Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ, tôi
xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. BSNT. Vũ Thị Huyền giảng viên bộ
môn Y sinh học - Di truyền, trường đại học Y Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn tôi
từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình nghiên cứu và làm khóa luận, đóng góp
cho tôi những ý kiến quý báu hoàn thành bản khóa luận này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên bộ
môn đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để tôi
hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, ban Giám hiệu, phòng Quản lý đại
học và bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường đại học Y Hà Nội đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian hoàn thành nghiên cứu.
Tôi cũng xin cám ơn hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp đã đóng góp
những ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện bản khóa luận.
Nhân dịp này, tôi kính trọng tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha, mẹ tôi đã
dành tất cả điều kiện để tôi được học tập, phấn đấu và trưởng thành trong
cuộc sống và sự nghiệp.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã dành cho tôi nhiều sự động viên và đóng góp.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Sinh viên

Tạ Tiên Sinh


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác
định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở
nam giới vô sinh nguyên phát” là do tự bản thân tôi thực hiện. Tất cả những
số liệu do chính tôi thu thập, kết quả trong luận văn này trung thực và chưa có
ai công bố trong bất kỳ một nghiên cứu nào khác.
Tôi xin đảm bảo tính khách quan, trung thực của các số liệu và kết quả
xử lý số liệu trong nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày

tháng

Sinh viên

Tạ Tiên Sinh

năm 2016


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid Deoxyribonucleic

A

Adenin

Ala

Alalin

ARMS

Amplification refractory mutation system

Arg

Arginin

Asn

Asparagin

BN

Bệnh nhân

C

Cytosin

CYP1A1

Cytochrom P450-A1

G

Guanin

Gln

Glutamin

Gly

Glycin

GSTP1

Glutathion S transferase-P1

Ile

Isoleucin

NAT2

N-Acetyltransferase 2

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase chain reaction

T

Thymin

Thr

Threonin

Val

Valin

WHO

World Health Organization


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.................................................................................3
1.1. Vô sinh....................................................................................................3
1.1.1. Khái niệm vô sinh và lịch sử các nghiên cứu về vô sinh..................3
1.1.2. Nguyên nhân vô sinh nam giới.........................................................4
1.2. Xenobiotic...............................................................................................6
1.2.1. Khái niệm xenobiotic và ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể....6
1.2.2. Quá trình biến đổi chung của xenobiotic..........................................8
1.2.3. Gen chuyển hóa xenobiotic.............................................................11
1.3. PCR.......................................................................................................17
1.3.1. Khái niệm và lịch sử phát triển của kỹ thuật PCR..........................17
1.3.2. Nguyên lý kỹ thuật PCR.................................................................18
1.3.3. Một số phương pháp PCR đặc hiệu................................................19
1.3.4. Phương pháp di truyền phân tử - kỹ thuật ARMS - PCR.....................21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................25
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................25
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu...........................................25
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ..........................................................................25
2.1.3. Số bệnh nhân và số mẫu..................................................................25
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu.................................................................26
2.2. Đạo đức trong nghiên cứu.....................................................................29
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................30
3.1. Đặc điểm tuổi của đối tượng nghiên cứu..............................................30
3.2. Kết quả tách chiết và đo độ tinh sạch ADN..........................................30
3.3. Kết quả phương pháp ARMS - PCR.....................................................31


3.3.1. Kết quả chạy điện di........................................................................31
3.3.2. Kết quả nghiên cứu đột biến CYP1A1 A2455G sử dụng kỹ thuật
ARMS - PCR..................................................................................32
3.3.3. Kết quả nghiên cứu đột biến GSTP1 C341T sử dụng kỹ thuật
ARMS - PCR..................................................................................33
3.3.4. Kết quả nghiên cứu đột biến GSTP1 G313A sử dụng kỹ thuật
ARMS - PCR..................................................................................34
3.3.5. Kết quả nghiên cứu đột biến NAT2 C481T sử dụng kỹ thuật
ARMS - PCR..................................................................................34
3.3.6. Kết quả nghiên cứu đột biến NAT2 G590A sử dụng kỹ thuật
ARMS - PCR.................................................................................35
3.3.7. Kết quả nghiên cứu đột biến CYP1A1 A2455G, GSTP1 G313A,
GSTP1 C341T, NAT2 C481T, NAT2 G590A của nhóm bệnh............36
Chương 4: BÀN LUẬN..................................................................................38
4.1. Đặc điểm sinh học của nhóm đối tượng nghiên cứu.............................38
4.2. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi ở các
gen CYP1A1, NAT2, GSTP1................................................................39

4.2.1. Tách chiết ADN..............................................................................40
4.2.2. Tiến hành PCR theo phương pháp ARMS và điện di đọc kết quả. .41
KẾT LUẬN.....................................................................................................47
KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO...............................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.

Một số đột biến của CYP1A1.....................................................13

Bảng 1.2.

Một số đột biến của GSTP1........................................................15

Bảng 1.3.

Một số đột biến của NAT2..........................................................17

Bảng 2.1.

Trình tự cặp mồi của các polymorphism CYP1A1 (Ile462Val),
NAT2 (Leu161Leu), GSTP1(Ile105Val và Ala114Val)..............28

Bảng 2.2.

Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR......................................28

Bảng 3.1.

Đặc điểm độ tuổi của đối tượng nghiên cứu và nhóm chứng......30

Bảng 3.2.

Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp
Phenol/Chloroform......................................................................30

Bảng 3.3.

Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp ADNexpress.........................................................................................31

Bảng 3.4.

Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen CYP1A1
A2455G sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR....................................32

Bảng 3.5.

Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen GSTP1
C341T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR.......................................33

Bảng 3.6.

Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen GSTP1
G313A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR.......................................34

Bảng 3.7.

Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen NAT2
C481T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR.......................................34

Bảng 3.8.

Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen NAT2
G590A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR.......................................35

Bảng 3.9.

Kết quả nghiên cứu đột biến gen CYP1A1 A2455G, GSTP1 G313A,
GSTP1 C341T, NAT2 C481T, NAT2 G590A của nhóm bệnh........36

Bảng 4.1.

So sánh một số ưu nhược điểm hai phương pháp tách ADN......41

Bảng 4.2.

Thành phần 1 mẫu PCR theo khuyến nghị của nhà sản xuất......41


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.

Sơ đồ chuyển hóa xenobiotic......................................................10

Hình 1.2.

Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15.................................................12

Hình 1.3.

Vị trí gen GSTP1 trên NST 11....................................................14

Hình 1.4.

Vị trí gen NAT2 trên NST 8........................................................16

Hình 1.5.

Chu trình 3 giai đoạn PCR..........................................................19

Hình 1.6.

Sơ đồ kỹ thuật ARMS - PCR......................................................22

Hình 1.7.

Mẫu kết quả chạy điện di kỹ thuật ARMS - PCR.......................22

Hình 3.1.

Kết quả chạy điện di GSTP1 Ile105Val sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR....32


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh hiện nay là một vấn đề cần được quan tâm nhiều hơn tại Việt
Nam cũng như trên thế giới. Vô sinh không chỉ ảnh hưởng tới chất lượng cuộc
sống mà còn làm tăng tần suất của những cuộc ly hôn. Hiện nay vô sinh
không còn là vấn đề riêng của nữ giới. Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO),
trong các cặp vợ chồng ở độ tuổi sinh sản gặp vấn đề về sinh con thì 30 - 40%
do nam giới và 10% là do cả 2 giới, 40% do nữ giới và khoảng 10% không rõ
nguyên nhân [1]. Tại các nước Tây Âu, tỷ lệ vô sinh dẫn đến ly hôn chiếm
15%, trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm hơn 50%. Từ đó vô sinh nam
đã được nghiên cứu một cách sâu sắc và toàn diện hơn.
Cơ thể chúng ta là một hệ thống mở luôn tiếp nhận các chất từ môi
trường tự nhiên: thức ăn, thuốc, hóa chất,… Xenobiotic là các chất hóa học lạ
đối với cơ thể, nó có thể có những ảnh hưởng tốt đối với cơ thể trong quá
trình chống lại các tác nhân lạ (ứng dụng của thuốc trong điều trị các bệnh lý
nội ngoại khoa) song bên cạnh đó nó cũng có những tác dụng không tốt cho
cơ thể (hóa chất độc hại, thuốc lá, rượu,…), trong đó có rất nhiều chất có khả
năng gây vô sinh. Nhiệm vụ của cơ thể là chuyển hóa các chất độc hại và đào
thải chúng, giúp cơ thể có được sự cân bằng trong các hoạt động sống và sinh
sản. Trong quá trình chuyển hóa xenobiotic, CYP1A1 là gen có vai trò then
chốt, tham gia mã hóa enzym liên quan đến biến đổi nhóm hoạt tính của
xenobiotic trong giai đoạn I của chu trình; GSTP1 và NAT2 là hai gen giữ vai
trò mã hóa hai enzym tham gia biến đổi xenobiotic giai đoạn II, biến đổi
thành các chất dễ dàng thải trừ ra ngoài môi trường. Vì vậy việc nghiên cứu
ảnh hưởng của đột biến những gen này gây nên vô sinh ở nam giới cũng đã
được tiến hành trên nhiều quốc gia. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện chưa có một
công trình nghiên cứu nào.


2
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử giúp chẩn đoán nhanh và rất hữu hiệu
đối với các bệnh phân tử. Việc thực hiện kỹ thuật ARMS - PCR trong việc

nghiên cứu các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 để xác định các biến đổi của các
gen đó ở nam giới vô sinh chưa có một nghiên cứu nào được tiến hành tại Việt
Nam. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:
“Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của
một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh
nguyên phát”
Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu sau:
1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật ARMS - PCR để xác định những biến đổi
ở các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 ở nam giới vô sinh nguyên phát.
2. Mô tả một số biến đổi của các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 ở nam
giới vô sinh nguyên phát.


3
Chương 1

TỔNG QUAN
1.1. Vô sinh
1.1.1. Khái niệm vô sinh và lịch sử các nghiên cứu về vô sinh
1.1.1.1. Khái niệm
Theo WHO, vô sinh (infertility) là tình trạng một cặp nam nữ trong độ
tuổi sinh đẻ, chung sống và quan hệ tình dục thường xuyên trong vòng 12
tháng mà không có con, dù không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào [2].
Vô sinh được phân thành hai nhóm: vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ
phát. Vô sinh nguyên phát là khi người nam hay nữ này chưa từng có con lần
nào. Vô sinh thứ phát là trong tiền sử của người nam hoặc nữ này đã từng có con
ít nhất một lần nhưng sau đó không thể có con dù quan hệ tình dục bình thường
trong vòng 12 tháng mà không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào.
Vô sinh nam là vô sinh mà nguyên nhân không có con bắt nguồn từ
người nam giới, do chức năng sinh sản của người nam giới không được đảm

bảo như người bình thường, cần có sự can thiệp của y tế.
1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu về vô sinh
Theo ước tính của WHO (1991), trên thế giới có khoảng 12,15% cặp vợ
chồng vô sinh tương đương 50 - 80 triệu người [3].
Năm 2003, nghiên cứu của Krauz và cộng sự cũng kết luận nguyên nhân
gây vô sinh nam giới khoảng 50%, trong đó khoảng 40 - 50% những nam giới
này có bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng [4].
Tại Ả Rập, năm 2006, Ali Hellani tiến hành nghiên cứu và cũng cho
rằng, khoảng 10 - 15% cặp vợ chồng vô sinh, trong đó nguyên nhân do nam
giới chiếm 50% [5].


4
Tại Singapore năm 2009, Poongothai J. và cộng sự tiến hành nghiên cứu
cũng cho rằng khoảng 15% cặp vợ chồng vô sinh, trong đó nguyên nhân do
nam giới chiếm 50% [6].
Đến năm 2010, WHO công bố số liệu mới, cho rằng 8 - 10% cặp vợ
chồng vô sinh trong đó 35% do vợ, 30% do chồng, 25% do cả hai, 10% chưa
rõ nguyên nhân [7].
Như vậy, theo các nghiên cứu trên, tỷ lệ các cặp vợ chồng vô sinh chiếm
từ 10 - 20%, trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm khoảng 50%.
Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam
Theo Ngô Gia Hy (2000), trong các cặp vợ chồng vô sinh, nguyên nhân
do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cả hai chiếm tỷ lệ 10% [8].
Theo Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002), tỷ lệ vô sinh chiếm 5%,
trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [9].
Theo Trần Quán Anh (2009) tỷ lệ vô sinh chiếm 15%, và tỉ lệ này đang
có chiều hướng tăng mạnh. Trong đó vô sinh nam chiếm trên 50% [10].
Theo Trần Đức Phấn (2010) trong số các cặp vợ chồng vô sinh có 44%
có tinh dịch đồ bất thường [11].

Báo cáo của Nguyễn Viết Tiến tại Hội thảo quốc tế “Cập nhật về hỗ trợ
sinh sản” (2013) tại Hà Nội cho thấy tỷ lệ vô sinh ở Việt Nam là 7,7%. Trong
đó nguyên nhân do nam giới chiếm 25 - 40% [12].
Như vậy, tại Việt Nam, tỷ lệ vô sinh khác nhau giữa các nghiên cứu,
song đều chỉ ra rằng nguyên nhân bắt nguồn từ nam giới khoảng 40 - 50%.
1.1.2. Nguyên nhân vô sinh nam giới
Vô sinh nam do nhiều nguyên nhân gây nên, trong đó có hai nhóm
nguyên nhân chính là nhóm nguyên nhân do di truyền và nhóm nguyên nhân
không phải do di truyền.


5
1.1.2.1. Nhóm nguyên nhân do di truyền
Bao gồm những nguyên nhân bất thường trong NST gây mất chức năng
sinh sản có từ thời kì bào thai. NST bị đột biến có thể là NST thường hoặc
NST giới tính. Một số bệnh lý thường gặp trong nhóm nguyên nhân này:
- Hội chứng Klinefelter: một người đàn ông có hai NST X và một NST Y
thay vì một NST X và một NST Y (47,XXY). Đây là nguyên nhân hàng đầu
gây vô sinh ở nam giới, chiếm tỷ lệ từ 1/500 đến 1/1000 trẻ trai được sinh ra
[13]. Điều này gây ra sự phát triển bất thường của tinh hoàn, dẫn đến
testosteron thấp hoặc không có, từ đó gây bất thường tới sự sản sinh tinh
trùng, dẫn đến giảm cả số lượng và chất lượng tinh trùng.
- Hội chứng Down: trẻ mới sinh có bộ NST 46,XY,+21, hay còn gọi là
trisomy 21. Trẻ mắc hội chứng Down thường có những bất thường về thể chất
và tâm thần, trong đó thường không có khả năng sinh sản [14].
- Đột biến gen trên NST X: Gen AR là gen thụ thể của androgen, thuộc
nhánh dài NST X. Nếu gen này bị đột biến sẽ dẫn đến mất một phần hay toàn
bộ thụ thể androgen gây hội chứng kháng androgen trên lâm sàng, gây ảnh
hưởng tới việc sản xuất tinh trùng nhưng không gây dị tật bộ phận sinh dục,
từ đó ảnh hưởng trực tiếp tới chức năng sinh sản của nam giới [15].

- Đột biến gen trên NST Y: AZF là một đoạn ở nhánh dài của NST Y
(Yq11). Người có đột biến gen này thường có số lượng tinh trùng bị giảm nặng
hoặc không tạo được tinh trùng, chính là nguyên nhân gây vô sinh [16].
- Đột biến gen trên NST thường: Gen UBE2I được tìm thấy trên nhánh
ngắn NST số 16. Nam giới bị đột biến gen này ảnh hưởng tới chức năng của
thụ thể androgen, làm giảm sự sản sinh tinh trùng và gây nên vô sinh [17].
Gen CFTR được tìm thấy trên nhánh dài của NST số 7. Nam giới bị bệnh này
sẽ không có ống dẫn tinh hoặc tắc ống dẫn tinh, dẫn đến không có tinh trùng
trong tinh dịch [18].


6
- Sự đứt gãy ADN ở tinh trùng: Những tinh trùng bị đứt gãy ADN dẫn tới
chất lượng tinh trùng giảm sút, giảm khả năng thụ tinh, tăng nguy cơ sẩy thai.
1.1.2.2. Nhóm nguyên nhân không phải do di truyền
Một số nguyên nhân trong nhóm này như các yếu tố sinh hóa, nội tiết tố,
và các yếu tố môi trường.
+ Các yếu tố sinh hóa: quá trình sản xuất tinh trùng cần một số nguyên
liệu như kẽm, fructose, acid citric, ion calci… Fructose là nguồn dinh dưỡng
và năng lượng chính của tinh trùng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự suy
giảm nồng độ fructose trong tinh dịch có liên quan đáng kể tới các bất thường
về số lượng, cấu trúc và chức năng tinh trùng [19].
+ Nội tiết tố: nội tiết tố ảnh hưởng tới quá trình sản xuất tinh trùng gồm
3 chất chủ yếu FSH, LH và testosteron. Sự điều hòa 3 chất này đảm bảo cho
quá trình sản xuất tinh trùng diễn ra bình thường. Khi có bất thường trong hệ
trục dưới đồi - tuyến yên - tinh hoàn gây nên sự bất thường trong nồng độ 3
chất này, từ đó làm rối loạn quá trình sản xuất tinh trùng [20].
+ Các yếu tố môi trường: hóa chất độc hại, các chất kích thích, nhiệt độ
không thích hợp, kim loại nặng… không chỉ ảnh hưởng tới chuyển hóa vật
chất và năng lượng nói chung mà còn là nguyên nhân gây suy giảm sản xuất

tinh trùng cả về số lượng và chất lượng [21].
1.2. Xenobiotic
1.2.1. Khái niệm xenobiotic và ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể
1.2.1.1. Khái niệm
Xenobiotic là những chất hóa học lạ so với cơ thể sinh vật, là những chất
mà cơ thể sinh vật không tự sản xuất ra. Các chất này gồm: chất có nguồn gốc
thực vật, dược phẩm, thuốc trừ sâu, mỹ phẩm, hương liệu, nước hoa, phụ gia
thực phẩm, hóa chất công nghiệp và chất gây ô nhiễm môi trường [22]…


7
Khi xenobiotic xâm nhập vào cơ thể con người, nó sẽ được chuyển hóa
và đào thải ra ngoài. Nếu quá trình chuyển hóa đó diễn ra không theo đúng
trình tự của cơ thể (do đột biến các gen mã hóa enzym tham gia chuyển hóa
xenobiotic), xenobiotic sẽ là các chất độc và sinh ra các gốc tự do, các gốc tự
do đó sẽ tích tụ lại và tiếp tục gây nên các đột biến khác của cơ thể hoặc ảnh
hưởng trực tiếp tới chức năng cơ quan, qua đó gây nên bệnh tật.
1.2.1.2. Ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể
+ Dioxin: Đây là một chất được xếp vào loại cực độc. Việc đốt cháy túi
nilon từ các hoạt động của con người là một trong các nguồn phát sinh chủ
yếu của dioxin. Đây là chất ít tan trong nước, tồn tại trong đất, qua đó xâm
nhiễm qua con đường thực phẩm, vào thực vật, tôm cá, rau quả và cuối cùng
được con người hấp thu. Ngoài ra, dioxin cũng có thể gây ngộ độc trực tiếp
qua hô hấp, qua da do tiếp xúc hoặc qua nước uống. Nếu liều lượng cao,
dioxin có thể gây độc cấp tính, nếu liều lượng thấp có thể gây độc mạn tính và
ung thư, ảnh hưởng tới chức năng của hệ nội tiết và sinh sản [21].
+ Thuốc lá: Các chất độc từ thuốc lá không chỉ ảnh hưởng đến người hút
mà còn gây nguy hại với những người vô tình hít phải khói thuốc, nhất là phụ
nữ và trẻ em. Thành phần khói thuốc lá rất phức tạp, có tới hơn 4000 hợp chất
trong đó 200 loại hóa chất có hại cho sức khỏe và 40 chất có thể gây ung thư

(benzopyren, các nitrosamin). Việc hút thuốc làm giảm đáng kể nồng độ của
nội tiết tố và các thông số tinh dịch, đó là khuyến cáo cho rằng những người
đàn ông đang điều trị vô sinh nên ngừng hút thuốc để tăng cơ hội có con [23].
+ Rượu: Quá trình chuyển hóa của rượu trong cơ thể sinh ra acetaldehyd.
Đây là chất gây biến dị tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh dục. Sau thời gian
nghiện rượu mãn tính, nồng độ acetaldehyd trong máu cao sẽ làm tăng nguy
cơ gây ung thư gan và các tổ chức khác trong cơ thể bởi khả năng làm đột
biến ADN. Việc sử dụng rượu mãn tính là một nguyên nhân gây giảm số lượng
và chất lượng tinh trùng [24].


8
+ Thuốc trừ sâu: thuốc trừ sâu (hay thuốc bảo vệ thực vật) là loại hóa
chất con người sản xuất ra để trừ sâu bệnh và cỏ dại cho cây trồng. Một số
chất như DDT (hydrocarbon clo hữu cơ) gây ảnh hưởng tới cơ thể sinh vật
bằng cách phá vỡ sự cân bằng Natri/Kali của các sợi thần kinh, khiến các dây
thần kinh hoạt động truyền tải liên tục, gây ảnh hưởng tới chức năng thần
kinh. Các chất thuộc nhóm carbamat hoạt động gây ức chế enzym
acetylcholinesterase khiến acetylcholin hoạt động liên tục mà không bị phân
hủy và gây ra các bệnh yếu hoặc liệt. Nhóm hóa chất diệt cỏ acid benzoic lại
có chức năng tương tự như các hormon tăng trưởng khiến tế bào phân chia
không bình thường, gây ra các đột biến. Nhóm người tiếp xúc thường xuyên
với các hóa chất diệt cỏ có nguy cơ bị đột biến và vô sinh cao [25].
+ Dược phẩm: dược phẩm là những chất được chế tạo mà khi được hít,
tiêm, uống, bôi… sẽ được hấp thu vào cơ thể và gây thay đổi sinh lý học. Một
số chức năng của dược phẩm như các chất hướng thần (nicotin, cafein…) ảnh
hưởng đến chức năng hệ thần kinh trung ương, làm thay đổi nhận thức, tâm
lý, ý thức; các kháng sinh (penicillin, chloramphenicol…) khi được hấp thu sẽ có
tác dụng giúp cơ thể chống lại các sinh vật xâm nhập vào cơ thể; các hóa chất
chống ung thư (cisplastin, 5-fluo-uracin…) xâm nhập vào các tế bào ung thư và

tiêu diệt. Bên cạnh tác dụng trợ giúp cơ thể chống lại bệnh tật, dược phẩm còn
gây ra các tác dụng không mong muốn ảnh hưởng không tốt tới cơ thể như phụ
thuộc (hay nghiện) thuốc (các thuốc giảm đau nhóm opioid: morphin và các dẫn
xuất), giảm tác dụng dược lý (các kháng sinh)… và đặc biệt các thuốc nhóm hóa
chất chống ung thư có thể ảnh hưởng tới chức năng sinh sản [26].
1.2.2. Quá trình biến đổi chung của xenobiotic

1.2.2.1. Hấp thu
Xenobiotic xâm nhập cơ thể qua đường tiêu hóa, hô hấp, da-niêm mạc,
tiêm truyền, trong đó đường tiêu hóa là chủ yếu.


9
Quá trình hấp thu phụ thuộc vào cấu trúc của tổ chức, pH môi trường nơi
xenobiotic xâm nhập, cấu tạo của xenobiotic…
Cơ chế hấp thu chủ yếu theo qui luật vật lý, vận chuyển theo gradient
(bậc thang) nồng độ, từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp.
Đối với thuốc: Khả năng hấp thu được đặc trưng bởi đại lượng sinh khả
dụng. Đó là tỷ lệ thuốc xâm nhập hệ tuần hoàn so với lượng đưa vào.
1.2.2.2. Phân bố
Sau khi xâm nhập cơ thể, xenobiotic được phân bố ở các tổ chức khác
nhau, tùy thuộc tính chất hóa học, tính tan của mỗi chất. Các chất ít tan trong
nước, ưa lipid như chloroform, hexobarbital sẽ phân bố nhiều vào mô mỡ, cơ
quan nhiều lipid như tổ chức thần kinh.
Trong huyết tương, 1 phần xenobiotic gắn với protein huyết tương (chủ
yếu là với albumin). Đặc điểm của sự gắn xenobiotic với protein:
+ Chất nào càng ít tan trong nước thì gắn với protein huyết tương càng
nhiều.
+ Có sự cân bằng động giữa phần tự do và phần gắn với protein.
Xenobiotic + Protein huyết tương  Xenobiotic-protein

Dạng tự do là dạng hoạt động (tác dụng hoặc độc tính).
+ Có sự cạnh tranh giữa các xenobiotic khi gắn với protein: ví dụ
Tolbutamid và Phenylbutazon.
+ Khả năng gắn có giới hạn và phụ thuộc hàm lượng protein huyết tương.
1.2.2.3. Chuyển hóa
Cơ quan chuyển hóa chủ yếu xenobiotic là gan. Con đường đào thải chủ
yếu là qua nước tiểu. Đa số các xenobiotic ít tan trong nước, vì vậy quá trình
chuyển hóa nói chung nhằm tạo ra các dẫn xuất dễ tan trong nước, mất độc
tính rồi thải ra ngoài.
Quá trình chuyển hóa thường gồm 2 giai đoạn (phase):


10

Nguồn: />
Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa xenobiotic
+ Giai đoạn I:
Trong giai đoạn I, một loạt các enzym tham gia hoạt động để biến đổi
nhóm hoạt tính của xenobiotic. Phức hợp enzym xúc tác để kết hợp một
nguyên tử oxy, dẫn đến hình thành các nhóm hydroxyl hoặc -N, -S, =O. Phản
ứng có thể tóm tắt qua sơ đồ:
RH + O2 + NADPH + H+

ROH + NADP+ + H2O

Các enzym tham gia phản ứng giai đoạn I rất đa dạng và phong phú. Bao
gồm hệ thống enzym oxidase, reductase, và hydrolysis, trong đó hệ thống
cytochrom P450 monooxygenase (CYP450) giữ vai trò oxidase các
xenobiotic. CYP1A1 là một gen mã hóa enzym trong họ CYP450.
+ Giai đoạn II:

11
Trong các phản ứng tiếp theo giai đoạn II, các chất chuyển hóa
xenobiotic được chia thành các nhóm: glutathion (GSH), sulfat, glycin, hoặc
acid glucuronic. Các loại phản ứng liên hợp xảy ra bao gồm carboxyl
(-COOH), hydroxyl (-OH), amino (-NH2) và nhóm sulfhydryl (-SH). Sản
phẩm của các phản ứng liên hợp ít phân cực hơn so với ban đầu, không giống
như phản ứng giai đoạn I thường tạo ra các chất hoạt động hóa học. Việc bổ
sung các nhóm anion lớn (như GSH) giải độc các ion phản ứng và sản sinh ra
nhiều chất chuyển hóa phân cực mà không thể khuếch tán qua màng, và có
thể phải thông qua cơ chế vận chuyển tích cực.
Những phản ứng này được xúc tác bởi một nhóm lớn các transferase
đặc trưng, mà khi kết hợp có thể chuyển hóa gần như bất kỳ hợp chất kỵ
nước nào [27]. Một trong các emzym quan trọng nhất của nhóm này là
glutathione S-transferase (GST, GSTP1 là một gen mã hóa enzym trong họ
GST) và N-acetyltransferase 2 (NAT2).
1.2.2.4. Thải trừ
Sau khi phản ứng giai đoạn II, các hợp chất xenobiotic có thể được
chuyển hóa hơn nữa. Một ví dụ phổ biến là việc xử lý hợp chất glutathion để
acetylcystein (acid mercapturic) liên hợp [28].
Con đường thải trừ chủ yếu của cơ thể là qua nước tiểu, còn lại một phần
qua phân, mồ hôi, hơi thở…
Đa số các xenobiotic sau khi được chuyển thành các dẫn xuất tan trong
nước, được đào thải ra nước tiểu. Một số chất có phân tử lượng lớn, ít tan
trong nước, được gan đào thải qua mật, xuống ruột rồi ra ngoài theo phân.
Sự thải trừ được đặc trưng bởi đại lượng “thời gian bán thải” (T 1/2) là
thời gian để thải một nửa lượng chất so với ban đầu.
Mức độ thải trừ phụ thuộc nhiều vào chức năng thận. Khi thận suy, làm
giảm thải trừ, tăng độc tính.

12
1.2.3. Gen chuyển hóa xenobiotic
1.2.3.1. CYP1A1
Gen CYP1A1 mã hóa 1 enzym là thành viên của họ các enzym CYP450.
CYP450 là monooxygenase, thường thấy trong microsom của gan, enzym này
liên quan đến con đường vận chuyển điện tử NADPH. Gen CYP1A1 nằm trên
nhánh dài của NST số 15 gồm 6069 cặp base, tại vùng 2 băng 4 băng phụ 1
(15q24.1). Chức năng của CYP450 trong chuyển hóa oxy hóa các hợp chất
bao gồm steroid, các acid béo, và xenobiotic [29].


13

Nguồn: />
Hình 1.2. Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15

Bảng 1.1. Một số đột biến của CYP1A1
Phenotype
CYP1A1*2A

Đột biến
T3801C


14
CYP1A1*2B
CYP1A1*3
CYP1A1*4

A2455G
T3205C
C2453A

Nguồn: Fritsche E. et al (1998)

Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng đột biến hay gặp nhất trong nhóm
CYP1A1 là CYP1A1*2B do sự biến đổi nucleotide A thành G tại vị trí 2455 gây
ra sự biến đổi acid amin Isoleucin thành Valin ở vị trí 462 trên exon 7 [30].
Trong nghiên cứu của mình, Fritsche E. và cộng sự (1998) đã chỉ ra
rằng một đột biến xảy ra ở exon 7 gây ra sự biến đổi acid amin Ile thành Val
gây ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa xenobiotic, tỷ lệ bị mắc vô sinh
trong nhóm mang đột biến này cao hơn so với nhóm chứng (OR = 2,4;
95%CI = 0,83 - 6,95) [31]. Aydos S.E. và cộng sự (2009) cũng đã chỉ ra rằng
đột biến này gắn với đột biến gen GSTM1 làm tăng nguy cơ vô sinh lên 6,9
lần so với nhóm chứng (95%CI = 2,29 - 19,3) [32].
Luo H. và cộng sự (2014) đã chứng minh được rằng đột biến gen
CYP1A1 làm tăng nguy cơ vô sinh nam [33].
1.2.3.2. GSTs và GSTP1
Glutathione S-transferases (GSTs), gồm các enzym tham gia vào giai
đoạn II của quá trình chuyển hóa xenobiotic, xúc tác cho sự liên hợp
glutathion (GSH) với mục đích giải độc. Các GSTs bao gồm ba họ: các
cytosolic, mitochondrial, ADN microsomal - còn gọi là MAPEG-protein [34].
Các thành viên của GSTs cực kỳ đa dạng trong chuỗi acid amin, và một phần
lớn các chức năng không rõ [35].
GSTP1 (Glutathion S transferase pi 1) là 1 gen thành viên của họ GSTs.
Gen nằm trên nhánh dài của NST số 11 gồm 3066 cặp base, tại vùng 1 băng 3
băng phụ 3 (11q13.3). GSTP1 mã hóa enzym đóng vai trò quan trọng trong giải
độc bằng xúc tác cho sự tiếp hợp của nhiều hợp chất kỵ nước và lực điện tử với

glutathion, tham gia hoạt động trong quá trình chuyển hóa xenobiotic [36].


15

/>
Hình 1.3. Vị trí gen GSTP1 trên NST 11
Bảng 1.2. Một số đột biến của GSTP1
Phenotype

Đột biến

GLUTATHIONE S - TRANSFERASE, TYPE A

GSTP1, Ala114Val


16
GLUTATHIONE S - TRANSFERASE, TYPE B
GLUTATHIONE S - TRANSFERASE, TYPE C

GSTP1, Ile105Val
GSTP1, Ile105Val và
Ala114Val

Nguồn: Ali – Osman et al (1997)

Theo nghiên cứu của Ali - Osman và cộng sự (1997), các đột biến
thường gặp của GSTP1 xảy ra tại hai vị trí là G313A trên exon 5 (đột biến
thay đổi acid amin Isoleucin thành Valin) và C341T trên exon 6 (đột biến thay

đổi acid amin Alalin thành Valin). Và theo nhóm đột biến như vậy sẽ có 3
type tương ứng: type A - đột biến tại vị trí C341T; type B - đột biến tại vị trí
G313A; và type C - đột biến tại cả hai vị trí G313A và C341T [37].
Yarosh S.L. và cộng sự (2015) đã khẳng định sự đa hình trong gen
GSTM1, GSTT1 và GSTP1 (G313A) làm tăng nguy cơ vô sinh nam lên 1,5 lần
(95%CI = 1,02 - 2,20; p = 0,04), nguy cơ này tăng lên bởi hút thuốc lá [38].
Khi tiến hành nghiên cứu đa hình trong nhóm gen GSTs, Xiong D.K. và
cộng sự (2015) kết luận sự đa hình trong các đột biến GSTP1 vị trí G313A
làm phát triển các yếu tố nguy cơ vô sinh nam ở nam giới Tứ Xuyên, Tây
Nam Trung Quốc (OR = 1,53; 95%CI = 1,11 - 2,11; p = 0.009) [39].
1.2.3.3. NAT và NAT2
Các gen nhóm NAT (N-acetyltransferase) gồm có NAT1 và NAT2, mã
hóa enzym có chức năng acetyl trong quá trình chuyển hóa các xenobiotic.
NAT2 mã hóa enzym có hoạt động acetyl hóa cao. Các N-acetyltransferases
tham gia vào giai đoạn II của quá trình chuyển hóa xenobiotic, mà hoạt động
của nó là acetyl sulfamethazine (kháng sinh), song với acid amino benzoic thì
không chuyển hóa được tất cả [40].
NAT2: Gen NAT2 nằm trên nhánh ngắn của NST số 8 gồm 9974 cặp
base, tại vùng 2 băng 2 (8p22). Gen này mã hóa enzym có chức năng acetyl


17
hoá xenobiotic tham gia cùng với các glutathione S-transferase trong chuyển
hóa xenobiotic ở giai đoạn II [41].

Nguồn: />
Hình 1.4. Vị trí gen NAT2 trên NST 8
Bảng 1.3. Một số đột biến của NAT2
Phenotype
Acetyl hóa chậm

Acetyl hóa chậm

Đột biến
NAT2, Arg197Gln
NAT2, Ile114Thr


18
Acetyl hóa chậm
Acetyl hóa chậm
Acetyl hóa chậm

NAT2, Lys268Arg
NAT2, Gly286Glu
NAT2, G191A

Nguồn: Cascorbi I. et al (1996), Delomenie C. et al (1996), Magalon H. et al (2008)

Theo Cascorbi I. (1996), Delomenie C. (1996), Magalon H. (2008) đã
cùng chỉ ra rằng vai trò của NAT2 là tham gia acetyl hóa các xenobiotic trong giai
đoạn II của quá trình chuyển hóa, và các đột biến hay gặp ở gen này đều làm cho
quá trình acetyl hóa bị chậm lại, do đó gây nên sự tích tụ các chất độc hại trong cơ
thể là nguyên nhân sinh ra một số bệnh di truyền trong đó có vô sinh [42],[43],
[44].
Một đột biến điển hình hay gặp của NAT2 xảy ra tại vị trí G590A gây
thay đổi acid amin trong quá trình dịch mã Arg197Gln được Yarosh và cộng
sự (2014) nghiên cứu, đột biến gây ra tính nhạy cảm đến vô sinh nam, và
nguy cơ này được tăng cường ở nhóm có sự tiếp xúc với các chất oxy hóa
như: khói thuốc lá (OR = 1,71; 95%CI = 1,02 - 2,87; p = 0,042), lạm dụng
rượu (OR = 2,14; 95%CI = 1,08 - 4,27; p = 0,029), lượng thức ăn ít chất xơ

(OR = 1,68; 95%CI = 1,01 - 2,79, p = 0,04) [45].
1.3. PCR
1.3.1. Khái niệm và lịch sử phát triển của kỹ thuật PCR
PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction được dịch là chuỗi
trùng hợp hay phản ứng khuếch đại chuỗi gen. PCR là một kỹ thuật nhằm
khuếch đại một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật như E.Coli hay
nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau, như xác định bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn
đoán các bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống [46].