Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (curcuma zedoaria roscoe) tt

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng
(Zingiberaceae), từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền của
nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các bệnh về da như
các vết thương và các vết lở loét, cũng như sự bất thường của chu kỳ
kinh nguyệt. Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các
dẫn xuất của nó như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin
là nhóm hợp chất chính tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của
củ nghệ. Các nghiên cứu gần đây cho thấy curcuminoid, đặc biệt là
curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý rộng như kháng viêm, kháng
khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống tia tử ngoại, ức chế
phát triển khối u và bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid).
Hiện nay, các gen tham gia trong quá trình chuyển hóa
curcuminoid ở nghệ vàng (C. longa) đã được xác định và phân tích
mức độ biểu hiện, bao gồm hai nhóm gen type III polyketide synthase
là gen diketide-CoA synthase (DCS) và các gen curcumin synthase
(CURS1, CURS2 và CURS3). Tuy nhiên, các gen tham gia tổng hợp
curcuminoid ở loài nghệ đen đến nay vẫn chưa được công bố.
Elicitor là những chất hóa học được dùng để tác động vào con
đường chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp các chất có
giá trị dược phẩm hoặc các dược phẩm thực vật trong nuôi cấy tế bào
thực vật.
Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh
hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia
quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma
zedoaria Roscoe)” nhằm xác định các loại elicitor và nồng độ thích
hợp của chúng để điều hòa tăng biểu hiện của các gen type III

2
polyketide synthase trong con đường phenylpropanoid ở tế bào nghệ
đen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ cung cấp bằng chứng đầu
tiên về vai trò của SA, YE và MeJA như là những chất điều hòa dương
tính của biểu hiện gen ở loài dược liệu có giá trị này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu lý thuyết
Cải thiện mức độ biểu hiện của các gen CzDCS, CzCURS1,
CzCURS2 và CzCURS3 tham gia trong con đường chuyển hóa
phenylpropanoid sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen nuôi
cấy in vitro bằng một số elicitor.
Mục tiêu thực nghiệm
Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính
của nhóm chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ở
tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro.
3. Nội dung và phạm vi nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao bằng
cách bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Phân lập các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS
tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid)
ở nghệ đen.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor như YE, SA và
MeJA lên mức độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và khả
năng tích lũy curcumin trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro.
Phạm vi nghiên cứu
Các nghiên cứu được tiến hành trong phạm vi phòng thí
nghiệm./.

3
4. Đóng góp mới của luận án
- Các nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây nghệ đen trước
đây đều chưa sử dụng AgNO3 để tăng hiệu quả nuôi cấy, trong nghiên
cứu này, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm
tạo cây in vitro, nuôi cấy callus) đều làm tăng hiệu quả của quá trình
nuôi cấy so với các nghiên cứu trước đây.
- Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình tổng hợp
curcuminoid, các gen này tương đồng 99% so với các gen tương ứng
ở cây nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã
số lần lượt là MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835. Các
gen này đều có sự biểu hiện ở trong củ và callus của cây nghệ đen.
- Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp curcumin ở cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của
gen này quyết định trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được.
- Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của một số loại elicitor (dịch
chiết nấm men và salicilic acid) lên khả năng tích lũy curcumin và
mức độ biểu hiện của các gen liên quan. Giá trị tốt nhất thu được khi
xử lý dịch chiết nấm men (1 g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu
hiện cao hơn 2,78 lần so với đối chứng.
5. Cấu trúc luận án
Luận án được trình bày trong trang A4, không bao gồm Phụ lục.
Trong đó, phần Mở đầu 4 trang, phần Tổng quan tài liệu 33 trang, phần
Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu 11 trang, phần Kết quả nghiên
cứu 40 trang, phần Bàn luận 16 trang, Kết luận và Kiến nghị 1 trang,
Danh mục các công trình công bố 1 trang, Tài liệu tham khảo 21 trang
và phần Phụ lục 13 trang. Luận án có 169 tài liệu tham khảo, trong đó
có 161 tài liệu tiếng Anh. Phần kết quả nghiên cứu có 9 bảng và 26
hình.

4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Cây nghệ đen
Nghệ đen là cây thân thảo sống nhiều năm hoặc hàng năm, cao
khoảng 1-1,5m; có củ (thân rễ) hình trứng, có khía chạy dọc, củ tỏa
theo hình chân vịt; cây mẫm và chắc. Cây có nhiều củ, ngoài củ chính
ra còn có những củ phụ, vỏ củ có màu xám, bên trong củ có màu vàng
lưu huỳnh nhạt hoặc vàng sáng, khi già có nhiều vòng màu xanh tím.
Củ nghệ khô có mùi thơm camphor nhẹ và có vị đắng hơi cay.
Nghệ đen là loài thảo dược có củ chứa các nhóm chất chủ yếu
như tinh dầu (sesquiterpene và monosesquiterpene) và curcuminoid
(curcumin, demethoxy-curcumin và bisdemethoxycurcumin). Ngoài
ra, củ nghệ còn chứa một số hợp chất khác như tinh bột, chất dẻo và
các chất có vị đắng như tannin, flavonoiod.
2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật trong sản xuất hợp chất thứ cấp
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng
dụng lâu dài trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các
chất dùng trong y học. Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định
về mặt chất lượng và số lượng sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên.
Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những thí nghiệm sinh lý, hóa
sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp khác nhau.
3. Elicitor và các ứng dụng
Elicitor được định nghĩa như là một chất cơ bản mà khi đưa một
lượng nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì có thể khởi động hoặc cải thiện
sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào. Sự kích kháng thực
vật (elicitation) là quá trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp các
chất chuyển hóa thứ cấp nhờ tác động của các elicitor, giúp cho cây
chống lại các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như tác nhân gây bệnh hoặc

5
điều kiện sinh thái khắc nghiệt.
Đến nay, đã có nhiều công trình ứng dụng elicitor để kích thích
sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy in vitro thực vật. Các nghiên
cứu đều cho thấy sự tích lũy của những chất này đã tăng lên đáng kể
so với đối chứng sau khi được xử lý với loại elicitor và nồng độ thích
hợp của chúng. Một số loài cây đã được nuôi cấy có bổ sung elicitor
như

Dioscorea

zingiberensis,

Digitalis

lanata,

Hypericum

triquetrifolium, Portulaca oleracea, Psoralea corylifolia, Silene
vulgaris, Alstonia scholaris, Hypericum perforatum, Scrophularia
kakudensis, cây thủy tùng (Taxus baccata), Artemisia annua…
Đối với các loài thuộc chi nghệ, việc nuôi cấy có bổ sung elicitor
cũng đã được thực hiện như nuôi cấy cây nghệ xanh (C. aeruginosa),
cây nghệ vàng (C. longa), và cây nghệ C. mangga.
4. Các gen tham gia tổng hợp curcuminoid
Tham gia vào chu trình tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng có
nhiều enzyme xúc tác cho nhiều phản ứng trung gian khác nhau, phần

lớn các gen/enzyme này đều đã được nghiên cứu cả về đặc điểm, chức
năng cũng như biểu hiện tái tổ hợp. Trong số đó, các enzyme thuộc
nhóm polyketide synthase type III đóng vai trò hết sức quan trọng.
Gen diketide-CoA synthase (DCS) mã hóa diketide-CoA
synthase là một enzyme thuộc nhóm polyketide synthase type III xúc
tác tạo thành feruloyldiketide-CoA từ feruloyl-CoA và malonyl-CoA.
Gen curcumin synthase (CURS) mã hóa enzyme xúc tác tạo
thành curcuminoid từ cinnamoyldiketide-N-acetylcysteamine và
feruloyl-CoA. Hoạt động đồng thời của DCS và CURS khi có sự hiện
diện của feruloyl-CoA và malonyl-CoA sẽ tạo ra nhiều curcumin,
trong khi một mình CURS cho hiệu quả tổng hợp curcumin thấp cùng
với sự hiện diện của feruloyl-CoA và malonyl-CoA.


6
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là sự biểu hiện của các gen tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp curcuminoid trong tế bào cây nghệ đen
(Curcuma zedoaria Roscoe).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen
Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro
Chồi mầm sau khi khử trùng (1-1,5 cm) được cấy lên môi
trường cơ bản MS có sucrose 20 g/L, agar 8 g/L, bổ sung BAP 3 mg/L,
IBA 0,5 mg/L và nước dừa 20% (v/v) để tái sinh cụm chồi. Chồi in
vitro tái sinh được chuyển lên môi trường tương tự như trên nhưng
thêm AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả năng nhân cụm chồi.
Các chồi in vitro (3-4 cm) được nuôi trên môi trường MS bổ sung
NAA 2 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả năng tạo rễ.

Nuôi cấy callus
Gốc lá (leaf-base) (0,2×1 cm) được nuôi trên môi trường MS bổ
sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L để tạo callus. Các callus sơ cấp
sau đó được cắt thành các khối nhỏ (đường kính ~ 2 mm) cấy chuyển
lên môi trường mới có 2,4-D 1 mg/L + KIN hoặc NAA từ 0,5-2 mg/L
hoặc AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để tăng sinh.
Nuôi cấy tế bào
Chuyển 3 g callus 2 tuần tuổi vào bình tam giác 250 mL chứa
50 mL môi trường MS lỏng có sucrose 20 g/L, bổ sung 2,4-D 3 mg/L
và BAP 3 mg/L, nuôi lắc 150 vòng/phút trong 18 ngày.
2.2.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid
Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ lá nghệ đen được tách chiết bằng phương


7
pháp CTAB theo Babu và cs. (2014) có cải tiến.
Khuếch đại PCR
DNA tổng số của nghệ đen được sử dụng làm khuôn mẫu để
khuếch đại các gen dựa vào các cặp primer đặc hiệu của chúng được
thiết kế dựa trên các gen tương ứng của cây nghệ vàng (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các
gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen.
Gen

Primer

Trình tự nucleotide (5’- 3’)

Chiều dài ước

tính của sản
phẩm PCR (bp)

CzDCS

CzCURS1

CzCURS2

CzCURS3

DCS-F

GTCGTTTCTGTGACCTTCTC

DCS-R

CTTTTGGATGCAGACTGGAACA

CURS1-F

CTGCGACTGCGAGAAGAAGC

CURS1-R

CAGATAGACAGCCATACAAACC

CURS2-F

GCACGCGTTTTCTTGCTAATC

CURS2-R

GATCGTGTTCATAATTCACTGG

CURS3-F

CTAGCTAGCTGCAATTCGTT

CURS3-R

GTGCTAGCTTAGCTTGACGTA

~ 1400

~ 1250

~ 1300

~ 1250

Tạo dòng và chú giải gen
Sản phẩm PCR được tinh sạch, gắn vào vector pGEM®T-Easy
bằng T4 DNA ligase (Promega, Mỹ) và biến nạp vào tế bào E. coli
TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Trình tự nucleotide của sản phẩm
PCR được xác định bằng phương pháp dideoxy terminator.
Xây dựng cây phả hệ
Vùng CDS của các gen DCS, CURS1, CURS2, CURS3 của cây
nghệ đen và nghệ vàng được sử dụng để xây dựng cây phả hệ thông
qua phần mềm MEGA7.

2.2.3. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid


8
Xử lý elicitor
Elicitor được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ
khác nhau (MeJA 25-150 µM, SA 50-150 µM và YE 0,1-1,5 g/L) và
tại các thời điểm khác nhau (thời điểm ban đầu hoặc ngày thứ 5).
Phân tích RT-PCR
Mức độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid trong các
mẫu khác nhau được phân tích bằng kỹ thuật PCR phiên mã ngược
(RT-PCR) với các primer đặc hiệu cho các đoạn chỉ thị của các gen này.
Bảng 2.2. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các
gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen.
Gen

Primer

CzDCS

CzCURS1

CzCURS2

CzCURS3

Trình tự nucleotide (5’- 3’)

ID-F

TGCTCCGAGGTCACCGTGC

ID-R

GGTCAGCCCAATTTCGCGG

IC1-F

CCGCTGGAAGGAATTGAAAAA

IC1-R

GAGCTTGTCCGGGCTCAGCTG

IC2-F

CCACCTCCGCGAGGTGGGGCT

IC2-R

GCGGTGGCCAGCTTGCTCTGT

IC3-F

CACCTGAGGGAAATCGGCTGG

IC3-R

GCGAGCTTCCCCTGTTCCAGC

Chiều dài Nhiệt độ gắn
(bp)

(oC)

272

55

286

55

211

55

202

50

2.2.3.3. Phân tích HPLC
Tách chiết curcumin được tiến hành theo phương pháp của
Paramapojn và Gritsanapan (2009). Hàm lượng curcumin được xác
định dựa theo đường chuẩn curcumin.
2.2.4. Xử lý thống kê
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp
lại ít nhất 3 lần. Kết quả thí nghiệm được tính trung bình và phân tích
ANOVA bằng Duncan’s test với p<0,05) sử dụng phần mềm SPSS./.

9
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thiết lập nuôi cấy tế bào
3.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro
3.1.1.1. Tái sinh chồi
 Sử dụng chồi in vitro nguyên vẹn. Ở môi trường đối chứng
(ĐC), chồi đỉnh bắt đầu kéo dài từ ngày thứ 3 và sau đó xuất hiện các
chồi mới từ ngày thứ 5. Trên các môi trường có bổ sung AgNO3, chồi
đỉnh bắt đầu kéo dài và hình thành các chồi mới muộn hơn 1 ngày.
Các môi trường có bổ sung AgNO3 đều cho tỷ lệ tạo chồi mới cao hơn
hoặc tương đương ĐC.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in
vitro nguyên vẹn.
AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm)
ĐC

100

5,4ab

6,3ab

0,5

100

5,6ab

7,1a

1,0

100

6,1ab

6,9ab

1,5

100

6,4a

6,6ab

2,0

100

5,1b

6,2b

ĐC: đối chứng không bổ sung AgNO 3, chú thích này dùng chung cho các
bảng 3.2 và 3.3. Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có
ý nghĩa thống kê với p< 0,05 (Duncan’s test), chú thích này dùng chung cho
tất cả các bảng (ngoại trừ bảng 3.7).

 Sử dụng chồi in vitro chẻ đôi. Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy tất
cả môi trường được thăm dò đều có khả năng tái sinh chồi tương tự
như thí nghiệm chồi in vitro nguyên vẹn. Nhìn chung, so với chồi
nguyên vẹn thì chồi chẻ đôi có hiệu quả tái sinh chồi mới cao (7,5/6,4
chồi).


10
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in
vitro đã được chẻ đôi.
AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm)
ĐC

100

5,6c

3,4c

0,5

100

5,9bc

3,6bc

1,0

100

6,6b

3,9a

1,5

100

7,5a

3,7b

2,0

100

6,1bc

3,6bc

3.1.1.2. Tạo rễ in vitro
Khi kết hợp NAA với AgNO3, tất cả môi trường thăm dò đều
có khả năng tạo rễ. Ở các môi trường có AgNO3 rễ hình thành sớm
hơn, chỉ sau 3 ngày nuôi cấy và số lượng cũng nhiều hơn ĐC.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro.
AgNO3 (mg/L)

Tỷ lệ tạo rễ (%)

Số rễ/mẫu

Chiều dài rễ (cm)

c

0,6c

ĐC

100

18,3

0,5

100

20,0bc

0,7ab

1,0

100

22,5b

0,7ab

1,5

100

27,0a

0,8a

2,0

100

20,8bc

0,8a

3.1.2. Nuôi cấy callus
3.1.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN
Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng
khá rõ rệt lên sinh trưởng của callus. Nhìn chung, ở môi trường có 2,4D 1 mg/L + KIN từ 1-1,5 mg/L callus sinh trưởng mạnh hơn ĐC;
đường kính trung bình của chúng khoảng 1,53-1,56 cm, khối lượng
tươi và khối lượng khô tương ứng từ 0,84-0,9 g và 83,15-84,11 mg.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA
Kết quả trình bày ở bảng 3.5 cho thấy hiệu quả kích thích sinh


11
trưởng callus của NAA dường như không bằng KIN.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng
của callus nghệ đen.

KIN (mg/L)

Đường kính (cm)

ĐC

Khối lượng
Tươi (g)

Khô (mg)

1,35c

0,68c

61,24c

0,5

1,48abc

0,79b

79,03b

1,0

1,53ab

0,84ab

83,15a

1,5

1,56a

0,90a

84,11a

2,0

1,38bc

0,85ab

80,37b

ĐC: đối chứng là môi trường có 2,4-D 3 mg/L và BA 3 mg/L. Chú thích này
dùng chung cho các bảng 3.5 và 3.6.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh
trưởng của callus nghệ đen.
NAA (mg/L)

Đường kính (cm)
c

Khối lượng
Tươi (g)

0,65

c

Khô (mg)
60,89c

ĐC

1,35

0,5

1,45abc

0,70abc

64,39c

1,0

1,56a

0,79a

80,16a

1,5

1,50ab

0,76ab

73,91b

2,0

1,44bc

0,69bc

63,23c

3.1.2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và AgNO3
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở tất cả môi trường được thăm dò,
sinh trưởng của callus đều tăng so với ĐC, môi trường có AgNO3 1,5
mg/L callus có khối lượng khô cao nhất (62,43 mg) (Bảng 3.6).


12
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của AgNO3 từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh
trưởng của callus nghệ đen.
AgNO3 (mg/L)

Đường kính (cm)

ĐC

Khối lượng
Tươi (g)

Khô (mg)

1,28b

0,53c

48,21c

0,5

1,38ab

0,59bc

49,78c

1,0

1,41a

0,65ab

56,87b

1,5

1,45a

0,71a

62,43a

2,0

1,35ab

0,67ab

58,18b

3.1.3. Nuôi cấy tế bào nghệ đen
Kết quả trình bày ở hình 3.3 cho thấy pha thích nghi của tế bào
khá ngắn, tế bào sớm chuyển qua pha tăng trưởng và tăng sinh liên tục
từ 2 đến 14 ngày nuôi cấy sau đó giảm dần. Sinh khối tươi đạt cực đại

9.00

0.90

7.50

0.75

6.00

0.60

4.50

0.45

3.00

0.30
Sinh khối tươi

1.50

Khối lượng khô (g/bình)

Khối lượng tươi (g/bình)

là gần 170 g/L, tương đương với khối lượng khô khoảng 15 g/L.

0.15

Sinh khối khô

0.00

0.00
2

4

6

8

10

12

14

16

18

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen.

3.2. Nhận dạng các gen sinh tổng hợp curcuminoid
3.2.1. Phân lập gen


13
Các gen DCS, CURS1, CURS2 và CURS3 của nghệ đen có
chiều dài lần lượt là 1382 bp, 1240 bp, 1288 bp và 1265 bp (Hình 3.6).
Các gen này được đặt tên tương ứng là CzDCS, CzCURS1, CzCURS2
và CzCURS3 và đã đăng ký trên GenBank với các mã số sau:
MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835.
Để xác định các vùng intron/exon trên các gen CzDCS,
CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 có nguồn gốc từ DNA tổng số,
chúng tôi đã sử dụng các phương pháp khác nhau. Kết quả cuối cùng
cho thấy các gen CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 chỉ có 1 vùng
intron trong khi gen CzDCS có 2 vùng intron. Vùng intron/exon giả
định của 4 gen được minh họa ở hình 3.7.

Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ
DNA tổng số của nghệ đen. M1 và M2: DNA size marker (100 bp BioRad và
1 kb DNA Ladder Geneaid), 1: CzDCS, 2: CzCURS1, 3: CzCURS2, 4:
CzCURS3.

Do có sự tương đồng cao giữa các gen tổng hợp curcuminoid
của nghệ đen và nghệ vàng, chúng tôi đã xây dựng cây phả hệ các gen
này. Kết quả trình bày ở hình 3.16 cho thấy nhóm gen nghiên cứu có
giá trị bootstrap rất cao, thể hiện đặc tính cùng nguồn gốc và chức
năng (orthologs and paralogs) của các gen này giữa 2 loài. Trên cây


14
phả hệ, nhóm các gen CURS tạo thành 1 nhóm với độ tương đồng rất
cao, mức độ sai khác giữa các gen chỉ từ 0,1-0,2. Các gen DCS cũng
có độ tương đồng khá cao và tạo thành một nhóm trên cây phả hệ.

Hình 3.7. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp
curcuminoid ở nghệ đen. Trong đó, intron (đường thẳng), exon (hình hộp) và
vị trí của nó. Số 1 là nucleotide đầu tiên trong mã mở đầu. Cấu trúc chung
của chuỗi protein mã hóa được thể hiện bên dưới (màu cam). Vị trí các vùng
được xác định bằng công cụ InterProScan.

Hình 3.16. Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid.

3.2.2. Phân tích biểu hiện của các gen sinh tổng hợp curcuminoid
Để nghiên cứu sự biểu hiện của các gen sinh tổng hợp

15
curcuminoid trong 2 cấu trúc khác nhau của nghệ đen (củ và callus),
chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR sau đó xác định độ sáng của
băng DNA trên hình ảnh điện di.
Phân tích dữ liệu RT-PCR của 4 gen CzDCS, CzCURS1,
CzCURS2 và CzCURS3 ở củ và callus cho thấy tất cả chúng đều có
sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ các gen này đều biểu hiện ở cả 2 loại
mô nói trên (Hình 3.17). Kết quả này còn minh chứng cho nhận định
cơ chế sinh tổng hợp curcuminoid của nghệ đen cũng xuất hiện trong
quá trình nuôi cấy in vitro, và callus là nguyên liệu thích hợp để phát
triển hệ thống nuôi cấy tế bào nhằm mục đích sản xuất curcumin.

Hình 3.17. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1,
CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. M: DNA
size marker (1 kb), 1-3-5-7: củ, 2-4-6-8: callus, A: CzDCS, B: CzCURS1, C:
CzCURS2, và D: CzCURS3.

Để củng cố nhận định trên, chúng tôi đã phân tích hàm lượng
curcumin, một thành phần chính của nhóm curcuminoid, ở các mẫu
trên bằng HPLC. Kết quả cho thấy cả hai dịch chiết củ và callus đều
có chứa peak curcumin với thời gian lưu tương tự curcumin chuẩn.
3.3. Ảnh hưởng của elicitor lên quá trình sinh tổng hợp
curcuminoid
3.3.1. Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các
gen tổng hợp curcuminoid


16
Kết quả phân tích RT-PCR cho thấy khi xử lý methyl jasmonate
(25-150 mM), mức độ biểu hiện của gen CURS1 gần như không thay

đổi so với đối chứng (Hình 3.22A) trong khi CURS3 có chiều hướng
tăng lên (Hình 3.22B). Khi xử lý salicilic acid (50-150 mM), mức độ
biểu hiện của 2 gen này đều tăng so với đối chứng, trong đó gen
CURS1 tăng mạnh nhất khi xử lý ở nồng độ 100 mM trong khi gen
CURS3 mạnh nhất ở nồng độ 150 mM. Khi xử lý bằng dịch chiết nấm
men, mức độ biểu hiện của các gen chỉ tăng ở nồng độ 0,7-1,0 g/L, các
công thức xử lý còn lại các gen đều có mức độ biểu hiện thấp hơn so
với đối chứng.
Chúng tôi nhận thấy MeJA ít có ảnh hưởng lên sự biểu hiện của
các gen CURS, trong khi đó SA và YE có ảnh hưởng lớn đến mức độ
biểu hiện của các gen này. Các nồng độ xử lý elicitor được lựa chọn
là salicilic acid 100 mM và dịch chiết nấm men 1 g/L, các công thức
xử lý này sẽ được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của tất cả các
gen ở các thời điểm xử lý khác nhau về sau.
3.3.2. Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid
Kết quả phân tích hình ảnh điện di các sản phẩm RT-PCR cho
thấy sự biểu hiện của các gen ở tế bào nghệ đen đã được xử lý elicitor
mạnh hơn đối chứng là tế bào không xử lý (Hình 3.23). Mức độ biểu
hiện của các gen này được đánh giá thông qua độ sáng của các băng
DNA đã cho thấy các tế bào có xử lý cao hơn khoảng 1,14-3,64 lần so
với không xử lý (Bảng 3.8). Nhìn chung, YE có tác dụng kích thích
tốt hơn so với SA, cường độ tổng số của các băng DNA đạt 71.528 so
với 31.625 (hơn khoảng 2,3 lần).


17
Bảng 3.8. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ở các gen tổng hợp
curcuminoid.
SA (100 µM)

YE (1 g/L)

chứng

0

5

0

5

CzDCS

4706

5312

6146

5113

13425

CzCURS1

6881

7810

10766

32576

13524

CzCURS2

4646

6186

8510

12139

17783

CzCURS3

4414

4146

6203

21700

12664

Tổng số

20647

23455

31625

71528

57397

1,00

1,14

1,53

3,46

2,78

Gen

Tăng so với ĐC

Đối

0 và 5 là ký hiệu elicitor được bổ sung vào môi trường ở thời điểm ban đầu
hoặc ngày thứ 5 của quá trình nuôi cấy.

Hình 3.23. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp
curcuminoid ở nghệ đen. A: CzDCS, B-D: CzCURS1-3, E: RNA tổng số. 1:
đối chứng (tế bào không xử lý elicitor), 2 và 4: tế bào được xử lý SA và YE
tại thời điểm ban đầu. 3 và 5: tế bào được xử lý SA và YE vào ngày thứ 5 của
quá trình nuôi cấy. M: DNA size marker (1 kb DNA Ladder).


18
3.3.3. Tích lũy curcumin
Sinh trưởng của tế bào nghệ đen ở tất cả các công thức xử lý
elicitor đều bị ức chế đáng kể, sinh khối tươi thu được cao nhất chỉ đạt
105,20 g/L (9,80 g khô) so với 154,20 g/L (12,80 g khô) ở đối chứng.
Tuy nhiên, có sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen khi
phân tích RT-PCR với sự tích lũy curcumin khi phân tích bằng HPLC.
Ảnh hưởng của YE lên cao hơn so với khi xử lý bằng SA và ĐC.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các elicitor lên sinh trưởng và tích lũy curcumin
trong tế bào nghệ đen
Sinh trưởng tế bào
Elicitor

Curcumin

Khối lượng

Khối lượng khô

tươi (g)

(g)

YE(1)

105,20b

9,80b

0,92d

YE(2)

97,6c

8,40c

1,44a

SA(1)

69,00d

6,20d

1,14c

(2)

d

d

1,32b

SA

63,20

6,00

(mg/g)

Đối chứng (I)

154,2a

12,80a

0,57f

Đối chứng (II)

-

-

0,78e

Elicitor được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở thời điểm ban đầu (1) hoặc
sau 5 ngày (2). Đối chứng (I): tế bào không xử lý elicitor. Đối chứng (II): củ
nghệ đen 10 tháng tuổi.

Hình 3.25. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5
ngày nuôi cấy.


19
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Thiết lập nuôi cấy tế bào
4.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro
Đối với quá trình tái sinh chồi, nghiên cứu của Loc và cs (2005)
cho thấy môi trường có bổ sung 3 mg/L BAP cho hiệu quả tốt nhất, số
chồi/mẫu đạt 2,3 và chiều cao chồi đạt 3,42 cm. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi sử dụng công thức môi trường này để tiến hành nghiên cứu
ảnh hưởng của AgNO3. Kết quả nghiên cứu cho thấy số chồi tạo thành
cao hơn (3,3 so với 2,3 chồi) và chiều dài chồi cũng cao hơn (4,1 cm
so với 3,42 cm). Như vậy, AgNO3 đã có tác dụng trong việc nâng cao
hiệu quả của quá trình tái sinh chồi. Môi trường tốt nhất để tạo rễ theo
Loc và cs (2005) là 2 mg/L NAA, khi bổ sung AgNO3 vào môi trường
này, chúng tôi nhận thấy 1,5 mg/L AgNO3 cho hiệu quả tốt nhất. So
với nghiên cứu trước đây của Loc và cs (2005) thì kết quả thu được
của chúng tôi tốt hơn, số rễ/mẫu nhiều hơn (27,0 so với 18,5), rễ tạo
thành cũng dài hơn (0,80 cm so với 0,51 cm).
Qua các kết quả nghiên cứu về nhân giống, chúng tôi nhận
thấy bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng cao hiệu suất
nhân giống, các chỉ tiêu nghiên cứu đều tăng lên từ 25-50%.
4.1.2. Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen
Loc và cs. (2006, 2008) đã nghiên cứu sản xuất sinh khối tế
bào cây nghệ đen thông qua nuôi cấy callus, callus đã được tạo thành
khi nuôi cấy mảnh lá trên môi trường có chứa 3 mg/l BAP và 3 mg/l
2,4-D. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách nuôi 3 g

callus tươi trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml cùng loại môi
trường.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc bổ sung AgNO3 vào môi


20
trường nuôi cấy đã làm tăng khả năng sinh trưởng của tế bào. Sau 14
ngày nuôi cấy, sinh khối tươi đạt cực đại là gần 8,5 g/bình, tương
đương với khối lượng khô khoảng 0,75 g/bình, cao hơn kết quả nghiên
cứu trước đây của Tuan và cs. (2011) (khoảng 0,66 g khô/bình) hay
Miachir và cs. (2004) (quy đổi tương đương 5,33 g tươi/bình). Bên
cạnh đó, thời gian đạt sinh trưởng cực đại của chúng tôi (14 ngày)
cũng ngắn hơn rất nhiều so với các nghiên cứu đã công bố như trong
nghiên cứu của Mello và cs. (2001) là 35 ngày hay Miachir và cs.
(2004) là 20 ngày. Thời gian nuôi cấy ngắn sẽ góp phần làm tăng hiệu
quả của quá trình sản xuất curcumin.
4.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid
4.2.1. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid
Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy có sự tương đồng
lớn giữa các gen của nghệ đen với nghệ vàng (xấp xỉ 99%). Các phân
tích trình tự cũng cho thấy các gen thuộc tất cả loài của trong chi
Curcuma có sự tương đồng rất lớn, thậm chí ngay ở các vùng không
mã hóa. Chính sự tương đồng cao trong trình tự của các gen này dẫn
đến sẽ có sự tương đồng cao trong các trình tự amino acid của các
protein được mã hóa. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các
sản phẩm PCR đặc hiệu cho tất cả các gen, điều này chứng tỏ cây nghệ
đen chứa tất cả các gen này.
So sánh kết quả phân lập của chúng tôi với các kết quả đã công
bố trên cây nghệ vàng có thể thấy các gen giữa hai loài này có độ tương
đồng rất cao, lên đến 99%.

4.2.2. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid
Thông qua quá trình xử lý elicitor, vai trò của các gen cũng đã
được thể hiện. Khi xử lý YE ở thời điểm ban đầu, mật độ băng DNA
của gen CzDCS là 5.133 trong khi tổng mật độ của 3 gen CzCURS là


21
66.415 (Bảng 3.8) cho hàm lượng curcumin là 0,92 mg/g khô (Bảng
3.9). Trong khi đó bổ sung elicitor tại thời điểm 5 ngày, mật độ của
gen CzDCS là 13.425 (tăng hơn 2 lần) và tổng mật độ của các gen
CzCURS là 43.971 (giảm hơn 30% so với bổ sung thời điểm ban đầu)
nhưng hàm lượng curcumin đã tăng lên là 1,44 mg/g khô (gấp 1,5 lần).
Xử lý SA cũng cho kết quả tương tự nhưng không rõ bằng YE.
Khi xử lý SA ở thời điểm ban đầu, mật độ băng DNA của gen CzDCS
là 5.312 trong khi tổng mật độ của 3 gen CzCURS là 18.142 (Bảng
3.8) cho hàm lượng curcumin là 1,14 mg/g khô (Bảng 3.9). Trong khi
đó bổ sung elicitor tại thời điểm 5 ngày, mật độ của gen CzDCS là
6.146 (tăng khoảng 1,2 lần) và tổng mật độ của các gen CzCURS là
25.479 (tăng 1,4 lần) thu được hàm lượng curcumin là 1,32 mg/g khô
(gấp 1,15 lần). Như vậy, việc tăng mức độ biểu hiện của gen CzDCS
đã làm tăng khả năng sinh tổng hợp curcumin trong tế bào, mức độ
biểu hiện của các gen CzCURS ít tác động đến khả năng sinh tổng hợp
curcumin.
4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor lên sự biểu hiện của các
gen tổng hợp curcuminoid
4.3.2. Ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng của tế bào
Trong các công trình nghiên cứu được công bố, việc xử lý
elicitor sẽ ức chế sự sinh trưởng của tế bào giống như trong nghiên
cứu cứu của chúng tôi. Đối với tế bào cây nghệ đen, xử lý SA sinh
khối tươi của tế bào giảm còn 27,24-44,75% trong khi xử lý YE sinh

khối tươi giảm còn 63,29- 68,22% (Bảng 3.9). Như vậy, tác dụng ức
chế của SA lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen gần gấp đôi của YE.
4.3.3. Ảnh hưởng của elicitor lên mức độ biểu hiện gen
Sự tích lũy của các sản phẩm thứ cấp chính trong nuôi cấy tế
bào thực vật tăng lên có liên quan đến mức độ biểu hiện của các gen


22
cũng như tăng lên dưới tác dụng của các elicitor. Trong nghiên cứu
của chúng tôi, khi xử lý elicitor ở các nồng độ và thời điểm khác nhau
sẽ tăng lên ở các mức độ khác nhau. Đối với gen CzDCS, mức độ biểu
hiện tăng cao nhất khi xử lý YE vào thời điểm 5 ngày sau khi nuôi cấy,
mức biểu hiện gấp 2,85 lần so với đối chứng (cường độ băng DNA đạt
13.425 so với 4.706 của đối chứng). Đối với các gen CURS, gen
CzCURS1 mức biểu hiện cao nhất ghi nhận được tại công thức xử lý
YE vào thời điểm ban đầu (nồng độ 32.576), gen CzCURS2 là khi xử
lý YE ở thời điểm 5 ngày (cường độ 17.778) còn gen CzCURS3 cao
nhất khi xử lý YE ở thời điểm ban đầu (cường độ 21.700) (Bảng 3.8).
Như vậy, trong tất cả các công thức xử lý, mức độ biểu hiện của các
gen khi xử lý bằng YE đều cao hơn khi xử lý bằng SA, điều này chứng
tỏ YE phù hợp hơn SA trong việc tăng cường mức độ biểu hiện của
các gen trong chu trình phenylpropanoid ở cây nghệ đen.
4.3.4. Ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin
Trong nghiên cứu của chúng tôi trên cây nghệ đen, xử lý YE
vào thời điểm 5 ngày sau quá trình nuôi cấy cho kết quả tốt nhất, hàm
lượng curcumin đạt 1,44 mg/g, gấp 1,53 lần so với đối chứng không
xử lý elicitor (Bảng 3.9). Các công thức xử lý khác cũng đều thu được
hàm lượng curcumin cao hơn đối chứng, xử lý bằng SA vào thời điểm
5 ngày cũng cho kết quả rất tốt, hàm lượng curcumin cao gấp 2,32 lần
so với đối chứng. Đối chiếu với kết quả phân tích mức độ biểu hiện

của các gen trong chu trình, sự tích lũy curcumin trong tế bào có sự
khác biệt. Đối với YE, mức độ biểu hiện của các gen tại thời điểm ban
đầu cao hơn thời điểm 5 ngày, trong khi hàm lượng curcumin tại thời
điểm 5 ngày lại cao hơn, điều này có thể thấy vai trò quan trọng của
gen DCS trong quá trình sinh tổng hợp curcumin.


23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã xây dựng thành công hệ thống nuôi cấy cây nghệ đen có
sử dụng AgNO3, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào các môi trường nuôi
cấy tạo cây in vitro và nuôi cấy callus đều cho hiệu quả nuôi cấy tốt
nhất.
2. Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp curcuminoid, các gen này được đặt tên tương ứng là CzDCS,
CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3; có chiều dài lần lượt là 1382 bp,
1240 bp, 1288 bp và 1265 bp; tương đồng 99% so với các gen tương
ứng ở cây nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các
mã số lần lượt là MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835.
Các gen này đều có sự biểu hiện ở trong củ và callus của cây nghệ đen.
3. Các elicitor (dịch chiết nấm men và salicilic acid) đều có tác
dụng tăng cường mức độ biểu hiện của các gen cũng như sự tổng hợp
curcumin. Giá trị tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1
g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu hiện của các gen cao hơn 2,78
lần và hàm lượng curmin tích lũy cao hơn 2,5 lần so với đối chứng
không xử lý.
4. Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp curcumin ở cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của
gen này quyết định trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được.

KIẾN NGHỊ
Đề tài cần được tiếp tục nghiên cứu theo hướng ứng dụng, mở
rộng ở quy mô pilot, thăm dò thêm các elicitor khác, từ đó hoàn thiện
quy trình sản xuất để có thể áp dụng vào sản xuất ở quy mô công
nghiệp.


24
DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Trương Thị Phương Lan, Lê Thị Anh Thư, Ngô Thị Sen (2017)
Ảnh hưởng của AgNO3 đến quá trình tái sinh in vitro cây nghệ đen
(Curcuma zedoaria Roscoe). Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn 126(3D): 5-15.
2. Trương Thị Phương Lan, Lê Thị Anh Thư, Nguyễn Thị Hà Ngân
(2017) Thăm dò ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng
của callus nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe). Tạp chí Khoa học
và Công nghệ, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế: Chuyên san
Hóa-Sinh-Khoa học trái đất 12(2): 63-74.
3. Truong Thi Phuong Lan, Nguyen Duc Huy, Nguyen Ngoc Luong,
Nguyen Van Nghi, Trinh Huu Tan, Le Viet Quan, Nguyen Hoang Loc
(2018) Identification and characterization of genes in curcuminoid
pathway of Curcuma zedoaria Roscoe. Current Pharmaceutical
Biotechnology. DOI: 10.2174/1389201019666181008112244.
4. Truong Thi Phuong Lan, Nguyen Duc Huy, Nguyen Ngoc Luong,
Hoang Tan Quang, Trinh Huu Tan, Le Thi Anh Thu, Nguyen Xuan
Huy, Nguyen Hoang Loc (2019) Expression of elicitor-induced
curcuminoid genes in cells of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe).
Journal of Plant Biotechnology (accepted).

25
INTRODUCTION
1. The necessity of the study
Curcuma

zedoaria,

belonging

to

the

ginger

family

(Zingiberaceae), has been using in traditional medicine in various
countries to treat inflammation, aches, skin diseases such as wounds
and spots sores, as well as abnormalities of the menstrual cycle.
Curcuminoids, a mixture of curcumin and its delivery including
demethoxycurcumin, and bisdemethoxycurcumin, is major compound
having bioactivity of Curcuma. Previous studies suggested that
curcuminoids, especially curcumin, have valuable biological activities
such as antioxidant, antitumor, anti-inflammatory, anti-acidogenic,
radioprotective and neuroprotective (anti β-amyloid) properties.
Genes that involve the pathway of curcuminoid metabolism in
C. longa have been identified and qualified the expression level,
including two type III polyketide synthase genes, DCS gene and
CURS1, CURS2 and CURS3 genes. However to our knowledge,

genes which metabolize curcuminoids in zedoary (C. zedoaria) were
not reported yet.
Elicitors are the chemical compounds which have been used to
modify the pathway of secondary metabolism in order to enhance of
the biosynthesis of pharmaceutically significant metabolites or
phytopharmaceuticals in plant cell cultures.
Thus, we carried out the research entitles “Study the effect of
elicitors on expression of genes involved curcuminoid biosynthesis
pathway in Curcuma zedoaria cells” to find out the elicitor and
optimal concentration to enhance the expression level of type III
polyketide synthase gene in the phenylpropanoid pathway of Curcuma
zedoaria cells. Our results firstly provide scientific evidence on the