Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất điểm hồng (dendrobium draconis rchb f) trên môi trường nuôi cấy lỏng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH
----------

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất
điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) trên
môi trường nuôi cấy lỏng

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AIA

: axit indol axetic

BA

: 6 – benzyl adenine

BAP

: 6 – benzyl aminopurine

B5

: gamborg

cs

: cộng sự

CT

: công thức

2,4 – D

: diclorophenoxyacetic acide

ĐHQG – HCM : Đại học Quốc gia – Hồ Chí Minh
GA

: gibberellic acid

IAA

: indole 3 – acetic acide

IBA

: indol 3 – butyric acide

KIN

: kinetin

MS

: Murashinge & Skoog (1962)

M6

: Chu et all. (1975)

NAA

: α – napthalen acetic acide

NOA

: naphthoxyacetic acid

N–6

: delta 2 – isopentenyl

TDZ

: thidiazuron

2


DANH MỤC BẢNG
Bảng

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

Tên bảng
Ảnh hưởng của lượng mẫu đưa vào đến khả năng nhân nhanh
protocorm trên môi trường lỏng
Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến khả năng nhân
nhanh protocorm trên môi trường lỏng
Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân nhanh protocorm
lan nhất điểm hồng trên môi trường lỏng.
So sánh khả năng nhân nhanh protocorm lan nhất điểm hồng
trên môi trường lỏng và đặc.
Ảnh hưởng của KIN, BAP, IBA đến khả năng nhân chồi in
vitro lan nhất điểm hồng.

3

Trang

19

22

24

26

28


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ
3.1

3.2

3.3

3.4

Tên biểu đồ
Ảnh hưởng của lượng mẫu đưa vào đến khả năng nhân
nhanh protocorm trên môi trường lỏng
Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân nhanh
protocorm lan nhất điểm hồng.
Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến khả năng nhân
nhanh protocorm trên môi trường lỏng
So sánh khả năng nhân nhanh protocorm lan nhất điểm hồng
trên môi trường lỏng và đặc.

4

Trang

20

22

25

26


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình
2.1
3.1

3.2

3.3

Tên hình
Lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f)
Protocorm phát sinh sau 15 ngày nuôi cấy với lượng mẫu nuôi
cấy ban đầu khác nhau.
Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân nhanh protocorm
lan nhất điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy
Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng nhân nhanh
protocorm lan nhất điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy

Trang

16
21

23

25

3.4

Protocorm lan nhất điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy

27

3.2

Nhân chồi in vitro lan nhất điểm hồng sau 60 ngày nuôi cấy.

28

5


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, hoa lan đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh,
xuất khẩu trên Thế giới. Đặc biệt là các nước thuộc châu Á nhiệt đới như Thái Lan,
Singapore, Philippin, Indonesia…Thái Lan là một nước điển hình về nuôi trồng và
xuất khẩu hoa lan [6]. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm. Các loài lan
rừng Việt Nam là những thành phần quan trọng trong cấu thành các hệ sinh thái của
rừng Việt Nam tạo nên cho Việt Nam thành một trong những vùng phân bố các loài

lan quý của Thế giới [6]. Tuy nhiên thời gian gần đây hệ sinh thái rừng Việt Nam bị
giảm sút nghiêm trọng dẫn đến việc thu hẹp nơi sinh sống của các loài lan rừng
cũng như việc khai thác quá mức làm cho nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng cục bộ.
Bằng các kĩ thuật nuôi cấy như phương pháp nuôi cấy ngập chìm trong điều
kiện vô trùng các bộ phận của cơ thể thực vật, phương pháp nuôi cấy in vitro ngập
chìm cho ra số lượng lớn cây đồng nhất về mặt di truyền một cách nhanh chóng,
đồng thời còn bảo tồn và phục hồi được các loài cây quý hiếm có hiệu quả. Ứng
dụng kĩ thuật này vào sản xuất không những sẽ giải quyết được vấn đề bảo tồn đa
dạng sinh học mà còn mở ra một hướng mới cho sản xuất và kinh doanh cây trồng
nhất là các loài cây dược liệu, hoa kiểng,…
Trong số những giống lan ở nước ta như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium,
Mokara, Vanda, Dendrobium… thì Dendrobium là một chi lớn và có giá trị kinh tế
cao. Nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) là loài lan thuộc chi
Dendrobium. Đây là một loài lan đẹp, nằm trong sách đỏ Việt Nam và có giá trị
kinh tế cao.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis
Rchb.f) trên môi trường nuôi cấy lỏng”

6


2. Mục đích của đề tài
Xây dựng quy trình nhân nhanh lan nhất điểm hồng bằng kỹ thuật nuôi cấy
in vitro trên môi trường lỏng.
3. Nội dung đề tài
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện và môi trường nuôi cấy đến
khả năng nhân protocorm của lan nhất điểm hồng: lượng mẫu (protocorm) nuôi cấy
ban đầu, tốc độ lắc, hàm lượng đường sucrose.
- So sánh khả năng nhân nhanh protocorm trên môi trường lỏng và môi

trường đặc.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất KTST (BAP, KIN, IBA) lên
khả năng nhân chồi từ protocorm.

7


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về lan Dendrobium
1.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố
Giống lan này được đặt tên vào năm 1799. Chữ Dendrobium có nguồn gốc
của chữ Hy Lạp. Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sống, vì tất cả các loài
của Dendrobium đều là phụ sinh bám trên cây gỗ. Dendrobium rất phong phú về
chủng loại, loài này lớn thứ hai trong họ lan với khoảng 1600 loài phân bố trên các
vùng thuộc nhiệt đới châu Á, tập trung nhiều ở Đông Nam Á và Úc châu.
Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng có nhiều loài chỉ mọc
và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian và cũng có loài thích
nghi với bất kì điều kiện khí hậu nào [4].
1.1.3. Đặc điểm về hình thái
Dendrobium là loại đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang
một thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có nhiều mắt ngủ. Hoa có thể mọc từ
thân thành từng chùm hoa hay từng hoa đơn độc. Hoa có màu trắng, vàng đến tím
[4]
Dendrobium được chia làm hai nhóm chính theo dạng thân của chúng: dạng
thòng hay Nobile là dạng thân mềm thường ở vùng hơi lạnh như Đà Lạt; dạng đứng
hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng có khí hậu nóng hơn [4].
Hình dạng Dendrobium cũng rất biến thiên: nhóm có giả hành rất dài và
mang lá dọc theo chiều dài của giả hành ấy, thường rụng hết lá khi ra hoa như Long
Tu (Dendrobium primulinum), Ý Thảo (Dendrobium grastio sisimum)…; nhóm giả
hành to, ngắn, tận cùng thường có 2-3 lá dài, bền, không rụng. Hoa tập trung ở phần

này tạo thành chùm đứng hay thòng như Thủy Tiên trắng (Dendrobium farmeri),
Thủy Tiên vàng (Dendrobium thyrisflorum)… Nhóm giả hành rất mảnh mai, dài
hay ngắn, có lá mọc theo chiều dài của chúng, dai, bền, không rụng. Hoa thường cô
độc ở nách như Hương Duyên (Dendrobium revolutum)…

8


1.2. Vài nét về lan nhất điểm hồng
1.2.1. Nơi phân bố
Nhất điểm hồng Dendrobium draconis do mục sư C.P.S Parish tìm ra ở Miến
Điện vào năm 1862. Cây lan này mọc khắp Đông Nam Á. Tại Việt Nam lan mọc ở
Đà Nẵng, Nha Trang, Langbian, Đà Lạt, Sông Bé, Lộc Ninh. Theo sách của Phạm
Hoàng Hộ và Trần Hợp đều gọi là nhất điểm hồng [1].
1.2.2. Đặc điểm thực vật học
Đây là một giống phong lan cao chừng 40 cm có 7-9 đốt với vỏ bọc đầy lông
đen. Hoa nở vào mùa Xuân, màu trắng, trong họng có màu đỏ hay đỏ cam, ngang to
6-7 phân, thơm như mùi cam, quýt, lâu tàn mọc từ các đốt gần ngọn của thân cây
năm trước [5]. Cây mọc ở trên núi, thích hợp với thời tiết mát mẻ, có thể sống ở
chậu hoặc trên các giá thể.
1.2.3. Hiện trạng và những nghiên cứu về lan nhất điểm hồng
1.2.3.1. Hiện trạng
Thuộc loài lan quý hiếm nằm trong sách đỏ Việt Nam.
1.2.3.2. Những nghiên cứu về lan nhất điểm hồng
Rangsayatorn và cs nghiên cứu việc bảo tồn giống Dendrobium draconis từ
hạt sau đó tạo protocorm rồi chuyển thành chồi. Kết quả cho thấy ở môi trường
Vacin và Went bổ sung 200 ml/l nước dừa là phát triển tốt nhất, số lượng chồi phát
triển là tốt nhất [21].
Rangsayatorn nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi lan nhất điểm hồng trên
chồi với môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA và 1mg/l NAA [20].

Phan Hùng Vĩnh và cs nghiên cứu nhân giống in vitro lan nhất điểm hồng
(Dendrobium draconis) một loài lan rừng quý hiếm [18].
Lê Thị Nhung nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi in vitro lan Nhất Diểm
Hồng (Dendrobium dranconis Rchb.f) trên môi trường lỏng [6].
Nhìn chung những nghiên cứu về lan nhất điểm hồng trên Thế giới chưa
nhiều và chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam. Những nghiên cứu này chỉ là những nghiên
9


cứu bước đầu ở một số tổ hợp môi trường và chưa nghiên cứu toàn diện để tìm ra
môi trường tối ưu cho việc nhân giống loài lan này bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật.
1.3. Tình hình nuôi trồng, sản xuất hoa lan trên Thế giới và Việt Nam
1.3.1. Tình hình nuôi trồng và sản xuất hoa lan trên Thế giới
Ở châu Á, hoa lan được biết đến và đưa vào nuôi trồng từ rất sớm. Đến thế kỉ
20, người Anh đến Singapore mở đầu cho một giai đoạn mới là lập trại nuôi trồng
hoa lan và kỹ thuật nuôi trồng lan. Các giống lan được nuôi trồng ở đây là:
Arachnis, Vanda, Oncidium…đồng thời lai tạo các loài mới.
Đầu thế kỷ 20, kỹ thuật gieo trồng hoa lan từ bằng nhiều nấm cộng sinh có từ
cây lan mẹ bắt đầu mở ra một giai đoạn mới. Với những kĩ thuật nhân giống bằng
hạt đã mở ra khả năng phát triển về ngành lan ở Châu Âu cũng như Thế giới.
Từ năm 1957, Thái Lan, Indonexia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy mô
ngày càng lớn phục vụ cho việc xuất khẩu. Các loài lan rừng, lan lai, lan cắt cành
của Thái Lan được xuất khẩu qua nhiều nước trên Thế giới. Có thể nói Thái Lan là
một nước điển hình cho ngành nuôi trồng và xuất khẩu hoa lan ở các nước Châu Á.
Công nghiệp sản xuất, xuất khẩu hoa lan ở Thái Lan được bắt đầu từ Thong Lor
Rakhpa Busobat ở Bangkok. Sau những thành công của Thong Lor thì việc sản xuất
và kinh doanh hoa lan rộng sang Ấn Độ, Sri Lanka, Philippin đã lần lượt đến Thái
Lan học hỏi kinh nghiệm sản xuất và kinh doanh hoa lan.
Mọi kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng hoa lan đã trở thành một bộ phận chủ

yếu nhất của ngành trồng hoa cảnh xuất khẩu của nhiều nước. Việc nuôi trồng để
xuất khẩu hoa lan hiện nay ở nhiều nước đã đạt đến số lượng hàng trăm ngàn giò
lan và cành lan mỗi năm. Nhu cầu trồng hoa lan trên quy mô công nghiệp ngày càng
phát triển. Ở nhiều nước các nhà nuôi trồng hoa lan nghiệp dư và chuyên nghiệp đã
lập ra các hội hoa lan ngày càng nhiều. Đã có hơn 400 hội hoa lan trên Thế giới có
nhiều chuyên sang về hoa lan đã được xuất bản. Nhiều cuộc hội thảo về hoa lan
quốc tế được tổ chức [4].

10


Trung Quốc là nước có tốc độ phát triển về lan khá nhanh. Đầu thập kỷ 80,
Trung Quốc bắt đầu nhập nội lan hồ điệp. Năm 2002 sản lượng lan hồ điệp của
Trung Quốc là ba triệu cây, chủ yếu ở Quảng Đông, Phúc Kiến, Bắc Kinh, Vân
Nam, Sơn Đông,… bao gồm 50 – 60 xí nghiệp có quy mô lớn, trong đó Quảng
Đông có hơn 10 công ty sản xuất khoảng 1,2 triệu cây (chiếm 40% sản lượng lan hồ
điệp của Trung Quốc). Cùng với mức sống ngày càng cao của người dân thì nhu cầu
về hoa cũng ngày càng tăng, diện tích trồng hoa ngày một tăng và nghề trồng lan hồ
điệp đã trở thành con đường làm giàu chắc chắn cho nhiều công ty và doanh nghiệp
ở Trung Quốc [4].
Thị trường xuất khẩu hoa lan trên Thế giới ngày càng mở rộng. Kim ngạch
thương mại hoa lan cắt cành trên Thế giới năm 2000 đạt 150 triệu USD trong đó
Nhật Bản là một trong những nước nhập khẩu hoa lan cắt cành số một Thế giới, thứ
hai là Ý, tiếp đến là Pháp, Đức đứng thứ 4 và thứ 5 là Mỹ, ở các nước đứng thứ 6
đến 17 lần lượt là: Anh, Hà Lan, Áo, Bỉ, Hy Lạp, Ba Lan, Tây Ban Nha, Thụy Điển,
Canada, Phần Lan, Đan Mạch, Thụy Sĩ…
Thị trường xuất khẩu hoa lan hiện nay rất lớn và đầy triển vọng. Ngày nay
người tiêu dùng có xu hướng mua hoa lan có giá thành hạ mà không cần biết xuất
xứ vì vậy thị trường hoa lan Thế giới luôn có chỗ cho những quốc gia miễn là hạ
giá, hoa bền lâu, màu sắc đúng thị hiếu của đa số người tiêu dùng [4].

1.3.2. Tình hình nuôi trồng và sản xuất hoa lan ờ Việt Nam
Riêng về hoa lan, các loại hoa lan rừng đẹp đến mức độ lộng lẫy đã đến với
người dân Việt Nam từ xa xưa. Hoa lan đến với người Việt Nam từ những bông hoa
đẹp, những vị thuốc chữa bệnh được lưu truyền trong dân gian từ đời này qua đời
khác cho đến ngày nay. Hoa lan là một loại hoa quý, đối với người Việt Nam, hoa
lan tượng trưng cho sự trong sạch, thanh cao. Sự hiểu biết về hoa lan còn ít và
những người chơi lan trước đây chủ yếu là những người giàu có, những nho sĩ,
những cụ già nhàn rỗi [4].
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới ẩm phù hợp với sinh thái của các loài hoa lan,
nhưng bối cảnh lịch sử của nền kinh tế còn chưa phát triển nên hầu như các cây lan
ở Việt Nam chỉ dừng lại ở dạng trồng để thưởng thức. Việc nuôi trồng, kinh doanh
11


hoa lan như các nước Châu Âu và Châu Á phát triển chưa được quan tâm đúng
mức.
Vấn đề kinh doanh xuất khẩu hoa lan đối với Việt Nam cho đến ngày nay
vẫn đang ở giai đoạn đầu. Việt Nam có hai miền Nam, Bắc có khí hậu khác nhau rõ
rệt. Miền Bắc có mùa đông lạnh và có bão, miền Nam khí hậu ôn hòa, ấm áp. Vì thế
để sản xuất lan kinh doanh ở miền Bắc chỉ thích hợp với việc trồng các loại lan chủ
yếu khai thác từ các loại lan rừng và nuôi trồng với số lượng ít để trưng bày thưởng
thức, còn vấn đề nuôi trồng trên quy mô công nghiệp không thích hợp, do có bão
dấn đến giá thành cao, hiệu quả kinh tế kém.
Hiện nay, hàng năm vào dịp Tết Nguyên Đán, Hà Nội và thành phố Hồ Chí
Minh đều mở hội hoa xuân trong đó có trưng bày nhiều loại hoa lan. Việc tổ chức
chấm thi hoa lan, trao giải, trao huy chương cho các nghệ nhân nuôi trồng hoa lan
có hoa lan đẹp diễn ra thường kì, có tác dụng kích thích người trồng hoa lan, phong
trào nuôi trồng hoa lan ngày càng phát triển và nuôi trồng hoa dần dần bước sang
giai đoạn kinh doanh, xuất khẩu. Các công ty như công ty rau quả xuất khẩu Trung
nông – Vegetexco và công ty thủ công mỹ nghệ tổng hợp xuất khẩu thành phố Hồ

Chí Minh (Atex – Saigon) là những công ty tham gia xuất khẩu lần đầu tiên ở Việt
Nam.
Tại thành phố Hồ Chí Minh từ năm 1983 – 1984 bắt đầu có hàng loạt các cơ
quan đóng tại thành phố tổ chức thử nghiệm nuôi trồng trên quy mô lớn để xuất
khẩu. Các vườn lan đáng kể là vườn lan T78, vườn lan của Cục Quản lý giáo dục
Bộ tham mưu, vườn lan cửa hàng dân dụng.
Về lan giống từ năm 1976, Trung tâm Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tổ
chức phòng nuôi cấy phong lan và tạo ra hàng loạt cây con phong lan bằng phương
pháp cấy mô.
Năm 1987, Ủy ban khoa học thành phố Hồ Chí Minh tổ chức nghiên cứu đề
tài và kinh tế kỹ thuật khoa học lan xuất khẩu. Và cũng năm 1987, thành phố quyết
định thành lập công ty phong lan xuất khẩu trực thuộc sở Lâm nghiệp. Sau đó Hội
hoa lan, cây cảnh thành phố ra đời, thường xuyên mở những hội thảo về lan, về cây
cảnh [4].
12


Việc xuất khẩu hoa lan ở Việt Nam chính thức được thực hiện vào năm 1980
do công ty Vegetexco sản xuất lan cắt cành Đà Lạt (Cymbidium) và các loại hoa
khác như hoa lay ơn (Gladiolus communis L.), hoa ly. Các công ty ở Việt Nam lần
đầu tiên cử đại diện đi dự hội nghị hoa quốc tế tổ chức tại Bratistava (Tiệp Khắc) và
bắt đầu quan hệ với các công ty hoa Unicoop (Tiệp Khắc), Inovator (Hunggari) về
hoa lan cảnh [4].
Tại Đà Lạt có khoảng 500 gia đình nuôi trồng hoa lan, trong đó có hơn 150
gia đình tham gia vào Hội hoa lan của thành phố Đà Lạt. Ủy ban Khoa học Kỹ thuật
của Đà Lạt, phòng Sinh học của Viện hạt nhân Đà Lạt cũng tham gia tích cực vào
việc lập các cơ sở cấy mô phong lan và sưu tầm các loại lan. Hiện nay Đà Lạt đã thu
thập được 200 loài có khả năng nuôi trồng xuất khẩu.
Đà Lạt hiện nay đang trở thành điểm thu hút các nhà đầu tư kinh doanh hoa
do sự thành công của các công ty nước ngoài đầu tư vào cách đây hơn 10 năm như

Dalat Hasfarm chuyên trồng hoa ôn đới, công ty Lâm Thăng – Đài Loan chuyên về
Phalaenopsis (lan hồ điệp).
Vùng Sa Pa, Tam Đảo rất thích hợp cho việc trồng hoa ôn đới như hồng,
lyly, lay ơn… Riêng hoa lan nhiệt đới, qua các năm 2003 – 2005 đã tăng từ từ 20 ha
đến 50 ha (tăng 150%). Xu hướng tiêu dùng hoa lan đã tăng lên đáng kể và dự đoán
sẽ tăng mạnh trong những năm tới do Việt Nam đã trở thành thành viên của Tổ
chức Thương mại Quốc tế WTO sẽ là yếu tố tăng mạnh đầu tư nước ngoài làm tăng
các dịch vụ du lịch, tổ chức hội nghị quốc tế [4].
1.4. Sơ lược về nhân giống in vitro
1.4.1. Khái niệm
Thuật ngữ nhân giống in vitro (In vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân
giống (Micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật
nuôi cấy để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của cây, có
kích thước nhỏ, sinh trưởng ở các điều kiện vô trùng trong ống nghiệm hoặc các
loại bình nuôi cấy khác [8].

13


1.4.2. Vai trò và ý nghĩa của nhân giống in vitro
Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật có vai trò và ý nghĩa vô cùng to
lớn trong việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản cũng như đóng góp trực tiếp cho
thực tiễn sản xuất và đời sống.
Về mặt lý luận, nuôi cấy mô đã mở ra khả năng lớn cho việc tìm hiểu kĩ
lưỡng về bản chất của sự sống, mối tương tác giữa các bộ phận trong cây, tạo điều
kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển, từ đó
tìm ra các biện pháp thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng mong
muốn. Phương pháp nuôi cấy mô còn giúp chúng ta giải quyết nhiều vấn đề về bệnh
lý, giúp cho việc phòng bệnh thực vật tốt hơn [8].
Về mặt thực tiễn sản xuất, phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục

tráng, nhân nhanh các giống cây trồng và để chọn giống cây trồng. Nuôi cấy mô còn
có triển vọng sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học, bằng phương pháp này chỉ
sau một thời gian ngắn chúng ta có thể tạo được một sinh khối lớn vẫn giữ nguyên
thuộc tính của chúng, tức vẫn có khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp.
Qua đó, chúng ta thấy ngoài ý nghĩa về mặt lý luận sinh học cơ bản, phương
pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn và có vai trò hết sức
quan trọng đối với thực tiễn sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Việc ứng dụng
phương pháp này thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt
[3].
1.4.3. Các điều kiện và môi trường ảnh hưởng đến hiệu quả nhân giống in vitro
1.4.3.1. Nguồn gốc của mẫu vật
Theo Nguyễn Hoàng Lộc quy trình nhân giống in vitro có 3 giai đoạn: cấy
gây, nhân nhanh, chuẩn bị ra đất và kết quả của việc cấy gây phụ thuộc vào nguồn
gốc của mẫu vật. Đỉnh sinh trưởng, chồi nách là nguồn mẫu vật quan trọng nhất, sau
đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá [10]. Điều này được khẳng định trong
nghiên cứu của Styer và Chin (1983), khi hai tác giả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để
thu cây sạch bệnh. Tuy nhiên kết quả cho thấy tỷ lệ thành công phụ thuộc vào đỉnh
sinh trưởng của chồi ngọn hay chồi bên của cây.

14


1.4.3.2. Độ lớn của mẫu vật
Trong việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì độ lớn của chồi có ý nghĩa rất lớn.
Độ lớn của chồi có liên quan đến tỷ lệ sống và ổn định về mặt di truyền. Nếu độ lớn
tăng thì tỷ lệ sống, tính ổn định tăng và ngược lại [9].
1.4.3.3. Phương pháp khử trùng mẫu
Hầu hết các mô, cơ quan thực vật đều được nuôi cấy nhưng mức độ thành
công phụ thuộc vào môi trường sử dụng, loài thực vật được nuôi và phương pháp
khử trùng mẫu. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho lượng mẫu cấy vô trùng

vẫn còn khả năng sinh trưởng.
Hiện nay có rất nhiều hóa chất được sử dụng để khử trùng như: dung dịch
thuốc diệt nấm, cồn 70%, hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, dung dịch brom,
chlorur thủy ngân, thuốc kháng sinh,… Tùy vào đối tượng mà ta lựa chọn loại tác
nhân vô trùng và thời gian khử trùng thích hợp [9].
1.4.3.4. Sự hóa nâu trong nuôi cấy
Một số loài thực vật, mẫu cấy có thể bị hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ
khi bắt đầu nuôi cấy (Basu và Chand, 1998; Mathur và Ahuja, 1991;…). Khi mẫu
vật bị hóa nâu thì sự sinh trưởng của mẫu bị ức chế, nếu để lâu ngày mẫu sẽ chết.
Sự hóa nâu của mẫu là kết quả của sự oxy hóa hợp chất polyphenol từ mẫu cấy. Đây
là hợp chất tự nhiên được biết đến như một tác nhân ức chế sinh trưởng. Có nhiều
cách để ngăn cản hiện tượng này trong nuôi cấy in vitro và một trong những cách đó
là cấy chuyển mẫu sang môi trường mới hai tuần một lần (Mathur và cs, 1988; Rout
và cs, 1999), làm như vậy thì lượng lớn phenol không được tích tụ [8].
1.4.3.5. Ánh sáng, nhiệt độ
Ánh sáng là yếu tố cần thiết cho quá trình phát sinh chồi, rễ và phát sinh phôi
vô tính. Cả chất lượng và cường độ ánh sáng đều rất quan trọng, liên quan đến sự
thành công của nuôi cấy. Ánh sáng đèn huỳnh quang thường được sử dụng: ánh
sáng xanh đẩy mạnh phát sinh chồi; ánh sáng đỏ gây ra rễ của nhiều loài
(Murashige, 1977). Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh
hưởng của chu kì chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng). Thời gian
15


chiếu sáng thường 12 – 16h/ngày, cường độ 8 -12 Wm-2. Nhiệt độ nuôi cấy thường
25 0C, đối với cây nhiệt đới thì nền nhiệt cao hơn 27 – 30 0C (Tisserart, 1981).
1.4.3.6. Môi trường nuôi cấy cơ bản
Có hàng trăm loại môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây
khác nhau nhưng có thể phân làm ba loại gồm môi trường White, Knop; B5; MS.
Cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng sẽ giúp mẫu nuôi cấy có khả năng tái sinh và hiệu

quả nuôi cấy cao. Hiện nay môi trường MS được sử dụng rộng rãi nhất [17].
1.4.3.7. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một
hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần
thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức
sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi
tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của
chúng. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính:
Nhóm auxin: môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau, IAA là
auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin
nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân
tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin – oxydase) không có tác dụng.
Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc
nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng
(sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn. Các auxin được hòa tan
hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng [7].
Nhóm cytokinin: liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi… Trong
môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ
mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ
[7]. Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu
đến sự phân chia tế bào , sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy
mô như Zeatin và 2 – iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các
cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Tỷ lệ

16


auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong
các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và
rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự

sinh sản chồi và chồi nách [18].
1.4.3.8. Hàm lượng đường sucrose
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro chủ yếu sống theo phương thức dị
dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện
ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào mt nuôi
cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon thông dụng nhất đã được
kiểm chứng là sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng phụ thuộc
vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào)
và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước).
Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa và môi trường nuôi cấy và cho
hiệu quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn
fructose cho hiêu quả kém hơn. Sucrose trong khi khử trùng mt, bị biến đổi thành
glucose và fructose. Trong tiến trình này, đầu tiên glucose sẽ được sử dụng và sau
đó là fructose. Các carbonhydrate khác như: lactose, galactose, rafinose, maltose,
cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm nhưng tỏ ra kém hiệu
quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt.
1.4.3.9. Tốc độ lắc trong nuôi cấy lỏng
Nuôi cấy lỏng lắc giúp tăng tối đa việc phát triển của mô qua việc loại trừ
hiện tượng phân cực của nó; ngăn chặn các ức chế do mô tiết ra bằng cách hòa tan
các chất này; giúp môi trường thoáng khí, qua đó sẽ hô hấp, tổng hợp protein hấp
thụ muối khoáng của tế bào; môi trường lỏng sẽ gia tăng bề mặt tiếp xúc của mô đối
với các chất dinh dưỡng. Tốc độ lắc trong nuôi cấy lỏng liên quan nhiều đến khả
năng tăng sinh tế bào. Đó là bởi tốc độ lắc ảnh hưởng đến sự lưu thông trong bình
nuôi cấy và nồng độ oxy hoà tan (DO) trong bình.

17


1.4.3.10. Độ pH môi trường nuôi cấy ban đầu
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong

nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần
thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu
hết các môi trường nuôi cấy pH: 5,0 – 6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu.
Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng
đông đặc của agar. Hầu hết các môi trường nuôi cấy nghèo đệm, vì thế chúng làm
dao động giá trị pH, sự giao động này có thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài
ngày và sự sinh trưởng của các tế bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp.
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận
các chất sinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng môi trường nhất
định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về
mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy callus của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5
– 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị từ 6,0 – 6,5. Đặc biệt khi sử dụng các
loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định
phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5 – 6,5. Những
thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc.
1.5. Ứng dụng của nuôi cấy lỏng trong nhân giống in vitro và bảo tồn các loài
lan
1.5.1. Thế giới
Nghiên cứu của Guek Eng Sim và cs tại trường Đại học School of Chemical
and Life Sciences, Singapore Polytechnic về sự cảm ứng tạo hoa in vitro ở
Dendrobium Madame Thong-In (Orchidaceae) từ cây con. Trong nghiên cứu này,
Guek Eng Sim phân tích mức độ và loại cytokinin nội sinh hiện diện trong mô của
D. Madame Thong-In nuôi cấy dưới cả trạng thái sinh dưỡng và ra hoa. Phương
pháp thí nghiệm để cảm ứng tạo hoa ở D. Madame Thong-In gồm có 3 bước chủ
yếu. Bước 1, bao gồm từ lúc hạt nảy mầm trong môi trường cơ bản đến lúc phát
triển thành protocorm. Bước 2, cây con cao từ 2-3 mm có một vài lá nhỏ được
chuyển qua môi trường lỏng chứa BA (4,4 mg/l) và trong môi trường này cây con
đã chuyển sang giai đoạn sinh sản, một vài cây đã có thể sinh sản chồi hoa. Bước 3,
18

chuyển sang môi trường 2 lớp BA dành riêng cho sự phát triển của hoa, môi trường
này sẽ giúp hoa nở tốt hơn [14].
Nghiên cứu của Meneerattenarungroj và cs về ảnh hưởng của đường và nồng
độ BA đến protocorm của lan Dendrobium gasratiosissimum Rchb.f. Protocorm của
lan này phát triển trong môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 0,3 mg/l NAA trong
vòng 2 tháng. Sau đó lấy các phần tái sinh mạnh chuyển sang nuôi cấy trong môi
trường lỏng có bổ sung 1mg/l BA trong vòng 1 tuần và tỷ lệ này sẽ đạt khoảng 67%
trong vòng 2 tuần.
Nghiên cứu của Khin Lay Nge và cs về ảnh hưởng của nhóm chất kích thích
đến sự phát triển của mô tế bào hoa lan. Sự phát triển protocorm của lan trong môi
trường lỏng làm tăng gấp 15 lần trong sự có mặt của chitosan và sự cô cạn tốt nhất
ở 15 ppm. Sự phát triển protocorm của lan về cơ bản là khác với sự phát triển của tế
bào chồi, rễ trong môi trường đặc. Hiệu quả tốt nhất là sự phát sinh 5-7 cây trong 12
tuần quan sát trong sự có mặt của 20 ppm khi sử dụng 10Kda chitosan [15].
Nghiên cứu của Puchooa về so sánh sự phát triển trong môi trường nuôi cấy
in vitro khác nhau tế bào lan Dendrobium. Trong tất cả môi trường nghiên cứu để
tăng sinh protocorm, số lượng tạo nhiều nhất là trong môi trường lỏng MS có bổ
sung 0,1 mg/l BA, 1 mg/l NAA và 15% nước dừa với tốc độ lắc 80 vòng/phút. Các
chồi tái sinh này sẽ được chuyển sang môi trường nuôi cấy đặc có bổ sung 0,1 mg/l
BA, 1 mg/l NAA, 15% nước dừa và 10g hormon của khoai tây. Các chồi sẽ phát
triển rễ trong 4 tuần trên cùng môi trường [12].
1.5.2. Việt Nam
Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang Việt thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên
đã nghiên cứu nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trong môi trường lỏng. Mô phân sinh
hoa tự phát hoa sau 11 – 13 ngày sinh trưởng, có chiều dài khoảng 10 – 13 mm và
được đặt vào Erlen 50ml chứa 5ml môi trường MS lỏng với zeatin 1mg/l kết hợp
IAA 0,1; 0,5 mg/l hay với GA3 1mg/l (lắc liên tục với tốc độ 80 vòng/phút). Sau 4
tuần nuôi cấy, mô phân sinh hoa tự ngừng tăng trưởng trong môi trường MS không
hormone, trong khi trong môi trường MS có bổ sung IAA 0,5mg/l, zeatin 1mg/l và

19


GA3 1mg/l mô phân sinh hoa tự hoạt động mạnh để kéo dài trục phát hoa và cho
nhiều mô phân sinh hoa [13].
Nghiên cứu của Hồ Thiên Hoàng và cs, trường Đại học Công nghiệp thành
phố Hồ Chí Minh về khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến
quá trình nhân giống in vitro lan Ngọc Điểm Đỏ Rhynchostylis gigantea rild. Var.
Rubra (red). Cụm chồi lan Ngọc Điểm 6 tuần tuổi, cao 1cm, được tách thành từng
mảnh nhỏ, nuôi cấy trên môi trường Knudson C bổ sung 1mg/l BA và 0,5 mg/l
NAA, sau 6 tuần các protocorm bắt đầu hình thành ở vị trí vết cắt. Trên môi trường
có bổ sung 1 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA thì các protocorm tăng sinh rất nhanh,
đường kính khối protocorm có thể lên tới 1,5 cm. Protocorm sau khi tăng sinh được
cấy chuyển sang môi trường có bổ sung 1mg/l BA và 0,05mg/l NAA để biệt hóa
thành chồi. Cây con phát triển hoàn chỉnh trên môi trường Knudson C cơ bản, sau 8
tuần có thể chuyển ra vườn ươm [5].

20


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) thuộc Bộ Lan
(Orchidales), họ lan (Orchidaceae).

Hình 2.1. Lan nhất điểm hồng
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm

21


2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối nuôi cấy ban đầu
Sử dụng protocorm (2 tháng tuổi, được nuôi cấy trên môi trường MS + 0,8%
agar + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + 2 mg/l BAP + 1 mg/l NAA) cấy vào
bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MS + 15% nước dừa + 30 g/l đường sucrose +
2mg/l BAP + 1mg/l NAA với lượng sinh khối nuôi cấy ban đầu là 1, 3, 5, 7 gam để
khảo sát khả năng nhân nhanh protocorm in vitro.
2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc
Sử dụng protocorm (2 tháng tuổi, được nuôi cấy trên môi trường MS + 0,8%
agar + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + 2 mg/l BAP + 1 mg/l NAA) cấy vào
bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MS + 15% nước dừa + 30 g/l đường sucrose +
2mg/l BAP + 1mg/l NAA với lượng sinh khối nuôi cấy ban đầu (vừa khảo sát), đặt
trên máy lắc, khảo sát tốc độ lắc (80, 100, 120) vòng/ phút
2.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường sucrose
Sử dụng protocorm (2 tháng tuổi, được nuôi cấy trên môi trường MS + 0,8%
agar + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + 2 mg/l BAP + 1 mg/l NAA) nuôi cấy
trong bình tam giác 250ml chứa 50ml MS + 15% nước dừa + 2mg/l BAP + 1mg/l
NAA với lượng sinh khối nuôi cấy ban đầu và hàm lượng đường sucrose (vừa khảo
sát), đặt trên máy lắc, khảo sát tốc độ lắc (80, 100, 120) vòng/ phút
2.2.2.4. Khảo sát khả năng nhân nhanh chồi
Protocorm thu được sau khi nuôi cấy trên môi trường lỏng thích hợp chuyển
sang môi trường MS + 0,8% agar + 15% nước dừa + 1% than hoạt tính + 30 g/l
đường sucrose phối hợp với tổ hợp KIN và BAP hoặc KIN và IBA để đánh giá khả
năng nhân chồi.
Tất cả các môi trường được điều chỉnh ở mức pH = 5,8 trước khi khử trùng
trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 0C trong 20 phút. Điều kiện phòng nuôi cấy mô và tế
bào thực vật được duy trì ở nhiệt độ 25 0C ± 2 0C, cường độ ánh sáng đèn huỳnh

quang 1500 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày.

22


2.2.3. Xử lý số liệu
Kết quả được phân tích và xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft excel
2007 bằng phương pháp thống kê sinh học.

23


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện và môi trường nuôi cấy đến khả năng
nhân protocorm của lan nhất điểm hồng
Hạt lan nảy mầm có thể sản xuất ra một khối tế bào chưa phân hóa rõ ràng
được gọi là protocorm. Tất cả những protocorm này sẽ tiếp tục phát triển trong
nhiều tuần, nhiều tháng hay thậm chí nhiều năm phụ thuộc từng loài cho đến khi đủ
lớn để tạo lá và rễ (McKendrick, 2000) [16]. Vì vậy việc tìm ra môi trường, điều
kiện nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy lỏng để nhân nhanh protocorm, làm cơ sở
cho việc sản xuất nhanh giống lan nhất điểm hồng có ý nghĩa thực tiễn rất lớn.
3.1.1. Ảnh hưởng của lượng sinh khối protocorm nuôi cấy ban đầu
Protocorm (2 tháng tuổi) được nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml chứa 50
ml môi trường MS + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + 2 mg/l BAP + 1 mg/l
NAA với lượng mẫu nuôi cấy ban đầu là 1, 3, 5, 7 gam. Kết quả thu được sau 15
ngày được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của lượng mẫu đưa vào đến khả năng nhân nhanh protocorm
lan nhất điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy
Lượng mẫu
nuôi cấy ban

đầu (g)
1
3
5
7

Lượng mẫu (protocorm) sau 15
ngày (g)

Phần trăm lượng mẫu tăng
sau 15 ngày nuôi cấy

1.59
4.76
7.82
8.8

59.00%
58.56%
56.33%
25.71%

24


70%
60%

59.00%

58.56%

56.33%

50%

40%
30%

25.71%

20%
10%

Phần trăm
lượng mẫu
tăng sau 15
ngày nuôi
cấy

0%
1 gam

3 gam

5 gam

7 gam

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của lượng mẫu đưa vào đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan nhất điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy.
Kết quả bảng 3.1 và biểu đồ 3.1 cho thấy, lượng mẫu đưa vào là có tác động
đến sự hình thành protocorm. Với cùng 50ml môi trường lỏng và nuôi cấy trong
điều kiện như nhau thì sau 15 ngày nuôi cấy, lượng mẫu nuôi cấy ban đầu là 1 gam
có tỷ lệ tăng cao nhất (59%), tiếp đến là 3 gam (58,56%) và 5 gam (56,33%) với tỷ
lệ tăng xấp xỉ nhau, thấp nhất là mẫu 7 gam với tỷ lệ tăng chỉ đạt 25,71% đồng thời
protocorm bị hóa nâu. Như vậy, qua kết quả khảo sát chúng tôi nhận thấy lượng
mẫu nuôi cấy ban đầu 5 gam là thích hợp nhất cho nhân nhanh protocorm.

25