Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu nhập tại vùng biển miền Trung - Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

CAO ĐỨC DANH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP
TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261, G248 THU
THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2019


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về sinh
học lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động thực vật
trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường biển đã được
biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, như một kho
dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá. Đặc thù môi trường sống
khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với
những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá. Việc nghiên

cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên thế giới đã thu được
nhiều thành tựu đáng kể. Trong số đó có rất nhiều các hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa
học và hoạt tính sinh học lý thú. Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được
thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Việt Nam nằm trong khu vực Thái
Bình Dương (có chủ quyền biển với diện tích khoảng 1.000.000 km2) có hệ sinh vật
biển đa dạng và phong phú, có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển. Chính phủ Việt
Nam đã có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên nhiên và
nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên từ biển. Tuy nhiên nghiên cứu các hợp chất thứ cấp
từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu
đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn. Các bệnh
truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của con người và động vật. Khoảng nửa
sau thế kỷ 19, người ta đã phát hiện vi sinh vật chính là nguyên nhân gây ra các bệnh
truyền nhiễm. Do đó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi sinh vật gây bệnh đã được phát
triển thành liệu pháp điều trị chính. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra
Penicillin – hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh và được Abraham, Chain, Florey
tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào năm 1941. Thuốc kháng sinh
Penicillin trở nên nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều người trong chiến tranh thế giới II. Kể
từ đó, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí hàng đầu trong
lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày
càng tăng và lượng sản xuất ngày càng lớn. Hiện nay, đã có thêm nhiều loại kháng sinh
được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm phần lớn trong đó có
các xạ khuẩn biển. Nhưng càng ngày càng nhiều các vi sinh vật gây bệnh kháng với các
kháng sinh hiện có. Do vậy, rất cần phải tiếp tục nghiên cứu, tìm kiếm, phát hiện các


2

loại kháng sinh mới, các hoạt chất có tính kháng lao, chống ung thư. Vì vậy chúng tôi
thực hiện luận án này với tên đề tài: ‘‘Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng
sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246,

G261, G248 thu thập tại vùng biển miền Trung - Việt Nam”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Phát hiện các hợp chất có hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào từ nguồn vi
sinh vật đáy biển miền Trung của Việt Nam cụ thể:
- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi
cấy của 3 chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam.
- Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của
các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng
các hợp chất này.
3. Các nội dung nghiên cứu của luận án
- Tổng quan tài liệu về các nghiên cứu trước đây về các hợp chất thứ cấp cũng như hoạt
tính sinh học từ các chủng vi sinh vật biển.
- Tìm các quy trình xử lý dịch nuôi cấy để tạo dịch chiết. Tinh chế các cặn dịch chiết
này trên sắc ký cột để thu được các phân đoạn.
- Tinh chế các chất có trong các phân đoạn để thu được các hợp chất sạch.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch phân lập được.
- Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các chất phân lập được.
- Thử hoạt tính chống ung thư in vitro đối với một số dòng tế bào ung thư như KB,
MCF-7, Hep-G2, Lu-1 của các hợp chất sạch phân lập được.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Sự phân bố và tính đa dạng của vi sinh vật biển

1.2.

Xạ khuẩn và sự hình thành các hợp chất thứ cấp từ xạ khuẩn

1.3. Các họ xạ khuẩn biển thƣờng gặp

1.4. Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.4.1.1. Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh
1.4.1.2. Các hợp chất có hoạt tính kháng lao
1.4.1.3. Các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước


3

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
2.1.3. Thiết bị
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu
2.2.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn biển
2.2.3. Phương pháp làm sạch các chủng bằng que cấy vòng
2.2.4. Phương pháp giữ giống xạ khuẩn sau phân lập
2.2.5. Phương pháp hoạt hoá và nuôi cấy
2.2.6. Phương pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy để sàng lọc hoạt tính sinh học
2.2.7. Phương pháp định danh xạ khuẩn
2.2.8. Phương pháp sinh khối lượng lớn
2.2.9. Phương pháp phân lập các hợp chất thứ cấp.
2.2.10. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch tách chiết được
2.2.11. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
2.2.12. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
2.2.13. Phương pháp thử hoạt tính kháng lao.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. Kết quả thu mẫu
Đã thu thập được 25 mẫu từ các vùng biển miền trung Việt Nam, cụ thể:
- Ở vùng biển Thanh Hóa thu được 2 mẫu trầm tích.
- Ở vùng biển Quảng Bình thu được 2 mẫu trầm tích, 1 mẫu hải miên, 2 mẫu rong, 1
mẫu san hô. Ở vùng biển Quảng Trị thu được 2 mẫu trầm tích, 1 mẫu hải miên, 1 mẫu
rong.
- Ở vùng biển của bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng thu được 1 mẫu trầm tích, 2 mẫu hải
miên, 1 mẫu rong, 1 mẫu da gai, 1 mẫu có bao.
- Ở vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam thu được 3 mẫu trầm tích, 1 mẫu da gai, 1
mẫu thân mềm, 1 mẫu thỏ biển, 1 mẫu đuôi rắn.


4

3.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn
- Từ 25 mẫu thu thập được ở các vùng biển miền Trung Việt Nam, đã phân lập được 32
chủng xạ khuẩn có hình thái và màu sắc khuẩn lạc khác nhau.
- Từ 12 mẫu thu thập ở vùng biển Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị đã phân lập
được 12 chủng xạ khuẩn.
- Từ 13 mẫu thu thập ở vùng biển Đà Nẵng và Quảng Nam, đã phân lập được 20 chủng
xạ khuẩn.
3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu đƣợc.
Kết quả kháng VSVKĐ: 29/32 chủng có hoạt tính (xem chi tiết bảng 3.1).
Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng lao được thực hiện tại trường Đại học UIC đối
với chủng Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Kết quả cho thấy 21/32 chủng thể hiện
hoạt tính kháng lao, trong đó 1 chủng thể hiện hoạt tính rất tốt với giá trị % ức chế >
90%, 7 chủng chủng thể hiện hoạt tính tốt với giá trị % ức chế > 50% (xem chi tiết ở
bảng 3.2).
Cặn thô của dịch chiết nuôi cấy của 32 chủng nghiên cứu được thử hoạt tính gây
độc tế bào với dòng tế bào ung thư ở người (KB - ung thư biểu mô (CCL-17TM). Kết

quả có 19 chủng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB ( xem chi tiết bảng
3.3)
3.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học
3.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu
3.4.2. Nhân gen 16S ARN riboxom
3.4.3. Giải trình tự gen
Trình tự nucleotit đoạn gen 16S ARN riboxom của chủng G246, G261, G248
cho thấy các chủng nghiên cứu đều thuộc chi Streptomyces sp. (xem PLIII.1.4)
3.5. Kết quả sinh khối lƣợng lớn các chủng có hoạt tính sinh học tốt.
Các chủng G246, G261, G248 có hoạt tính sinh học tốt được tiến hành lên men
lượng lớn 50 lít trong điều kiện phù hợp để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.6. Tách chiết và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng
xạ khuẩn Streptomyces sp. G246
3.6.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết
3.6.2. Phân lập các hợp chất từ các cặn chiết


5

Hình 3. 1. Sơ đồ phân lập cặn chiết chủng Streptomyces sp. G246
3.6.3. Thông số vật lí và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ chủng
Streptomyces sp. G246
3.7. Tách chiết và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất thứ cấp từ các chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G261
3.7.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết
3.7.2. Phân lập được từ chủng Streptomyces sp. G261
3.7.3 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất
thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261
3.8. Tách chiết và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất thứ cấp từ các chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G248

3.8.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết
3.8.2. Phân lập các hợp chất từ các cặn chiết


6

Hình 3. 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G261

Hình 3. 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng Streptomyces sp. G248


7

3.8.3. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G248
3.9. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc từ các chủng
xạ khuẩn
3.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSVKĐ của một số hợp chất phân lập được
Trong số 26 chất được phân lập, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng
VSVKĐ. Kết quả có 13 chất có hoạt tính kháng VSV kiểm định, trong đó có nhiều chất có
hoạt tính rất mạnh như G246-2, G248-11, G248-12, G248-9 và nhiều chất có hoạt tính
kháng nấm tốt như G246-6, G261-11, G248-11 (xem chi tiết bảng 3.5).
3.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của một số hợp chất phân lập được
Kết quả thử hoạt tính kháng lao được thực hiện tại trường Đại học UIC. Một số chất
được thử nghiệm hoạt tính kháng lao với Mycobacterium tuberculosis H37Rv, trong đó
G246-1 thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị MIC = 6,00 µg/ml, G248-10 thể hiện hoạt
tính tốt với giá trị MIC = 11,17 µg/ml, còn G248-9 thể hiện hoạt tính yếu với giá trị MIC =
48,02 µg/ml Các chất còn lại không thể hiện hoạt tính tại nồng độ nghiên cứu (50 µg/ml)
(xem chi tiết bảng 3.6).
3.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được

14 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao từ 03 chủng nghiên cứu (G246,
G261 và G248) được thử hoạt tính gây độc tế bào với bốn dòng tế bào ung thư ở người:
KB - ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung
thư vú (HTB – 22TM) và LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM) . Kết quả được trình bày chi tiết
trong bảng 3.5.

Kết quả có 5 hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, trong đó có 4 chất

có hoạt tính với dòng tế bào KB, 5 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào ung thư gan HepG2, 4 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào Lu-1, 4 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào
MCF7 (xem chi tiết bảng 3.7)

CHƢƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Kết quả thu mẫu
Tổng số 25 mẫu bao gồm có: 12 mẫu ở vùng biển Thanh Hóa, Quảng Bình và
Quảng Trị; 13 mẫu ở vùng biển Đà Nẵng và Quảng Nam. Cụ thể có 10 mẫu trầm tích, 4
mẫu rong, 4 mẫu hải miên, 1 mẫu san hô mềm, 2 mẫu da gai và 4 mẫu khác.
4.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn
Từ 25 mẫu thu được đã phân lập được 32 chủng xạ khuẩn có hình thái và màu sắc
khuẩn lạc khác nhau từ mẫu thu thập được (chi tiết được mô tả tại phụ lục PL III.1.2).


8

4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu đƣợc.
- Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định với cặn thô thu được cho thấy 29/32
chủng phân lập có tính kháng các chủng VSVKĐ.
- Kết quả cho thấy 21/32 chủng thể hiện hoạt tính kháng lao.
- Kết quả có 20 chủng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 < 128
µg/ml). Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ, hoạt tính kháng lao cũng
như hoạt tính gây độc tế bào (với dòng KB) trong luận án này tôi lựa chọn 3 chủng

phân lập có hoạt tính tốt nhất để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo (gồm các
chủng xạ khuẩn G246, G261, G248).
4.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học
4.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu
4.4.2. Nhân gen 16S ARN riboxom
4.4.3. Giải trình tự gen xác định tên các chủng xạ khuẩn
Đã xác định được các chủng G246, G261, G248 đều thuộc chi Streptomyces sp.
(Xem chi tiết tại PLIII.1.4)
4.5. Kết quả sinh khối lƣợng lớn các chủng có hoạt tính sinh học tốt.
Đã lên men thành công lượng lớn 50 lít cho các chủng G246, G261, G248 để
tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo.
4.6. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. G246
Từ dịch nuôi cấy của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G246, chúng tôi đã
phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 10 hợp chất, trong đó có 2 hợp chất mới là
G246-1 và G246-2. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp
phổ NMR, MS và so sánh với tài liệu tham khảo, các hợp chất được xác định là
(2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone
lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone

(G246-1),

(G246-2),

(2″S)-5′-

cyclo-(Pro-Gly)

(G246-3), cyclo-(L-Pro-L-Tyr) (G246-4), cyclo-(D-Pro-L-Tyr) (G246-5), cyclo-(ProAla) (G246-6), norharman (G246-7), tryptophan (G246-8), 3-indol carboxylic acid
(G246-9), phenyl alanin (G246-10), trong đó có 2 chất mới là G246-1 và G246-2. Cấu

hình tuyệt đối của 2 hợp chất mới G246-1 và G246-2 được xác định dựa vào phương
pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular
Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09.


9

Hình 4.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-1 đến G246-10
Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất mới.
4.6.1.

Hợp

chất

G246-1:

(2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-

trihydroxylflavanone (hợp chất mới)

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp
chất G246-1 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo.
Hợp chất G246-1 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình màu trắng, độ
quay cực [α]25D = - 28 (c 0,8, MeOH). Phổ khối phân giải cao của hợp chất này cho pic
phân tử proton hóa ở m/z 439,2115 [M+H]+ tính toán lý thuyết cho công thức phân tử
C26H31O6 (m/z 439,2121), kết hợp với phổ

13

C-NMR có thể xác định được công thức

phân tử của G246-1 là C26H30O6. Phổ IR của G246-1 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho
nhóm hydroxyl (νmax 3299 cm-1) và carbonyl (νmax 1670 cm-1).
Trên phổ 1H-NMR, ở vùng aromatic có sự xuất hiện tín hiệu của hệ ABX ở δH 6,35
(1H, d, J = 2,0 Hz, H-3′), 6,37 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-5′), 7,31 (1H, d, J = 8,5 Hz, H6′) và một proton singlet ở δH 6,13 (1H, H-8). Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR có tín hiệu của 3
proton dạng đỉnh double doublet ở H 2,71 (1H, dd, J = 2,5; 16,5, H-3ax), 2,89 (1H, dd, J =
13,0; 16,5, H-3eq), 5,56 (1H, dd, J = 2,5; 12,5, H-2) là các tín hiệu đặc trưng cho vị trí


10

nhóm methylene CH2-3 và proton H-2 của một flavanone. Thêm vào đó là các tín hiệu
cộng hưởng của một nhóm methoxy ở H 3,83, ba nhóm methyl singlet ở H 1,97, 1,98 và
1,65, 3 proton olefinic ở H 4,98, 4,54 và 4,59 và các proton thuộc vùng aliphatic.
Phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT, HSQC cho biết phân tử của G246-1 có
26 nguyên tử cacbon bao gồm một nhóm ketone ở C 193,9, năm nhóm methine sp2 ở C
93,4; 103,4; 103,7; 128,5; 132,0, một nhóm methylene sp2 ở C 111,2, hai nhóm methine
sp3 ở C 48,2; 75,5, ba nhóm methylene sp3 ở C 28,2; 32,4; 48,2, ba nhóm methyl ở C
17,8; 19,2; 25,9, một nhóm methoxy ở C 55,9 và 10 cacbon sp2 không liên kết trực tiếp
với hydro. Bên cạnh hệ aromatic ABX, hai hệ tương tác spin-spin cũng được ghi nhận trên
phổ COSY: H-2/CH2-3 (I) và CH2-1″/H-2″/CH2-3″/H-4″ (II). Độ chuyển dịch hóa học của
các nguyên tử cacbon ở C 75,5 (C-2), 156,6 (C-2′), 159,5 (C-4′), 164,9 (C-5), 161,9 (C-7)
và 164,9 (C-9) gợi ý đến chúng được liên kết với nguyên tử oxy.
Trên phổ HMBC cho thấy tương tác giữa proton của nhóm CH3-10″ và CH2-9″ với
C-2″ và tương tác giữa proton của nhóm CH2-1″ với C-8″ chứng tỏ sự kết nối của C-2″
của hệ spin II với nhóm isopropenyl. Tiếp theo, tương tác HMBC của H-4″ với C-6″ và C7″, tương tác của CH2-3″ với C-5″ chỉ ra sự có mặt của nhóm lavandulyl trong cấu trúc của
G246-1. Sự có mặt của vòng B được khẳng định bằng tương tác của H-3′ với C-1′, C-2′, C4′ và C-5′. Tương tự, vòng A được thiết lập dựa trên tương tác HMBC của H-8 với C-6, C7, C-9 và C-10. Các đặc trưng về phổ của hệ spin I và tương tác của các proton trong hệ
spin này với nhóm carbonyl (C 193,9) trên phổ HMBC chứng tỏ G246-1 là một
flavanone. Sự kết nối của nhóm lavandulyl với vòng A ở C-6 được chứng minh dựa trên

tương tác HMBC giữa proton của CH2-1″ với C-5, C-6 và C-7. Cuối cùng, tương tác trên
phổ HMBC của proton thuộc nhóm methoxy ở H 3,85 với C-7(C 161,9) và tương tác
NOESY giữa nhóm 7-OCH3 với H-8 cho phép xác định vị trí của nhóm methoxy tại C-7.
Như vậy từ các dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của hợp chất G246-1 và chất tham khảo
sophorflavanone G [89] xác định được G246-1 là 6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′trihydroxylflavanone.
Phổ CD của G246-1 cho hiệu ứng Cotton dương tại 336 nm (Δ +2,98 mdeg) và
hiệu ứng Cotton âm tại 292 nm (Δ - 9,08 mdeg), cho phép xác định cấu hình tuyệt đối tại
C-2 là 2S [89]. Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của G246-1 được xác định dựa vào
phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular
Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09. Tính toán lý thuyết cho 2 đồng phân 2S,2″S-


11

và 2S,2″R- cho phép xác định cấu hình 2S,2″S của hợp chất G246-1 phù hợp với mô hình
tính toán (xem hình 4.10). Từ các phân tích trên phổ khối, phổ IR, 1D và 2D NMR, phổ
CD kết hợp với phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECDElectronic Circular Dichroism) đã thiết lập nên cấu trúc của G246-1, đây là hợp chất mới
được xác định là (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone.

Bảng 4. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-1 và hợp chất tham khảo
Vị trí
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1′
2′
3′
4′
5′
6′
1′′
2′′
3′′
4′′
5′′
6′′
7′′
8′′
9′′
10′′
OMe

C#,b

 Ca

75,3
42,8

75,5
48,2

198,2
163,0

96,2
165,3
107,8
162,1
103,2
117,9
156,1
103,4
159,4
107,8
128,6
27,7
47,8
31,9
124,5
131,6
17,9
25,8
149,1
111,2

193,9
164,9
109,6
161,9
93,4
164,9
105,7
118,5
156,6

103,4
159,5
107,6
128,5
28,2
48,2
32,4
124,8
132,0
17,8
25,9
149,8
111,2

19,1

19,2
55,9

H (độ bội, J, Hz)
5,56 (dd, 2,5; 13,0)
2,89 (dd, 13,0; 16,5)
2,71 (dd, 2,5; 16,5)

6,13 (s)

6,35 (d, 2,0)
6,37 (dd, 2,0; 8,5)
7,31 (d, 8,5)
2,64 (m)

2,52 (m)
2,02 (m)
4,98 (t, 6,5)
1,97 (s)
1,98 (s)
4,54 (s)
4,59 (s)
1,65 (s)
3,84 (s)

a) đo trong CD3OD; b) đo trong CD3COCD3; δC# số liệu của hợp chất sophoraflavanone G [89]


12

4.6.2.
Hợp
chất
G246-2:
tetrahydroxylchalcone (hợp chất mới)

(2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′-

Hình 4. 2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp
chất G246-2 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo G246-1
Hợp chất G246-2 thu được dưới dạng chất rắn vô định hình màu trắng, độ quay
cực [α]25D = -8,6 (c 0,25, CH2Cl2). Phổ khối phân giải cao chỉ ra pic ion giả phân tử ở
m/z 439,2115 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C26H31O6 với m/z
439,2121), kết hợp với các dữ liệu trên phổ

13

C-NMR gợi ý đến công thức phân tử

C26H30O6 cho hợp chất G246-2. So sánh các dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất này với
dữ liệu phổ NMR của G246-1 cho thấy hợp chất G246-2 cũng có nhóm lavandulyl và
hệ vòng A, B như của hợp chất G246-1. Sự khác nhau giữa hai hợp chất này là hệ
CH=CH thay vì các tín hiệu của hệ spin thứ nhất (CH-2/CH2-3) của G246-1. Các phân
tích trên gợi ý đến khung chalcone của G246-2, điều này cũng được khẳng định dựa
trên tương tác của H- với C-2, C-6 và C-γ trên phổ HMBC của G246-2. Nhóm
lavandulyl được gắn vào khung chalcone ở vị trí C-5′ dựa trên tương tác HMBC của H1″ với C-5′ (δC 107,4), C-6′ (δC 165,8), C4′(δC 161,1) và tương tác HMBC của H-2″ với
C-5′ (δC 107,4), C-8″(δC 150,5), C-9″(δC 110,5). Tương tự, tương tác HMBC của proton
thuộc nhóm methoxy ở H 3,85 với C-4′ (δC 161,0) xác định vị trí của nhóm methoxy ở
C-4′ của khung chalcone. Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của hợp chất G246-2 được
xác định dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD
- Electronic Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09 tương tự như hợp
chất G246-1. Tính toán lý thuyết cho 2 đồng phân 2″S- và 2″R- cho phép xác định cấu
hình 2″S của hợp chất G246-2 phù hợp với mô hình tính toán. Kết hợp phân tích các
phổ và so sánh với hợp chất G246-1 đã xác định được G246-2 là (2″S)-5′-lavandulyl4′-methoxy-2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone, đây là hợp chất mới.


13

Bảng 4. 2. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-2 và chất so sánh G246-1
C#

C#,b

C

Ca

H (độ bội, J, Hz)

1′

118,5

1

116,5

2′

156,6

2

156,9

3′

103,4

3

106,2

4′

159.5

4

159,1

5′

107,6

5

109,1

6,43 (br d, 8,0)

6′

128,5

6

131,0

7,39 (d, 8,0)

10

105,7

1′

106,2

9

164,9

2′

161,0

8

93,4

3′

90,9

7

161,9

4′

161,0

6

109,6

5′

107,4

5

164,9

6′

165,8

1′′

28,2

1′′

29,7

6,37 (br,s)

5,92 (s)

2,70 (dd, 6,0; 14,0)
2,71 (dd, 8,0; 14,0)

2′′

48,2

2′′

46,5

2,39 (m)

3′′

32,4

3′′

31,9

2,14 (m)

4′′

124,8

4′′

122,8

5′′

132,0

5′′

132,9

6′′

17,8

6′′

18,0

1,60 (s)

7′′

25,9

7′′

25,8

1,69 (s)

8′′

149,8

8′′

150,5

9′′

111,2

9′′

110,7

10′′

19,2

10′′

20,7

OH-6′

5,11 (t, 6,5)

4,76 (s)/ 4,79 (s)
1,72 (s)
14,46 (s)

OMe

55,9

OMe

55,7

3,85 (s)

3

48,2

α

126,0

7,82 (d, 16,0)

2

75,5

β

137,5

7,96 (d, 16,0)

4

193,9

γ

193,2

a) đo trong CDCl3; b) đo trong CD3OD; δC# số liệu của hợp chất G246-1


14

4.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. G261

Hình 4. 1. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-1 đến G261-13
Từ dịch nuôi cấy của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G261 đã phân lập và
xác định cấu trúc hóa học của 13 hợp chất: norharman (G261-1), 2,3-butanediol (G2612), 1H-pyrrole-2-carboxylic acid (G261-3), 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4carboxylic

acid

(G261-4),

3-hydroxy-4-methoxybenzoic

acid

(G261-5),

2-

acetamidobenzamide (G261-6), phenyl alanin (G261-7), cyclo-(Pro-Gly) (G261-8),

cyclo-(Pro-Ala) (G261-9), cylo-(Pro- Leu) (G261-10), cyclo-(Pro-Tyr) (G261-11),
cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) (G261-12), cyclo-(Leu-Tyr) (G261-13), trong đó có 1 chất
lần đầu phân lập được từ tự nhiên là 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic
acid (G261-4).
Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất
G261-4 là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ thiên nhiên.
4.7.1. Hợp chất G261-4: 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid

Hình 4.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của G261-4


15

Phổ khối ESI-HRMS của G261-4 cho pic ion giả phân tử ở m/z 178,0152 [M-H](tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C8H4NO4 m/z 178,0140). Phổ 1H-NMR thấy
xuất hiện tín hiệu của các proton vòng thơm ở δH 7,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7); 7,23
(1H, dd, J = 8,0; 8,0 Hz, H-6); 7,49 (1H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz, H-5). Phổ 13C-NMR kết
hợp với HSQC cho thấy 3 nhóm methine vòng thơm ở δC 118,1 (C-5); 123,6 (C-7);
126,4 (C-6); và 3 cacbon bậc bốn sp2 ở δC 116,7 (C-4); 144,2 (C-3); 146,5 (C-7a);
Ngoài ra thấy xuất hiện của 1 nhóm cabonyl ở vùng trường thấp gắn với dị tố nitơ ở δC
149,2 và một nhóm cacbonyl ở δC 163,4. Trên phổ HMBC thấy có tương tác xa của
proton H-5 (δH 7,49) với C-4 (δC 116,7); C-3a (δC 144,2) và C=O (δC 163,4) tương tác
của proton H-7 (δH 7,24) với C-7a (δC 146,5), C-6 (δC 123,6). Kết hợp các dữ liệu phổ
và so sánh với tài liệu tham khảo [102] cho phép xác đinh được G261-4 là 2-oxo-2,3dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid. Đây là hợp chất lần đầu phân lập từ tự
nhiên [103].
4.8. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. G248

Hình 4.81. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-1 đến G248-13
Từ dịch chiết nuôi cấy của chủng xạ khuẩn biển Streptomyces sp. G248, bằng
các phương pháp sắc ký và phương pháp phổ MS, 1D-NMR, 2D-NMR đã phân lập và

xác định cấu trúc hóa học của 13 hợp chất ký hiệu từ G248-1 đến G248-13 gồm cyclo


16

(Pro – Leu) (G248-1), cyclo-(Pro-Phe) (G248-2), norharman (G248-3), cyclo-(Pro-Tyr)
(G248-4), cyclo-(Pro-Gly) (G248-5), cyclo-(Pro-Trp) (G248-6), Adenine (G248-7), 2(4-hydroxyphenyl)acetic acid (G248-8), (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′dihydroxylflavanone

(G248-9),

(2S)-6-prenyl-4′-methoxy-5,7-dihydroxylflavanone

G248-10, (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone (G248-11), (2″S)-5′lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone

(G248-12),

(2S,2″S)-6-

lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone (G248-13). Trong đó có 3 hợp chất
mới là G248-9, G248-11, G248-12 thuộc loại hợp chất flavonoids.
Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới
4.8.1.

Hợp

chất

G248-9:

(2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′-

dihydroxylflavanone

Hình 4. 2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp
chất G248-9 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo.
Hợp chất G248-9 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình, màu vàng, độ
quay cực [α]25D –5 (c 0,8, MeOH). Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất này cho pic phân tử
proton hóa ở m/z 453,2270 [M+H]+ (số khối tính toán cho công thức phân tử C27H33O6 là
453,2277), kết hợp với phổ 13C-NMR có thể xác định được công thức phân tử của G248-9
là C27H32O6. Phổ IR của G248-9 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl (νmax
3433 cm-1) và carbonyl (νmax 1648 cm-1).
Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-9 rất giống với hợp chất G246-1, chỉ khác là
thấy xuất hiện thêm 1 nhóm methoxy. Giống như hợp chất G246-1, trên phổ 1H-NMR của
hợp chất G248-9 có tín hiệu của 4 proton aromatic ở δH 6,47 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H5′), 6,49 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3′), 7,38 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6′), 6,12 (1H, s, H-8) và tín
hiệu của 3 proton đặc trưng cho vị trí nhóm methylene CH2-3 và proton H-2 của một
flavanone ở H 2,67 (1H, dd, J = 2,5; 17,0 Hz, H-3ax), 2,89 (1H, dd, J = 13,5; 17,0 Hz, H3eq), 5,55 (1H, dd, J = 2,5; 13,0 Hz, H-2). Ngoài ra, tín hiệu của 1 nhóm lavandulyl và 2
nhóm methoxy cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR (xem bảng 4.18). Phân tích phổ


17
13

C-NMR kết hợp với HSQC cho biết phân tử của G248-9 có 27 cacbon bao gồm một

nhóm ketone (C 193,6), 10 cacbon bậc 4 sp2 ở C 164,7; 109,6; 161,9; 165,4; 105,6;
119,7; 160,1; 132,0; 149,8; 159,0, năm nhóm methine sp2 ở C 93,6; 99,8; 108,1; 128,5;
124,8, một nhóm methylene sp2 ở C 111,2; hai nhóm methine sp3 ở C 48,2; 75,0, ba
nhóm methylene sp3 ở C 28,2; 32,3; 45,4, ba nhóm methyl ở C 17,8; 25,8; 19,1 và hai
nhóm methoxy ở C 55,9. Bên cạnh hệ aromatic ABX, hai hệ tương tác spin-spin cũng
được ghi nhận trên phổ COSY: H-2/CH2-3 (I) và CH2-1″/H-2″/CH2-3″/H-4″ (II). Độ

chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon ở C 75,0 (C-2), 160,1 (C-2′), 159,0 (C-4′),
164,7 (C-5), 161,9 (C-7) và 165,4 (C-9) gợi ý đến chúng được liên kết với nguyên tử oxy.
Trên phổ HMBC, nhìn thấy tín hiệu tương tác giữa các proton thuộc nhóm CH3-10″ và
CH2-9″ với C-2″, tương tác HMBC giữa các proton của nhóm CH2-1″ với C-8″ chứng tỏ
sự kết nối của C-2″ của hệ spin II với nhóm isopropenyl. Tiếp theo, tương tác của H-4″
với C-6″ và C-7″, tương tác của CH2-3″ với C-5″ chỉ ra sự có mặt của nhóm lavandulyl
trong cấu trúc của G248-9. Sự có mặt của vòng B được khẳng định bằng tương tác của H3′ với C-1′, C-2′, C-4′ và C-5′. Tương tự, vòng A được thiết lập dựa trên tương tác HMBC
của H-8 với C-6, C-7, C-9 và C-10. Các đặc trưng về phổ của hệ spin I và tương tác của
các proton trong hệ spin này với nhóm carbonyl (C 198,5) trên phổ HMBC chứng tỏ
G248-9 là một flavanone. Sự kết nối của nhóm lavandulyl với vòng A ở C-6 qua C-6/C1″ được chứng minh dựa trên tương tác HMBC giữa các proton CH2-1″ với C-5, C-6 và C7. Cuối cùng, nhóm methoxy ở H 3,83 tương tác HMBC với C-7(C 161,9), C-8 (C 93,6)
và tương tác ROESY giữa các proton của nhóm methoxy với H-8, điều này xác định vị trí
của nhóm này tại C-7 và nhóm methoxy ở H 3,82 tương tác HMBC với C-4′(C 159,0) và
tương tác ROESY giữa các proton của nhóm methoxy với H-3′, H-5′ giúp ta xác định vị trí
của nhóm này tại C-4′. Từ các dữ liệu phổ MS, 1D, 2D –NMR của G248-9 và so sánh với
chất tham khảo G246-1 có thể khẳng định được cấu trúc của G248-9 là 6-lavandulyl-7,4′dimethoxy-5,2′-dihydroxylflavanone. Phổ CD của G248-9 cho hiệu ứng Cotton dương tại
336 nm (Δ +2,7) và hiệu ứng Cotton âm tại 292 nm (Δ - 8,5), cho phép xác định cấu hình
tuyệt đối tại C-2 là 2S [90]. Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của G248-9 được xác định
dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic
Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09. Tính toán lý thuyết cho 2 đồng phân
2S,2″S- và 2S,2″R- cho phép xác định cấu hình 2S,2″S của hợp chất G248-9 phù hợp với
mô hình tính toán (Hình 4. 66). Từ các phân tích trên HR-ESI-MS, phổ IR, 1D và 2D


18

NMR, phổ CD và ECD đã thiết lập nên cấu trúc của G248-9 là (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′dimethoxy-5,2′-dihydroxylflavanone. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder cho phép kết
luận đây là hợp chất mới.
Bảng 4. 3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-9 và hợp chất tham khảo G246-1
Vị trí

C#,a

Ca

H (độ bội, J, Hz)

2

75,5

75,0

5,55 (dd, 2,5; 13)

3

48,2

45,4

2,67 (dd, 2,5; 17,0)
2,89 (dd, 13,5; 17,0)

4

193,9

193,6

5

164,9

164,7

6

109,6

109,6

7

161,9

161,9

8

93,4

93,6

9

164,9

165,4

10

105,7

105,6

1′

118,5

119,7

2′

156,6

160,1

3′

103,4

99,8

4′

159,5

159,0

5′

107,6

108,1

6,47 (dd, 2,0; 8,5)

6′

128,5

128,5

7,38 (d, 8,5)

1′′

28,2

28,2

2,63 (m)

2′′

48,2

48,2

2,50 (m)

3′′

32,4

32,3

2,02 m

4′′

124,8

124,8

5′′

132,0

132,0

6′′

17,8

17,8

1,48 (s)

7′′

25,9

25,8

1,57 (s)

8′′

149,8

149,8

9′′

111,2

111,2

10′′

19,2

19,1

1,64 (s)

OMe

55,9

55,9

3,83 (s)

55,9

3,82 (s)

OMe
a) đo trong CD3OD;

δC#

6,12 (s)

6,49 (d, 2,0)

4,96 (t, 5,5)

4,52 (s)/ 4,59 (s)

số liệu của hợp chất tham khảo G246-1


19

4.8.2.

Hợp

chất

G248-12:

(2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-

tetrahydroxylchalcone

Hình 4. 3. Cấu trúc hóa học, các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất
G248-12 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo
Hợp chất G248-12 thu được dưới dạng chất rắn vô định hình màu vàng, độ quay
cực [α]25D -1,8 (c 0,54, CH2Cl2). Phổ khối phân giải cao chỉ ra pic ion giả phân tử ở m/z
439,2115 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C26H31O6 là 439,2121),
kết hợp với các dữ liệu trên phổ 13C-NMR gợi ý đến công thức phân tử C26H30O6 cho
hợp chất G248-12. So sánh các dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất G248-12 với dữ liệu
phổ NMR của Kuraridin đã được phân lập từ loài Sophora flavescen [115] cho thấy 2
hợp chất là giống nhau (xem bảng 4.23). Từ các dữ liệu phổ 1D- NMR và 2D-NMR của
hợp chất G248-12 và so sánh với chất tham khảo Kuraridin [115] và G246-2 giúp ta
xác định cấu trúc phẳng của G248-12 là 5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′tetrahydroxylchalcone. Tuy nhiên hai hợp chất có độ quay cực khác nhau nên về mặt
cấu trúc lập thể của hợp chất G248-12 là khác với kuraridin (có độ quay cực [α]25D
−25.5 (c 0,1, MeOH). Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của G248-12 được xác định
dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD Electronic Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09. Tính toán lý thuyết
cho 2 đồng phân 2″S- và 2″R- cho phép xác định cấu hình 2″S của hợp chất G248-12
phù hợp với mô hình tính toán (Hình 4. 76). Kết hợp phân tích các phổ 1D, 2D-NMR
phổ CD và ECD chúng tôi đã xác định được G248-12 là (2″S)-5′-lavandulyl-2′methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder cho phép
kết luận đây là hợp chất mới.


20

Bảng 4. 4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-12 và hợp chất tham khảo
Vị trí
1
2
3
4
5
6
1′
2′
3′
4′
5′
6′
1′′
2′′
3′′
4′′
5′′
6′′
7′′
8′′
9′′
10′′
OMe
α
β
γ

Ca

(G246-2)
116,5
156,9
106,2
159,1
109,1
131,0
106,2
161,0
90,9
161,0
107,4
165,8
29,7
46,5
31,9
122,8
132,9
18,0
25,8
150,5
110,7

*Ca
(Kuraridin)
125,0
160,3
103,7

162,4
108,9
131,6
108,9
164,0
91,6
162,4
116,3
166,6
28,2
48,0
32,4
125,0
131,8
17,9
25,9
149,9
111,1

124,4
160,3
103,7
162,4
109,0
131,6
108,8
164,0
91,6
162,3
116,2

166,6
28,2
48,0
32,4
125,0
131,8
17,9
25,9
149,9
111,1

20,7
55,7
126,0
137,5
193,2

19,0
56,1
125,5
139,8
194,8

19,0
56,0
125,4
139,8
194,7

#

Ca

H (độ bội, J, Hz)

6,37 (d, 2)
6,36 (m)
7,42 (d, 8,0)

6,02 (s)

2,64 (m)
2,57 (m)
2,10 (m)
5,06 (m)
1,58 (s)
1,65 (s)
4,55 (d, 2,5)
4,61 (dd, 2,5; 1)
1,72 (s)
3,91 (s)
7,96 (d, 16,0)
8,02 (d, 16,0)

#

a) đo trong CD3OD; δC, *δC số liệu của hợp chất tham khảo G246-2 và kuraridin [115]

Nhận xét chung về các hợp chất thứ cấp tách chiết từ 3 chủng xạ khuẩn biển
nghiên cứu: Từ 3 chủng xạ khuẩn thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ và hoạt tính gây

độc tế bào bao gồm G246, G261, G248 đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 36
hợp chất. Tuy nhiên có nhiều hợp chất giống nhau nên thực tế chỉ thu được 26 hợp
chất khác nhau. Trong đó có 6 hợp chất thuộc lớp chất flavonoids, 9 hợp chất thuộc
lớp chất dicyclopeptid và 3 hợp chất indol và các hợp chất khác. Các hợp chất mới là
G246-1, G246-2, G248-9, G248-11, G248-12 đều thuộc lớp chất flavonoids.


21

4.9. Biện luận kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc từ
các chủng xạ khuẩn.
4.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSV kiểm định của một số hợp chất
Có 26 hợp chất phân lập được đã được thử hoạt tính đối với 7 chủng VSVKĐ
bao gồm 3 chủng vi khuẩn Gram âm: E. coli ATCC25922, P. aeruginosa ATCC27853,
S. enterica ATCC13076; 3 chủng vi khuẩn Gram dương: E. faecalis ATCC29212, S.
aureus ATCC25923, B. cereus ATCC 13245 và 1 chủng nấm C. albicans ATCC10231.
Kết quả cho thấy 13 hợp chất kháng vi sinh vật kiểm định, trong đó có những hợp chất
có hoạt tính mạnh như hợp chất G246-2, G246-6, G248-12, G248-9 phân lập từ 2
chủng Streptomyces sp. (G246, G248) có trong vùng biển Đà Nẵng, Quảng Nam. Đặc
biệt là 4 hợp chất G246-2, G248-9, G248-11, G248-12 thể hiện hoạt tính mạnh đối
với cả 6 chủng VSVKĐ thử nghiệm, 5 hợp chất mới là G246-1, G246-2, G248-11,
G248-12, G248-9 đều thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ mạnh, như hợp chất G248-11
có hoạt tính kháng VSVKĐ rất đáng quan tâm với giá trị MIC đều là 1 (µg/ml) với 5
chủng VSVKĐ. Riêng hợp chất G248-12 thể hiện hoạt tính mạnh đối với 7 chủng
VSVKĐ. Có 3 chất đều có khả năng ức chế chủng vi khuẩn Gram (-) E. coli, trong số
này hợp chất G248-12 ức chế chủng vi khuẩn Gram (-) E. coli khá mạnh với giá trị
MIC = 4 (µg/ml). Ngoài ra, hợp chất G246-2, G246-6, G248-11, G248-12, G248-9 thể
hiện hoạt tính ức chế nấm khá tốt với giá trị MIC lần lượt là 8, 2, 1, 16, 16 µg/ml. (Xem
bảng 3.5)
4.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của một số hợp chất

Một số hợp chất phân lập được cũng đã được khảo sát hoạt tính kháng lao với vi
khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Tuy nhiên, hầu hết các hợp chất không
thể hiện hoạt tính, ngoại trừ hợp chất G246-1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị
MIC = 6,00 µg/ml, hợp chất G248-9 có hoạt tính yếu với giá trị MIC = 48,02 µg/ml
điều này là do cấu trúc của hai hợp chất G246-1 và G248-9 khác nhau ở vị trí 4' của
vòng B trong khung flavanone, còn hợp chất G248-10 thể hiện hoạt tính tốt với giá trị
MIC = 11,17 µg/ml. Các hợp chất này đều được phân lập từ chủng G246, G248 có
trong vùng biển Đà Nẵng của Việt Nam (xem bảng 3.7).
4.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được
14 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao được phân lập từ 3 chủng
G246, G261, G248 được thử hoạt tính gây độc tế bào đối với 4 dòng tế bào ung thư


22

KB, Lu, Hep-G2 và MCF7. Kết quả có 12 hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, trong
đó có 9 chất có hoạt tính với dòng tế bào KB, 10 hợp chất có hoạt tính với 10 dòng tế
bào ung thư gan Hep-G2, 8 chất với dòng tế bào Lu, 9 chất với dòng tế bào MCF7. Hợp
chất G246-1, G248-10 có hoạt tính khá mạnh đối với dòng tế bào ung thư biểu mô
KB với giá trị IC50 lần lượt là 11,05, 5,65 µM. Hợp chất G246-1, G246-2, G246-10
có hoạt tính mạnh đối với dùng tế bào ung thư gan Hep-G2 với giá trị IC50 lần lượt là
5,18; 6,51; 5,65 µM. Các hợp chất G246-1, G248-10 còn thể hiện hoạt tính gây độc tế
bào mạnh đối với 3 dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, Lu-1 với giá trị IC50 nằm trong
khoảng 5,18 đến 11,05 µM (xem chi tiết ở bảng 3.6)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
* KẾT LUẬN
Các kết quả chính của luận án đạt được là:
1. Đã phân lập được 32 chủng xạ khuẩn từ 25 mẫu thu thập được ở 5 vùng biển
(Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Đà Nẵng, Quảng Nam) và sàng lọc hoạt tính sinh
học của 32 chủng xạ khuẩn phân lập được. Đã lựa chọn được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt

tính tốt nhất để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo, gồm các chủng G246, G248 thu thập
ở bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng, chủng G261 thu thập ở Cù Lao Chàm, Quảng Nam. Đã
định danh 3 chủng (G246, G261, G248) bằng giải trình tự gen 16S rARN và chúng đều
thuộc chi Streptomyces.
2. Đã tiến hành nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 36 hợp chất
từ 3 chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261 và G248 thu được lần lượt là 10, 13 và
13 hợp chất sạch. Trong đó có 5 hợp chất mới khung flavonoid là (2S,2″S)-6-lavandulyl7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone (G246-1),
2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone

(G246-2),

(2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-

(2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′-

dihydroxylflavanone (G248-9), (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone
(G248-11), (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone (G248-12) và
1 hợp chất lần đầu phân lập được từ tự nhiên là 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4carboxylic acid (G261-4).
3. Các hợp chất phân lập được đã được khảo sát hoạt tính sinh học. Trong đó, 4
hợp chất (G246-1, G246-2, G246-4, G246-6) phân lập từ chủng Streptomyces sp. G246,
4 hợp chất (G261-1, G261-4, G261-10, G261-13) phân lập từ chủng Streptomyces sp.


23

G261, 5 hợp chất (G248-2, G248-7, G248-9, G248-11, G248-12) phân lập từ chủng
Streptomyces sp. G248 thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ. Đặc biệt các hợp chất G246-2,
G248-11 có hoạt tính kháng VSVKĐ mạnh. Đối với hoạt tính kháng lao, chỉ có hợp chất
G246-1 thể hiện hoạt tính tốt đối với Mycobacterium tuberculosis H37Rv với giá trị MIC
là 6,00 μg/ml.

4. Ngoài ra, 14 hợp chất đã được đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của 4
dòng tế bào ung thư (KB, Lu-1, Hep-G2 và MCF7). Hợp chất G246-2, G248-10 thể hiện
hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư biểu mô KB với giá trị IC50 lần lượt
là 11,05, 5,65 µM, hợp chất G246-1, G248-10 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tốt đối
với cả 3 dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, Lu-1 với giá trị IC50 nằm trong khoảng 5,65
đến 11,05 µM.
* KIẾN NGHỊ
- Cần mở rộng nghiên cứu tại các khu vực biển khác của nước ta nhằm phát hiện
các chủng vi sinh vật biển có khả năng sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học cao,
nhằm nghiên cứu ứng dụng. Đồng thời cần tiếp tục nghiên cứu các chủng xạ khuẩn đã
phân lập được, cũng như điều kiện lên men nhằm tìm kiếm các chất mới có hoạt tính
kháng vi sinh vật kiểm định, kháng lao và gây độc tế bào mà trong khuôn khổ luận án
này chưa có điều kiện nghiên cứu.
- Cần có các nghiên cứu tiếp theo đối với các hợp chất có hoạt tính kháng
VSVKĐ, kháng lao và hoạt tính gây độc tế bào mạnh như hợp chất G246-1, G246-2,
G248-11 có thế tiếp tục thử hoạt tính in vitro sâu hơn, nghiên cứu cơ chế tác dụng.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Từ 25 mẫu vật thu thập tại một số vùng biển miền Trung, Việt Nam, đã nghiên cứu có
hệ thống về phân lập, nuôi cấy và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học,
kết quả: 29/32 chủng kháng vi sinh vật kiểm định, 21/32 chủng kháng lao, 20/32 chủng
có hoạt tính gây độc tế bào KB.
- Đã lựa chọn được 3 chủng xạ khuẩn (G246, G261, G248) có hoạt tính sinh học tốt,
xác định tên khoa học và lên men lượng lớn (50 lít) để thực hiện các nghiên cứu tiếp
theo.
- Đã phân lập được 5 hợp chất mới là (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′trihydroxylflavanone

(G246-1),

(2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′-

24

tetrahydroxylchalcone

(G246-2),

(2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′-

dihydroxylflavanone (G248-9), (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone
(G248-11), (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone (G248-12)
và có 1 chất lần đầu phân lập được từ tự nhiên là 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4carboxylic acid (G261-4).
- Các hợp chất mới phân lập đều có hoạt tính sinh học tốt. Đặc biệt các hợp chất
G246-2, G248-11 có hoạt tính kháng VSVKĐ rất mạnh. Hợp chất G246-1 thể hiện
hoạt tính rất tốt đối với Mycobacterium tuberculosis H37Rv với giá trị MIC là 6,00
μg/ml. Hợp chất G246-1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tốt đối với 3 dòng tế bào ung
thư KB, Hep-G2, Lu-1 với giá trị IC50 nằm trong khoảng 5,18 đến 11,05 µM.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Duc Danh Cao, Thi Quynh Do, Huong Doan Thi Mai, Quyen Vu Thi, Hong Minh
Le Thi, Dang Thach Tran, Van Minh Chau, Cong Thung Do and Van Cuong Pham,
Antimicrobial Lavandulated Flavonoids from a Sponge-Derived Actinomycete, Natural
Product Research, 2018, doi: 10.1080/14786419.2018.1538219 (Online).
2. Duc Danh Cao, Thi Thanh Van Trinh, Huong Doan Thi Mai, Van Nam Vu, Hong
Minh Le, Quyen Vu Thi, Mai Anh Nguyen, Thu Trang Duong, Dang Thach Tran, Van
Minh Chau, Rui Ma, Gauri Shetye, Sanghyun Cho, Brian T. Murphy and Van Cuong
Pham, Antimicrobial Lavandulylated Flavonoids from a Sponge-Derived Streptomyces
sp.

G248

in

East

Vietnam

Sea,

Marine

Drugs,

2019,

17(9),

529-542.

doi:10.3390/md17090529.

3. Cao Duc Danh, Cao Duc Tuan, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Doan Thi Mai
Huong, Pham Van Cuong, Chau Van Minh, Le Thi Hong Minh, Identification and
antimicrobial activity of actinomycetes strain isolated from marine samples in the
coastal area of Thanh Hoa – Quang Binh – Quang Tri, Vietnam Journal of Science and
Technology, 2018, 56 (4), 424-433.
4. Cao Duc Danh, Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Tran Dang Thach, Nguyen Mai
Anh, Le Thi Hong Minh, Tran Tuan Anh, Pham Van Cuong, Cyclopeptides from
marine actinomycete Streptomyces sp. G261, Vietnam Journal of Chemistry, 2018,
56(5), 570-573.