Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH
KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN
THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
CURCUMINOID
Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria
Roscoe)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
Mã số: 9420112

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC


ii

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
BAP

6-benzylaminopurine

CoA

coezyme A

cs

cộng sự

CTAB

hexadecyltrimethylammonium bromide

CzDCS

Curcuma zedoaria DCS

CzCURS1

Curcuma zedoaria CURS1

CzCURS2

Curcuma zedoaria CURS2

CzCURS3

Curcuma zedoaria CURS3

ĐC

đối chứng

DPPH

1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

dw

dry weight (khối lượng khô)

FRAP

ferric reducing antioxidant power

fw

fresh weight (khối lượng tươi)

HPLC

high-performance liquid chromatography

IBA

3-indolebutyric acid

KIN

kinetin

MAPK

mitogen-activated protein kinase

MeJA

methyl jasmonate

MS

Murashige and Skoog (1962)

NAA

naphthaleneacetic acid

NO

nitric oxide

PAA

phenyl acetic acid

ROS

reactive oxygen species

SA

salicylic acid

SNP

sodium nitroprusside

YE

yeast extract (dịch chiết nấm men)


iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .................................................................... viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................ 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.......................................................................... 2
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................................ 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 5
1.1. CÂY NGHỆ ĐEN ...................................................................................... 5
1.1.1. Đặc điểm thực vật học......................................................................... 5
1.1.2. Phân bố ................................................................................................ 5
1.1.3. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen ....................................... 6
1.1.3.1. Tinh dầu ........................................................................................... 6
1.1.3.2. Curcuminoid..................................................................................... 7
1.1.4. Công dụng của nghệ đen ..................................................................... 8
1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau ........................................................................... 8
1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư................................................................... 9

1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan ........................................................................ 9
1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét ................................................ 9
1.1.4.5. Hoạt tính chống oxy hóa ................................................................ 10
1.1.4.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm............................................ 10
1.1.4.7. Các hoạt tính khác .......................................................................... 11
1.3. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG ......................................................... 15


iv

1.3.1. Elicitor ............................................................................................... 15
1.3.1.1. Khái niệm ....................................................................................... 15
1.3.1.2. Phân loại ......................................................................................... 15
1.3.1.3. Cơ chế kích kháng .......................................................................... 16
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự kích kháng ...................................... 18
1.3.2. Ứng dụng của elicitor ........................................................................ 20
1.3.2.1. Elicitor sinh học ............................................................................. 20
1.3.2.2. Elicitor phi sinh học ....................................................................... 26
1.4. CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID ........................ 27
1.4.1. Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid ...................................... 27
1.4.2. Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid ......... 31
1.4.2.1. Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS)...................... 31
1.4.2.2. Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS) .......................... 31
1.4.2.3. Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase .................................. 32
1.4.2.4. Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase ........................................ 33
1.4.2.5. Các gen khác .................................................................................. 34
1.4.3. Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp ........................ 35
1.4.4. Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor .................................. 37
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 39
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 39

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 39
2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen ......................................................... 40
2.2.1.1. Khử trùng mẫu vật ......................................................................... 40
2.2.1.2. Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro ....................................................... 41
2.2.1.3. Nuôi cấy callus ............................................................................... 41
2.2.1.4. Nuôi cấy tế bào .............................................................................. 41
2.2.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid ........................................... 42
2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số................................................................. 42


v

2.2.2.2. Khuếch đại PCR ............................................................................. 43
2.2.2.3. Tạo dòng và chú giải gen ............................................................... 43
2.2.2.4. Xây dựng cây phả hệ ...................................................................... 45
2.2.3. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid ............... 46
2.2.3.1. Xử lý elicitor .................................................................................. 46
2.2.3.2. Phân tích RT-PCR .......................................................................... 46
2.2.3.3. Phân tích HPLC ............................................................................. 48
2.2.4. Xử lý thống kê ................................................................................... 49
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 50
3.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO .......................................................... 50
3.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro ..................................................... 50
3.1.1.1. Tái sinh chồi ................................................................................... 50
3.1.1.2. Tạo rễ in vitro ................................................................................. 52
3.1.2. Nuôi cấy callus .................................................................................. 54
3.1.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN ........................................................ 54
3.1.2.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA ...................................................... 55
3.1.2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và AgNO3 ................................................... 55
3.1.3. Nuôi cấy tế bào nghệ đen .................................................................. 57

3.2. NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID .................... 59
3.2.1. Phân lập gen ...................................................................................... 59
3.2.2. Phân tích biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid.................... 68
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
CURCUMINOID ............................................................................................ 72
3.3.1. Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng
hợp curcuminoid ......................................................................................... 72
3.3.2. Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid ......................................... 74
3.3.3. Tích lũy curcumin ............................................................................. 76
Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 79


vi

4.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO .......................................................... 79
4.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro ..................................................... 79
4.1.2. Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen ............................................ 81
4.2. PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID ......................... 83
4.2.1. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid ................................................. 83
4.2.2. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid .............................. 85
4.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN
CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID ........................................... 85
4.3.1. Đặc điểm của các elicitor sử dụng trong nghiên cứu ........................ 85
4.3.1.1. Dịch chiết nấm men ....................................................................... 85
4.3.1.2. Salicylic acid .................................................................................. 87
4.3.2. Ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng của tế bào ...................... 89
4.3.3. Ảnh hưởng của elicitor lên mức độ biểu hiện gen ............................ 90
4.3.4. Ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin ........... 92
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 95
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 95

KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 95
DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................... 96
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 97


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại các elicitor khác nhau ..................................................... 17
Bảng 1.2. Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất
thứ cấp trong nuôi cấy in vitro. ....................................................................... 21
Bảng 2.1. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen
tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen................................................................... 45
Bảng 2.2. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các
gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen ............................................................ 47
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in
vitro nguyên vẹn. ............................................................................................. 51
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in
vitro đã được chẻ đôi ....................................................................................... 52
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro ........ 53
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng
của callus nghệ đen ......................................................................................... 55
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng
của callus nghệ đen ......................................................................................... 56
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh
trưởng của callus nghệ đen.............................................................................. 56
Bảng 3.7. Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen
CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ
đen ................................................................................................................... 70
Bảng 3.8. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ở các gen tổng hợp

curcuminoid ..................................................................................................... 76
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các elicitor lên sinh trưởng và tích lũy curcumin trong
tế bào nghệ đen ................................................................................................ 77


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin .................................................. 8
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng .. 30
Hình 1.3. Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ở
nghệ vàng. ....................................................................................................... 32
Hình 2.1. Cây nghệ đen. .................................................................................. 39
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm. ............................................................................ 40
Hình 2.3. Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ). ......................................... 44
Hình 2.4. Vị trí của primer xuôi và ngược trên gen CzCURS1 ...................... 48
Hình 3.1. Cây nghệ đen in vitro 2 tháng tuổi. ................................................. 53
Hình 3.2. Callus nghệ đen 2 tuần tuổi sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 1
mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) và đối chứng sinh trưởng trên môi trường
có 2,4-D 3 mg/L kết hợp với BAP 3 mg/L (B). .............................................. 57
Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen. ............................... 58
Hình 3.4. Tế bào nghệ đen nuôi trong bình tam giác chứa môi trường MS bổ
sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L ................................................................ 59
Hình 3.5. Sinh khối tươi (A) và khô (B) của tế bào nghệ đen. ....................... 59
Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA
tổng số của nghệ đen ....................................................................................... 61
Hình 3.7. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp
curcuminoid ở nghệ đen. ................................................................................. 61
Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzDCS
(MF663785) ở nghệ đen và DCS ở nghệ vàng (AB495006.1). ...................... 62

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS1
(MF402846) ở nghệ đen và CURS1 ở nghệ vàng (AB495007.1). ................. 63
Hình 3.10. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS2
(MF402846) ở nghệ đen và CURS2 ở nghệ vàng (AB506762.1). .................. 64


ix

Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS3
(NCBI: MF987835) ở nghệ đen và CURS3 ở nghệ vàng (NCBI: AB506763.1).
......................................................................................................................... 65
Hình 3.12. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzDCS và DCS
(C0SVZ5.1). .................................................................................................... 66
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS1 và CURS1
(AJF45913.1)................................................................................................... 66
Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS2 và CURS2
(BAW81545.1). ............................................................................................... 67
Hình 3.15. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS3 và CURS3
(AJF45914.1)................................................................................................... 67
Hình 3.16. Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid..................... 68
Hình 3.17. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1,
CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. ................ 70
Hình 3.18. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. ................................................... 71
Hình 3.19. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen.......................................... 71
Hình 3.20. Phổ HPLC của dịch chiết callus nghệ đen. ................................... 72
Hình 3.21. RNA tổng số của các mẫu tế bào sau khi được xử lý elicitor ....... 73
Hình 3.22. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzCURS1 (A) và
CzCURS3 (B) sau khi được xử lý elicitor. ...................................................... 74
Hình 3.23. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp
curcuminoid ở nghệ đen. ................................................................................. 75

Hình 3.24. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. ................................................... 78
Hình 3.25. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày
nuôi cấy. .......................................................................................................... 78
Hình 3.26. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với SA 100 µM sau 5
ngày nuôi cấy. ................................................................................................. 79


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae)
còn được gọi là nga truật, tam nại hay ngải tím là loài thảo dược bản địa ở Ấn
Độ và Indonesia, nhưng cũng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản,
Brazil, Nepal, Thái Lan [78] và Việt Nam [7]. Nghệ đen từ lâu đã được sử dụng
trong y học cổ truyền của nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các
bệnh về da như các vết thương và các vết lở loét, cũng như sự bất thường của
chu kỳ kinh nguyệt [157].
Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các dẫn xuất của nó
như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin là nhóm hợp chất chính
tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của củ nghệ [76]. Các nghiên cứu gần
đây cho thấy curcuminoid, đặc biệt là curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý
rộng như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống
tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u và bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid)
[14], [58], [116]. Curcuminoid được chiết xuất từ củ (thân rễ) của các loài nghệ
khác nhau, chẳng hạn C. caesia [24], C. amada [50], C. longa [67], C.
aromatica [74] và C. zedoaria [78]. Curcuminoid hiện đang được sử dụng như
dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư
trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến… [35]. Nhiều
nghiên cứu cũng đã cho thấy curcuminoid có độ an toàn cao, dung nạp tốt với

cơ thể, không độc đến liều 8 g/kg thể trọng [46].
Hiện nay, các gen tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid ở nghệ
vàng (C. longa) đã được xác định và phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai
nhóm gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase là diketide-CoA
synthase (DCS) và các curcumin synthase (CURS1, CURS2 và CURS3) [66],
[67]. Trước đó, Brand và cs. (2006) cũng đã mô tả một gen mã hóa enzyme


2

type III polyketide synthase khác là chalcone synthase (CHS) có ở cây
Wachendorfia thyrsiflora, và gen này cũng tham gia vào quá trình tổng hợp
curcuminoid [28]. Behar và cs. (2016) khi phân tích biểu hiện của các gen tham
gia tổng hợp curcuminoid ở C. caesia bao gồm DCS, CURS, CURS2, CURS3
và CHS1 đã nhận thấy mức độ biểu hiện của chúng trong củ cao hơn ở lá [24].
Tuy nhiên, các gen tham gia tổng hợp curcuminoid ở loài nghệ đen đến nay vẫn
chưa được công bố.
Elicitor là những chất hóa học được dùng để tác động vào con đường
chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp các chất có giá trị dược
phẩm trong nuôi cấy tế bào thực vật [62], [111]. Theo Abraham và cs (2011),
dịch chiết nấm men (YE) đã được ứng dụng trong nuôi cấy in vitro thực vật do
khả năng kích thích cơ chế bảo vệ, tăng sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp
có hoạt tính sinh học [9]. Salicilic acid (SA) được xem là một trong những tín
hiệu quan trọng trong phản ứng tự vệ của cây và cũng được sử dụng rộng rãi
trong sản xuất các chất chuyển hóa từ nuôi cấy tế bào thực vật [22]. Methyl
jasmonate (MeJA) cũng đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan
trọng trong việc truyền tín hiệu điều chỉnh khả năng phòng vệ của thực vật và
có thể kích thích sự sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp trong nuôi cấy tế bào
[158], [169].
Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng

của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình
tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm
xác định các loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng để điều hòa tăng biểu
hiện của các gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase trong con đường
phenylpropanoid ở tế bào nghệ đen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ cung
cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò của SA, YE và MeJA như là những chất
điều hòa dương tính của biểu hiện gen ở loài dược liệu có giá trị này.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU


3

Mục tiêu lý thuyết
Cải thiện mức độ biểu hiện của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và
CzCURS3 tham gia trong con đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng
hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro bằng một số elicitor.
Mục tiêu thực nghiệm
Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính của nhóm
chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ở tế bào nghệ đen
nuôi cấy in vitro.
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
- Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao bằng cách bổ
sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Phân lập các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS tham gia
trong quá trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) ở nghệ đen.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor như YE, SA và MeJA lên mức
độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và khả năng tích lũy curcumin
trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro.
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Luận án có các đóng góp mới như sau:
- Các nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây nghệ đen trước đây đều chưa
sử dụng AgNO3 để tăng hiệu quả nuôi cấy, trong nghiên cứu này, bổ sung
AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo cây in vitro, nuôi cấy
callus) đều làm tăng hiệu quả của quá trình nuôi cấy so với các nghiên cứu
trước đây.
- Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình tổng hợp
curcuminoid, các gen này tương đồng 99% so với các gen tương ứng ở cây
nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã số lần lượt là


4

MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835. Các gen này đều có sự biểu
hiện ở trong củ và callus của cây nghệ đen.
- Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp curcumin ở cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của gen này quyết định
trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được.
- Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của một số loại elicitor (dịch chiết nấm
men và salicilic acid) lên khả năng tích lũy curcumin và mức độ biểu hiện của
các gen liên quan. Giá trị tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1
g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu hiện cao hơn 2,78 lần so với đối chứng.


5

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY NGHỆ ĐEN
1.1.1. Đặc điểm thực vật học

Nghệ đen là cây thân thảo sống nhiều năm hoặc hàng năm, cao khoảng 11,5m; có củ hình trứng, có khía chạy dọc, củ tỏa theo hình chân vịt; cây mẫm
và chắc. Cây có nhiều củ, ngoài củ chính ra còn có những củ phụ, vỏ củ có màu
xám, bên trong củ có màu vàng lưu huỳnh nhạt hoặc vàng sáng, khi già có nhiều
vòng màu xanh tím. Củ nghệ khô có mùi thơm camphor nhẹ và có vị đắng hơi
cay. Chồi lá nghệ đen có thể cao tới 1 m với 5 lá. Lá có bẹ ôm vào thân cây
phía dưới, dài 30-60 cm, rộng 7-8 cm, dọc theo gân chính giữa có những đốm
màu đỏ, cuống lá ngắn hay hầu như không có. Cụm hoa mọc ngang, dài 15-20
cm. Lá bắc phía dưới hình trứng hay hình mác tù, màu xanh lục nhạt, mép đỏ;
lá bắc phía trên màu vàng nhạt, đầu lá màu đỏ, không mang hoa. Hoa màu vàng,
đài hoa có thùy hình mác tù dài 15 mm, thùy giữa nhọn, cánh môi hẹp ở phía
dưới nhưng hơi mở rộng phía trên [59], [105].
Trong hai tháng 3 và 4, các cụm hoa từ chồi nách của thân và chồi đỉnh
của củ bắt đầu vươn lên mặt đất. Trên các điểm gần cụm hoa thường phát triển
các chồi và từ đó bắt đầu hình thành các nhánh mới. Vào mùa thu, lá trên mặt
đất bắt đầu lụi. Từ tháng 11 đến tháng 12, các chất chuyển hóa thứ cấp ở củ bắt
đầu được tích lũy [7].
1.1.2. Phân bố
Cây nghệ đen được xem như là cây bản địa của vùng Đông Bắc Ấn Độ
nhưng hiện đang được trồng khắp nơi ở Ấn Độ, Malaysia, Nhật Bản, Trung
Quốc, Thái Lan và Việt Nam. Ở Việt Nam, nghệ đen phân bố ở các tỉnh miền
núi và trung du phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái… và một số tỉnh ở


6

miền Trung. Hiện nay, cây nghệ đen cũng đã được trồng tại một số địa phương
khác của miền Bắc và Tây Nguyên [6].
1.1.3. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen
Nghệ đen là loài thảo dược có củ chứa các nhóm chất chủ yếu như tinh
dầu (sesquiterpene và monosesquiterpene) và curcuminoid (curcumin,

demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin). Ngoài ra, cây nghệ còn chứa
một số hợp chất khác như tinh bột, chất dẻo và các chất có vị đắng như tannin,
flavonoiod [76].
1.1.3.1. Tinh dầu
Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của tinh
dầu củ nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như α-pinen, borneol, camphen,
camphor và cineol bên cạnh các sesquiterpene, nhưng không phân lập và xác
định được loại sesquiterpene nào. Xingyi (1999) khi nghiên cứu tinh dầu nghệ
đen ở Trung Quốc nhận thấy chúng chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó
chủ yếu là curzerenone (45,02%), curcumenol (8,31%), β-elemene (5,79%) và
isocurcumenol (4,05%) [164]. Trong tinh dầu nghệ đen sinh trưởng ở vùng
Đông Bắc Ấn Độ, Tohda và cs (2006) đã thu được 37 hợp chất, chiếm 87,7%
lượng tinh dầu tổng số, chủ yếu là curzerenone (22,3%), tiếp đến là 1,8-cineole
(15,9%) và germacrone (9%), β-tumerone (19,88%) và zingiberene (7,84%)
[155]. Duke và cs (2003) đã tìm thấy trong củ nghệ đen một số sesquiterpenoid
như ar-turmerone zederone, β-turmerone, curcumadiol, curcumenol, curcumol,
curcolone,

curdione,

curzerene,

curzerenone,

dehydrocurdione,

epicurzerenone, furanodiene, isocurcumenol, procurcumenol và zingiberene
[41].
Ở Việt Nam, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đã và đang
được quan tâm nghiên cứu. Thành phần chính trong tinh dầu củ nghệ thu được

tại Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [3], trong khi tinh dầu nghệ


7

đen ở Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) đều giàu epicurzerenon
và germacrone. Các hợp chất khác trong tinh dầu có hàm lượng thấp hơn đó là
α-cadinol, β-elemen, β-pinen, δ-cadinen, 1,8-cineol, 2,4-diisopropenyl-1-vinylcyclohexan,

benzofuran-6-ethyxyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5

isopropyl, camphor, germacrene, isoborneol, T-muurolol và zingiberen [1].
Thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở Đà Lạt có chứa các hợp
chất như γ-elemen (14,18-18,79%), curzeren (14,28-16,67%), và germacrone
(22,53-24,28%) [4].
1.1.3.2. Curcuminoid
Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu, các nghiên
cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng được quan tâm.
Syu và cs (1998) nhận thấy dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa các hợp
chất

nhóm

curcuminoid

là

curcumin,

demethoxycurcumin

và

bisdemethoxycurcumin (Hình 1.1) [149].
Curcumin (C21H20O6) là một hợp chất dạng tinh thể, màu vàng cam, có
trong các loài thực vật thuộc chi Curcuma, tan tốt trong các dung môi hữu cơ
như acetone, methanol, ethanol và isopropanol nhưng không tan trong nước.
Các dung môi hòa tan thích hợp để tách chiết curcumin là acetone,
dichloromethan, ethanol ethyl acetate, methanol, n-butanol và hexane.
Curcumin có thể được thu hồi bằng cách kết tinh từ dịch chiết [2], [60].


8
O

O

H3CO

OCH3

HO

Curcumin
O

OH

O
OCH3

HO

Demethoxycurcumin
O

HO

OH

O

Bisdemethoxycurcumin

OH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin.

1.1.4. Công dụng của nghệ đen
Cây nghệ đen được trồng phổ biến dùng làm rau hoặc đồ gia vị ở các nước
vùng Đông và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Malaysia, Thái
Lan và Việt Nam [59], [135]. Từ lâu, nghệ đen đã được sử dụng như một vị
thuốc trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nghệ đen cũng được kê
trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều trị hội chứng “Oketsu” gây
ra do tắc nghẽn mạch máu, điều kinh và cải thiện kinh nguyệt với nhiều dạng
pha chế khác nhau [96]. Ở Thái Lan, nghệ đen được dùng để làm dịu cơn đau
dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt hoặc làm se các vết thương ở
ngoài da [135]. Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong
gân, ung nhọt và vết thương [41]. Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa
giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa

bệnh phù hay phong hủi [64], [109]. Ngày nay, nhiều hoạt chất sinh học của
nghệ đen đã được chứng minh có tác dụng giảm đau, bảo vệ gan, kháng ung
thư, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống đột biến…
1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau


9

Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của hai loại sesquiterpene là
cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen trên thỏ và chuột thực nghiệm.
Kết quả cho thấy, cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối
[144]. De Navarro và cs (2002) khi nghiên cứu hoạt tính giảm đau của nghệ
đen ở Brazil đã nhận thấy hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao hơn
nhiều lần so với các loại thuốc giảm đau thông thường như aspirin và dipyrone
[38].
1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư
Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt
tính chống ung thư và kháng viêm. Khả năng ức chế sinh tổng hợp các chất
prostalandin và NO của dịch chiết nghệ được cho là có tiềm năng trong việc
kháng viêm và trong hóa trị liệu chống ung thư [59]. Seo và cs (2005) nhận
thấy dịch chiết nước của củ nghệ có hoạt tính chống di căn phổi của các tế bào
khối u ác tính B16 [140]. Syu và cs (1998) đã nghiên cứu hoạt tính kháng ung
thư của các curcuminoid thu được từ dịch chiết ethanol của củ nghệ. Kết quả
cho thấy, chúng có hoạt tính gây độc đối với các tế bào ung thư buồng trứng
OVCAR-3 ở người [149]. Các nghiên cứu của Jiang và cs (1996), Hanif và cs
(1997) cũng cho thấy curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả năng ức chế
sinh trưởng khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết và ung thư
biểu mô gan ở người [55], [63].
1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan
Matsuda và cs (1998) nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ đen

có hoạt tính bảo vệ gan, sesquiterpene và curcumin chống lại sự hình thành Dgalactosamine/lipopolysaccharide làm giảm tổn thương gan ở chuột [95]. Kết
quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen có thể được sử dụng
như một loại thuốc tiềm năng trong điều trị chứng xơ gan mãn tính [70].
1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét


10

Nghệ đen còn được sử dụng như là phương thuốc chủ yếu để điều trị các
vị trí bị loét trong hệ tiêu hóa. Nghiên cứu của Raghuveer và cs (2003) cho thấy
dịch chiết nghệ đen có khả năng chống lại tình trạng tiết nhiều acid và viêm
loét dạ dày [122]. Watanabe và cs (1986) đã nghiên cứu hoạt tính kháng loét
của 8 loại dịch chiết từ nghệ đen trồng ở Yakushima (Nhật Bản) trên chuột gây
viêm loét dạ dày cấp tính. Các hợp chất furanogermenone và (4S, 5S)-(+)
germacrone 4,5-epoxide phân lập từ tinh dầu nghệ đen có hoạt tính ức chế sự
hình thành vết loét trên chuột thực nghiệm [161]. Jang và cs (2001) nhận thấy
ba hợp chất epiprocurcumenol, procurcumenol và 7-bis (4-hydroxyphenyl)1,4,6-heptatrien-3-one từ dịch chiết củ nghệ đen có hoạt tính kháng viêm [61].
1.1.4.5. Hoạt tính chống oxy hóa
Theo Matsuda và cs (1993), các hợp chất curcumin, demethoxycurcumin
và bisdemethoxycurcumin phân lập từ củ nghệ đen có hoạt tính chống oxy hóa
và kháng viêm tương đương với các chất này thu được từ củ nghệ vàng [94].
Dịch chiết ethanol của củ nghệ đen ở Thái Lan có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
với nồng độ ức chế 50% (EC50) từ 18,29-40,33 μg/mL (trung bình 25,71
μg/mL). Khả năng bắt gốc tự do của các curcuminoid phân tách từ dịch chiết
ethanol của nghệ đen lần lượt là: curcumin (EC50 = 7,89 μg/mL),
demethoxycurcumin (EC50 = 9,52 μg/mL) và bisdemethoxycurcumin (EC50 =
149,09 μg/mL) [114]. Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) nhận thấy tinh dầu nghệ
đen trồng ở Đà Lạt ở nồng độ 20 mg/mL có khả năng chống oxy hóa tương đối
cao, từ 74,8-77,8% [4]. Nghiên cứu của Loc và cs (2008) cho thấy hoạt tính của
các enzyme chống oxy hóa như peroxidase, superoxide dismutase và catalase

trong tế bào nghệ đen đạt giá trị cao nhất sau 14 ngày nuôi cấy, lần lượt là
0,63 U/mg, 16,60 U/mg và 19,59 U/mg protein [81].
1.1.4.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Hoạt tính kháng các loại vi khuẩn và nấm gây bệnh ở người và thực vật
của nghệ đen cũng được quan tâm nghiên cứu. Theo Wilson (2005), dịch chiết
từ củ nghệ đen có khả năng kháng năm chủng vi khuẩn khác nhau là Bacillus


11

subtilis NCIM 2603, Escherichia coli NCIM 2574, Klebsiella pneumoniae
NCIM 2957, Micrococcus luteus NCIM 2103 và Proteus mirabilis NCIM
2300, và hai chủng nấm là Aspergillus niger NCIM 596 và Candida albicans
NCIM 3102 [162]. Dịch chiết ethanol của nghệ đen trồng ở Ấn Độ có khả năng
kháng B. cereus ở nồng độ 1.000 μg/mL và có hoạt tính ức chế tương đối với
C. albicans và K. pneumoniae [145]. Nghiên cứu của Giang và cs (2000) cho
thấy, dịch chiết củ nghệ đen trồng ở Việt Nam có phổ kháng khuẩn rộng. Các
chất như a-humulene, humulene-8-hydroperoxide, zerumbone và zerumbone2,3-epoxide có hoạt tính kháng lại các loài vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) được
thử nghiệm [49].
1.1.4.7. Các hoạt tính khác
Ansari và Ahmad (1991) nhận thấy dịch chiết alcohol từ củ nghệ đen nồng
độ 1-10 mg/mL có khả năng ức chế sự phát triển của amoeba (Entamoeba
histolytica) [16]. Champakaew và cs (2007) khi phân tích thành phần hóa học
và thử hoạt tính kháng muỗi Aedes aegypti mang virus gây bệnh sốt Dengue
của tinh dầu nghệ đen đã nhận thấy chúng thật sự có hiệu quả trong việc giết
chết các ấu trùng muỗi, đây được xem là nguồn tinh dầu thay thế triển vọng để
phát triển các loại thuốc diệt ấu trùng muỗi trong tương lai [30]. Daduang và cs
(2005) nghiên cứu khả năng kháng nọc độc rắn của dịch chiết nghệ đen cho
thấy nó có tác dụng ngăn cản nọc độc di chuyển trước khi bổ sung kháng thể
kháng độc [37].

1.2. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG SẢN XUẤT HỢP
CHẤT THỨ CẤP
1.2.1. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu dài
trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất dùng trong y học.
Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định về mặt chất lượng và số lượng
sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên. Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những


12

thí nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp
khác nhau [5].
Các nghiên cứu cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản
xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó được chiết
từ cây ngoài tự nhiên. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một
cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở:
- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo
nên không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý, không cần phải vận chuyển và bảo
quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại
bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật.
- Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong
tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng).
- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch
huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [5].
- Chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau.
- Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa
quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm sẽ tăng lên [108].
Thực vật có khả năng sản xuất số lượng lớn các hợp chất thứ cấp và sự

phân bố các hợp chất thứ cấp ở mức độ tế bào phụ thuộc vào con đường sinh
tổng hợp và đặc điểm cấu trúc của chúng [112]. Trong đó, các không bào dự
trữ thường chiếm 40-90% thể tích tế bào thực vật, chúng đóng vai trò then chốt
trong sự tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Sự tích lũy các hợp chất thứ
cấp trong không bào có ít nhất hai vai trò được xác định đó là lưu trữ tạm thời
các hoạt chất sinh học nội sinh trong tế bào và bảo vệ chúng khỏi quá trình dị
hóa [52]. Các nghiên cứu cũng cho thấy có hai cơ chế vận chuyển các hợp chất
thứ cấp chủ yếu trong không bào đó là vận chuyển theo gradient H + qua kênh


13

vận chuyển ion H+ và vận chuyển sơ cấp cần năng lượng trực tiếp bởi các chất
mang dạng hình hộp liên kết với phân tử ATP [93]. Một số nghiên cứu khác
cũng nhận thấy, gen không những liên quan đến sinh tổng hợp các hợp chất thứ
cấp mà còn liên quan đến các yếu tố vận chuyển chúng. Kết quả nghiên cứu
này sẽ hữu ích trong công nghệ trao đổi chất nhằm tăng khả năng sản xuất các
hợp chất thứ cấp có giá trị ở thực vật [165].
1.2.2. Các phương pháp nuôi cấy sử dụng trong sản xuất hợp chất thứ

cấp từ thực vật
1.2.2.1. Nuôi cấy callus
Nuôi cấy callus là quá trình nuôi cấy các tế bào thực vật không biệt hóa
được hình thành bằng cách nuôi cấy các mô trên môi trường chứa nồng độ
auxin cao hoặc kết hợp auxin và cytokinin trong điều kiện in vitro. Nuôi cấy
callus đã được ứng dụng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật đặc biệt
là các hợp chất flavonoid. Quy trình nuôi cấy callus ổn định và tối ưu là bước
quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy huyền phù để sản xuất
hợp chất thứ cấp ở quy mô lớn hơn [153].
1.2.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào là quá trình nuôi cấy các tế bào hay một khối
tế bào nhỏ không biệt hóa của thực vật trong môi trường lỏng và được duy trì
trong điều kiện sục khí, kích thích, ánh sáng, nhiệt độ và các thông số vật lý
thích hợp. Các tế bào nuôi cấy không chỉ có thể tạo ra các hợp chất hóa sinh
tiêu chuẩn xác định với khối lượng lớn mà còn loại bỏ sự hiện diện của nhiều
hợp chất không mong muốn khác với trong cây tự nhiên. Nuôi cấy huyền phù
tế bào được ứng dụng phổ biến nhất để sản xuất thứ cấp ở quy mô lớn. Một số
loại bioreactor khác nhau đã được sử dụng cho quá trình nuôi ấy. Ứng dụng
thương mại đầu tiên về nuôi cấy tế bào quy mô lớn được thực hiện trong các


14

bioreactor bể khuấy có công suất 200 lít và 750 lít để sản xuất shikonin từ
Lithospermum erythrorhizon. Tế bào của Catharanthus roseus, Dioscorea
deltoidea, Digitalis lanata, Panax notoginseng, Taxus wallichiana và
Podophyllum hexandrum đã được nuôi cấy trong các bioreactor khác nhau để
sản xuất các sản phẩm thực vật thứ cấp. Những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy
tế bào để sản xuất các hợp chất dược phẩm đã tạo ra nhiều loại dược phẩm như
alkaloids, terpenoids, steroid, saponin, phenolics, flavanoid. Bằng cách cải biến
quy trình nuôi cấy, sản lượng hợp chất thứ cấp thu được có thể tăng cao (dẫn
theo Plunkett và cs. 2004) [119].
1.2.2.3. Nuôi cấy rễ tơ
Hệ thống nuôi cấy rễ tơ (hairy root) đã trở nên phổ biến trong hai thập
kỷ qua như một phương pháp để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp được
tổng hợp trong rễ. Rễ tơ là các rễ đột biến trong quá trình nuôi cấy biệt hóa
được tạo ra bởi sự lây nhiễm của Agrobacterium rhizogenes vào các loài thực
vật bậc cao bị tổn thương. Tác nhân gây bệnh này gây ra sự nhiễm bệnh dẫn
đến sự phát triển các khối u của rễ được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng cao
trong môi trường không chứa hormone và sự ổn định di truyền khi nuôi cấy

trong một thời gian dài. Rễ tơ có con đường tổng hợp các hợp chất cũng giống
với ở các cơ quan hoang dại nhưng lại cho năng suất cao hơn nhiều lần. Chính
đặc tính ổn định và năng suất cao cho phép khai thác rễ tơ là công cụ công nghệ
sinh học có giá trị để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật [113],
[119].

1.2.3. Vai trò của AgNO3 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nano bạc bao gồm các hạt bạc có kích thược nano, khoảng từ 1-100 nm,
thông thường kích thước đo được khoảng 25 nm. Theo Kumar và cs (2009) và


15

Sandra & Maira (2013), AgNO3 khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô
thực vật có tác dụng ức chế hoạt động của ethylene nội sinh, vì thế quá trình
sinh trưởng của tế bào sẽ được thuận lợi hơn [73], [134].
Đến nay, AgNO3 đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật để
tái sinh chồi, tăng hệ số nhân giống, phát sinh cơ quan, cải thiện các thông số
hóa sinh và thậm chí chuyển gen thông qua Agrobacterium… (Kumar và cs.
2009) [73], Sandra và Maira. 2013 [134], Sgamma và cs. 2015 [141],
Sarropoulou và cs. 2016 [137], Mohiuddin và cs. 1997 [104], Tamini và cs.
2015 [151], Harathi và cs. 2016 [56], Da Silva và cs. 2013 [152]). Park và cs
(2016) cho rằng YE và AgNO3 có thể cảm ứng làm tăng mức độ biểu hiện của
gen sinh tổng hợp phenylpropanoid và tăng cường tích lũy rosmarinic acid
trong tế bào cây hoắc hương núi (Agastache rugosa) [115].

1.3. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG
1.3.1. Elicitor
1.3.1.1. Khái niệm
Elicitor (hay chất kích kháng) được định nghĩa như là một chất cơ bản mà

khi đưa một lượng nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì có thể khởi động hoặc cải
thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào [111]. Sự kích kháng
thực vật (elicitation) là quá trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa thứ cấp nhờ tác động của các elicitor, giúp cho cây chống lại các
yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như tác nhân gây bệnh hoặc điều kiện sinh thái
khắc nghiệt [143].
1.3.1.2. Phân loại
Elicitor có thể được phân loại dựa trên bản chất tự nhiên của chúng là
elicitor phi sinh học (abiotic elicitor) và elicitor sinh học (biotic elicitor), hoặc
dựa vào nguồn gốc của chúng là elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) và
elicitor nội sinh (endogenous elicitor). Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn


16

gốc không thuộc sinh vật, chủ yếu là các muối vô cơ và các tác nhân vật lý, ví
dụ: các ion Cu2+, Cd2+, Ca2+, độ pH cao... Elicitor sinh học là các chất có nguồn
gốc từ sinh vật, bao gồm các polysacharide của thành tế bào thực vật (cellulose
hoặc pectin) và vi sinh vật (chitin hoặc glucan), hoặc các glycoprotein, Gprotein hay các protein nội bào có chức năng gắn các receptor và tác động bằng
cách hoạt hóa hay bất hoạt một số các enzyme hoặc các kênh ion. Elicitor ngoại
sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các acid béo, các
polysaccharide và polyamine. Ngược lại, elicitor nội sinh là các chất có nguồn
gốc bên trong tế bào như là galacturonide, hepta-β-glucoside... (Bảng 1.1)
[111].
1.3.1.3. Cơ chế kích kháng
Elicitor là các chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây nên các đáp
ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh ra khi thực
vật chịu tác động của các tác nhân gây bệnh). Chúng có thể là các elicitor phi
sinh học như ion kim loại, hợp chất vô cơ hoặc elicitor sinh học có nguồn gốc
từ nấm, vi khuẩn hoặc động vật ăn cỏ, mảnh vỡ của thành tế bào thực vật cũng

như các chất được giải phóng ra tại vị trí tổn thương của thực vật do mầm bệnh
hoặc động vật tấn công.
Thực vật được xử lý elicitor hoặc bị mầm bệnh tấn công gây ra một loạt
các phản ứng phòng vệ, bao gồm sự tích lũy các hợp chất thứ cấp bảo vệ ở cả
trong cây tự nhiên cũng như trong nuôi cấy in vitro. Mặc dù đã có nhiều nghiên
cứu về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên quá trình sinh tổng hợp các chất thứ
cấp ở thực vật nhưng cơ chế của sự kích kháng vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có
nhiều giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+, các yếu tố ảnh
hưởng đến sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đường ức chế/hoạt hóa nội
bào hay sự thay đổi áp suất thẩm thấu [111].
Bảng 1.1. Phân loại các elicitor khác nhau [111]
A. Theo bản chất