Tổng quan cây An Xoa-cấu trúc -đặc tính vật lý chữa ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU
Tên đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT TẾ BÀO UNG THƯ

CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC TỪ THÂN CÂY AN XOA
(HELICTERES HIRSUTA. LOUR) TỈNH BÌNH PHƯỚC

Họ và tên

: LƯƠNG ÁNH HỒNG

Khóa

: 2016-2018

Chuyên nghành: KỸ THUẬT HÓA HỌC
Mã nghành

: 60520301

TP Hồ Chí Minh - Tháng 07/2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU

Tên đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT TẾ BÀO UNG THƯ

CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC TỪ THÂN CÂY AN XOA
(HELICTERES HIRSUTA. LOUR) TỈNH BÌNH PHƯỚC

CBHD

: TS. Hoàng Minh Hảo
TS. Mai Huỳnh Cang

HVTH

: Lương Ánh Hồng

Khóa

: 2016 – 2018

Chuyên nghành : KỸ THUẬT HÓA HỌC

TP Hồ Chí Minh - Tháng 07/2018


MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC BẢNG

4

DANH SÁCH CÁC HÌNH

5

Chương 1: MỞ ĐẦU

6

1.1 Đặt vấn đề

6

1.2 Mục đích đề tài

7

1.3 Nội dung đề tài

7

1.4 Kế hoạch công việc

7

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

9

2.1 Tổng quan về cây An Xoa

9

2. 1.1 Mô tả chung:

9

2.1.2 Dược tính học

11

2.1.3 Thành phần hóa học

11

2.2 Các kết quả nghiên cứu đã có

11

2.2.1 Cytotoxi Lignans từ thân cây An Xoa thu tại Indonesia.

11

2.2.2 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào HEP-G2 của cây
An Xoa (Helicteres hirsute L.)
12
2.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào

14

2.4 Phương pháp phân lập chất

15

2.4.1 Sắc ký cột

15

2.4.1.1Cơ sở lý thuyết

15

2.4.1.2 Hóa chất và dụng cụ

16

2.4.1.3 Cách tiến hành

16

2.4.2 Sắc ký lớp mỏng

18

2.4.2.1 Cơ sở lý thuyết

18

2.4.2.2 Hóa chất và dụng cụ

18

2.4.2.3 Cách tiến hành

18

2.4.2.4 Sắc ký lớp mỏng điều chế

19

2.4.2.5 Hiện hình các vết sau giải ly

19

2


2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất sau cô lập

20

2.5.1 Phổ hồng ngoại (IR)

20

2.5.2 Phổ NMR

20

2.5.2.1 Phổ 1H-NMR

21

2.5.2.2 Phổ 13C-NMR

21

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

3.1 Hóa chất, thiết bị

22

3.2 Phương pháp nghiên cứu

23

3.2.1 Phương pháp ly trích và cô lập các hợp chất hữu cơ từ thân cây An Xoa 23
3.2.1.1 Điều chế cao etanol thân

23

3.2.1.2 Điều chế các loại cao từ cao etanol thân

23

3.2.1.3 Cô lập các hợp chất trong cao etanol thân

24

Chương 4: THỰC NGHIỆM

25

4.1 Ly trích và cô lập hợp chất từ thân cây An Xoa

25

4.1.1. Xử lý mẫu cây

25

4.1.2 Điều chế cao etanol

25

TÀI LIỆU THAM KHẢO

27

3


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Bảng kết quả khảo sát khả năng chống tế bào ung thư từ cao MeOH thân
cây An Xoa

12

Bảng 2.2: Bảng kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào Hep-G2

(tế bào ung thư) đối với bốn phân đoạn cao khác nhau: petroleum ether (PE),
dichloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH).

13

Sơ đồ 3.1: Qui trình điều chế cao etanol thân của cây Cây An Xoa - Helicteres
hirsuta. Lour

23

Sơ đồ 3.2: Qui trình điều chế các loại cao từ cao etanol (EOH) thân của cây Cây An
Xoa - Helicteres hirsuta. Lour.

24

4


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.2: Cây tổ kén hoa trắng (tên khoa học: Helicteres viscida Blume)...............9
Hình 2.5: Cây tổ kén tròn (tên khoa học: Helicteres isora L.)................................10
Hình 2.3: Cây tổ kén không lông (tên khoa học: Helicteres glabriuscula Wall.)....10
Hình 2.6: Cây An Xoa (Helicteres hirsuta Lour.)...................................................10
Hình 2.4: Cây tổ kén lá mác (tên khoa học: Helicteres lanceolata DC.)................10
Hình 2.7: Các lignans tách được từ cây an xoa thu tại Indonesia............................11
Hình 2.8: Cấu trúc hợp chất HD09 (stigmasterol)..................................................13
Hình 2.9: Cấu trúc của hợp chất HD02 (lupeol).....................................................13
Hình 2.10: Cấu trúc của hợp chất HD08 (apigenin)................................................14
Hình 2.11: Cấu trúc của hợp chất HD01 (tiliroside)...............................................14
Hình 4.1: Kết quả SKLM cao etanol thân cây An Xoa...........................................25

5


Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, bên cạnh sự phát triển kinh tế xã hội nhanh đến chóng mặt là sự phát
sinh thêm những căn bệnh nguy hiểm. Trong đó, ung thư là một trong những căn
bệnh nguy hiểm và việc chữa trị cực kỳ khó khăn, hầu như chưa có Phương thuốc
nào điều trị hoàn toàn. Nhờ vào sự phát triển của y học sinh học phân tử mà người
ta biết rõ bệnh ung thư do nhiều nguyên nhân gây nên. Một tác nhân gây ung thư có
thể gây ra một số loại ung thư và ngược lại 1 loại ung thư có thể do nhiều nguyên
nhân khác nhau gây ra. Ung thư xảy ra do sự đột biến trong DNA, làm tế bào tăng
sinh vô hạn độ, vô tổ chức, không tuân theo các cơ chế kiểm soát về phát triển cơ
thể. Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà
sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng trơ với các tín hiệu chết
theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis).
Tại Việt Nam, dân gian và những bệnh nhân tế bào ung thư đang truyền tai
nhau một cây thuốc dại có khả năng chữa trị bệnh ung thư mang tên An Xoa. Một
loài cây mọc dại tại các khu vực cận đồi, đất khô như Bình Phước, Lâm Đồng…
Tuy nhiên, cho tới hiện tại vẫn chưa có một nghiên cứu cụ thể nào xác minh được
dược tính học của loài cây này và khả năng chữa bệnh tế bào ung thư như dân gian
truyền miệng. Người bệnh thì vẫn cứ cầu trực vào những bài thuốc dân gian với hy
vọng mong manh là con đường duy nhất họ có thể sống.
Vậy cây An Xoa có thực sự chữa được tế bào ung thư như dân gian truyền
miệng. Và thành phần mang hoạt tính chữa bệnh của cây An Xoa là gì? Chúng ta có
thể tách được hoạt tính này hay không để có một hướng đi điều chế thuốc cho căn
bệnh tế bào ung thư trong tương lai? Chính vì những câu hỏi trên mà nhóm chúng
tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “ Tách chiết và xác định thành phần hóa học trong
cây An Xoa (Helicteres hirsuta Lour) góp phần xác minh khả năng chống ung thư

của thành phần cây An Xoa.

6


1.2 Mục đích đề tài
Tách chiết các hợp chất hóa học có trong cây An Xoa.
Xác định cấu trúc các hợp chất hóa học tách được.
Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các phân đoạn cao và các hợp chất tinh khiết
trên tế bào ung thư.
1.3 Nội dung đề tài
Khảo sát quy trình trích ly hợp chất hóa học từ cây An Xoa.
Cô lập chất hóa học thu được từ cao An Xoa.
Xác định công thức và cấu trúc hợp chất hóa học cô lập từ cây An Xoa.
Khảo sát hoạt tính sinh học các phân đoạn cao và các hợp chất hóa học cô lập
từ cây An Xoa trên tế bào ung thư.
1.4 Kế hoạch công việc
STT
01

Nội dung công việc
Đọc tài liệu và định hướng
Viết đề cương NCKH, khảo sát nguyên
liệu

Thời gian
Tháng 7/2018

02

Làm thí nghiệm điều chế cao etanol

Tháng 8/2018

03

Điều chế các loại cao từ cao etanol

04

Cô lập các hợp chất hữu cơ

Tháng 9/2018
Từ tháng 10/2018 đến
tháng 1/2019

05

Thử hoạt tính sinh học và chụp các loại
phổ của các hợp chất được cô lập

Tháng 2/2019

06

Giải đoán cấu trúc và viết luận văn

Từ tháng 3/2019 đến tháng
4/2019

 Địa điểm làm đề tài nghiên cứu:
Phòng thí nghiệm BM CNHH, TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM TP. HCM.
Và phòng thí nghiệm KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM,
TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT.
3.2. Dự kiến kinh phí

7


STT

MỤC CẦN KINH PHÍ

Giá (vnd)

01

Các hóa chất liên quan
Chụp các loại phổ, thử hoạt tính
sinh học
Dụng cụ thiết bị

Khoảng 5 triệu

Tổng

12 triệu

02
03

8

5 triệu
2 triệu


Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây An Xoa
Tên khoa học: Helicteres hirsuta Lour.
Tên gọi ở Việt Nam: Dó lông, tổ kén cái, cây an xoa.
Họ: Trôm – Sterculiaceae
Một số loại cây cùng họ: Tổ kén (tên khoa học: Helicteres angustifolia L.), tổ
kén hoa trắng (tên khoa học: Helicteres viscida Blume), Tổ kén không lông (tên
khoa học: Helicteres glabriuscula Wall.), tổ kén lá mác (tên khoa học: Helicteres
lanceolata DC.), tổ kén tròn (tên khoa học: Helicteres isora L.), ...
2. 1.1 Mô tả chung:
Thân: Cây bụi cao 1 - 3m; nhánh hình trụ, có lông.
Lá: Hình trái xoan dài 5 - 17cm, rộng 2.5 - 7.5cm, gốc cụt hay hình tim, đầu
nhọn thành mũi nhọn, mép có răng không đều, mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ
đầy lông hình sao; gân gốc 5, cuống lá dài từ 0.8 - 4cm; lá kèm hình dải, có lông dễ
rụng.

Hoa: cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá. Hoa màu
hồng hay đỏ; cuống hoa có các khớp và có lá bắc dễ rụng; đài hoa hình ống phủ
lông hình sao màu đo đỏ, chia 5 răng; cánh hoa 5; cuống bộ nhị có vân đỏ; nhị 10,
nhị lép bằng chỉ nhị; bầu có nhiều gợn, chứa 25 - 30 màu trong mỗi lá noãn. Quả
nang hình trụ nhọn; hạt nhiều hình lăng trụ. Ra
hoa2.2:
kết quả

đến mùa
Hình
Câytừtổmùa
kénhạhoa
trắngđông
Hình Nơi
2.1: sống
Cây và
tổ thu
kénhái:
(Helicteres
cây phân bố ở(tên
namkhoa
Trunghọc:
Quốc
và nhiềuviscida
nước Nam
Helicteres
angustifolia
L.) ta, cây an xoa mọc nhiều Blume)
Châu
Á. Ở nước
ở Bình Phước, Lâm Đồng, Hòa Bình ,
Hình 2.4: Cây tổ kén lá mác (tên
Hình 2.3: Cây tổ kén không lông
Điện Biên, Sơn La, Phú Thọ,...
khoa học: Helicteres lanceolata
(tên
khoa
học:

Helicteres
DC.)

glabriuscula Wall.)
9


2.1.2 Dược tính học
Cây An Xoa thường mọc dại tại một số vùng đất cao.
Hiện nay chưa có tài liệu nào công bố về dược tính của cây này.
2.1.3 Thành phần hóa học
Trên thế giới đã có nghiên cứu về thành phần hóa học cây An Xoa. Tuy
nhiên, cây An Xoa ở Việt Nam còn rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học.
2.2 Các kết quả nghiên cứu đã có
2.2.1 Cytotoxi Lignans từ thân cây An Xoa thu tại Indonesia.
Theo một nghiên cứu ở Indonesia [1] thì thành phần trong cây An Xoa có
khả năng chống lại các tế bào ưng thư, đặc biệt là tế bào ung thư.
Nghiên cứu chỉ ra 6 hợp chất tách được từ cao chiết thân cây An Xoa như
sau:

1:
2:
3:

R1
OMe
OMe
OMe

R2

H
OMe
OMe

R3
H
H
OMe

R4
OMe
OMe
OMe

1:
2:
3:

R1
Feruloyl
Feruloyl
H

R2
feruloyl
H
H

Hình 2.7: Các lignans tách được từ cây an xoa thu tại Indonesia
Nhóm nghiên cứu này khảo sát khả năng chống lại tế bào ung thư từ cao

MeOH thân cây An Xoa với 4 loại tế bào ung thư: Lu1 (tế bào ung thư biểu mô phổi
ở người), LNCaP (tế bào ung thư tuyến tiền liệt), MCF-7 (ung thư vú), HUVEC (tế
bào nội mô tĩnh mạch).

10


Bảng 2.1: Bảng kết quả khảo sát khả năng chống tế bào ung thư từ cao MeOH
thân cây An Xoa

2.2.2 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào HEP-G2 của cây An
Xoa (Helicteres hirsute L.)
Nhóm tác giả Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước được đăng trên tạp
chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ (2016) [2] đã chỉ ra thành phần trong cao
chiết từ thân, lá và hoa cây An Xoa thu tại Hòn Sơn thuộc xã Lại Sơn, huyện Kiên
Hải, tỉnh Kiên Giang. Nghiên cứu đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế
bào Hep-G2 (tế bào ung thư) đối với bốn phân đoạn cao khác nhau: petroleum ether
(PE), dichloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH). Kết quả có hai
cao có biểu hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư) là cao
PE và cao DC. Từ cao DC đã cô lập được 4 hợp chất: stigmasterol, lupeol, apigenin
và tiliroside. Cấu trúc hóa học các hợp chất được xác định bằng các phương pháp
phổ (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT).

11


Bảng 2.2: Bảng kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào HepG2 (tế bào ung thư) đối với bốn phân đoạn cao khác nhau: petroleum ether
(PE), dichloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH).

Hình 2.8: Cấu trúc hợp chất HD09 (stigmasterol)

Stigmasterol được sử dụng trong phòng ngừa khối u và kháng oxy hóa.
Ngoài ra, stigmasterol còn có tiềm năng chữa viêm xương khớp [2].

Hình 2.9: Cấu trúc của hợp chất HD02 (lupeol)

12


Lupeol có thể tiêu diệt và ngăn chặn sự lan truyền của tế bào ung thư. Hợp
chất lupeol có khả năng gây độc tế bào với dòng tế bào tế bào ung thư (Hep-G2)
[2].

Hình 2.10: Cấu trúc của hợp chất HD08 (apigenin)
Apigenin có khả năng chống viêm, chống oxy hóa và ngăn ngừa ung thư [2].

Hình 2.11: Cấu trúc của hợp chất HD01 (tiliroside)
Tiliroside là hợp chất tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm, đã
được thử nghiệm in vitro và in vivo cho kết quả tốt [2].
2.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính sinh học của các hợp chất tinh khiết cô lập từ thân cây An Xoa trên
tế bào ung thư được thực hiện tại Khoa Khoa học, Đại học Y Dược TP. HCM. Tiến

13


hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên tế bào ung thư bằng Phương pháp
Sulforhodamine B (SRB). Môi trường McCoy’s 5A từ Gibco BRL (Đan Mạch) và
huyết thanh (FBS) từ Seromed (Đức). Chất chuẩn resveratrol, dimetylsulfoxid
(DMSO), Sulforhodamine B (SRB), acid tricloroacetic (TCA) và propidium iodua
được mua từ Sigma-Aldrich (Đan Mạch). Tris-base và acid acetic được mua từ

hang Merck.
Tế bào ung thư được nuôi cấy trong bình Roux đạt độ phủ 80-90%. Huyền
phù để tách lớp đơn tế bào. Đếm và phủ tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 10000
tế bào/ giếng, tiến hành ủ trong 24h, tại 37 oC, 5% CO2. Thêm các chất cần thử với
nồng độ khác nhau (chất chứng dương là resveratrol), tiếp tục ủ trong 48h, tại 37 oC,
5% CO2. Cố đinh tế bào bằng TCA 50%, đặt vào tủ 4 oC trong 1h sau đó rửa 5 lần
với nước. Nhuộm SRB trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa 4 lần với acid
acetic 1%, hòa tan SRB đã gắn bằng 10nM Tris-base, lắc trên máy 10 phút, đọc kết
quả ở bước song 492 và 620 nm. Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.

14