Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán tại Việt Nam

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
trong chẩn đoán tại Việt Nam
Phạm Hùng Vân
Phó phòng thí nghiệm Y Sinh ĐHYD
Chủ nhiệm BM Kỹ Thuật Y Học Viện VSYT Công Cộng
Trưởng Khoa Vi Sinh BV. Nguyễn Tri Phương
Thành Viên ANSORP (Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens)


Từ yêu cầu thực tế
• Phải có các xét nghiệm hữu dụng lâm sàng hơn
trong chẩn đoán, giúp chỉ định điều trị, theo dõi điều
trị nhiều bệnh lý nhiễm trùng
• Tiến bộ đặc biệt hiện nay trong điều trị ung thư là
điều trị đích rất cần phải có xét nghiệm pharmacogenetic
• Cần phải có các xét nghiệm xác định bệnh lý di
truyền đưa vào chẩn đoán tiền sanh, tham vấn tiền
hôn nhân để nâng cao chât lượng dân số, tránh
gánh nặng xã hội
• Nhu cầu xét nghiệm dấu vân tay di truyền trong
pháp y, trong y học thể thao


Thực tế này đòi hỏi
chúng ta phải có
thêm những tiếp cận
mới, trong đó có tiếp
cận sinh học phân tử


Sinh học phân tử

áp dụng trong
chẩn đoán phát
hiện tác nhân VSV
gây nhiễm trùng


NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI C (HCV)

Schering-Plough


Giải pháp toàn diện cho
xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C
RT-qPCR định lượng HCV-RNA

Định lượng
HCV genotype

Định genotype HCV

Tuần 12 (4)
Định lượng

RT-qPCR định lượng HCV-RNA

Giảm hơn 2 log10 hay âm tính
HCV-RNA

Không giảm hơn 2 log10

Cân nhắc ngưng
điều trị

Genotype - 1
Điều trị 48 tuần

Genotype non-1
Điều trị 24 tuần

(2002 NIH Consensus Conference)
RT-PCR phát hiện HCV-RNA

Cuối điều trị
HCV-RNA
Theo dõi sau 6 tháng
HCV-RNA

HCV RNA (+)
Không đáp ứng

HCV RNA (+)
Tái phát

HCV RNA (-)
Đáp ứng


NA đích dành cho chẩn đoán sinh học phân tử được lựa chọn là 5’-NC
nhờ có những trình tự bảo tồn, dễ cho thiết kế các xét nghiệm độ nhạy cao

Giải pháp gói xét nghiệm định lượng và xác định genotype
HCV là độc đáo về mặt kỹ thuật , hữu dụng lâm sàng, và
giá thành rẽ nên đưa vào áp dụng dễ dàng hơn
Phân bố các genotype HCV trong 2000
mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV
được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí
nghiệm NK-Biotek trong năm 2008


Công ty Nam Khoa đang triển khai giải trình tự vùng NS5B
để tránh nhầm lẫn một số genotype 6 thành genotype 1
Very high prevalence of HCV genotype 6 variants in Southern Vietnam : large scale survey based on sequence
determination Van Hung Pham, An Duc Xuyen Vo Dien Vu Banh, Ling Lu and Kenji Abe. Emerging Infectious Diseases
(submitted)


IL28B SNP rs12979860: INTERFERON switch
 Chromosome 19
 Điều biến đáp ứng interferon
 CC haplotype (CC-ON):
o

o

o

CC-ON

Đáp ứng với interferon 60-80%.

Khả năng đáp ứng thuốc và tiến triển mạn
tính thấp hơn 1/2 so voi kiểu CT (Ge et al.,
Thomas et al.)
Gặp nhiều trên bn nhiễm genotype 6

 CT haplotype (CC-OFF):
o
o

Đáp ứng với interferon 30-40%.
Khả năng kháng thuốc và tiến triển mạn tính
thấp cao gấp đôi kiểu CC (Ge et al., Thomas
et al.)
CC-OFF


Phát hiện INTERFERON switch
 Phòng thí nghiệm NK-BIOTEK đã triển khai xét nghiệm
xác định IL28B SNP bằng kỹ thuật giải trình tự và kỹ
thuật real-time (taqman probe)
 Có trên 80% bệnh nhân mang haplotype CC (CC-ON)
 Giá thành xét nghiệm 400.000 VND (ở Mỹ là 300USD)
 Nếu bệnh nhân đã điều trị có kết quả HCV-RNA âm tính
không thể xác định genotype HCV, vẫn tiên đoán được
hiệu quả điều trị bằng IL28B SNP:
o Nếu là CC thì đáp ứng sẽ tốt, nếu CT đáp ứng sẽ có
nguy cơ không tốt
o Mẫu thử có thể chỉ cần quệt niêm mạc má

NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI B (HBV)

WHO 2001


Giải pháp toàn diện cho
xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B
HBsAg [+]
HBVDNA [+]

PCR phát hiện HBV-DNA
và định lượng

qHBVDNA

Phát hiện đột
biến precore,
core-promoter

105
ALT

Ann Intern Med. 2002;137:1-9. Updated Definitions of Healthy
Ranges for Serum Alanine Aminotransferase Levels. Daniele
Prati, MD; Emanuela Taioli, MD, PhD; et Al.

ALT 19u/ml: Nữ
ALT 33u/ml: Nam

ALT

ALT Normal

Điều trị

Biopsie
or Fibroscan
AFP

qHBVDNA/3th
105

qPCR định lượng
HBV-DNA

LamR, AdfR

Bất thường
Phát hiện đột biến kháng thuốc


Phát hiện ĐB PreS1/S2
•
•

Nguy cơ HCC
Genotype HBV

PCR đặc hiệu gene S
•

•

Phát hiện HBV-DNA
Định lượng HBV-DNA

Phát hêện đột biến “a”
• Vaccin escape mutant
• Xác định genotype

Giải trình tự gene rt
(trình tự 700bps)
• Phát hiện đột biến kháng thuốc
• Xác định genotype

Giải trình tự gene preC và C
(trình tự 250bps)
•
•

Phát hiệnđột biến precore/core promoter
Xác định genotype



G1896A (Codon 632)
A1762T (Codon 588)
G1764A (Codon 588)










Xét nghiệm tìm AFB không
xác định được lao
Khá nhiều trường hợp lao
phổi mà soi không thấy, cấy
không ra
Các trường hợp lao ngoài
phổi rất khó chẩn đoán xác
định như lao màng não, lao
khớp, lao màng bụng, lao
màng tim, lao xương
Phải có kết quả kháng sinh
đồ sớm để biết có đa kháng
không


Giải pháp phát hiện M. tuberculosis nhạy hơn,
nhanh hơn, có kết quả kháng sinh đồ sớm hơn


PCR/qPCR phát hiện/định lượng tác nhân
VSV gây nhiễm trùng trên người và động vật
Tác nhân virus cần phải phát hiện để sớm có biện
pháp theo dõi (Dengue, HPV), điều trị (HSV) hay
theo dõi hiệu quả điều trị (HBV, HCV, HIV/AIDS)

 Tác nhân vi khuẩn nhưng các phương pháp
truyền thống không nhạy, không kịp thời
(Chlamydia, Lậu kinh niên)
 Các tác nhân gây dịch nhưng cần phát hiện từ cơ
sở để phòng ngừa lây lan và sẽ không an toàn
nếu làm xét nghiệm với các phương pháp vi sinh
truyền thống tại các phòng xét nghiệm lâm sàng
chưa có an toàn cấp độ 3 (H5N1, H1N1, SARS,
tác nhân khủng bố sinh học)



Xét nghiệm
sinh học phân tử
áp dụng
trong ung thư


NSCLC
(Non Small Cell Lung Cancer)


Các đột biến EGFR
• Đột biến EGFR là trên 4 exon của gen, đó là exons 18 đến 21
• Đột biến mất đoạn ở Exon 19 và đột biến L858R trên exon 21
chiến 90% các đột biến
Domain Tyrosine Kinase
Exons 18-24
EGFR Gene

Exon 18
G719C
G719S
G719A
5%

Exon 19
Del E746-A750
Del E746_S752>V
Del E746_T751>A
Del E746_T751
Del L747_A750>P
Del L747_E749
Del L747_P753>Q
Del L747_P753>S
Del L747_S752
Del L747_T751>P
Del L747_T751
Del S752_I759
& additional deletions
~45%

Exon 20

Exon 21

T790M
D770_N771 (ins NPG)
D770_N771 (ins SVQ)
D770_N771 (insG)

S768I

L858R
L861Q
~45%

~5%

Lynch et al., 2004
Paez et al., 2004
Sharma et al., 2007
Hirsch and Bunn, 2009


Các kỹ thuật phát hiện đột biến EGFR
Kỹ thuật

Độ nhạy

Phát hiện được

Giải trình tự trực tiếp

25%

ĐB mới và đã biết

PCR-SSCP

10%

ĐB mới và đã biết

TaqManPCR

10%

Chỉ ĐB đã biết

Loop-hybrid mobility shiftassay

7.5%

Chỉ ĐB đã biết

CycleavePCR

5%

Chỉ ĐB đã biết

PCR-RLFP (fragmentlength analysis)

5%

Chỉ ĐB đã biết

MassARRAYgenotyping

5%

Chỉ ĐB đã biết

LNA-PCR clamp

1%

Chỉ ĐB đã biết

Scorpion ARMS (DxS)

1%

Chỉ ĐB đã biết

dHPLC

1%

Chỉ ĐB đã biết

COLD-TaqManPCR

0.05%

Chỉ ĐB đã biết

Pao and Ladanyi. Clin Cancer Res 2007;13:4954-55

Một kết quả giải trình tự
phát hiện đột biến EGFR

Exon 19 deletion E746-A750

Exon 21 L858R


ARMS

(Amplification Refractory Mutation System )

using scorpion primers

Scorpion primers không phát huỳnh quang

Khi đầu 3’ scorpion primers match được với
trình tự đích thì primer sẽ được kéo dài

Khi biến tính (nhiệt độ 95oC), scorpion
primer đã kéo dài tách khỏi sợi khuôn

Khi nhiệt độ hạ xuống thì scorpion primer
đã kéo dài sẽ cho trình tự đầu 5’ bắt cặp một
trình tự kéo dài của nó làm tách reporter khỏi
quencher và phát huỳnh quang