Bước đầu thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA từ đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ma
cy
,V
NU

KHOA Y DƯỢC

ne

an

dP
ha
r

NGUYỄN THỊ CHUYÊN

ici

BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN

fM

ed

TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM

Sc
h

oo

lo

(Salvia miltiorrhiza Bunge)

Co

py

rig

ht

©

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ma
cy
,V
NU

KHOA Y DƯỢC

dP
ha
r

NGUYỄN THỊ CHUYÊN

an

BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN

ici

ne

TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM

lo

fM

ed

(Salvia miltiorrhiza Bunge)

Khóa: QH.2013.Y

Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Hữu Tùng – giảng viên

ma
cy
,V
NU

bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà
Nội, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ cho em trong suốt thời gian thực
hiện khóa luận này.

Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa cùng toàn thể các thầy cô
giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và các thầy cô, cán bộ

dP
ha
r

thuộc Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc nói riêng đã dạy dỗ, chỉ bảo và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại Khoa và thực hiện khóa
luận tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn anh Trần Đức Bình và các anh chị lớp Dược

an

K57QH.2012.Y, đặc biệt là chị Bích, chị Huệ, chị Ngần đã luôn động viên, giúp đỡ

ne

và cho em nhiều ý kiến giá trị trong quá trình hoàn thành khóa luận.

ici

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn cùng Nhóm nghiên cứu đã

ed

đóng góp nhiều nhận xét bổ ích cho em trong quá trình thực hiện khóa luận.
trong suốt thời gian qua.

fM

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên em

Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

Em xin chân thành cảm ơn!

Nguyễn Thị Chuyên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Buthanol
Sắc kí cột

13C-NMR
DAD
DĐVN IV
EtOAc
EtOH
GC
GLP
HPLC
Hex

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của C13
Đầu dò UV
Dược điển Việt Nam IV
Etyl acetat
Ethanol
Sắc kí khí
Thực hành phòng thí nghiệm tốt
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hexan

dP
ha
r

Phổ cộng hưởng từ proton

Phổ hồng ngoại
Tên hợp chất
Lipoprotein tỉ trọng thấp
Phổ khối
Nhiệt độ nóng chảy
Methanol
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phụ lục

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

ne

ici

ed

fM
lo

oo

Rf
RSD
SKC
TLC
UV-VIS
UV
v/v
Φ

an

1

H-NMR
IR
IUPAC
LDL
MS
Mp
MeOH
NMR
PL

ma
cy
,V
NU

BuOH
CC

Hệ số lưu giữ
Độ lệch chuẩn tương đối
Sắc ký cột
Sắc ký lớp mỏng
Phổ hấp thụ phân tử
Tử ngoại
Thể tích/thể tích
Đường kính cột


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1

ma
cy
,V
NU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Tổng quan về thiết lập chất chuẩn đối chiếu ...................................................3
1.2. Tổng quan về đan sâm .....................................................................................4
1.2.1. Đặc điểm thực vật .....................................................................................4
1.2.2. Phân bố, sinh thái .....................................................................................5

dP
ha

r

1.2.3. Thành phần hóa học .................................................................................5
1.2.4. Tác dụng sinh học.....................................................................................8
1.2.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền ...........................................9

an

1.3. Tổng quan về tanshinon IIA ..........................................................................10

ne

1.3.1. Cấu trúc hóa học .....................................................................................10

ici

1.3.2. Đặc điểm tanshinon IIA .........................................................................10

ed

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................12

fM

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu ..........................................................12
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ..........................................................................12

lo

2.1.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................12

oo

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ............................................13

Sc
h

2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................13
2.2.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế ..........................................13

©

2.2.2. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu ...........................................14

rig

ht

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................15

py

2.3. Sơ đồ và nội dung nghiên cứu .......................................................................16

Co

2.4. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................17

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................18

3.1. Chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ đan sâm ...........................................18
3.1.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất ....................................................18


3.1.2. Phương pháp phân lập và tinh chế ..........................................................18
3.2. Xác định cấu trúc tanshinon IIA ....................................................................20

ma
cy
,V
NU

3.2.1. Tính chất vật lý .......................................................................................20
3.2.2. Các phương pháp phổ: phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR...... 20
3.2.3. Xác định cấu trúc ....................................................................................22
3.2.4. Đánh giá sơ bộ độ tinh khiết ...................................................................23
3.3. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu ......................................................................24

dP
ha
r

3.3.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng của tanshinon IIA ................................24
3.3.2. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất ..........................................24
3.4. Bàn luận .........................................................................................................28

an

3.4.1. Về phân lập và xác định cấu trúc của tanshinon IIA ..............................28

ne

3.4.2. Về phân tích HPLC ................................................................................28

ici

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................29

ed

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

fM

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR của tanshinon
IIA

22

Bảng 3.2

Chương trình gradient trong 30 phút

25

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi
định lượng tanshinon IIA tinh chế được

25

Bảng 3.4

Kết quả phân tích độ tinh khiết của tanshinon IIA tinh chế

26

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

dP
ha
r

ma
cy
,V
NU

Bảng 3.1


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình

Tên hình

Trang

Cây đan sâm

Hình 1.2

Cấu trúc một số abietane diterpenoid

Hình 1.3

Cấu trúc một số acid phenolic

Hình 1.4

Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L

8

Hình 1.5

Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA

10

Hình 2.1

Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai

12

Hình 3.1

Sơ đồ chiết xuất, phân lập và tinh chế tanshinon IIA

19

Hình 3.2

Tanshinon IIA tinh chế được

20

Hình 3.3

Phổ1H-NMR (CDCl3,400MHz) và13C-NMR (CDCl3,100MHz)
của tanshinon IIA phân lập được

21

Hình 3.4

Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA

23

Hình 3.5

Sắc ký lớp mỏng khảo sát tanshinon IIA tinh chế được

23

Hình 3.6

Sắc ký đồ HPLC của tanshinon IIA

27

dP
ha
r

an

ne

ici

ed

fM

lo
oo
Sc
h
©
ht
rig
py
Co

ma
cy
,V
NU

Hình 1.1

4
6
7

ĐẶT VẤN ĐỀ

ma
cy
,V
NU

Đan sâm ở nước ta được biết đến như một cây thuốc quý có nguồn gốc từ
Trung Quốc hiện nay được trồng nhiều và sinh trưởng tốt ở vùng Tây Bắc nước ta.
Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô hoặc sấy khô của cây
đan sâm, thường được dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không đều, phong thấp,
thần kinh suy nhược, mất ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Việt Nam, Hàn
Quốc, đan sâm là thuốc tăng cường tuần hoàn máu, chữa đau nhói ở ngực và bụng,
nhiễm khuẩn da, bồn chồn, chứng to gan lách, đau thắt ngực, đột quỵ [7,25].

dP
ha
r

Ở nước ta, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng
dụng loại dược liệu quý này trong y học hiện đại. Nghiên cứu của Viện Dược liệu
đã cho thấy cây đan sâm trồng ở Sapa có hàm lượng tanshinon IIA cao bên cạnh
một số thành phần tanshinon khác [15,21]. Gần đây, tác giả Nguyễn Thanh Hải và

an

cộng sự đã công bố phân lập thêm một số thành phần tanshinon [23] và hai hợp chất
triterpen là acid ursoli và acid 2β-hydroxypomolic [23].

ici

ne

Các kết quả nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy đan sâm có các thành phần
tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester, trijuganon B,
cryptotanshinon, tanshinon IIA và tanshinon I,….Trong đó, tanshinon IIA là thành

ed

phần tanshinon chính, hoạt chất chính của đan sâm được dùng làm chất chuẩn đánh

fM

dấu trong đánh giá dược liệu đan sâm. Cho đến thời điểm này chưa có nhiều nghiên
cứu chiết xuất, tinh chế tanshinon IIA làm chất chuẩn đối chiếu ở nước ta.

oo

lo

Nhìn chung với các sản phẩm từ dược liệu hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở phần
lớn dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần cao dược liệu hoặc một nhóm chất

©

Sc
h

bằng các phương pháp không đặc hiệu mà không định lượng được các hợp chất
chính đặc trưng, được coi là các hợp chất có hoạt tính sinh học do thiếu chất chuẩn
đối chiếu. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu ngày càng trở nên
cần thiết đối với công tác đảm bảo chất lượng thuốc và sản phẩm từ dược liệu, từ

py

rig

ht

giai đoạn lựa chọn nguyên liệu đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, cũng
như giám sát chất lượng thuốc lưu hành của cơ quan quản lí. Ở nước ta đan sâm
hiện được trồng ngày càng nhiều và tập trung tại Hà Giang, Lào Cai, Tam Đảo,

Co

Lâm Đồng,...tuy nhiên chưa thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của dược liệu rất có
giá trị này. Đan sâm bán trên thị trường thiếu sự đảm bảo về chất lượng và có thể bị
nhầm lẫn do chưa có tiêu chuẩn đánh giá thành phần các hoạt chất. Theo khảo sát
trên thị trường và ở các công ty dược phẩm, phần lớn đan sâm vẫn phải nhập khẩu

1


từ Trung Quốc và cũng như nhiều dược liệu khác, vấn đề kiểm soát chất lượng cần
được quan tâm, và kiểm soát dược liệu kém chất lượng đang tràn lan như hiện nay.

ma
cy

,V
NU

Trên cơ sở thực tiễn đó và kế thừa, tiếp nối các nghiên cứu trước về đan sâm,
chúng tôi bước đầu tiến hành “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn của tanshinon
IIA từ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở Việt Nam”. Kết quả của đề
tài sẽ góp phần cung cấp chất chuẩn tanshinon IIA dùng trong phân tích và kiểm
nghiệm dược liệu đan sâm và sản phẩm chứa đan sâm.
Mục tiêu của đề tài khóa luận:

dP
ha
r

1. Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế được tanshinon IIA có
độ tinh khiết trên 95% từ rễ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở Sapa để
sử dụng làm chất chuẩn đối chiếu.

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất và xác định độ tinh khiết.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về thiết lập chất chuẩn đối chiếu

ma
cy
,V
NU

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), chuẩn đối chiếu là bất kỳ nguyên liệu
đã được xác định tính chất (định tính) và độ tinh khiết/hoạt lực. Một chuẩn đối

chiếu chính thức phải có mặt trong danh mục chính thức của Dược điển Anh
(BP) hoặc Dược điển Mỹ (USP) hoặc của WHO. Có thể thiết lập một chuẩn đối
chiếu cơ sở thông qua so sánh tính chất và độ tinh khiết/hoạt lực với một chuẩn
đối chiếu chính thức hoặc xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng các kỹ thuật

dP
ha
r

khác. Việc chấp nhận mức độ tinh khiết cao hơn hay thấp hơn đối với một chuẩn
đối chiếu tùy theo mục đích sử dụng (dùng để định tính hay định lượng) và bản
chất phương pháp định lượng.

ne

an

Các phương pháp phân tích trong Dược điển hiện tại mà có thể đòi hỏi
việc sử dụng các chất chuẩn đối chiếu là: Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV),
phương pháp sắc ký, các kỹ thuật tách khác, chuẩn độ thể tích, khảo nghiệm dựa
trên góc quay cực, xét nghiệm vi sinh, các kiểm tra liên quan tới hóa học miễn dịch,

ici

hiệu chuẩn các dụng cụ [6].

ed

Quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu

lo

fM

- Mua vật liệu với một lượng lớn
Nên lựa chọn vật liệu có chất lượng tốt từ quá trình sản xuất, lượng thay đổi
từ 20 g đến 500 g tùy thuộc vào nhu cầu dự kiến.

Sc
h

oo

- Đánh giá sơ bộ
Xác nhận danh tính, độ tinh khiết, hàm lượng bằng các kĩ thuật như: HPLC,
sắc ký lớp mỏng và phương pháp hóa lý khác như phổ NMR, MS hoặc phối hợp các
phương pháp.

rig

ht

©

- Phân tích protocol
Đối với việc xác định chất:
+ Phổ - Infrared: phổ hồng ngoại so sánh với tiêu chuẩn tham chiếu chính.

Co

py

+ HPLC, GC và TLC: thời gian lưu giữ, thời gian chết, khoảng cách di chuyển
nên tương ứng với những tiêu chuẩn tham chiếu đã được quy định trước.
+ Phương pháp khác: Đo quang, nhiệt độ nóng chảy…
Đối với kiểm tra độ tinh khiết:
+ Kỹ thuật HPLC, GC và TLC: độ tinh khiết của chất hữu cơ hoặc các chất
liên quan nên được đánh giá bằng cách so sánh với tiêu chuẩn tham chiếu chính.

3


ma
cy
,V
NU

- Hợp tác giữa các phòng thí nghiệm quốc gia của các nước.
- Thẩm định kết quả:
Các dữ liệu (kết quả cân, pha loãng, quang phổ hồng ngoại, UV, TLC, HPLC...)
sẽ được tổng kết và lập bảng. Bảng bao gồm tên của phòng thí nghiệm, phương pháp,
kết quả, phòng thí nghiệm có ý nghĩa và độ lệch chuẩn.
Các kết quả được thẩm định bằng cách sử dụng Z-score. Các giá trị với Zscore dưới 2 được chấp nhận sau đó giá trị trung bình với % RSD sẽ được báo cáo
để xem xét và thông qua.
1.2. Tổng quan về đan sâm

Hình 1.1. Cây đan sâm

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

dP
ha
r

Cây đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc chi Salvia,
họ Bạc hà (Lamiaceae).

(Nguồn: />
©

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Co

py

rig

ht

Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn gọi là huyết sâm, xích sâm,
huyết căn là cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu
vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu. Thân
vuông trên có các gân dọc. Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7. Lá
chét mọc giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa.
Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm. Mép lá chét có răng cưa tù. Mặt trên lá chét
màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng
dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ. Cụm hoa mọc

4


ma
cy
,V
NU

thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm. Hoa mọc vòng, mỗi vòng
3-10 hoa, thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông
nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn. Hai nhị ở
môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên. Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5 mm [1,14].
1.2.2. Phân bố, sinh thái

dP
ha

r

S. miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc. Nó cũng có
mặt tại Nhật Bản [31]. Cây đan sâm có nguồn gốc Trung Quốc [1] thích hợp với đất
cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6]. Cây trồng ở trại thuốc Sapa (Viện
Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao. Cây sinh
trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được đã gieo đi
gieo lại nhiều năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện tốt nhất vào
tháng 2-3 để đến tháng 11-12 thu hoạch [1]. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa
quả tháng 6-9 [14]. Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6].

an

1.2.3. Thành phần hóa học

fM

ed

ici

ne

Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học
của đan sâm. Thành phần hóa học chính là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và
một số thành phần khác. Bộ phận trên mặt đất của có chứa flavonoid, triterpenoid
và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và lá. Trong khi đó, diterpenoid và acid
phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [28].

Sc

h

oo

lo

Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của đan sâm đã được chia thành hai
nhóm là tanshinon tan trong lipid và acid phenolic tan trong nước. Đến nay, hơn 20
acid phenolic phân lập từ rễ cây đan sâm đã được nghiên cứu. Các chất có hoạt tính
thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA,
cryptotanshinon... Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và
sinh tổng hợp [36].

©

1.2.3.1. Diterpenoid

py

rig

ht

Nhóm diterpenoid bao gồm rất nhiều chất có cấu trúc khác nhau được phân
thành 4 phân nhóm là abietane diterpenoid, clerodane diterpenoid, pimarane
diterpenoid và labdane diterpenoid. Chủ yếu là abietane diterpenoid ở trong rễ,
clerodane diterpenoid và labdane diterpenoid thì ít hơn [31].

Co

Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon như
tanshinon I, II và III, sau đó đến isotanshinon I và II, isocryptotanshinon và
cryptotanshinon [31] (Hình 1.2).

5


22

20 R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

ma
cy
,V
NU

19 R = R1 = H, Δ5(10),6(7),15(16)

23 Δ15(16)

24

21 R = R1 = OH, Δ15(16)

dP
ha
r

25 R = R1 = H, Δ5(10),6(7)
19-21.Tanshinon I, II, III

24. Isocryptotanshinon

22-23. Isotanshinon I, II

25. Cryptotanshinon

an

Hình 1.2. Cấu trúc một số abietane diterpenoid

ne

1.2.3.2. Các dẫn xuất của acid phenolic

ici

Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước
của đan sâm. Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

fM

ed

salvianolic từ A – K [35] (Hình 1.3).

6


ma
cy
,V
NU
dP
ha
r
an
ne
ici
ed

fM

Hình 1.3. Cấu trúc một số acid phenolic

lo

1.2.3.3. Flavonoid

oo

Thành phần có mặt nhiều nhất chính là flavon, flavonol và các dẫn xuất của

Sc
h

chúng [35].

Flavon và aglycon flavon: thành phần chính là apigenin (5,7,4’trihydroxyflavon) và luteolin (5,7,3’,4’- tetrahydroxyflavon) và các dẫn xuất 6-

©

hydroxylat của chúng.

rig

ht

Flavon và flavonol glycosid: các flavon O-glycosid xuất hiện phổ biến
trong các loài thuộc chi Salvia L. và nhiều nhất trong số đó là các flavon 7-glycosid

Co

py

như apigenin 7-glucosid (cosmosiin), luteolin 7-glucosid (cinarosid) và các
7-glucuronid tương ứng của chúng.

Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều
trong các hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L.

7


1.2.3.4. Một số thành phần khác

R1 R2 R3

R4

an

R

dP
ha
r

Ngoài ra còn có tanin và một số thành phần khác [35].

ma
cy
,V

NU

Triterpenoid phổ biến nhất và được tìm thấy trong đan sâm là acid ursolic và
acid oleanolic (Hình 1.4). Ngoài ra còn tìm thấy một số triterpenoid khác như
anagadiol, taraxerol acetate, germanicol, navidiol,…[ 31].

3 OH OH H

R=R1=H, R2=R3=Me

5 OH

H

H

Me Me
Me Me

ici

ne

R=H, R1=R2=Me, R3=H

ed

L. Acid ursolic 2. Acid oleanolic 3. Anagadiol 4. Taraxerol 5.Germanicol

1.2.4. Tác dụng sinh học

fM

Hình 1.4. Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L

oo

lo

Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của Salvia
miltiorrhiza Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác
dụng này do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B,
acid salvinolic B, militron và salvinon. Ngoài ra, đan sâm còn được chứng

Sc
h

-

©

minh có tác dụng chống đau thắt ngực [1,2,14,21,25,29].

ht

Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [25].

-

rig

-

Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế

py

bào [2,10].

Co

-

Tác dụng an thần do thành phần miltiron nên được sử dụng điều trị chứng
mất ngủ [7,10].

8


Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn

-

ma
cy
,V
NU

Staphylococus kháng thuốc. Các thành phần như dihydrotanshinon I,

hydroxytanshinon II-A, cryptotanshinon, methyl tanshinat và tanshinon II-B
được chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus
[10,12,21,36].
-

Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa
và mày đay [10].

-

Hoạt tính chống viêm do có thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ
miễn dịch [11].

Hoạt tính chống oxy hóa gây bởi dihydrotanshinon I [2], acid salvinolic A,
B, acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [12].

-

Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [2].

-

Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [10-11].

-

Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi
sưng to do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác
dụng làm giảm các huyết quản nhỏ [7].

-

Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục: làm
tăng nhẹ estrogen và androgen trên chuột [21].

fM

ed

ici

ne

an

dP
ha
r

-

lo

1.2.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

oo

Tính vị: vị đắng, tính hàn [3].

Sc

h

Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can.
Tác dụng và công dụng:
Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau bụng

©

-

kinh, bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn
Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược
thần kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương
quy, táo nhân [1,3]. Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau
thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt [2].

Co

py

-

rig

ht

thương mà cơ gân sưng tấy đau đớn.

-

Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh
mặt nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng. Khi dùng với tính chất

9


bổ huyết thì dùng đan sâm dạng không qua chế biến [3,7].
Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh
huyết hấp trùng đều có hiệu quả [3,7].

-

Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [3].

-

Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú

ma
cy
,V
NU

-

[1,2].

Liều dùng: 8-20 g [3].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [6].
1.3. Tổng quan về tanshinon IIA

dP
ha
r

Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn
tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [2].

-

an

Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh và

ne

Việt Nam, tanshinon IIA là một trong những chất chính được dùng để định tính, có
thể định lượng dược liệu đan sâm và cao đan sâm [7,24,34].

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

1.3.1. Cấu trúc hóa học

©

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA

ht

- Tên IUPAC:

rig

1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-naphthol[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dion.

Co

py

- Công thức phân tử: C19H18O3
- Khối lượng phân tử: 294,3444 g/mol

1.3.2. Đặc điểm tanshinon IIA

Là bột màu cam hoặc đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25oC), tan
tốt trong các dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực, trong methanol

10

(5 mg/ml), ethanol (5 mg/ml) ở 25oC, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25 mg/ml) [27].

ma
cy
,V
NU

- Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid có khung terpenoid, ngoài ra trong
phân tử còn có nhóm lacton và xeton. Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy
đủ tính chất của terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton.
Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy đủ tính chất của terpeniod.
- Tanshinon IIA không bền vững ở nhiệt độ cao, ánh sáng, độ ẩm và tiếp
xúc với oxy. Dưới tác động của các tác nhân trên, nó có xu hướng bị phân hủy. Đó
có thể là lí do chính trong việc giảm hàm lượng tanshinon IIA trong toàn bộ quá
trình chiết, cô đặc, sấy khô [27,34].

dP
ha
r

- Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính, định
lượng tanshinon IIA. Tanshinon IIA hấp thu mạnh UV ở bước sóng từ 254-280 nm
[27].

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

- Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng giảm
đáng kể kích thước vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở
màng ty thể tim. Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của
Angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim.

11

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ma
cy
,V
NU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

ed

ici

ne

an

dP
ha
r

2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu

fM

Hình 2.1. Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai

lo

Rễ đan sâm sử dụng để nghiên cứu chiết tách được thu hái tại Sapa (Lào Cai) tháng

9/2016 và được TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược

Sc
h

oo

liệu giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà (Lamiaceae).
Tiêu bản của mẫu nghiên cứu (DS2016.01) được lưu tại Viện Dược liệu và Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.1.2. Dung môi, hóa chất

ht

©

- Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu,
sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm:

rig

+ Ethanol (EtOH)

Co

py

+ Methanol (MeOH)

+ n-Hexan

+ Dicloromethan (CH2Cl2)

+ Cloroform (CHCl3)

12


+ Ethylacetat (EtOAc)
+ n-butanol (BuOH)

ma
cy
,V
NU

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck,Đức.
- Hạt nhồi dùng cho sắc kí cột loại:

+ Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản)
+Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản)

- Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và
pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất

dP
ha
r

bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung
dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất.

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

an

- Đo điểm chảy trên máy Kofler micro-hotstage.

ici

ne

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass
Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap.
- Phổ cộng hưởng từ (1D và 2D- NMR) được đo trên máy Bruker Avance

ed

AM500 FT- NMR (Bruker, Đức).

lo

fM

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 series, đầu dò PDA
(Agilent Technologies, Mỹ).

Sc
h

oo

- Thiết bị chiết siêu âm, cân phân tích có độ chính xác 0,1 và 0,01 mg, máy
cất quay chân không, đèn soi tử ngoại UV, tủ sấy và các dụng cụ thí nghiệm khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

©

2.2.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế

ht

2.2.1.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu

rig

- Phương pháp chiết mẫu: chiết siêu âm với dung môi ethanol 80% - nước.

py

- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng – lỏng.

- Quy trình: rễ đan sâm sau khi sơ chế (làm sạch, sấy khô, nghiền nhỏ) được

Co

ngâm chiết kỹ bằng dung môi ethanol 80%, 3 lần, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở
40oC. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại
dung môi dưới áp suất giảm cho cao chiết tổng ethanol. Phân tán cặn chiết ethanol
này trong nước cất và chiết phân bố lần lượt với từng dung môi hexan, ethyl acetat

13

và butanol (3 lần). Phân đoạn hexan là phân đoạn tập trung các tanshinon bao gồm
tanshinon IIA. Các phân đoạn ethyl acetat và butanol được cất loại dung môi dưới
áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng.

ma
cy
,V
NU

2.2.1.2. Phương pháp phân lập và tinh chế tanshinon IIA

Để phân lâ ̣p các hơ ̣p chấ t, sử dụng một số phương pháp sắ c ký gồm: sắ c ký
lớp mỏng (dùng để khảo sát), sắ c ký cô ̣t pha thường và sắ c ký cô ̣t pha đảo.
+ Sắ c ký lớp mỏng (TLC): đươ ̣c thực hiê ̣n trên bản mỏng Silica gel 60 F254
(Merck) và Silica gel RP-18 F254s (Merck). Phát hiê ̣n chấ t bằ ng đèn tử ngoa ̣i ở hai

dP
ha
r

bước sóng 254 nm và 365 nm hoă ̣c dùng thuố c thử là dung dich
̣ H2SO4 10% đươ ̣c
phun đề u lên bản mỏng, sấ y khô rồ i hơ nóng trên bế p điê ̣n từ từ đế n khi hiê ̣n màu.
+ Sắ c ký cô ̣t (CC): đươ ̣c tiế n hành với chấ t hấ p phu ̣ là Silica gel pha thường
và pha đảo.

an

2.2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

ed

ici

ne

Sử dụng các phương pháp vật lý (đặc điểm cảm quan, điểm chảy) và phương
pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) kết
hợp so sánh với dữ liệu công bố trong các tài liệu tham khảo.
2.2.2. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu

fM

Đánh giá chất lượng của chất chuẩn theo các chỉ tiêu chất lượng sau:
Định tính: tiến hành phương pháp đo NMR hoặc phối hợp thêm HPLC.
Xác định độ tinh khiết: sử dụng phương pháp HPLC.
Công thức tính hàm lượng tạp chất gần đúng theo tỉ lệ diện tích pic khi áp
dụng phương pháp HPLC:

Sc
h

oo

lo

-

Trong đó:

rig

-

ht

©

(2.1)

Co

py

Ctap %: tỉ lệ % tạp chất trong mẫu phân tích
Spic: diện tích pic tạp chất

∑Spic: tổng diện tích pic
+ Xác định hàm lượng: sử dụng phương pháp HPLC (Dựa trên cơ sở Chương

14


trình sắc ký trong DĐVN IV, phụ lục 5.3 và được đánh giá lại về tính thích hợp hệ
thống) [6].

ma
cy

,V
NU

Hàm lượng tanshinon IIA trong dung dịch thử được tính theo công thức:

Trong đó:

ST, SC: Diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung

dP
ha
r

dịch chuẩn tương ứng (mAU.min).

Cc: Nồng độ của tanshinon IIA trong dung dịch chuẩn (mg/ml).
mcân: Khối lượng mẫu cân thực nghiệm (mg).

an

V: Thể tích dung dịch thử (ml).
Đóng gói

-

ici

ne

Nguyên liệu sau khi được đánh giá theo qui trình và đạt yêu cầu về chất

lượng được đưa vào đóng lọ theo các bước quy định trong VKN/TT/21.20. Sử dụng

ed

lọ thủy tinh nâu, nút xoáy có lớp đệm Teflon đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy
định. Để đảm bảo chất lượng của chất đối chiếu trong suốt thời gian bảo quản và sử

lo

fM

dụng thì việc đóng gói các CCĐC dự kiến được tiến hành trong Glove – Box là nơi
có thể kiểm soát được độ ẩm. Tiến hành trong Glove – box đã nạp khí nitơ 99,99%,
độ ẩm tương đối trong buồng đóng khoảng 40%. Khối lượng 20 mg/lọ. Dán nhãn có

oo

ghi tên hoạt chất và đánh số thứ tự cho từng lọ.

Sc
h

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê ứng

ht

©

dụng trong nghiên cứu phân tích, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft

Excel [6].

rig

Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả:

Co

py

Tính giá trị trung bình:

-

1
𝑋̅ = ∑𝑛𝑖=1 𝑥𝑖
𝑛

Tính độ lệch chuẩn:

15


ma
cy
,V
NU

Tính độ lệch chuẩn tương đối:

-

Trong đó:
𝑋̅ : giá trị trung bình các mẫu thử

xi: giá trị của mẫu thử

dP
ha
r

n: số thử nghiệm/mẫu thử được sử dụng để tính giá trị trung bình
SD: độ lệch chuẩn
RSD: độ lệch chuẩn tương đối

an

2.3. Sơ đồ và nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu:
+ Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu rễ đan
sâm đạt độ tinh khiết cần thiết.

Co

-

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

- Sơ đồ nghiên cứu:

+ Phân tích, xác định cấu trúc hóa học của tanshinon IIA tinh chế được.

16


+ Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng tanshinon IIA: cảm quan, dữ liệu phổ.
+ Phân tích xác định tạp chất, độ tinh khiết của tanshinon IIA tinh chế được.
2.4. Địa điểm nghiên cứu

ma
cy
,V
NU

Nghiên cứu này được thực hiện tại Khoa Y dược Đại học Quốc gia Hà Nội,
trong khuôn khổ Chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản trong khoa học tự nhiên

Co

py

rig

ht

©

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

dP
ha
r

và kỹ thuật của Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED),
thuộc đề tài “Nghiên cứu dược liệu Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở
Việt Nam: thành phần hóa học và tác dụng trên các dòng tế bào ung thư máu”, mã
số: 106-YS.05-2015.05 (Chủ nhiệm Đề tài: TS. Nguyễn Hữu Tùng).

17