vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp, hấp vô
khuẩn ở 1210C trong 18 - 20 phút. Lấy ra làm nguội nhanh tới 25 0C, tiếp tục bảo
quản ở nhiệt độ 20 - 30 0C, tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống
(hoặc bình) môi trờng có màu hồng, môi trờng không thích hợp để thử nghiệm.
Có thể phục hồi lại môi trờng bằng cách đun cách thuỷ cho mất màu rồi làm lạnh
đột ngột. Nhng chỉ sử dụng môi trờng đã phục hồi này một lần, không dùng môi
trờng phục hồi lần 2. Các môi trờng thioglycolat lỏng chỉ dùng trong khoảng 3
tuần.
Môi trờng thioglycolat không có thạch
Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao.
L. Cystin
0,50 g
Natri clorid
2,50 g
Dextrose (C6H12O6.H2O)
5,50 g
Cao men bia (có khả năng tan trong
5,00 g
nớc)
15,0 g
Casein pancreatic
0,50
Natri thioglycolat
g
(hoặc acid thioglycolic 0,3
g)
10 ml
Resazurin (dung dịch 1% mới pha)

1000
Nớc cất
ml
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2
Cho tất cả các thành phần trên vào một dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấy
đều đến khi thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh
để cho pH sau khi tiệt khuẩn đạt 7,1 0,2. Có thể lọc (nếu cần). Phân chia vào
các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp. Hấp tiệt khuẩn 121 0C trong khoảng 18 20 phút. Sau khi tiệt khuẩn đem làm nguội nhanh tới 25 0C, môi trờng không đợc
đun nóng trở lại.
Môi trờng phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm
Môi trờng Soybean - casein
Casein pancreatic
17,0 g
Bột papaic soybean
3,0 g
Natri clorid
5,0 g


Dikali
hydrophosphat
2,5 g
(K2HPO4)
2,5 g
Dextrose (C6H12O6.H2O)
1000 ml
Nớc cất
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3
0,2
Hoà tan tất cả các chất rắn trong nớc, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để

nguội ở nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để điều chỉnh
(nếu cần) cho pH sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho
môi trờng trong. Phân chia vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 121 0C
trong khoảng 20 phút.
Kiểm tra chất lợng môi trờng
a) Độ vô khuẩn:
Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trờng mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt
độ 30 - 350C trong 4 ngày đối với những loại môi trờng dùng nuôi cấy vi khuẩn
hiếu khí và kỵ khí; ủ ở nhiệt độ 20 - 250C trong ít nhất 7 ngày đối với những
loại môi trờng dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc. Các loại môi trờng phải không đợc
có vi khuẩn, nấm mốc mọc.
b) Khả năng dinh dỡng:
Cấy vào môi trờng dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại
vi khuẩn sau:
Loại hiếu khí dùng Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633.
Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes ATCC 9404.
Loại nấm dùng Candida albicans ATCC 10231.
Aspergillus niger ATCC 16404
Mỗi loại chủng chỉ thị đợc cấy vào loại môi trờng tơng ứng, rồi mang ủ ở nhiệt
độ thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày đối
với nấm mốc. Trên mỗi loại môi trờng, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc
tốt.
c) Kiểm tra tác dụng ức chế ở mẫu mang thử:
Một số chế phẩm do yêu cầu của sản xuất hoặc ở những chế phẩm mới ng ời ta
đã cho thêm chất bảo quản. Loại chế phẩm này có ảnh hởng đến sự phát triển
của vi khuẩn, nấm mốc, nên cần phải kiểm tra tác dụng ức chế của chúng đối với
vi khuẩn nấm mốc.
Đối với vi khuẩn kỵ khí
Dùng 4 ống môi trờng phát hiện vi khuẩn kỵ khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy

vào mỗi ống chứng này 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí Clostridium sporogenes
ATCC 9404 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn
lại cấy vào mỗi ống một lợng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, rồi cũng cấy vào
mỗi ống 100 nha bào Clostridium sporogenes ATCC 9404. Đem ủ tất cả các ống ở
30 - 350C ít nhất 7 ngày.
Đối với vi khuẩn hiếu khí
Dùng 4 ống môi trờng phát hiện vi khuẩn hiếu khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ
cấy vào mỗi ống chứng này 100 tế bào vi khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus
ATCC 6538 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch tế bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn
lại cấy vào mỗi ống một lợng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, và cũng cấy vào


mỗi ống 100 tế bào Staphylococcus aureus ATCC 6538. Đem ủ tất cả các ống ở 30
- 350C ít nhất 7 ngày.
Đối với nấm mốc
Dùng 4 ống môi trờng phát hiện nấm, mốc. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào
mỗi ống chứng này 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231. Hai ống dùng
kiểm tra, cấy vào mỗi ống 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 và một
lợng chế phẩm bằng nhau. Đem ủ tất cả các ống ở 20 - 25 0C ít nhất 7 ngày.
Đánh giá kết quả:
Nếu trong thời gian ủ, vi khuẩn, nấm mốc mọc tốt, (dễ dàng và phong phú), đối
với từng loại, mọc giống nhau giữa ống kiểm tra và ống chứng: Mẫu thử không có
tác dụng ức chế.
Nếu trên các ống môi trờng có cấy mẫu thử, vi khuẩn, nấm, mốc mọc yếu,
chậm phát triển hoặc không phát triển so với ống chứng vẫn mọc tốt: Mẫu thử
có tác dụng ức chế. Phải loại bỏ tác dụng ức chế.
Tác dụng ức chế của mẫu thử có thể loại bỏ đợc một cách có kết quả bằng cách
cấy truyền nhắc lại trên một loạt môi trờng mới hoặc lọc qua màng lọc vi
khuẩn.