xac dinh hoat luc KS

13.9 Xác định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phơng pháp thử vi
sinh vật
Hoạt lực kháng sinh đợc thể hiện bằng khả năng ức chế một loại chủng chỉ thị
nào đó, ở điều kiện thích hợp. Sự giảm hoạt tính sinh học của kháng sinh đợc
thể hiện trên chủng chỉ thị, rất khó phát hiện bằng phơng pháp phân tích hoá
học, vì vậy phơng pháp vi sinh vật thờng giữ một vai trò quan trọng trong việc
đánh giá khả năng mất hoạt lực của kháng sinh, nhất là những loại kháng sinh có
cấu trúc phức tạp, hoặc thành phần gồm một hỗn hợp kháng sinh cùng họ mà mức
độ hoạt lực chênh lệch nhau không lớn lắm.
Phơng pháp vi sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so sánh
tác động ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (đợc gọi là chủng chỉ thị)
bởi những độ pha loãng đã biết của kháng sinh mang thử (cha biết rõ hoạt lực) với
tác động ức chế bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn đã
biết rõ hoạt lực).
Thử nghiệm phải dùng phơng pháp phân tích thống kê để đánh giá những số
liệu thu đợc. Nếu áp dụng mô hình đờng thẳng song song, hai đờng log liều đáp ứng của chất chuẩn và chế phẩm thử phải song song với nhau và phải tuyến
tính trong khoảng liều đã dùng.
Hai phơng pháp thờng đợc sử dụng trong kiểm nghiệm là phơng pháp khuếch
tán dùng môi trờng thạch và phơng pháp đo độ đục dùng môi trờng lỏng.
Phơng pháp thứ nhất dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh từ chỗ chứa qua lớp
thạch đặc ở hộp Petri hoặc khay vào khoảng phát triển của vi sinh vật tạo ra
một vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ, lỗ thạch) dung dịch
kháng sinh.
Phơng pháp ống nghiệm dựa vào độ đục của canh khuẩn, biết đợc sự ức chế
phát triển của vi khuẩn gây ra bởi một loạt dung dịch kháng sinh trong môi trờng
lỏng là môi trờng thích hợp đối với sự phát triển của vi sinh vật khi không có
kháng sinh.
Phơng tiện và dụng cụ
Tất cả các dụng cụ phải đợc làm sạch hoàn toàn trớc và sau mỗi lần thí nghiệm.
Những dụng cụ thuỷ tinh và những đồ đựng khác dùng trong thí nghiệm phải
đợc loại hết vi khuẩn và chất ảnh hởng. Các dụng cụ dùng để giữ và chuyển

chủng chỉ thị cần làm sạch cẩn thận và tiệt khuẩn bằng sức nóng khô hoặc hơi
nớc ở điều kiện thích hợp.
Điều kiện nhiệt độ: Khi nuôi cấy chủng chỉ thị và chế tạo nhũ dịch cấy truyền,
cần thực hiện trong môi trờng đảm bảo nhiệt độ qui định. Đối với phơng pháp
đo độ đục, cần kiểm tra chặt chẽ buồng điều khiển nhiệt độ sao cho nhiệt
độ quanh các ống nghiệm phải đồng đều và phải đạt đợc nhiệt độ cần thiết
trong ống nghiệm. Nên dùng điều nhiệt bằng nớc luân chuyển sẽ tốt hơn điều
nhiệt bằng không khí.
Máy đo quang phổ: Đợc dùng để đo sự truyền qua hoặc hấp thụ trong khoảng
sóng khá hẹp, do đó cần có máy đo quang thích hợp có thể thay đổi đợc bớc
sóng hoặc dùng dùng kính lọc 650 nm hoặc 580 nm để đo nhũ dịch nuôi cấy
đã pha chế và dùng kính lọc 530 nm để đo độ hấp thụ ánh sáng ở phơng pháp
đo độ đục. Dùng canh thang đã tiến hành nh mẫu nhng thêm ngay dung dịch
formaldehyd để chỉnh máy cho độ hấp thụ về điểm 0
Dụng cụ thí nghiệm:


- Phơng pháp khuếch tán: Dùng các khay hoặc đĩa Petri bằng thuỷ tinh hoặc
plastic, đạt tiêu chuẩn bằng phẳng. Đĩa Petri có hai loại, cỡ nhỏ đờng kính 100
mm, cỡ lớn đờng kính lớn hơn 160 mm. Các khay thí nghiệm đã đợc tiêu chuẩn
hoá, bằng kính hoặc plastic với kích thớc 25 x 25 cm (loại vuông) hoặc 28,8 x
19,8 cm (loại chữ nhật). Có thể sử dụng những chất liệu thích hợp đạt tiêu chuẩn
bằng phẳng.
ống trụ bằng thép không rỉ, bằng thuỷ tinh, hoặc bằng sứ, có kích thớc nh sau:
Đờng kính ngoài 8,0 mm; đờng kính trong 6,0 mm; cao 10,0 mm.
Vật liệu dùng làm ống trụ phải là loại trơ, riêng đối với kháng sinh nhạy cảm với ánh
sáng phải dùng vật liệu có pha màu nâu. Khi dùng phải làm sạch cẩn thận, loại hết
cặn, khử khuẩn. Đôi khi phải rửa bằng acid nh dung dịch acid nitric 2M, hoặc
acid sulfocromic.
Dụng cụ dùng cho phơng pháp đo độ đục: Dùng các ống nghiệm loại 16 x 125

mm hoặc 18 x 150 mm bằng thuỷ tinh có cùng chiều dài, đờng kính và độ dày,
bề mặt phải không có vết xớc, không dây bẩn. Khi dùng, ống nghiệm phải sạch
hoàn toàn, đảm bảo không còn vết kháng sinh hoặc vết các chất tẩy rửa và phải
tiệt khuẩn trớc khi dùng.
Môi trờng, dung môi và chất pha loãng
Phải dùng các chất đạt từ mức tinh khiết hoá học trở lên để pha chế.
Môi trờng
Dới đây là công thức môi trờng cần thiết dùng cho kiểm nghiệm kháng sinh. Các
loại môi trờng này có thể đợc thay thế bằng môi trờng khô tơng ứng hoặc bằng
một loại môi trờng thúc đẩy vi sinh vật phát triển tốt hơn mà cùng cho một đờng
đáp ứng tơng tự. Pha môi trờng bằng cách hoà tan thành phần trong công thức
vào một phần nớc, sau đó thêm nớc vừa đủ một lít. Dùng dung dịch acid
hydrocloric 1N hoặc dung dịch natri hydroxyd 1N để điều chỉnh môi trờng
sao
cho
sau
khi
tiệt
khuẩn
ở
121oC
trong
15 phút có pH nh ghi trong công thức. Thời gian cần cho việc tiệt khuẩn có thể
kéo dài tới 30 phút đối với những môi trờng có thể tích lớn hơn 500 ml.
Môi trờng số 1
Pepton khô
6,0 g
Casein pancreatic
4,0 g
Cao men bia

3,0 g
Dextrose monohydrat
1,0 g
Thạch
20,0 g
Nớc cất
1000 ml
pH: 6,0 đến 7,0
Môi trờng số 2:
Pepton khô
6,0 g
Cao men bia
3,0 g
Cao thịt
1,5 g
Thạch
20,0 g
Nớc cất
1000 ml
pH: 6,0 đến 7,0
Môi trờng số 3:
Pepton khô
5,0 g
Cao men bia
1,5 g
Cao thịt
1,5 g
Dextrose monohydrat
1,0 g

Dikali
hydrophosphat
3,58 g
(K2HPO4)
1.32 g
Kali
dihydrophosphat
3,5 g
(KH2PO4)
1000 ml
Natri clorid
Nớc cất
pH: 6,0 đến 7,0
Môi trờng số 4:
Giống nh môi trờng số 2 nhng có pH là 7,0 đến 8,0.
Môi trờng số 5:
Giống nh môi trờng số 1, nhng có pH là 7,8 đến 8,0.
Môi trờng số 6:
Casein pancreatic
17,0 g
Bột đậu tơng papaic
3,0 g
5,0 g
Natri clorid
2,5 g
Dextrose monohydrat
2,5 g
Dikali hydrophosphat (K2HPO4)
15,0 g

Thạch
10,0
ml
Polysorbat 80
1000 ml
Nớc cất
pH : 7,0 đến 7,3
Chú ý: Polysorbat 80 đợc thêm vào một lợng dung dịch nóng của các thành phần
khác trớc khi thêm nớc vừa đủ dung tích cần thiết.
Môi trờng số 7:
Pepton khô
9,4 g
Cao men bia
4,7 g
Cao thịt
2,4 g
Dextrose monohydrat
10,0 g
Natri clorid
10,0 g
Thạch
20,0 g
Nớc cất
1000 ml
pH: 6,0 0,2
Dung môi và chất pha loãng
Dung môi và chất pha loãng dùng trong thí nghiệm phải không ảnh hởng đến sự
phát triển của vi sinh vật. Chúng đợc dùng để pha các dung dịch theo yêu cầu
trong từng thí nghiệm. Các loại dung môi nh nớc vô khuẩn, acid hydrocloric,
ethanol, dimethylformamid và các dung dịch đệm có dải pH khác nhau hoặc các

loại khác tuỳ thuộc vào từng kháng sinh riêng biệt (bảng 2).
Các dung dịch đệm phosphat đợc chế tạo bằng cách hoà tan lợng dikali
hydrophosphat và kali dihydrophosphat (theo bảng 1) vào trong nớc vừa đủ để
đợc 1000 ml. Sau đó điều chỉnh với acid phosphoric 18 N hoặc natri hydroxyd
18 N đến pH cần thiết. Giá trị pH chỉ ra trong bảng là pH của dung dịch sau khi
đã tiệt khuẩn.
Bảng 1.
Số
dun

Dikali
hydrophosph

Kali
dihydrophosph

pH
điều


g
dịc
h
đệ
m
1
2
3
4
5

6

at K2HPO4
(g)

at KH2PO4 (g)

chỉnh
đến

2,0
16,73
0
20,0
35,0
13,6

8,0
0,523
13,61
80,0
0
4,0

6,0 0,1
8,0 0,1
4,5 0,1
6,0 0,1
10,5
0,1

7,0 0,2

Chất đối chiếu và đơn vị
Chất đối chiếu đợc dùng trong thử nghiệm là những chất có hoạt lực đợc xác định
chính xác so với chuẩn quốc tế hoặc chất đối chiếu quốc tế tơng ứng.
Hoạt lực của một kháng sinh đợc thể hiện bằng đơn vị quốc tế. Một đơn vị
quốc tế là hoạt lực đặc biệt chứa trong một lợng (tính theo cân nặng) của
chuẩn sinh học quốc tế tơng ứng hoặc chế phẩm đối chiếu sinh học quốc tế.
Từng thời kỳ, Hội đồng về chuẩn sinh học của Tổ chức y tế thế giới sẽ có chỉ dẫn
và qui định chính xác cho mỗi chuẩn quốc tế . Trong một vài trờng hợp, định
nghĩa số đơn vị quốc tế có thể bao gồm một tổng lợng của một vài nguyên liệu
vì thực tế khó cân một lợng nhỏ dù chính xác của chất chuẩn sinh học quốc tế
hoặc chất đối chiếu sinh học quốc tế.
Hoạt lực của một vài chất kháng sinh có thể đợc biểu thị bằng àg. àg hoạt lực
không nhất thiết tơng ứng với khối lợng của chất kháng sinh vì nó không thể bao
hàm toàn bộ thực thể hoá học tinh khiết riêng của từng kháng sinh đó.
Chủng chỉ thị và dịch cấy truyền
Các chủng chỉ thị dùng phải nhạy cảm, phù hợp với từng kháng sinh, theo qui định
ở bảng 2. Có thể dùng chủng chỉ thị khác với chủng chỉ thị giới thiệu trong
chuyên luận này miễn sao chủng phải nhạy cảm với kháng sinh cần định lợng.
Chế tạo dịch cấy truyền
Chế tạo nhũ dịch vi khuẩn không có nha bào
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae (không tạo vỏ )
Micrococcus luteus
Saccharomyces cerevisiae
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus faecium
Dùng chủng chỉ thị mới phát triển trên thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền lại lên

mặt một ống thạch nghiêng khác hoặc một bề mặt thạch rộng (nh trong bình
Roux) của môi trờng số 1 (Saccharomyces cerevicae dùng môi trờng số 8;
Streptococcus faecium dùng môi trờng số 3) ủ ở 32 - 350C trong 24 giờ (riêng với
Klebsiella pneumoniae và Streptococcus faecium ủ ở 370C) với Saccharomyces
cerevisiae ủ ở 300C. Thu vi khuẩn đã phát triển trên bề mặt môi trờng bằng nớc
muối sinh lý, rồi hoà loãng với cùng một chất hoà loãng tới độ đục thích hợp để đ-


ợc đáp ứng thích hợp trong phơng pháp đo độ đục, hoặc để tạo ra vùng ức chế
rõ ràng, sắc nét thuận lợi khi đo trong phơng pháp khuếch tán.
Thí dụ: Pha loãng hỗn dịch vi khuẩn tới nồng độ sao cho khi đo ở b ớc sóng 650
nm, cốc đo dày 1cm, độ truyền qua T = 50%, ở bớc sóng 580 nm T = 25%, hay
cho vòng vo khuẩn rõ, sắc net có đờng kính 13 mm.
Nhũ dịch vi khuẩn chế tạo nh trên đem bảo quản ở nhiệt độ dới 40C có thể sử
dụng trong 2 tuần.
Chế tạo nhũ dịch nha bào
Bacillus cereus
Bacillus pumilus
Bacillus subtilis
Cho chủng vi khuẩn mọc qua đêm trên ống thạch nghiêng môi trờng số 1 ở 370C
(riêng với Bacillus cereus nuôi ở 300C). Thu vi khuẩn đã phát triển trên mặt thạch
bằng nớc muối sinh lý, rồi chuyển sang một bề mặt thạch rộng hơn (nh trong
bình Roux) của môi trờng số 1, trong môi trờng này đã thêm vào dung dịch
0,001% (kl/tt) mangan sulfat (MnSO 4) để giúp thúc đẩy sự hình thành nha bào.
Nhũ dịch vi sinh vật đợc trải cho phủ kín bề mặt môi trờng bằng cách cho vào
bề mặt thạch một vài viên bi thuỷ tinh vô khuẩn. Đem ủ ở 37 0C (riêng với Bacillus
cereus ủ ở 300C) trong 7 ngày. Dùng nớc cất vô khuẩn rửa vi khuẩn đã mọc (chủ
yếu là nha bào) đem hoà loãng tới nồng độ thích hợp, thí dụ khoảng 10 7 - 108
nha bào trong 1ml, đun cách thủy nhũ dịch nha bào ở nhiệt độ 70 oC trong 30
phút. Dùng test phiến kính để kiểm tra khả năng sống của nha bào. Xác định lợng nhũ dịch nha bào để cho vào 100 ml môi trờng định lợng có thể tạo đợc

vùng ức chế rõ ràng, sắc nét. Nhũ dịch nha bào có thể giữ lâu ở nhiệt độ 4 0C.
Các loại thử nghiệm
Thử nghiệm hai liều và ba liều.
Phơng pháp khuếch tán
Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch chuẩn nồng độ đã biết và
dung dịch thử đợc coi nh xấp xỉ nồng độ dung dịch chuẩn. Các dung dịch
chuẩn và thử này ban đầu đợc pha vào dung môi thích hợp để đợc những dung
dịch gốc. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng dung môi hoặc dung dịch đệm
vô khuẩn đến nồng độ thích hợp, có pH thích hợp cho từng loại kháng sinh ( xem
bảng 2). Để xác định hiệu lực của kháng sinh, dùng ba liều khác nhau của chuẩn
(S1, S2, S3) mang so sánh với ba liều khác nhau của thử (U 1, U2, U3) có hoạt lực đợc
coi nh dung dịch chuẩn. Nồng độ đợc pha theo cấp số nhân, thí dụ pha một loạt
độ pha loãng theo tỷ lệ 2 : 1 hoặc 4 : 1. Nếu quan hệ giữa logarit nồng độ
kháng sinh và đờng kính vùng ức chế đã chỉ ra gần nh thẳng với hệ số đã dùng
thì có thể dùng định lợng thờng xuyên bằng cách chỉ dùng hai nồng độ chuẩn
(S1, S2) và hai nồng độ thử (U1, U2) - Thử nghiệm hai liều. Trong trờng hợp có tranh
chấp bắt buộc phải sử dụng định lợng ba liều.
Chuẩn bị cấy truyền
Các thử nghiệm có thể tiến hành trên những đĩa Petri hoặc khay bằng phẳng.
Đổ vào hộp Petri hoặc khay môi trờng thích hợp đã cấy truyền chủng chỉ thị
thích hợp cho từng kháng sinh. Lớp môi trờng này thờng có độ dày 3 - 4 mm (riêng
với amphotericin B nystatin độ dày là 1 - 2 mm, đối với bleomycin, mithramycin
độ dày 2 - 3 mm). Thạch dinh dỡng có thể đợc đổ thành một lớp hoặc hai lớp
(gồm lớp nền không có vi khuẩn và lớp gieo cấy), nên chọn nồng độ nhũ dịch cấy
vào môi trờng sao cho tạo đợc vùng ức chế sắc nét nhất tơng ứng với các liều lợng


của kháng sinh. Dùng nhũ dịch chủng chỉ thị đã chế tạo nh phần trên, thờng cấy
vào môi trờng với nồng độ 1 ml chủng cho 100 ml môi trờng là thích hợp. Khi nhũ
dịch chủng là loại không có nha bào, thờng phải cấy vào môi trờng thạch đã đun

chảy hoàn toàn và để nguội đến 45 - 50 0C. Trờng hợp nhũ dịch chủng là nha
bào, nhiệt độ cho phép khi cấy tối đa là 65 - 70 0C. Dùng một lợng thích hợp môi
trờng đã cấy chủng chỉ thị, rót một cách vô khuẩn vào đĩa petri hoặc khay
kính (trên đĩa thạch hoặc khay đã có thạch nền hoặc không tuỳ theo yêu cầu)
để đợc một lớp môi trờng có độ dày thích hợp, dàn trải nhanh và đậy nắp ngay.
Trong khi đợi thạch đông đặc, đặt khay kính hoặc hộp petri trên một tấm
kính để tạo một mặt phẳng giúp cho môi trờng trên khay hoặc hộp có độ dày
đồng nhất. Những môi trờng đã chuẩn bị đợc để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút
trớc khi sử dụng (riêng đối với colistin và colistin sulfomethat natri, đĩa petri
hoặc khay kính đã cấy truyền phải để ở tủ lạnh 4 0C trong vài giờ).
Tiến hành thử:
Đối với thử nghiệm 3 liều, dùng 6 ống trụ vô khuẩn đặt lên mặt thạch đã cấy
truyền trong một hộp petri (với thử nghiệm 2 liều dùng 4 ống trụ cho mỗi hộp). Có
thể thay các ống trụ bằng cách dùng dụng cụ đục lỗ đã tiệt khuẩn, đục vào môi
trờng thạch để tạo ra những lỗ thạch đờng kính 6 - 8 mm (hoặc thay bằng
những khoanh giấy tẩm kháng sinh). Phân phối các dung dịch thử nghiệm của
chuẩn và mẫu thử trên mỗi hộp Petri hay khay vuông sao cho phù hợp với kiểu bố
trí thí nghiệm đã chọn (xem phụ lục 13.10). Việc bố trí ống trụ, lỗ khoan, hoặc
khoanh giấy trên mặt thạch phải sao cho các vùng ức chế không bị trùm lên nhau.
Dùng pipet nhỏ vào ống trụ, hoặc lỗ thạch một lợng bằng nhau các dung dịch
kháng sinh. Nếu dùng các khoanh giấy phải tiêu chuẩn hoá trớc thể tích chính xác
chất lỏng cho mỗi khoanh giấy. Giữ hộp petri hoặc khay ở nhiệt độ phòng trong
khoảng 1 - 4 giờ tuỳ theo đặc tính của mỗi kháng sinh. Đối với những kháng sinh
nhạy cảm với nhiệt độ, phải đợc giữ ở nhiệt độ 40C để sự khuếch tán của kháng
sinh vào môi trờng xẩy ra chậm và làm giảm đến mức tối thiểu hiệu quả của sự
biến đổi theo thời gian giữa các dung dịch khác nhau. Đối với colistin và colistin
sulfomethat natri nên để 2 - 4 giờ ở nhiệt độ phòng trớc khi ủ. Các hộp Petri
hoặc khay sau thời gian để khuếch tán, mang ủ ở nhiệt độ thích hợp cho từng
kháng sinh riêng (bảng 2). Nhiệt độ ủ phải đợc kiểm tra để khoảng nhiệt độ
chênh lệch so với quy định chỉ trong khoảng 0,50C. Thời gian ủ thờng kéo dài

16 - 18 giờ. Dùng dụng cụ đo có độ chính xác tối thiểu 0,1mm, đo đờng kính
vùng ức chế tạo bởi các nồng độ khác nhau của chuẩn và thử.
Kiểm tra tính có giá trị của định lợng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt
lực kháng sinh theo phụ lục 13.10
Phơng pháp đo độ đục
Pha các dung dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử
Dung dịch dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử đợc pha trong dung môi
thích hợp và đợc pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho
từng kháng sinh theo chỉ dẫn ở bảng 2. Để đảm bảo giá trị hiệu lực của phép
thử, làm thử nghiệm 3 liều là thích hợp. Pha song song những độ hoà loãng gồm
3 liều chuẩn (S1, S2, S3) và 3 liều thử (U1, U2, U3).
Chế tạo canh thang để cấy truyền
Để có đợc một độ đục thích hợp dùng đợc ngay ở dịch cấy truyền, pha dịch cấy
truyền nh mô tả ở phần chế tạo nhũ dịch cấy truyền rồi dùng ngay. Chủng chỉ


thị và điều kiện thử nghiệm của từng kháng sinh sử dụng trong phơng pháp
này đợc ghi trong bảng 2.
Tiến hành
Các ống nghiệm đợc xếp thành từng nhóm, mỗi nhóm 3 - 5 ống, thêm vào mỗi
ống 1 ml dung dịch của từng độ pha loãng của dung dịch chuẩn hoặc mẫu thử.
Đặt các ống nghiệm vào giá ống nghiệm theo quy tắc ngẫu nhiên theo khối
hoặc theo hình vuông latinh. Trong mỗi giá có 2 ống dùng kiểm tra không thêm
kháng sinh, một ống chứa 1 ml dịch pha loãng, còn ống kia chứa 1 ml dịch pha
loãng và 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt).
Thêm vào mỗi ống 9 ml canh thang đã cấy truyền. Đặt giá đã chuẩn bị xong
ngay vào trong tủ ấm hoặc cách thuỷ, giữ ở nhiệt độ thích hợp, khống chế
nhiệt độ ở mức sai số 0,50C so với nhiệt độ cần ủ (theo bảng 2) trong 3 - 4 giờ.
Sau khi ủ, làm ngừng sự phát triển của vi khuẩn bằng cách thêm vào mỗi ống 0,5
ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) trừ ống kiểm tra đã thêm formaldehyd 12%

trớc hoặc nhúng giá có các ống nghiệm đã ủ vào nớc sôi . Lấy từng giá ống
nghiệm khỏi nơi ủ, xác định độ truyền qua hoặc độ hấp thụ của mỗi dung
dịch bằng máy đo quang ở 530 nm.
Kiểm tra tính có giá trị của định lợng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy
của hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10
Phơng pháp đờng chuẩn
Hoà tan một lợng cân chính xác chất đối chiếu hoặc chất chuẩn sinh học của
một kháng sinh đã cho trong dung môi thích hợp, có thể phải làm khô trớc. Pha
loãng với dung môi qui định để đợc dãy chuẩn có 5 nồng độ. Tỷ lệ tăng giữa các
nông độ nên là 1: 1,25. (xem hớng dẫn ở bảng 2)
Tiến hành
Khi tiến hành xây dựng đờng chuẩn, khảo sát trên ít nhất 12 hộp Petri. Khi xác
định hàm lợng của một kháng sinh dùng ít nhất 3 hộp Petri. Đổ vào mỗi hộp Petri
21 ml môi trờng đã đun chảy, đợi thạch đông cứng lại tạo thành lớp có độ dày
đồng đều và một bề mặt bằng phẳng để làm nền. (Riêng với amphotericin B,
nystatin thì không dùng lớp nền). Đối với bleomycin, cycloserin, mithramycin hoặc
mytomycin dùng 10 ml làm lớp nền. Lớp nuôi cấy dùng 4 ml cho mỗi hộp, đợc đổ
và láng đều sau khi lớp nền đã đông cứng, đặt lên mặt thạch trong đĩa 6 ống
trụ bằng thép không rỉ hoặc những ống bằng chất liệu khác nh đã quy định ở
phần dụng cụ. Các ống trụ tạo thành một hình lục giác đều cách tâm khoảng
2,8 cm. Chia 12 hộp Petri để xây dựng đờng chuẩn thành 4 nhóm, mỗi nhóm 3
hộp. Dung dịch có nồng độ trung gian đợc lấy làm nồng độ kiểm tra dùng hiệu
chỉnh các giá trị đo đợc ở mỗi nhóm. Đổ đầy dung dịch kiểm tra vào 3 ống trụ,
bố trí xen kẽ trong mỗi hộp Petri. Các ống trụ còn lại đợc đổ đầy dung dịch có
nồng độ của một nhóm. Sau khi ủ các hộp ở nhiệt độ thích hợp 32 - 35 0C (theo
chỉ dẫn bảng 2) khoảng 16 - 18 giờ sẽ đo đợc 9 giá trị đờng kính vòng vô
khuẩn của nồng độ kiểm tra theo nhóm. Tổng số cả 4 nhóm sẽ đo đợc 36 giá trị
đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra. Độ chính xác của mỗi kết quả đo
là 0,1 mm.
Cách tính

Giá trị trung bình các đờng kính vòng vô khuẩn ở mỗi nồng độ là a, b, d, e; giá
trị trung bình các đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của mỗi nhóm
3 hộp (9 kết quả) là Ca, Cb, Cd, Ce và giá trị trung bình các đờng kính vòng vô
khuẩn của nồng độ kiểm tra ở tất cả 12 hộp (ký hiệu là C), gồm 36 kết quả .


So sánh giá trị trung bình của các đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm
tra của mỗi nhóm với giá trị trung bình của các đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng
độ kiểm tra của 12 hộp(C). Hiệu của chúng (C - C a; v. v... ) là số hiệu chỉnh dùng
để điều chỉnh giá trị trung bình của các đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng độ
mỗi nhóm. Cộng đại số giá trị hiệu chỉnh đạt đợc vào giá trị trung bình của đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của mỗi nhóm ta đợc các giá trị trung bình
của các đờng kính vòng vô khuẩn đã hiệu chỉnh của mỗi nồng độ là a, b, d, e.
Thí dụ: Giá trị trung bình của đờng kính 36 vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra
tính đợc là 19,2 mm; giá trị trung bình của đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng
độ kiểm tra của nhóm nồng độ a là Ca = 19,0 mm. Số hiệu chỉnh là 19,2 - 19,0
= 0,2 mm. Giá trị trung bình của đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của
nhóm là 17,9 mm. Vậy giá trị trung bình của đờng kính vòng vô khuẩn ở nồng
độ của nhóm sau khi đã hiệu chỉnh là a = 17,9 + 0,2 = 18,1 mm.
Trên hai chu kỳ giấy bán logarit vẽ đờng chuẩn qua các điểm giá trị trung bình
đã hiệu chỉnh. Trên trục tung (chia theo thang logarit) lấy nồng độ kháng sinh
bằng àg hoặc đơn vị hoạt lực trong ml. Trên trục hoành (chia theo thang số học)
lấy giá trị đờng kính vòng ức chế. Nh vậy đờng chuẩn đợc vẽ qua điểm tơng
ứng với giá trị đờng kính vòng ức chế cao nhất và thấp nhất tính đợc bằng phơng trình sau:
L =

3a + 2b + C
-e
5

H =

3e + 2d + C
-a
5

L: Đờng kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ thấp nhất của đờng chuẩn.
H: Đờng kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ cao nhất của đờng chuẩn.
C: Đờng kính trung bình của 36 kết quả của nồng độ kiểm tra.
a, b, d, và e: Những giá trị đờng kính trung bình đã hiệu chỉnh cho từng dung
dịch còn lại xếp theo thứ tự từ nồng độ thấp nhất tới nồng độ cao nhất.
Ba hộp Petri dùng cho mẫu thử nghiệm cũng đợc tiến hành đồng thời khi xây
dựng đờng chuẩn. Trong ba hộp này nhỏ xen kẽ giữa nồng độ trung gian của
dung dịch chuẩn với nồng độ của mẫu thử đã pha loãng với dung dịch đệm
thích hợp để có nồng độ giả định tơng đơng nồng độ trung gian của chuẩn.
Sau khi đo đờng kính các vòng vô khuẩn của mẫu thử, tính trung bình hiệu
chỉnh theo giá trị đờng kính nồng độ trung gian sẽ đợc đờng kính của chế
phẩm thử. Trên trục hoành ứng với giá trị đờng kính vừa tìm đợc của mẫu thử, kẻ
đờng vuông góc với trục hoành cắt đờng đờng chuẩn vừa vẽ đợc tại một điểm
và từ điểm này trên đờng chuẩn hạ vuông góc với trục tung sẽ tìm đợc giá trị
nồng độ ứng với đờng kính của mẫu thử.
Hoạt lực của chế phẩm đợc tính ra phần trăm so với chuẩn theo công thức sau:

=

Hoạt lực tìm thấy của chế
R% phẩm ì 100
Hoạt lực tìm thấy ở nồng độ
trung gian