Định lượng stipuleanosid r2 trong thân rễ sâm vũ diệp ( panax bipinnatifidus seem ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

U
VN

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

rm
ac

Ph
a

DƯƠNG THỊ PHƯỢNG

y,

KHOA Y DƯỢC

ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN

an
d

RỄ SÂM VŨ DIỆP

(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)

Me

dic

ine

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2018


U
VN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

rm
ac

Ph
a

DƯƠNG THỊ PHƯỢNG

y,

KHOA Y DƯỢC

an
d

ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN
RỄ SÂM VŨ DIỆP
(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)

ine

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

of

Me

dic

HIỆU NĂNG CAO

ho

ol

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y

ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH

Co

py

rig

ht

@

Sc

Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội - 2018


U

LỜI CẢM ƠN

VN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận

rm
ac

y,

được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo của Khoa Y Dược,
Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Thời điểm hoàn thành khóa
luận cũng là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với
những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn của mình là
TS. Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy đã

Ph
a

dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá
trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn của mình tới ThS. Nguyễn Thị Hoàng

an
d

Anh vì đã luôn dành thời gian hướng dẫn và động viên tôi trong quá trình hoàn
thiện khóa luận.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong

ine

Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều
kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này.

dic

Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt là các
bạn Thùy, Phương, Chuyên đã luôn đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua. Tôi

of

Me

xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thành viên trong nhóm nghiên cứu của tôi là chị
Thủy và chị Huệ vì đã luôn giúp đỡ và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

Lời cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh,
giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 30 tháng 4 năm 2018
Sinh viên

Dương Thị Phượng


VN

Acetonitril

BuOH

Buthanol

DAD

Detector mảng điốt (Diode array detector)

Dd

Dung dịch

EtOH

Ethanol

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

MeOH

Methanol

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SKĐ

Sắc ký đồ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

Sti

Stipuleanosid R2

SVD

Sâm vũ diệp

TB

Trung bình

TT

Thứ tự

UV

Ultra violete

VIS

Visible

rm
ac

Ph

a

an
d

ine

dic

Me

of

ol

ho

Sc
@

ht
rig

y,

ACN

py
Co

U

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT


VN

U

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Chương trình dung môi.

18

rm
ac

Bảng 3. Tính thích hợp hệ thống

y,

Bảng 2. Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết.

23
24

Bảng 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

26

Ph
a

Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2

Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an
d

Bảng 7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp

Co

19

27
28


VN

U

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng

rm
ac

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2

y,

Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp

4
5
7
10

Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được

11

Ph
a

Hình 2.1. Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa
Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016

17

Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng HPLC

19

Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu trắng

21

dic

ine

an
d

Hình 3.1. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun
H2SO4 10% /EtOH

21

Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch thử

22

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2

24

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn

py
Co

2


VN

U

MỤC LỤC

y,

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1

rm
ac

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN....................................................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP ................................................................... 2
1.1.1. Tên khoa học .....................................................................................................2

Ph
a

1.1.2. Đặc điểm thực vật .............................................................................................2
1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái ..........................................................................2

an
d

1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................................3
1.1.5. Tác dụng dược lý...............................................................................................4
1.1.6. Công dụng .........................................................................................................4
1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ....................................................... 5

ine

1.2.1. Công thức hóa học ............................................................................................5
1.2.2. Tính chất lý hóa .................................................................................................5

dic

1.2.3. Tác dụng sinh học .............................................................................................6
1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC ..........................6

Me

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ................. 6

ho

ol

of

1.3.1. Nguyên tắc của HPLC .......................................................................................6
1.3.2. Một số thông số đặc trưng .................................................................................7
1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC ........................................................9
1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp
bằng HPLC ..................................................................................................................9
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................10

Sc

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 10

ht

@

2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp .................................................................................10
2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2 .....................................................................10
2.1.3. Dung môi, hóa chất .........................................................................................11
2.1.4. Máy móc, dụng cụ ...........................................................................................11

rig

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 12
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 12

Co

py

2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất ..............................................................12
2.3.2. Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC ....13


VN

U

2.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp
...................................................................................................................................16

2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................... 16

y,

CHƯƠNG 3 – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN ........................................................17

rm
ac

3.1. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP
ĐƯỢC ....................................................................................................................... 17
3.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................................17
3.1.2. Phương pháp HPLC ........................................................................................17

Ph
a

3.1.3. Phương pháp đo độ nóng chảy ........................................................................20

3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2
BẰNG HPLC ........................................................................................................... 20

an
d

3.2.1. Chương trình sắc ký ........................................................................................20
3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng ...............................................................20

ine

3.3. ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ
DIỆP ......................................................................................................................... 27
3.4. BÀN LUẬN ....................................................................................................... 28

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

Me

dic

3.4.1. Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC............28
3.4.2. Về định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu và cao sâm vũ diệp ............29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................31


U

ĐẶT VẤN ĐỀ

VN

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), còn

rm
ac

y,

gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất là một vị
thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta
[3,22]. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm
ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng
làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc

vùng núi Tây Bắc [3,22]. Theo như các tài liệu đã được công bố về sâm vũ diệp cho

Ph
a

thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị
sử dụng của dược liệu quý này trong y học. Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành

an
d

phần saponin trong SVD cũng như định lượng được các thành phần đó có ý nghĩa
rất quan trọng trong việc ứng dụng dược liệu SVD trong thực tiễn.

ine

Qua quá trình tra cứu tài liệu, chúng tôi thấy rằng ở trong nước ta có rất ít
nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và tác dụng dược lý của sâm
vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax này. Trên cơ sở
đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học của thân rễ cây

dic

SVD thu hái ở Sapa, Lào Cai với các hợp chất saponin phân lập được từ phân đoạn

Me

buthanol và đã xác định được stipuleanosid R2 là thành phần saponin chính có trong
thân rễ SVD [24]. Tiếp nối nghiên cứu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Định lượng

ho

ol

of

stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc
xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc
quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường và tối ưu hóa quy trình chiết xuất
saponin của SVD sau này.

rig

ht

@

Sc

Mục tiêu đề tài:
1. Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ
diệp thu hái ở Tây Bắc.
Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây
Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên

Co

py

liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCNTB.07C/13-18.

1


U

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

VN

1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP
1.1.1. Tên khoa học

rm
ac

y,

SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [3,21], SVD thuộc chi
Sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2].
1.1.2. Đặc điểm thực vật

Ph
a

Sâm vũ diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm

[3,21]. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại.
Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có
vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu

ol

of

Me

dic

ine

an
d

tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng. Lá chét 5 - 7 (ít khi 3)
thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy
không đều, mép có răng cưa, có lông.

ho

Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21]

Sc

1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái

Co

py

rig

ht

@

Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở
nước ta. Trong tự nhiên, SVD phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát
Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22]. Gần đây
sâm vũ diệp đã được nghiên cứu và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa
phương ở Hà Giang, Lào Cai. Hiện nay vùng phân bố của SVD đang bị thu hẹp dần
và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Do vậy SVD là loài dược liệu quý hiếm cần
được bảo tồn và gìn giữ để phát triển trong tương lai.
Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như
quanh năm có sương mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm
2


VN

U

thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy
thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng

y,

một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang
lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến
tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào

rm
ac

thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng
đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp. Cách xác định tuổi của cây dựa vào
những vết sẹo thân được hình thành sau khi quả chín [3].

Ph
a

1.1.4. Thành phần hóa học

Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần

an
d

hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L.. Các nhà khoa học đã chiết tách và
xác định được gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31]. Các kết quả

dic

ine

nghiên cứu trước đây của SVD cũng chỉ ra rằng saponin là thành phần chính của lá
và rễ cây sâm vũ diệp, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng

tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn
[11,23].
Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13

Me

saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số
ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [37].

ho

ol

of

Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 cho thấy kết quả
định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen
và saponin cùng với acid béo, acid amin [21]. Năm 2003, đã xác định thành phần
saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những

Sc

chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các
saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [22].

Co

py

rig

ht

@

Gần đây vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập
và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là
thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt
Nam), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [33].

3


U
VN
y,
rm
ac
Ph
a
an
d
ine

Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [33]

dic

1.1.5. Tác dụng dược lý

Me

Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng
dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3].
Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động

ho

ol

of

vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh
hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề
kháng, tác dụng tán huyết [3]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự
đã chỉ ra rằng SVD có tác dụng chống stress [25], chống trầm cảm, có tác dụng bảo

Sc

vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [12-15].
1.1.6. Công dụng

rig

ht

@

Sâm vũ diệp được biết đến như một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư,
chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [25], chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu,

nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh. Sâm vũ diệp còn được dùng để cầm máu, tán ứ,
tiêu sưng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết
thương mau lành. Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh

Co

py

sâm dùng rất tốt cho sức khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở
vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu

4


VN

U

để uống cũng có tác dụng như rễ. Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp còn được dùng làm
thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22].
1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2

dic

ine

an
d

Ph

a

rm
ac

y,

1.2.1. Công thức hóa học

Me

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41]
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:

of

(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b-

ho

ol

heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4-

Sc

[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2carboxylic acid [40].

@

Công thức phân tử: C53H84O23 [41].

ht

Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [42].

Co

py

rig

1.2.2. Tính chất lý hóa
Chất bột màu trắng.
Độ tan: 0,57 g/L [42].
Điểm nóng chảy 210 - 2150C [41].

5


U

1.2.3. Tác dụng sinh học

VN

Stipuleanosid R2 là thành phần saponin trong dược liệu, được biết đến như là

rm
ac

y,

thành phần có hoạt tính và quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu
như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [36], Aralia elata [34] ... Trong
một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc

Ph
a

tế bào ung thư [30]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối
với dòng tế bào K562 và U937 [29]; có tác dụng chống oxy hóa [38]; hạ đường
huyết, điều hòa miễn dịch và hạ lipid máu [37].
1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Theo như tài liệu chúng tôi tìm hiểu được tính đến thời điểm hiên tại: Trên thế

an
d

giới vẫn chưa có các nghiên cứu công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2
trong dược liệu bằng phương pháp HPLC mà chủ yếu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập
chất này trong các dược liệu. Do đó việc xây dựng được phương pháp định lượng

ine

stipuleanosid R2 là rất cần thiết trong việc ứng dụng dược liệu trong thực tiễn.

1.3.1. Nguyên tắc của HPLC

dic

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Me

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một một phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn

ol

of

hợp phân tích; dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong
cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao. Trong đó: pha động là chất
lỏng; pha tĩnh là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một
chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.

ho

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay dựa
trên phân bố theo kích cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.

@

Sc

Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai
pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động dẫn
tới thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ khác nhau và từ đó giúp phân tách được
các chất.

Co

py

rig

ht

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Detector sẽ
giúp phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích. Hiện nay có rất nhiều loại detector
được sử dụng như: detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode
array (DAD), detector điện hoá,…Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector
DAD.

6


VN

U

Nếu thực hiện quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ thu
được kết quả là một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm

y,

nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ
[4,5,8,20,27,28].

ine

an
d

Ph
a

rm
ac

1.3.2. Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15]

dic

Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng [9]

Me

a) Thời gian lưu

t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký.

ol

of

tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ
thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.

ho

tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0.
(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất

Sc

định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).
b) Hệ số dung lượng k’

t 'R t R -t 0 t R
k'= =
= -1
t0
t0
t0

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là

Co

py

rig

ht

@

Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:

tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời
điểm cân bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm

7


nhất.
c) Hệ số bất đối AF (tailing factor)

rm
ac

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ:

W

AF 

y,

VN

U

mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ
nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt

1/20

Ph

a

2a

Trong đó:

an
d

- W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.

ine

- a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2.

dic

Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối.

Me

d) Hệ số chọn lọc

of

' t R,B-t 0
(k’B  k’A)
α= k B =

k 'A t R,A -t 0

Yêu cầu: α nằm trong khoảng 1,05 đến 2.

ol

α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng.

ho

e) Độ phân giải (resolution)

Sc

Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều
kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

ht

@

2t R,B  t R,A  1,18t R,B  t R,A 
N  α  1  k'B 





RS 
'



4
α
1


 k B 
WB WA
W1/2B W1/2A

- RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau.

Co

py

rig

- RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng,
chỉ xen phủ nhau 0,3%.
- Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%.

8


U

1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC

y,

VN

a) Yêu cầu chung
Các quy trình phân tích HPLC cần phải thẩm định là các quy trình chưa
được công bố trong tiêu chuẩn Dược điển các nước. Nội dung về thẩm định phương
pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được quy định trong các

rm
ac

Dược điển.
b) Nội dung thẩm định

Thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC cần đánh giá khi thẩm định phương

Ph
a

pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: tính thích hợp hệ thống, độ
đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng.

an
d

1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ
diệp bằng HPLC

Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã định lượng

ine

hàm lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp theo phương pháp
trọng lượng của Namba là 5,86% [17].

dic

Năm 2017, Nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội:
Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và xây dựng

ho

ol

of

Me

phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm
vũ diệp bằng phương pháp HPLC - DAD. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng
acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp và rễ sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034% và
0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao sâm
vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 µg/g
698 μg/g [11].

rig

ht

@

Sc

Nhận xét: Đây là những kết quả bước đầu về định lượng thành phần hóa học
của SVD và xác định hàm lượng saponin tổng số. Tính thời điểm hiện tại, chưa có
nhiều kết quả công bố phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể có
trong sâm vũ diệp. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích định lượng thành phần
saponin trong SVD bằng phương pháp HPLC, hiện đang là phương pháp được
Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp
quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu
hiện nay. Phương pháp HPLC với ưu điểm là độ chính xác cao sẽ đáp ứng được yêu

Co

py

cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ có trong mẫu, đặc biệt là đối với các mẫu
phức tạp như cao chiết từ dược liệu.

9


VN

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

U

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp

rm
ac

y,

Mẫu nghiên cứu trong đề tài là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus
Seem.) được trồng ở Sa Pa, Lào Cai và thu hái vào ngày 15/7/2016. Mẫu nghiên

Ph
a

cứu được giám định tên khoa học bởi ThS. Nguyễn Quỳnh Nga và CN. Phan Văn
Trường, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản (PB-150716)
được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.
Mô tả mẫu nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và những vết sẹo,
cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn,

an
d

dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt.

Sc

ho

ol

of

Me

dic

làm nguyên liệu nghiên cứu.

ine

Cách xử lí mẫu: thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa được rửa sạch, cắt miếng
mỏng, sấy khô ở 500C, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát

@

Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào
Cai vào ngày 15/7/2016
2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2

rig

ht

Trong đề này chúng tôi sử dụng chất stipuleanosid R2 được phân lập từ dược liệu
sâm vũ diệp trong một nghiên cứu trước của cùng nhóm nghiên cứu với chúng tôi
[24]. Stipuleanosid R2 phân lập được sẽ được tiến hành đánh giá độ tinh khiết đạt

Co

py

tiêu chuẩn để sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ chất
này có trong SVD bằng HPLC.

10


U
VN
y,
rm
ac
Ph
a

Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được

an
d

2.1.3. Dung môi, hóa chất

Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài
đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC.

ine

- Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol

dic

(MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH).

of

2.1.4. Máy móc, dụng cụ

Me

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của
Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển
Việt Nam IV.

ho

ol

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ
đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà
Nội:

Sc

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent
Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động.

@

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức).

Co

py

rig

ht

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số
0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ).
- Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60.
- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml.
- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc).
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ).
11


U

- Bếp điện, bếp đun cách thủy.

VN

- Đèn tử ngoại.
- Cột sắc ký các loại kích cỡ.

y,

- Màng lọc 0,45 µm.

rm
ac

- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức,
bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác.

Ph
a

- Tủ hút.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

an
d

1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong
thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân
lập từ SVD.

ine

2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa,
Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên.

dic

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất

Me

Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm
vũ diệp có chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất

of

saponin và sapogenin trong dược liệu để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp
nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ SVD [23].

ho

ol

- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%.
- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng.

Sc

Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:

@

1. Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng
dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 700C, chiết 3 lần.

rig

ht

2. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua
giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol.

py

3. Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung
môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ

Co

1:1. Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp

12


VN

U

suất giảm để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với
từng phân đoạn.

y,

4. Cao butanol thu được trong quá trình chiết xuất sẽ được sử dụng để định
lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp.

rm
ac

2.3.2. Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC
a) Lựa chọn điều kiện sắc ký

Ph
a

Tham khảo một số tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng
tôi đã tiến hành khảo sát về bước sóng, tỷ lệ dung môi, thành phần pha động, tốc độ
dòng, thể tích bơm mẫu nhằm mục đích lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu nhất để
đảm bảo điều kiện phân tích stipuleanosid R2 có trong thân rễ SVD đạt kết quả

an
d

chính xác nhất.

b) Thẩm định stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD đủ tiêu chuẩn làm chất

ine

chuẩn trong quy trình định lượng

* Yêu cầu của chất sử dụng làm chất chuẩn [35]:

cậy (các nhà sản xuất gốc).

Me

dic

- Nguyên liệu được sử dụng thiết lập chất chuẩn phải có độ tinh khiết cao
(đối với hợp chất hóa dược > 95%), được lựa chọn từ các lô nguyên liệu sản xuất
thuốc có chất lượng cao, có tính đồng nhất và được cung cấp từ các nguồn đáng tin

ol

of

- Việc đánh giá mức độ phù hợp của một nguyên liệu dự kiến thiết lập chuẩn
phải được tiến hành rất cẩn thận, phải cân nhắc tất cả số liệu thu được từ các phép
thử và nên áp dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau để đánh giá so sánh.

ho

* Phương pháp thẩm định: Độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được

Sc

được kiểm tra dựa vào ba phương pháp sau:

Co

py

rig

ht

@

1. Sắc ký lớp mỏng: Sti phân lập được sẽ tiến hành sắc ký trên silicagel RP18 F254S (Merk). Phát hiện chất bằng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong
Ethanol 96 %, phun đều lên bản mỏng, sấy khô ở 1200C rồi hơ nóng trên bếp điện
từ đến khi xuất hiện màu. Quan sát vết xuất hiện ở ánh sáng thường.
Yêu cầu: Sau khi phun thuốc thử trên sắc ký đồ phải xuất hiện một pic duy
nhất màu hồng tím của stipuleanosid R2.
2. HPLC
Phương pháp đánh giá độ tinh khiết thông qua tổng tạp dựa theo phương
pháp chuẩn hóa diện tích khi tiến hành định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC.

13


VN

U

Tiến hành định lượng 01 dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần bằng HPLC. Dựa
vào kết quả sắc ký đồ tính lượng tạp bằng phương pháp phần trăm diện tích pic.
Yêu cầu: độ tinh khiết > 95%.

rm
ac

y,

3. Đo độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2
phân lập được từ SVD.
Yêu cầu: stipuleanosid R2 phân lập được phải có nhiệt độ nóng chảy nằm
trong khoảng 210 - 2150C [41].

Ph
a

c) Thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD [4,5,40]
* Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có

an
d

mặt các thành phần như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Phương pháp HPLC
được coi là có tính đặc hiệu đối với chất cần phân tích nếu:

ine

- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa
thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.

Me

dic

- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu
tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
* Kiểm tra tính thích hợp hệ thống

ho

ol

of

Tính thích hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác
định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý. Tiến hành
tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic.
Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân
tích.

Sc

Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 %.
* Độ tuyến tính

Độ tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax+b với hệ số

Co

py

rig

ht

@

Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích
pic hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử. Khoảng tuyến tính
là khoảng nồng độ từ thấp đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến

tính.
tương quan tuyến tính R2. Trong đó: y là đáp ứng của pic (diện tích pic hay chiều
cao) và x là nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử.

14


U

Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

VN

- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ.

y,

- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác
định của phương pháp.

rm
ac

- Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn
ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau.
Yêu cầu: R2 > 0,998.

Ph
a

* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

an
d

LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về
mặt định tính.
LOQ là lượng thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử để có thể
phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp.

ine

Tiến hành: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường
nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất

Me

dic

có thể phát hiện được bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử.
Thiết lập tỷ số S/N.
LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3
lần nhiễu đường nền (S/N =3/1).

ho

* Độ lặp lại

ol

of

LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu
đường nền (S/N =10/1).

ht

@

Sc

Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả
thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một
mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng
các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu..) đến
công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.

Yêu cầu: RSD ≤ 5,0%.

Co

py

rig

Tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm
vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại được
biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.

15

U

* Độ đúng

VN

Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá
trị thực.

rm
ac

y,

Tiến hành: Pha dung dịch thử và dung dịch chuẩn theo quy trình chuẩn bị
mẫu. Thêm vào mẫu thử những lượng chất chuẩn khác nhau (lượng chất chuẩn thêm
vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng hoạt chất có trong
mẫu nằm trong khoảng tuyến tính) rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng
của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất chuẩn dựa trên phương trình

Ph
a

đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm
giữa lượng chất chuẩn tìm được so với lượng chất chuẩn thêm vào.

an
d

Yêu cầu: Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 95,0% đến 105,0%.
2.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ
diệp

dic

ine

Áp dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định ở trên để xác định hàm
lượng stipuleanosid R2 có trong cao SVD và trong dược liệu SVD.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Me

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh

of

học, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 với một số công thức tính toán trong
xử lý thống kê kết quả.

ho

ol

- Giá trị trung bình:

Sc

- Độ lệch chuẩn:



1 n

x 
xi
n i1




x

x
i


i 1



2

S

@

- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD 

n 1

S


Co

py

rig

ht

x

16

 100


U

CHƯƠNG 3 – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN

VN

3.1. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP
ĐƯỢC

y,

3.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

rm
ac

- Cách tiến hành: Stipuleanosid R2 phân lập được đã được kiểm tra độ tinh
khiết bằng SKLM silicagel RP-18 F254S trên bản mỏng, triển khai với hệ dung môi

an
d

Ph
a

Methanol:H2O = 2:1. Kết quả thu được sắc ký đồ như hình 3.1.

ine

Hình 3.1. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun H2SO4
10%/EtOH

Me

dic

- Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, SKĐ của
stipuleanosid R2 xuất hiện duy nhất vết màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang
màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen. Vì vậy sơ bộ kết luận stipuleanosid

R2 phân lập được là chất tinh khiết.

of

3.1.2. Phương pháp HPLC

ol

a) Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

ho

Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động,

Sc

tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi đã xây dựng được chương trình sắc ký sử
dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau [19]:

@

- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm).
- Detector DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm.

- Thể thích bơm mẫu: 20 µl.
- Nhiệt độ: 250C.
- Dung môi pha mẫu: Methanol.

Co

py

rig

ht

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

17