Nghiên cứu thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vawcsxin dại trên nuôi cấy tế bào vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

MẠC VĂN TRỌNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY
TẾ BÀO VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ
NGHIỆM

MẠC VĂN TRỌNG

2016 - 2018

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
CHÁT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO
VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

MẠC VĂN TRỌNG

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 8420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐỖ TUẤN ĐẠT
HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Tuấn Đạt, người đã tận tình
giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong công việc cũng như trong suốt quá trình học tập, và
thực hiện các nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu, ban lãnh đạo Khoa, các
thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Sau Đại Học, Trường Đại Học Mở Hà Nội đã tận
tình giảng dạy, hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị em, các bạn đồng
nghiệp phòng Công nghệ Cao, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, đã
nhiệt tình giúp đỡ, cùng chia sẻ các kinh nghiệm và kiến thức trong suốt thời gian
tôi thực hiện nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi muốn được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên khích lệ,
động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Học Viên

Mạc Văn Trọng


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về bệnh dại................................................................................... 3
1.1.1. Sơ lược về lịch sử bệnh dại ....................................................................... 3
1.1.2. Virút dại .................................................................................................... 5
1.1.3. Dịch tễ học bệnh dại.................................................................................. 8
1.2. Vắcxin phòng bệnh dại ................................................................................ 13
1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất ...................................................................... 13
1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai ........................................................................ 16
1.2.3. Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại được đề cập nghiên
cứu sử dụng trên thế giới................................................................................... 22
1.3. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại VABIOTECH ... 27
1.3.1. Tế bào Vero dùng trong sản xuất vắcxin dại .......................................... 27
1.3.2. Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại
VABIOTECH .................................................................................................... 29
1.3.3. Căn cứ và cơ sở thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại
trên nuôi cấy tế bào............................................................................................ 31
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 36
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 36
2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 36
2.2.1. Hóa chất................................................................................................... 36
2.2.2. Vắcxin, sinh phẩm, động vật thí nghiệm................................................. 38
2.2.3. Trang thiết bị ........................................................................................... 38
2.2.4. Dụng cụ ................................................................................................... 40
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 41
2.3.1. Các phương pháp kiểm tra hóa lý ........................................................... 41
i


2.3.1.1. Kiểm tra tính chất vật lý ................................................................... 41

2.3.1.2. Kiểm tra pH ...................................................................................... 41
2.3.1.3. Kiểm tra hàm lượng Thimerosal ....................................................... 42
2.3.1.4. Kiểm tra hàm lượng Protein.............................................................. 44
2.3.1.5. Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư ...................................................... 44
2.3.1.6. Kiểm tra hàm lượng nhôm ............................................................... 47
2.3.2. Các phương pháp kiểm tính an toàn và công hiệu .................................. 48
2.3.2.1. Kiểm tra vô khuẩn ............................................................................ 48
2.3.2.2. Chuẩn độ hiệu giá virút dại trên chuột (LD50/ml) ............................ 48
2.3.2.3. Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp miễn dịch huỳnh
quang phát hiện nucleocapsid của virút dại ( FFD50/0,05ml) ....................... 49
2.3.2.4. Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp xác định hàm lượng
kháng nguyên Glycoprotein của virút dại ( EL.U/ml) .................................. 52
2.3.2.5. Kiểm tra chất gây sốt........................................................................ 54
2.3.2.6. Kiểm tra an toàn chung chuột nhắt và chuột lang ............................ 54
2.3.2.7. Kiểm tra an toàn đặc hiệu................................................................. 55
2.3.2.8. Kiểm tra công hiệu ........................................................................... 56
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 60
3.1. Kết quả kiểm tra các thành phần hóa lý trong kiểm định vắcxin dại tế
bào ......................................................................................................................... 60
3.1.1. Kiểm tra tính chất vật lý .......................................................................... 60
3.1.2. Kiểm tra pH. ............................................................................................ 61
Tiến hành kiểm tra pH vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào ở các giai đoạn chúng
tôi thu được kết quả như bảng 3.1 dưới đây. .................................................... 61
3.1.3. Kiểm tra hàm lượng Thimerosal ............................................................. 62
3.1.4. Kiểm tra hàm lượng protein tổng số ....................................................... 63
3.1.5. Kiểm tra hàm lượng nhôm ...................................................................... 65
3.1.6. Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư ........................................................... 66
3.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn và công hiệu trong kiểm định vắcxin dại tế
ii

bào ......................................................................................................................... 68
3.2.1. Kiểm tra vô khuẩn ................................................................................... 68
3.2.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại ........................................................ 70
3.2.3. Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên glycoprotein virút dại. ....... 74
3.2.4. Kết quả kiểm tra chất gây sốt .................................................................. 75
3.2.5. Kết quả kiểm tra an toàn chung .............................................................. 77
3.2.6. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu ........................................................... 79
3.2.7. Kết quả kiểm tra công hiệu ..................................................................... 81
3.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin dại tế bào ................ 82
3.3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về thành phần hóa học ................................. 82
3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về tính an toàn và công hiệu ........................ 85
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................ 91
4.1. Kết luận ......................................................................................................... 91
4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 92
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 93

iii


DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ABLV

Australian Bat Lyssavirus

ADN

Deoxyribonucleic Acid

Axit Deoxyribonucleic

ARN

Ribonucleic Acid

Axit Ribonucleic

ASEAN
BSA

Association of South East Asian Hiệp hội các nước Đông
Nations

Nam Á

Bovine Serum Albumin

BTP
CDC

Bán thành phẩm
Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm soát bệnh
Prevention

tật và Dự phòng Hoa kỳ

CHLB

Cộng hoà Liên bang

CPE

Cytopathic effect

Huỷ hoại tế bào

CVS

Challenge Virus Strain

Chủng virút thử thách

DĐVN
EBLV

Dược điển Việt Nam
European Bat Lyssavirus

ED50

Effective Dose 50

EIA

Enzyme Immunoassay

ELISA
FAT
FAVN
FBS

Liều bảo vệ 50%

Enzyme - linked Immunosorbent
Assay
Fluorescent antibody test
Fluorescent antibody virus
neutralization
Fetal Bovine Serum

Huyết thanh bào thai bê
iv


Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

FFD50

Focus Forming Dose 50%

GMP

Good Manufacturing Practices

HGKT
IU

Thực hành sản xuất tốt
Hiệu giá kháng thể
Đơn vị Quốc tế

International Unit

kDa

KiloDalton

LD50

Lethal Dose

Liều gây chết 50%

mARN

Messenger RNA

ARN thông tin

MCB

Master Cell Bank

Ngân hàng tế bào giống gốc

MEM

Minimum Essential Media

NICVB

National Institute for Coltrol of Viện Kiểm định quốc gia
Vaccine and Biological

vắcxin và sinh phẩm y tế

NIH

National Institute Of Health

PBS

Phosphate buffered saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PV
RFFIT

RT-PCR

Viện sức khỏe quốc gia Hoa
Kỳ

Phản ứng chuỗi polymerase

Pasteur virus
Rapid fluorescent focus inhihition
test
Reverse Transcription polymerase
chain reaction

SRID

Single Radial Immunodiffusion

SSC

Saline - sodium citrate
v

PCR phiên mã ngược
Phương pháp miễn dịch
khuếch tán đơn


Viết tắt
TCA

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Trichloroacetic acid

TCYTTG
TE

Tổ chức y tế thế giới
Tris - EDTA
Trách nhiệm hữu hạn một

TNHH MTV

thành viên
Công

VABIOTECH

TNHH

MTV

Vắcxin và sinh phẩm số 1

VSDTTƯ
WCB

ty

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Working Cell Bank

Ngân hàng tế bào sản xuất

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Số người tiêm vắcxin dại và số ca tử vong do bệnh dại tại Việt Nam
1991-2016.................................................................................................................. 10
Bảng 1.2: Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y ...... 13
Bảng 1.3: Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất ................ 19

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra pH vắcxin dại tế bào ..................................................... 61
Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Thimerosal .................................................. 63
Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra hàm lượng nhôm ........................................................... 65
Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư BTP tinh khiết vắcxin dại tế bào
................................................................................................................................... 67
Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra vô khuẩn........................................................................ 68
Bảng 3.6: Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại .......................................................... 71
Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra chất gây sốt ................................................................... 76
Bảng 3.8: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu hoá lý......................................................... 83
Bảng 3.9: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu an toàn và công hiệu ................................. 85

vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại ................................................................................... 7
Hình 1. 2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại ............................................................ 8
Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017 ................................................. 9
Hình 1.4: Phân bố tỷ lệ chết do dại/100000 dân theo khu vực giai đoạn 1996-2017
................................................................................................................................... 12
Hình 1.5: Phân bố số ca bệnh dại theo tỉnh năm 2017-2018 .................................... 12
Hình 1.6: Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng để sản xuất vắcxin
trên nuôi cấy tế bào. .................................................................................................. 18
Hình 1.7: Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Vabiotech ... 29
Hình 3.1: Kết quả kiểm tra tính chất vật lý Vắcxin dại tế bào ở các giai đoạn. ....... 60
Hình 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Protein tổng số vắcxin dại tế bào BTP tinh
khiết .........................................................................................................................644
Hình 3.3:Hình ảnh kiểm tra hàm lượng AND tồn dư loạt sản xuất 0314 ................. 67
Hình 3.4: Hình ảnh ống thử nghiệm vô khuẩn vắcxin loạt 0215 trước và sau 14 ngày
theo dõi ...................................................................................................................... 69
Hình 3.5: Hình ảnh chuột liệt do virus dại và hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào
vero dưới kính hiển vi huỳnh quang trong các thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá ....... 73
Hình 3.6: Kết quả xác định hàm lượng glycoprotein. ............................................... 75
Hình 3.7: Đồ thị phân tích tổng nhiệt tăng của các loạt ........................................... 77
Hình 3.8: Kết quả kiểm tra an toàn chung vắcxin dại tế bào thành phẩm ................ 78
Hình 3.9: Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu BTP sau bất hoạt và BTP tinh khiết
vắcxin dại tế bào........................................................................................................ 80
Hình 3.10: Kết quả kiểm tra công hiệu vắcxin dại tế bào ......................................... 81

viii


MỞ ĐẦU

Bệnh dại là bệnh nhiễm virút cấp tính của hệ thống thần kinh trung ương do
virút thuộc họ Rhabdoviridae, giống Lyssavirus từ động vật lây sang người bởi chất
tiết, thông thường là nước bọt của chó bị nhiễm virút dại. Hầu hết các trường hợp bị
nhiễm virút dại đều qua vết cắn, vết liếm trên da, niêm mạc bị tổn thương. Kể cả
người và động vật khi đã bị bệnh dại đều dẫn tới tử vong. Bệnh dại thuộc nhóm B
trong Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm [2], [5], [6]. Bệnh dại phổ biến trên
toàn cầu, cả ở châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ La tinh, trừ một số vùng không
có bệnh dại như Vương quốc Anh, Nhật Bản, vùng Bắc cực, châu Đại Dương được
gọi là những vùng đất “biệt lập”. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới
(TCYTTG) hàng năm có khoảng 55000 - 70000 người chết vì bệnh dại, trong đó
hơn 90% được thông báo từ các nước đang phát triển ở châu Phi và châu Á. Ở Đông
Nam Á (ASEAN) bệnh dại đang có xu hướng diễn biến phức tạp và có chiều hướng
gia tăng trong những năm gần đây [2], [6]. Bệnh dại chưa có thuốc điều trị đặc hiệu,
do đó biện pháp tiêm vắcxin phòng bệnh dại để chủ động gây miễn dịch là phương
thức hữu hiệu nhất trong phòng và điều trị bệnh dại hiện nay.
Tại Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu
là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch
tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp
của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp).
Tuy nhiên, theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên
80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong
muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt
vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10000 mũi tiêm, nên từ năm
2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên
toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào
trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân
được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ
chiếm 15% số người được tiêm vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm

1

loại vắcxin này rất đắt do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa
được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế. Do vậy, phát triển các vắcxin dại cho
người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay
Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật
và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin
dại, công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã nghiên cứu
phát triển thành công quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero ở quy mô phòng thí nghiệm. Theo yêu cầu của các cơ quan quản lý, các nhà
sản xuất thuốc và dược phẩm sinh học nói chung phải kiểm soát tối đa các sản
phẩm, đảm bảo được chất lượng và các tiêu chuẩn kĩ thuật. Nhằm quản lý và đảm
bảo chất lượng tốt tất cả các công đoạn trong quy trình sản xuất cũng như đảm bảo
về an toàn và công hiệu cho người sử dụng vắcxin dại sản xuất trên nuôi cấy tế bào
Vero thì yêu cầu cấp bách đặt ra là cần thiết lập được các phương pháp cũng như
đưa ra các tiêu chuẩn trong kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên tế bào
Vero, do vậy chúng tôi thực hiện đề tài
"Nghiên cứu thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên
nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm"
Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài
1. Thiết lập được các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi
cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm bằng cách tiến hành các
phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại đã được khuyến cáo bởi các tổ chức
(WHO, DĐVN4) ở điều kiện kiểm tra thực tế.
2. Xây dựng được bảng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm.

2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh dại
1.1.1. Sơ lược về lịch sử bệnh dại
Bệnh dại là một trong những căn bệnh cổ xưa nhất của động vật có thể
truyền sang người một cách rủi ro khi có tiếp xúc với virút dại qua da hoặc niêm
mạc bị tổn thương. Bệnh dại (rabies) xuất phát từ chữ Latin có nghĩa là “cuồng
bạo, điên rồ”. Những người Hy Lạp cổ đã mô tả bệnh dại bằng từ lyssa nghĩa là
“chứng điên khùng, rồ dại”. Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não
nguyên phát của động vật có vú. Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc
da bị tổn thương. Từ hàng nghìn năm trước công nguyên, những người thầy thuốc
cổ phương Đông đã viết về căn bệnh tương tự bệnh dại – bệnh sợ nước, sợ gió mà
chó và người mắc phải. Bệnh dại cũng được người da đỏ, người Ả rập và người Do
Thái cổ đề cập trong y văn với 5 dấu hiệu bệnh dại ở chó: mõm há, chảy
nước dãi, tai rủ, đuôi cụp, giọng khàn và khuyến cáo nếu gặp các con vật có
biểu hiện này phải tiêu diệt ngay bằng cung tên. Ở Ai Cập, Hy Lạp, La Mã
người ta coi bệnh dại là sự trừng phạt của thượng đế vì sự bí mật của căn
nguyên gây bệnh cũng như sự khủng khiếp của các triệu chứng lâm sàng [2], [5],
[6].
Một trăm năm sau công nguyên, Celse đã biết rằng độc tố đã được
truyền từ chó sang người và muốn loại bỏ độc tố này cần phải đốt vết thương
bằng que sắt nung đỏ. Hai trăm năm sau công nguyên, Galien đã đề ra phương pháp
phẫu thuật cắt bỏ phần cơ thể bị vết cắn để ngăn ngừa sự phát bệnh dại.
Đầu thế kỷ 19, Zinke đã chứng minh được tính lây nhiễm có trong nước
dãi của chó dại. Tại viện Lion, Galtier đã thành công trong việc gây bệnh thực
nghiệm trên thỏ và thử nghiệm gây miễn dịch cho cừu bằng cách tiêm nước bọt
của con vật bị bệnh dại vào tĩnh mạch cón vật lành. Năm 1884, Louis Pasteur đã
thành công trong việc nghiền não tuỷ của chó mắc bệnh dại sau đó gây nhiễm dưới
màng cứng não thỏ. Tiếp tục nghiền não thỏ đã gây nhiễm truyền cho thỏ tiếp theo
3

và cứ tiếp tục như vậy sau hơn 100 lần tiêm truyền liên tiếp trên não thỏ ông đã thu
được chủng virút có thời gian ủ bệnh thu ngắn và cố định 6 - 7 ngày, ông gọi đó là
“virút dại cố định”. Pasteur cũng đã phát minh ra phương pháp bất hoạt virút dại
gây nhiễm não tuỷ thỏ bằng cách làm khô dưới KOH tinh thể. Ông đã dùng não tuỷ
thỏ bất hoạt này tiêm cho chó, sau đó dùng virút dại sống thử thách cho những
con chó này và kết quả thí nghiệm đã giúp Pasteur tìm ra cách sản xuất vắcxin
dại. Ngày 6 tháng 7 năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắcxin não thỏ bất
hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister, bị một con chó lên cơn dại cắn
nhiều vết. Sau khi được tiêm 13 mũi vắcxin dại của Pasteur, cậu bé đã được
cứu thoát khỏi bệnh dại. Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2500
người bệnh đã được điều trị bằng vắcxin này và chỉ có 12 người bị chết [5], [6].
Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự
phát triển của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn
dòng để chẩn đoán các chủng virút dại gây bệnh ở người và động vật. Bằng kỹ
thuật PCR, sequencing người ta đã có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp
các gen và trình tự nucleotide của virút dại. Hiện nay, chẩn đoán bệnh dại trên
người chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh và tiền sử phơi
nhiễm với virút dại. Chẩn đoán xác định bệnh dại bằng các kỹ thuât xét nghiệm:
phát hiện kháng nguyên (FAT), phân lâp virút, kỹ thuât sinh học phân tử (RT-PCR),
phát hiện kháng thể (ELISA, RFFIT, FAVN). Tuy nhiên, trên thực tế do tính nguy
hiêm của bệnh dại, nên khi bị động vât nghi dại cắn, ngươi bệnh phải được giám sát
và điều trị dự phòng khẩn cấp mà không chờ chẩn đoán xác định bệnh dại ở động
vât bằng xét nghiệm [2], [6].
Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và vết
cào xuyên da của động vật nhiễm. Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất lây nhiễm
thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn thương da mới của
nạn nhân. Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết có chứa virút hoặc cấy
ghép phủ tạng nhiễm bệnh.

Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến vài

4


tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm. Thời gian ủ bệnh
phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn thương và vị
trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập [17], [59].
Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ư ơng qua các dây
thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ virút nhân lên và phát tán ngược trở ra hệ thống
thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt. Virút dại lan truyền đến
toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên lúc đó cơ thể không
có được đáp ứng miễn dịch với virút [56].
Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở
người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng. Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa
trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình dịch tễ của
bệnh trên động vật. Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị
cảm tại vết thương. Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não
tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất
ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng thở ngừng tim. Bệnh dại
gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triển ít trầm trọng hơn tuy
nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong. Dạng bệnh dại này thường bị chẩn đoán
nhầm là bệnh lý khác [59].
Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại
được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh được
nguy cơ tử vong. Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ dơi được
cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc kháng virút
nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng trên một số bệnh
nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [56].
1.1.2. Virút dại

Virút dại thuộc họ Rhabdoviridae, chi Lyssavirus, có vât liệu di truyền
là ARN, vỏ ngoài là lipid. Có hơn 100 chủng phân bố trong tự nhiên có thể gây
nhiễm cho động vật và thực vật. Virút dại có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi
nhiệt độ; dễ bị phá hủy bởi các chất hòa tan lipid (xà phòng, ether, chloroform,
5


acetone); rất nhạy cảm với tia cực tím và bị bất hoạt nhanh chóng trong dung dịch
cồn và cồn iốt [2], [5], [6]. Trong chi Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút
hoang dại ở chó, mèo… và các chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên
trong 7 genotype của nhóm. Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh
ở động vật, tuy nhiên đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở
người như nhiễm Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu
(EBLV) [50], [56].
Hình thái:
Virút dại có hình viên đạn một đầu tròn, đầu kia dẹt với đường kính
trung bình 75 nm, chiều dài dao động từ 100 - 300 nm. Sự thay đổi về độ dài phản
ánh sự hiện diện các hạt trung gian có cấu trúc không hoàn chỉnh với độ dài ngắn
hơn khoảng từ 20 - 50% so với hạt virút hoàn chỉnh. Các hạt trung gian có bộ gen bị
cắt xén và vì thế thiếu hụt một số chức năng của virút, chúng nhân lên một cách
nhanh chóng và cạnh tranh tích cực với các virút có bộ gen bình thường trong quá
trình tạo thành lớp vỏ bao [6].
Cấu trúc:
Cấu trúc virút dại gồm lõi bên trong là chuỗi xoắn ribonucleoprotein, bao
bọc bên ngoài là một lớp vỏ lipoprotein gồm 2 màng mỏng phospholipid. Trên bề
mặt có những protein G tạo những chồi gai có chiều dài 10 nm (Hình 1.1). Đây là
kháng nguyên chủ yếu kích thích cơ thể tạo ra kháng thể trung hoà và là ngưng kết
tố hồng cầu. Thành phần hoá học của virút dại gồm có 67% protein, 26% lipid, 1%
ARN và 3% cacbonhydrat [6].

6


Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại
Các protein cấu trúc của virút dại:
Mỗi hạt virút dại gồm có ARN sợi đơn và 5 protein [6].
1. Protein L (180 kDa) là ARN polymerase phụ thuộc ARN, hoạt động như
một emzym trong quá trình tổng hợp ARN.
2. Glycoprotein: Protein G (62-67 kDa) có hai đoạn kỵ nước tạo khả năng
xuyên màng của virút, chịu trách nhiệm tiếp xúc, nhận biết và gắn vào thụ thể
đặc hiệu trên bề mặt tế bào cảm thụ. Protein G có vai trò sinh bệnh học của virút
dại, chúng tạo nên khả năng ái tính với tế bào thần kinh, kích thích hệ miễn
dịch tạo kháng thể trung hoà và ngưng kết hồng cầu.
3. Nucleoprotein N: (54 Da) Protein N đóng vai trò cấu trúc chính trong quá
trình tạo vỏ cho ARN gen và bảo vệ bộ gen. Ngoài ra, nó còn có thể điều hoà sự cân
bằng giữa phiên mã và sao mã. Protein N là protein có tính bảo tồn nhất trong các
protein của virút dại, trình tự nucleotide của gen mã hoá cho protein N có độ tương
đồng cao trong cùng một genotype, nhưng lại rất khác nhau giữa các genotype khác
nhau. Chính vì vậy mà gen N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh dại
bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đồng thời cũng được sử dụng để nghiên cứu sự
tiến hoá cũng như dịch tễ học phân tử của nhóm Lyssavirrus.

7


4. Phosphoprotein NS hay M1 (37 kDa): Protein M có vai trò điều hoà ARN
polymerase phụ thuộc ARN trong quá trình polymer hoá.
5. Protein màng M2: (24 kDa) protein M2 chịu trách nhiệm về hình thái và
tiếp xúc qua lại với protein của tế bào.
Cấu trúc hệ gen:

Hệ gen của virút dại là một chuỗi ARN sợi âm, không phân nhánh có
hằng số lắng 45S và trọng lượng phân tử 4,6 x 106 Dalton, chứa khoảng 12000
nucleotide. Sợi ARN chứa 5 gen có trật tự sắp xếp được bắt đầu từ 3’-N-M1-M2-GL-5’. ARN sợi âm không có khả năng trực tiếp dịch mã tổng hợp protein của virút
mà phải thông qua việc tổng hợp ARN sợi dương bổ trợ (mARN).

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại
ARN của virút dại không có khả năng lây nhiễm. ARN genome của chủng
PV (Pasteur virus) có 11932 nucleotide, 58 nucleotide đầu tiên từ vị trí 3’ của toàn
bộ genome là vùng không mã hóa và cũng chính là vùng mở đầu sao chép. Vùng
mở đầu sao chép này được hoạt hóa bởi bộ ba N, P và L protein. Ngay sau khi vùng
mở đầu sao chép được phiên mã thì 5 mARN mã hóa cho 5 protein cấu trúc của
virút là N, M1, M2, G và L lần lượt được tổng hợp và cuối cùng là vùng đuôi không
mã hóa gồm 70 nucleotide tận cùng ở phía đầu 5’ [6], [50], [56].
1.1.3. Dịch tễ học bệnh dại
Trên thế giới
Bệnh dại phổ biến trên toàn cầu, lưu hành ở trên 150 nước trên thế giới với
3,3 tỷ dân sống tại các vùng dịch lưu hành, từ châu Âu đến châu Á, châu Phi, Mỹ
La Tinh, trừ một số vùng không có bệnh dại như Vương Quốc Anh, Nhật Bản, vùng

8


Bắc Cực, Úc hay châu Đại Dương là những vùng đất “biệt lập”. Theo thống kê của
TCYTTG, hàng năm có khoảng 60000 người chết vì bệnh dại (99% trường hợp tử
vong này là do lây truyền virút dại từ chó, cứ 10 người chết vì bệnh dại thi có tới 4
trẻ em dưới 15 tuổi, 95% ca tử vong là ở châu Á và châu Phi) và 15 triệu người bị
phơi nhiễm bệnh dại phải đi điều trị dự phòng (trong đó 40% là trẻ em từ 5-14 tuổi
ở các nước châu Á và châu Phi), gây tổn thất kinh tế toàn cầu ước tính là 8,6 tỷ đô
la Mỹ mỗi năm. Cũng theo TCYTTG, nếu không được điều trị dự phòng, con số tử
vong có thể lên tới hơn 330 nghìn ngươi mỗi năm chiếm tới 80% số ca tử vong vì

bệnh này trên toàn thế giới. Số ca tử vong tâp trung ở các nước đang phát triển
thuộc khu vực Châu Phi (40%), Châu Á (55%). Các nước có số ca tử vong do bệnh
dại cao là Ấn Độ (20000 ngươi), Trung Quốc (3300), Băng-la-đét (1500), Nê-pan
(200). Trong khu vực Đông Nam Á, 8/11 nước có lưu hành bệnh dại (trừ Sing-gapo, Ma-lai-xi-a và Brunei). Từ năm 2004 đến nay bệnh dại tại các nước Châu Á,
đặc biệt khu vực Đông Nam Á đang có chiều hướng gia tăng, diễn biến phức tạp. Ở
Châu Á, mỗi năm có khoảng 26 triệu người được điều trị dự phòng sau phơi nhiễm,
trong đó riêng Trung Quốc là 15 triệu.

Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017
Tại châu Âu số lượng người đi điều trị dự phòng hằng năm chỉ khoảng
71500 người, bệnh dại chủ yếu xảy ra ở các nước CHLB Đức, Áo, Thuỵ Sĩ, Pháp,
Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Tiệp Khắc, Hung Ga Ry. Các quốc gia này mặc dù thường

9


xuyên liên tục thực hiện chương trình giám sát ổ dịch bệnh dại tự nhiên và dự
phòng bằng vắcxin cho động vật hoang dã, súc vật nuôi, nhưng hàng năm vẫn có tới
hàng chục nghìn người phải tới khám và phải sử dụng 1,2 triệu liều vắcxin tại các
trung tâm phòng dại [2], [6].
Trong nước
Ở Việt Nam, bệnh dại chủ yếu tập trung ở đồng bằng sông Hồng và sông
Mê Kông. Hàng năm có khoảng 350000 – 650000 người phải tiêm phòng vắcxin.
Mặc dù công tác điều trị dự phòng dại cho người sau phơi nhiễm với động vât nghi
mắc bệnh dại đã được tổ chức thực hiện ở nhiều địa phương, tuy nhiên hàng năm
vẫn còn nhiều người tử vong do bệnh dại. Kết quả giám sát bệnh dại của Viện Vệ
sinh dịch tễ Trung ương (VSDTTƯ), Bộ Y tế (Bảng 1.1) cho thấy liên tục trong 25
năm qua, năm nào cũng có người chết do bệnh dại và số người chết do bệnh dại
hàng năm luôn giữ vị trí cao nhất so với số ca tử vong của các bệnh truyền nhiễm
gây dịch ở Việt Nam [2].

Bảng 1.1: Số người tiêm vắcxin dại và số ca tử vong do bệnh dại tại Việt Nam
1991-2016
Năm

Số người

Số ca tử

tiêm vắcxin

vong

1991

87.625

282

- Chết vì bệnh dại: tổng 5 năm có: 2001

1992

145.272

404

người chết; trung bình 400 ca/năm

1993

130.604

398

- Tiêm vắcxin dại: 1.167.238 người; trung

1994

361.877

505

bình: 233.448 người/năm

1995

441.860

412

1996

487.125

285

- Chết vì bệnh dại: tổng 5 năm có: 758

1997

537.228

160

người chết; trung bình 152 ca/năm

1998

487.680

129

- Tiêm vắcxin dại: 2.649.757 người;

1999

569.558

94

trung bình: 529.951 người/ năm

2000

568.166

90

Ghi chú

10


Năm

Số người

Số ca tử

tiêm vắcxin

vong

2001

552.653

65

- Chết vì bệnh dại: Tổng 5 năm có: 314

2002

637.185

47

người chết; trung bình 63 ca/năm

2003

635.815

34

- Tiêm vắcxin dại: 3.018.624 người;

2004

607.720

84

trung bình: 603.725 người/ năm

2005

585.251

84

2006

567.173

82

- Chết vì bệnh dại: Tổng 5 năm có: 450

2007

450.023

131

người chết; trung bình 90 ca/năm

2008

380.450

91

- Tiêm vắcxin dại: 1.981.249 người;

2009

280.453

68

trung bình: 396.250 người/ năm

2010

303.150

78

2011

342.731

110

- Chết vì bệnh Dại: Tổng 5 năm có: 458

2012

400.308

98

người chết; trung bình 92 ca/năm.

2013

371.153

105

- Tiêm vắcxin dại: 1.900.409 người;

2014

394.979

67

trung bình: 380.082 người/ năm.

2015

391.238

78

Đến tháng

325.325

64

11.042.602

4.045

Ghi chú

11/2016
Tổng

Tỷ lệ tử vong do bệnh dại tính trên 100000 dân, cao nhất ở giai đoạn
1991-1995 là 0,43. Giai đoạn 1996-2003, thực hiện chỉ thị 92/TTg của Thủ tướng
Chính phủ công tác phòng chống bệnh dại được quan tâm hơn nên tỷ lệ tử vong
giảm xuống còn 0,04/100000 dân (Hình 1.4). Tuy nhiên từ năm 2004 đến nay, tỷ lệ
tử vong do bệnh dại có xu hướng gia tăng trở lại. Mỗi năm có khoảng 100 ca tử
vong và trên nửa triệu người phải tiêm phòng mỗi năm, gây tổn thất to lớn về
tính mạng, sức khỏe nhiều người [2].

11


Hình 1.4: Phân bố tỷ lệ chết do dại/100000 dân theo khu vực
giai đoạn 1996-2017
Trong năm 2017, cả nước có 74 trường hợp người bị tử vong do bệnh dại.
Báo cáo tình hình bệnh dại những năm gần đây cho thấy bệnh dại gây tử vong
trên người nhiều nhất ở các tỉnh miền núi phía Bắc và Bắc Trung bộ. Các tỉnh có số
ca bệnh dại cao nhất từ 2004-2017 là các tỉnh: Phú Thọ, Tuyên Quang, Yên Bái,
Thái Nguyên, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Hà Giang, Nghệ An, Bình
Thuận, Hà Nội (khu vực Hà Tây cũ), Đắc Lắc, Gia Lai, [2], [6].

Hình 1.5:Phân bố số ca bệnh dại theo tỉnh năm 2017-2018
Kết quả theo dõi và giám sát bệnh dại trên người trong các năm gần đây
cho thấy: trong số người đến tiêm vắcxin dại có 89,2% là do chó nhà cắn người;
12


8,7% do mèo cắn, 1,6% do tiếp xúc với chó và 0,5% là do các con vật khác như
chuột, khỉ... cắn. Bệnh dại có thể xảy ra quanh năm, tuy nhiên bệnh thường tăng
cao vào mùa nắng nóng từ tháng 5 đến tháng 8 hàng năm. Bệnh gặp ở mọi lứa
tuổi, nhưng nhiều nhất là ở trẻ em dưới 15 tuổi (chiếm trên 40%) và hầu hết các
trường hợp chết do bệnh dại đều không tiêm vắcxin và 98% số ca mắc bệnh này
là do bị chó nhà cắn hoặc do tiếp xúc như chăm sóc chó ốm, mổ chó. Số còn lại
là do mèo dại cắn và cho đến nay chưa phát hiện được trường hợp tử vong nào do
động vật hoang dã gây nên [2].

1.2. Vắcxin phòng bệnh dại
Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại
thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi bị cắn dựa trên việc bất hoạt virút trên mô thần

kinh. Từ đây trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới.
1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất
Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn
dịch chứa virút. Các vắcxin này đều đã được sử dụng rộng rãi cho cả người và động
vật. Các loại vắcxin dại chủ yếu thuộc thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và
thú y được trình bày trong Bảng 1.2 [31], [40].
Bảng 1.2: Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y
Mô được sử

Chủng

Loại

Phương pháp

Sử dụng

Dạng

dụng

virút

vắcxin

bất hoạt

cho người

vắcxin

Pasteur

Bất hoạt

Phenol (1 ngày)

Có

Dung dịch

Pasteur

Bất hoạt

Phenol, 30oC

Có

Dung dịch

Pasteur

Bất hoạt

Ether-Phenol

Có

Dung dịch

Mô thần
kinh: Cừu, dê
Mô thần
kinh: Thỏ,
cừu, dê
Mô thần
kinh: Cừu

13


Mô được sử

Chủng

Loại

Phương pháp

Sử dụng

Dạng

dụng

virút

vắcxin

bất hoạt

cho người

vắcxin

Pasteur

Bất hoạt

Phenol (14 ngày)

Có

Đông khô

PV11

Bất hoạt

-propiolactone

Có

Đông khô

Bất hoạt

Tia cực tím

Có

Dung dịch

PV

Bất hoạt

Tia cực tím

Có

Đông khô

PV

Bất hoạt

Phenol (14 ngày)

Có

Đông khô

PM

Bất hoạt

-propiolactone

Có

Đông khô

Flury

Giảm

LEP

độc lực

Mô thần
kinh: Cừu
Mô thần
kinh: Cừu
Não chuột
nhắt chưa dứt
sữa
Não thỏ chưa
dứt sữa
Não chuột
chưa dứt sữa
Phôi vịt

CVS,51,
91

Phôi gà

Phôi gà

Kelev

Không (chỉ
-

sử dụng

Đông khô

cho chó)
Không (chỉ

Giảm

-

độc lực

sử dụng

Đông khô

cho chó)
Không (sử

Phôi gà

FluryHEP

Giảm

-

độc lực

dụng cho
gia súc,

Đông khô

mèo)
Dựa trên các loại mô được sử dụng để sản xuất khác nhau, các vắcxin thế hệ
thứ nhất có thể được xếp loại theo:

14