Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây dưa chuột (cucumis sativus l ) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

CHÂU THỊ VƯỢNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN
CÂY DƯA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.) IN VITRO

Ngành: Công nghệ sinh học
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng – 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả khóa luận

Châu Thị Vượng


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện Khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường,

Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến
thức lý thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật, qua đó bản thân tôi đã trưởng thành hơn trong tư duy, bố trí và tiến hành
các nghiên cứu khoa học.
Để hoàn thành được Khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân,
tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự tận tình hướng dẫn, giúp đỡ về mặt khoa học của
TS. Nguyễn Minh Lý.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô thuộc khoa Sinh- Môi
trường đã truyền dạy cho tôi rất nhiều kiến thức cũng như phát triển kĩ năng thực
hành thí nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài Khoá luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên trong nhóm nghiên cứu, đã
luôn giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm trong thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động
viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả tốt nhất.
Xin trân trọng cảm ơn.
Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Châu Thị Vượng


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN..................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... vii
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài............................................................................... 1

2. Mục tiêu đề tài............................................................................................... 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯA CHUỘT.................................................... 4
1.1.1.

Nguồn gốc và phân loại cây dưa chuột............................................... 4

1.1.2.

Giá trị dinh dưỡng............................................................................... 5

1.1.3.

Giá trị kinh tế....................................................................................... 6

1.1.4.

Các giống dưa chuột lai đang sử dụng sản xuất hiện nay.................8

1.2. VAI TRÒ CỦA CÂY ĐƠN BỘI TRONG CHỌN GIỐNG CÂY
TRỒNG................................................................................................................. 8
1.2.1.

Giá trị của cây đơn bội........................................................................ 8

1.2.2.

Phương pháp tạo cây đơn bội............................................................. 9

1.3. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO
PHẤN.................................................................................................................. 11
1.3.1.

Ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng và kiểu gen cây mẹ.............11

1.3.2.

Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển bao phấn................................ 12

1.3.3.

Ảnh hưởng của việc xử lí vật liệu trước khi nuôi cấy.....................12

1.3.4.

Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuôi cấy...................................... 12

1.3.5.

Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy...........................13

1.4. NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở DƯA
CHUỘT ĐƠN BỘI VÀ CÁC CÂY TRONG HỌ BẦU BÍ..............................14


iv

1.4.1.

Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn trên thế giới................14

1.4.2.

Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam..................17

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19
2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU................19
2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu........................................................................ 19

2.1.2.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................... 20

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.................................................................... 20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................... 20
2.3.1.

Phương pháp thu nụ dưa chuột........................................................ 20

2.3.2.

Phương pháp vào mẫu...................................................................... 20

2.3.3.

Bố trí thí nghiệm và xử lí thống kê................................................... 21

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................... 26
3.1. CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU NỤ HOA......................................... 26
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA KIỂU GEN DƯA CHUỘT ĐẾN KHẢ NĂNG
PHÁT SINH CALLUS....................................................................................... 27
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC NỤ HOA DƯA CHUỘT ĐẾN KHẢ
NĂNG PHÁT SINH CALLUS.......................................................................... 28
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THU MẪU VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ
LẠNH ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO CALLUS......................................................... 29
3.4.1.

Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến hiệu quả tạo callus từ nuôi

cấy in vitro bao phấn dưa chuột..................................................................... 29
3.4.2.

Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến hiệu quả tạo callus từ nuôi

cấy in vitro bao phấn dưa chuột..................................................................... 30
3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG (ĐHST) ĐẾN
SỰ PHÁT SINH CALLUS ĐƠN BỘI VÀ TÁI SINH CÂY............................31
3.5.1.

Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy

in vitro bao phấn dưa chuột........................................................................... 31


v

3.5.2.

Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và KIN đến hiệu quả tạo callus từ

nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột............................................................ 33
3.5.3.

Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ callus bao phấn

dưa chuột......................................................................................................... 34
3.5.4.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của KIN và NAA đến khả năng tái

sinh cây từ callus bao phấn dưa chuột.......................................................... 36
3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO
CALLUS TỪ NUÔI CẤY IN VITRO BAO PHẤN DƯA CHUỘT.................38
3.6.1.

Điều kiện nhiệt độ.............................................................................. 38

3.6.2.

Điều kiện ánh sáng............................................................................. 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 41
1. Kết luận.......................................................................................................... 41
2. Kiến nghị........................................................................................................ 41
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................. 42

vi

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: Dichlorophenoxylacetic acid

BAP

: 6-Benzylaminopurine

ĐHST

: Điều hòa sinh trưởng

KIN

: Kinetin

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-Naphthaleneacetic acid

SH

: Schenk và Hildebrandt (1972)

TDZ

: Thidiazuron


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
1.2.

1.3.

Thàn

(Theo
Tình

giai đ

1.4.

Điều

2.1.

Đặc

2.2.

Các c

3.1.

Hiệu

3.2.

Sự ả
năng

3.3.

Sự ản

callus
3.4.

Sự ản
phát

3.5.

Sự ản

3.6.

Sự ản

3.7.

Ảnh h

bao p
3.8.

3.9

Ảnh h
phấn

Sự ản

callus


3.10.

Sự ản

callus


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình
3.1.

3.2.

3.3.

Hình callus phát s
Callus sau 3 tuần
Giống dưa chuột

Sự ảnh hưởng của

phát sinh callus sa
3.4.
3.5.

Callus phát sinh t

và 0,22 mg/l KIN
Sự tăng trưởng về

Callus phát sinh t
3.6.

và 0,2 mg/l KIN q
mm.

3.7.

Tái sinh 1 rễ từ ph

BAP 1,0 mg/l, tha

3.8.

Tái sinh 4 rễ từ ph

BAP 1,0 mg/l, tha
3.9.

Rễ từ phôi sau 3 t

mg/l tái sinh trở l
3.10.

Tái sinh 1 rễ từ ph

KIN 4,0 mg/l; tha
3.11.

3.12.

Tái sinh 4 rễ từ ph

KIN 4,0 mg/l; tha

Tái sinh 6 rễ từ ca

sung KIN 4,0 mg

Callus sau 3,4,5 tu

3.13.

0

ở nhiệt độ 32 C 1
trong quá trình nu


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) là một loại cây có giá trị kinh tế được trồng
phổ biến tại nhiều nơi trên thế giới, chúng được sử dụng chủ yếu dưới dạng tươi, cũng
có thể được dùng để chế biến một số loại món ăn, và một phần được bảo quản và chế
biến cho mục đích sử dụng lâu dài [10]. Ngoài ra, dưa chuột còn có giá trị như một vị
thuốc quý, trong quả dưa chuột có chứa hàm lượng vitamin C khá cao và một số men
có lợi kích thích tiêu hoá rất tốt cho sức khỏe. Nhiều sản phẩm chế biến sau thu hoạch
từ cây dưa chuột như dưa chuột muối, đóng hộp rất được ưa chuộng trên thế giới. Đối
với Việt Nam dưa chuột còn là một sản phẩm có giá trị xuất khẩu cao, hiện nay sản
phẩm từ dưa chuột Việt Nam đã được xuất khẩu sang nhiều thị trường rộng lớn như:
Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Singapo… [10]. Tính chung
trong 5 tháng đầu năm 2017 giá trị xuất khẩu dưa chuột đạt 20 nghìn USD [2]. Các tiêu
chuẩn và các quy định về hình thức, chất lượng dưa chuột dùng trong xuất khẩu là rất
cao, vì vậy bên cạnh yếu tố năng suất các giống dưa chuột được dùng cho mục đích này
cần đáp ứng được những yêu cầu hết sức khắt khe khác như độ dày cùi, màu sắc vỏ,
kích thước quả, thời gian bảo quản, hàm lượng các chất [13].Thời gian gần đây, tuy đã
có nhiều cố gắng trong công tác chọn giống cây trồng, nhưng bộ giống dưa chuột của
nước ta vẫn còn hạn chế, các giống dùng cho tiêu thụ nội địa thì năng suất và chất
lượng thấp, các giống dùng cho chế biến thì rất ít, và hầu hết đều là các giống nhập nội

từ Nhật Bản, Liên Bang Nga, Thái Lan…[2].
Dưa chuột là cây rau ăn quả ngắn ngày. Ở nước ta nó có thể trồng nhiều vụ trong
năm, quả cho thu hoạch nhiều đợt, năng suất trung bình đạt xấp xỉ 17 tấn/ha tương
đương với năng suất trung bình toàn thế giới. Trồng trong điều kiện nhà che phủ nylông
ứng dụng công nghệ cao tại Hà Nội, năng suất đạt tới hơn 120 tấn/ha, bằng 1/3 năng
suất dưa chuột ở nước ngoài trong điều kiện tương tự [13]. Mặc dù là cây rau đa dụng,
được trồng phổ biến, song năng suất và chất lượng dưa chuột ở nước ta còn thấp, một
phần do còn sử dụng nhiều giống địa phương, độ đồng đều không cao, mẫu mã kém;
các giống lai nhập nội có tính chống chịu yếu với sâu bệnh hại và môi


2

trường bất thuận đã làm ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất của giống cây trồng này
[7].
Ngoài ra, trong điều kiện nhiệt đới gió mùa ẩm quá trình sản xuất dưa chuột của
người nông dân gặp rất nhiều các loại sâu, bệnh hại do các yếu tố phi sinh học, và sinh
học gây nên (bệnh đốm lá, bệnh đốm phấn, bệnh sương mai, bệnh thối rễ, bệnh thối
quả, bệnh héo rủ, bệnh vàng lá), dẫn đến năng suất và chất lượng dưa chuột bị giảm đi.
Vì vậy, nhiệm vụ quan trọng của các nhà chọn giống hiện nay là phải tạo ra các giống
lai dưa chuột có năng suất cao, kháng bệnh tốt và thích hợp cho xuất khẩu cũng như sử
dụng ở dạng tươi. Tuy nhiên, quá trình tạo giống bằng phương pháp thông thường đòi
hỏi rất nhiều thời gian và chi phí. Ở hầu hết các nước việc chọn tạo các giống dưa mới
đều theo hướng tạo ra các giống dưa F1 có ưu thế lai cao từ các dòng bố mẹ thuần
chủng [2]. Nhưng dưa chuột có đặc điểm là cây đơn tính cùng gốc, giao phấn chủ yếu
nhờ côn trùng nên việc tạo ra các dòng thuần bằng phương pháp truyền thống thường
tốn rất nhiều thời gian và công sức. Dòng thuần được tạo ra bằng cách tự thụ phấn và
chọn lọc qua nhiều thế hệ (7 - 8 thế hệ). Mặc dù vậy phương pháp này nhiều khi vẫn
không đạt được dòng bố mẹ đồng hợp tử ở tất cả các cặp alen [2].

Điều này dẫn đến một sự cần thiết là phải sử dụng các kỹ thuật công nghệ sinh
học để tạo ra những giống dưa chuột có phẩm chất tốt, nhằm cải thiện vốn gen của
dòng dưa chuột hiện tại, khắc phục được những nhược điểm tồn tại của phương
pháp chọn giống truyền thống. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, các tiểu bào tử và noãn
đã trở thành một công cụ tối ưu, cung cấp giống cây đơn bội phổ biến, nhằm tạo ra
nguồn nguyên liệu phát triển cây dưa chuột đồng hợp, phục vụ cho công tác chọn
giống cây trồng. Qua đó tạo ra nguồn biến dị phong phú, đồng thời phục vụ trong
công tác chuyển gen ở cây trồng. Sản xuất cây đơn bội dưa chuột thông qua nuôi
cấy bao phấn cho phép các nhà nhân giống dưa chuột tạo các dòng mới nhanh hơn.
Trong Họ Dưa chuột Cucurbitaceae, sinh sản đơn tính đực đã được báo cáo đối
với cây bí, dưa hấu [39]. Sinh sản đơn tính cái bằng nuôi cấy noãn sản xuất giống
lai F1 đã được báo cáo trong họ bầu bí [50, 57].
Các thí nghiệm, các nghiên cứu trên cùng cho rằng nuôi cấy bao phấn và nuôi
cấy noãn phụ thuộc vào kiểu gen. Việc xác định được callus từ giao tử hay tế bào


3

soma còn nhiều hạn chế. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả, sự thành công của
việc nuôi cấy bao phấn (kiểu gen cây trồng, điều kiện sinh trưởng của cây mẹ cho
bầu nhụy và bao phấn, các giai đoạn phát triển của bao phấn, tiền xử lý nụ hoa, điều
kiện và môi trường nuôi cấy [26] vẫn chưa khảo sát đầy đủ. Vì những lý do trên,
chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả
năng phát sinh callus từ bao phấn cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) in vitro’’.

2. Mục tiêu đề tài
Xây dựng quy trình tạo callus từ bao phấn dưa chuột in vitro tạo nguồn vật
liệu cho quá trình tái sinh cây đơn bội phục vụ công tác chọn giống.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của các
yếu tố nội và ngoại sinh đến quá trình phát sinh callus từ bao phấn dưa chuột đơn
bội in vitro.
Nguồn callus được tạo ra trong nghiên cứu sẽ được sử dụng để phục vụ quá
trình tái sinh cây tạo dòng dưa chuột đơn bội kép phục vụ cho công tác chọn giống,
và các nghiên cứu trong lĩnh vực di truyền cây dưa chuột.


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯA CHUỘT

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây dưa chuột
Dưa chuột là loại rau ăn quả trồng lâu đời nhất, được biết đến cách đây khoảng
5.000 năm. Song cho đến nay vẫn có nhiều ý kiến khác nhau về nguồn gốc xuất xứ
của loại cây này. Phần lớn các nhà nghiên cứu đều thống nhất rằng cây dưa chuột có
nguồn gốc từ Tây Ấn Độ (Nam Á), nơi tồn tại các loài họ hàng hoang dại với số
lượng nhiễm sắc thể 2n = 14. Loài hoang dại Cucumis hardiwickii Royle là loài dưa
chuột quả nhỏ, có vị đắng, có gai quả cứng và thưa được tìm thấy mọc hoang dại ở
dưới chân núi Hymalaya. Một số nhà khoa học Liên Xô như Vavilov, Tcachenco
(1967), Taracanov cho rằng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam giáp Lào là nơi
phát sinh cây dưa chuột vì ở đây còn tồn tại dạng dưa chuột hoang dại [11].
Từ kết quả nghiên cứu qua các chuyến thám hiểm thực địa, nhà thực vật học
Vavilov (1926) đã cho rằng Trung Quốc là trung tâm khởi nguyên thứ 2 của loài dưa
này. Các tài liệu cổ của Trung Quốc cũng ghi nhận ngay từ thế kỷ thứ IV ở đây đã
trồng dưa chuột. Từ việc phát hiện ra dạng cây dưa chuột hoàn toàn hoa cái
(Gynoecious) trong tập đoàn giống từ Trung Quốc, giống như các dạng cây này của

Nhật Bản được phát hiện trước đó, Mochshorov cho rằng dưa chuột Trung Quốc
được trồng từ lâu ở những vùng có điều kiện khí hậu mát mẻ của Nhật Bản. Từ
vùng nguyên sản, dưa chuột được du nhập vào Châu Âu từ thế kỷ XV. Từ Châu Âu,
dưa chuột được đưa tới Châu Mỹ và cuối thế kỷ XVII chúng mới được phổ biến
rộng rãi tại lục địa này. Hiện nay dưa chuột được trồng hầu như khắp nơi trên thế
giới, từ vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi đến tận 63 vĩ độ Bắc [16].
Việc phân loại dưa chuột theo đặc tính sinh thái và di truyền học giúp các nhà
chọn tạo giống dễ dàng lựa chọn nguồn vật liệu khởi đầu. Theo Trần Khắc Thi
(1985) bảng phân loại của Gabaev (1932) loài C. sativus L. được chia thành 3 loài
phụ là: loài phụ Đông Á (ssp. rigidus Gab.), loài phụ Tây Á (ssp.graciolor Gab.) và
loài hoang dại (ssp. agrostis Gab., var. Hardwickii (Royle) Alef.)


5

1.1.2. Giá trị dinh dưỡng
Quả dưa chuột có hàm lượng nước thấp hơn các loại quả khác thuộc họ bầu
bí (Cucrbitaceae) nhưng lại có hàm lượng protein cao. Dưa chuột chứa nhiều loại
đường, một số loại axit amin, beta-carôten, vitamin B1, C, các chất canxi, phốt pho,
sắt và kali. Do đặc điểm giàu các nguyên tố khoáng như Kali và ít Natri, dưa chuột
kích thích sự lưu thông nước trong cơ thể, có tác dụng lợi tiểu và tái tạo khoáng [3].
Ngoài ra, dưa chuột có công dụng thanh nhiệt, chống khát, giải độc, tốt cho người
tiểu tiện khó, rôm sảy. Dưa chuột có tác dụng ức chế sự hình thành mỡ trong cơ thể,
người béo ăn nhiều dưa chuột rất có lợi, đồng thời giảm lượng cholesterol và chống
khối u. Bên cạnh đó dưa chuột còn có tác dụng làm đẹp, đắp mặt nạ bằng dưa chuột
có tác dụng bảo vệ da và chống lại các nếp nhăn.
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng ăn được trong 100 dưa chuột
(Theo “Bảng thành phần hóa học thức ăn Việt Nam - 2007”)
Thành phần dinh dưỡng
Nước

Năng lượng
Protein
Lipid
Glucid
Celluloza
Tro
Đường tổng số
Calci
Sắt
Magie
Mangan
Phospho
Kali
Natri
Kẽm
Vitamin C
Vitamin B1
Vitamin B2
Vitamin PP


6

1.1.3. Giá trị kinh tế
a. Tình hình sản xuất dưa chuột trên thế giới.
Quả dưa chuột có thể chế biến thành nhiều mặt hàng khác nhau. Do đó loại
cây này đang là nguồn thu của nhiều quốc gia. Trong những năm gần đây đã có
nhiều nước trên thế giới xuất, nhập khẩu dưa chuột dưới dạng ăn tươi hay chế biến
[2]. Dưới đây là bảng số liệu thống kê tình hình sản xuất dưa chuột của 1 số nước
trên thế giới giai đoạn 2012- 2016.

Bảng 1.3 : Tình hình sản xuất dưa chuột của 1 số nước trên thế giới giai đoạn
2012-2016 (Nguồn FAOSTAT 2018)
Chỉ
tiêu

Diện
tích

(ha)

Năng
suất
(kg/ha)


Sản
lượng
(tấn)


7

Nhìn chung, diện tích, năng suất và sản lượng dưa chuột của các nước trên thế
giới đều tăng qua các năm. Diện tích trồng dưa chuột trên thế giới năm 2016 là
2.144.672 ha tăng 1,37% so với năm 2012 với diện tích 2.115.757 ha. Sản lượng
dưa chuột đạt 375.893 tấn (năm 2016) tăng 12,5% so với năm 2012 (334.132 tấn).
Do nhu cầu về rau xanh nói chung và dưa chuột nói riêng của người tiêu dùng ngày
càng cao khi lương thực và các loại thức ăn giàu đạm được đảm bảo. Đặc biệt là các
nước phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản, Anh. Canada, Đức…
Năm 2005, 5 nước nhập khẩu dưa chuột lớn nhất thế giới là Hoa Kỳ (423.431 tấn),

Đức (410.084 tấn), Anh (104.054 tấn), Newtherlands (66.091 tấn) và Pháp (59.019 tấn).
Trong khi đó, 5 nước xuất khẩu dưa chuột lớn nhất thế giới là: Tây Ban Nha (399.256
tấn), Mexico (398.971tấn), Newtherlands (360.054 tấn), Jordan (64.308 tấn) và Canada
(54.967 tấn), như vậy nhiều quốc gia vừa xuất khẩu vừa nhập khẩu dưa chuột. Điều đó
cho thấy rằng công nghệ chế biến đồ hộp chỉ đang tập trung vào một số nước phát triển
như Hoa Kỳ, Canada, Newtherlands... Những nước này, ngoài lượng dưa chuột sản
xuất trong nước, đã nhập khẩu một lượng lớn dưa chuột ở dạng quả tươi, sau quá trình
chế biến, xuất khẩu dưa chuột dưới dạng đồ hộp.

b. Tình hình sản xuất dưa chuột ở Việt Nam
Trong số các cây thực phẩm thì dưa chuột là cây trồng ngắn ngày cung cấp
nguyên liệu cho ngành chế biến rau quả xuất khẩu, được nhiều quốc gia ưa thích.
Diện tích, năng suất, sản lượng dưa chuột tăng mạnh trong những năm gần đây.
Ở nước ta, dưa chuột được sản xuất chủ yếu ở một số tỉnh như Tây Ninh, Đồng Nai,
Tiền Giang, Đồng Tháp, An Giang, Lý Nhân (Hà Nam), Nam Định, Bắc Giang, Thanh
Hóa... thu lợi nhuận cao. Các mặt hàng dưa chuột xuất khẩu chủ yếu dưới dạng

dưa quả tươi, dưa bao tử, dưa chuột muối, dầm giấm... sang một số nước châu Âu,
châu Mỹ, châu Á: Trung Quốc, Đài Loan, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc [11]. Năm
2007, tổng công ty rau quả Việt Nam đã xuất khẩu được 47.423 tấn dưa chuột hộp
và 522 tấn dưa chuột đóng lọ thủy tinh. Năm 2008, tổng diện tích trồng là 1.685,56
ha, sản lượng xuất khẩu là 70.478 tấn. Năm 2009, diện tích trồng dưa chuột: 31.570
ha/năm (tăng gấp 18 lần so với năm 2008). Sản lượng dưa chuột: 577.218 tấn/năm
(năm 2009) (Số liệu Tổng cục Thống kê Việt Nam, năm 2009).


8

1.1.4. Các giống dưa chuột lai đang sử dụng sản xuất hiện nay
Các giống dưa chuột hiện đang trồng phổ biến ở Việt Nam khá đa dạng và

theo xu thế phát triển chung của thế giới. Phân theo kích thước quả gồm có nhóm
giống quả nhỏ, nhóm quả trung bình và nhóm quả to. Phân theo mục đích sử dụng
các giống được chia thành 02 nhóm: nhóm giống ăn tươi và nhóm giống phục vụ
chế biến. Theo thị hiếu vùng miền các giống dưa chuột lại được chia thành 02 nhóm
là nhóm giống sử dụng cho các tỉnh phía Nam và nhóm giống sử dụng cho các tỉnh
phía Bắc. Nhóm các giống sử dụng cho các tỉnh phía Nam (bao gồm cả miền Trung)
gồm các giống: Ninja 179, Amata 765, Trang Nông 20, Hưng Thịnh... Nhóm các
giống được trồng tập trung ở các tỉnh phía Bắc như các giống Yên Mỹ, CV5, Ninja
179. Một số giống đã được chọn tạo như:
Nhìn chung các giống dưa chuột hiện có của chúng ta còn chưa đáp ứng
được yêu cầu về sản xuất và tiêu dùng. Các giống địa phương vẫn chưa được khai
thác triệt để trong công tác chọn giống dưa chuột ở Việt Nam. Chưa có những giống
chuyên dùng cho chế biến và phục vụ xuất khẩu mà thường phải nhập từ nước ngoài
như: giống dưa chuột lai F1 TO, TK của Nhật Bản; giống dưa chuột bao tử nhập từ
Thái Lan MTXTE; giống Marina quả chùm hoặc giống Levina quả đơn, v.v.., giá
hạt giống cao. Đó là một yếu tố quan trọng dẫn đến chi phí sản xuất trên đơn vị diện
tích tăng [9].

1.2.

VAI TRÒ CỦA CÂY ĐƠN BỘI TRONG CHỌN GIỐNG CÂY
TRỒNG

1.2.1. Giá trị của cây đơn bội
Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã được
phát hiện từ lâu. Cây đơn bội đã được tạo ra bằng nuôi cấy bao phấn ở hàng loạt cây
trồng khác nhau. Các nhà khoa học đã tìm ra những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến
thành công của quá trình nuôi cấy như ảnh hưởng của kiểu gen, giai đoạn phát triển của
hạt phấn và các điều kiện môi trường nuôi cấy. Ngoài nuôi cấy bao phấn, các nhà khoa
học còn có những thành công rất lớn trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh, nuôi

9

cấy hạt phấn tách rời. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào
tử hoặc đại bào tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép tạo ra nhanh chóng
hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho mục đích nghiên cứu di truyền và tạo
giống cây trồng.
Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người ta phải tiến hành
đa bội hóa đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra allen hoàn toàn giống nhau. Những
biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể
các gen lặn. Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn
giống.
Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã được
phát hiện từ lâu. Karpachenco là người đầu tiên ngay từ năm 1929 đã chỉ ra khả
năng và triển vọng của việc sử dụng đơn bội vào mục đích chọn giống, vì trong bất
kỳ một quần thể nào, một tổ hợp mong muốn của các gen trong giao tử thường là
cao hơn so với trong hợp tử. Do đó về mặt lý thuyết sẽ thường xuyên và rất nhanh
nhận được các dạng đồng hợp tử có những tổ hợp các dấu hiệu mong muốn bằng
cách gấp đôi trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể ở các thể đơn bội [4]. Thời gian cần
thiết để tạo ra dòng vật liệu nguồn- dòng đơn bội kép như vậy được rút ngắn rất
nhiều, khoảng 3-4 lần, tùy đối tượng cây [1].

1.2.2. Phương pháp tạo cây đơn bội
Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế
bào đơn bội. Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội
(n). Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học
đã tiến hành nghiên cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội
làm nguồn vật liệu cho công tác chọn giống.
Tạo cây đơn bội in vitro là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện dụng và nhanh

chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội. Kỹ thuật tạo cây
đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi nuôi cấy
bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích thích các tế bào


10

trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội. Đặc biệt với cây ngô đã
nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống cây trồng.
Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. Nuôi cấy các
hạt phấn
đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên
môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển
thành cây đơn bội. Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn
tính đực (androgensis). Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương
thức sinh sản đơn tính đực như sau:
+
Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược. Khi đó hạt
phấn

đơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n).
+
Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô. Khi đó hạt phấn đơn
nhân
(tiểu bào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n.
+
sản

Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh

đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà chua.

Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh. Sự hình thành
cây đơn
bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh
(gynogensis). Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để
tạo cây đơn bội. Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy
rằng, nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ
bạch tạng là rất cao. Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng
dương, v.v. đã không cho kết quả như mong muốn. Trên cơ sở đó, vào những năm
70 các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy
noãn chưa thụ tinh và đã thu được nhiều thành tựu.
Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau.
Đối với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5 - 20%; ở lúa là 1,5 - 12%; ở dâu tằm là 3 -


6%, … Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức
tạp do việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn. Nhằm tăng hiệu quả của


11

quá trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai
đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, …
Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối
đơn giản và thu được nhiều thành công hơn cả.
Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau:
-

Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.

-

Tạo đột biến ở mức đơn bội.

-

Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng.

1.3. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO
PHẤN
1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng và kiểu gen cây mẹ
Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ/ngày) và ở
vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng tương đối tốt hơn so với cây dài ngày
(16 giờ/ngày) có cùng cường độ chiếu sáng. Sự phát sinh phôi hạt phấn có thể được
o

cải thiện nhiều hơn nếu nhiệt độ dưới điều kiện ngày ngắn duy trì ở 18 C. Sự thay
đổi mùa vụ thích hợp và tuổi cây cho bao phấn ảnh hưởng lớn đến phản ứng của các
hạt phấn. Xử lý cây bằng cách bơm thuốc trừ sâu hoặc các chất độc khác cần phải
được tránh. Cây thiếu nitrogen có thể ảnh hưởng xấu đến bao phấn hơn so với cây
được cung cấp đủ nitrogen. Vì thế, có thể khuyến cáo rằng chỉ có những nguyên liệu
sinh trưởng ở các điều kiện môi trường được điều chỉnh tốt chẳng hạn như nhà kính
(greenhouse) mới có thể dùng cho việc sinh sản đơn tính tiểu bào tử [16].
Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi
cấy không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong
một loài. Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một đặc điểm có khả
năng di truyền [25], [26].
Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy bao phấn dưa chuột.
Tác giả T.Suprunova và N.Shmykova đã nuôi cấy 10 giống (Hiziz, Gordion, Hana,

12

Melen, Kedet, Asak, Reisa, Tristan, Tarantutka và Rostovchanin). Kết quả chỉ có
giống Gordion có thể tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn [26].
Zagorska N.A. khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu
quả nuôi cấy bao phấn chỉ thu được callus từ bao phấn của 53 giống trong số 85
kiểu gen và sự tái sinh cây chỉ có được từ callus của 15 giống. Số liệu thu được cho
thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn [29]

1.3.2. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển bao phấn
Giai đoạn phát triển của bao phấn cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả
nuôi cấy. Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp, đồng thời tỷ lệ cây bạch
tạng tăng. Tuy nhiên không phải bất cứ loài cây trồng nào cũng có hiệu suất tối ưu ở
giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hoà thảo có nhiều điểm khác nhau. Một số
yếu tố khác hỗ trợ có thể gây nên sự thay đổi về giai đoạn phản ứng tối ưu, ví dụ đối
với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là trước và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong
điều kiện nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tăng từ 6 đến 9% [28].

Đối với lúa các nhà khoa học ở Viện lúa quốc tế (IRRI) đã nghiên cứu 500 bao
phấn chọn từ nhiều giống chứa hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau, kết quả cho thấy
hạt phấn ở giai đoạn từ đơn nhân giữa đến đơn nhân muộn là tốt nhất, có nghĩa là
cần lấy hoa khi khoảng cách giữa tai lá cờ và lá đối diện là 2- 4cm [47]. Trên cây
thuốc lá Reed đã xác định được giai đoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi đài và
tràng hoa có chiều dài tương đương nhau [43].

1.3.3. Ảnh hưởng của việc xử lí vật liệu trước khi nuôi cấy
Áp dụng tiền xử lý nhiệt là một nhân tố quan trọng làm tăng hiệu quả kích thích
sinh trưởng ở các loại cây khác nhau [37]. Tiền xử lý nhiệt đã được sử dụng để tạo ra

phôi từ bao phấn, nó phá vỡ khung tế bào trong bào tử giai đoạn đầu và nhiệt độ tối ưu,
thời gian xử lý thay đổi từ loài này sang loài khác. Tiền xử lý nhiệt độ cao sẽ phá vỡ sự
phát triển tích hợp bình thường của các mô bao phấn soma và sau đó có thể đồng bộ
hóa các trạng thái sinh lý của 2 mô từ đó kích thích quá trình cảm ứng.

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuôi cấy