ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Đề tài:

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE
TRONG THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ
SVTH: NHÓM 8


GIỚI THIỆU

QUY TRÌNH PHÂN
TÍCH

NỘI DUNG

VÍ DỤ THỰC TẾ


11

Giới thiệu về Vibrio Cholerae

Hình ảnh về Vibrio cholerae dưới kính hiển vi sau khi được nhuộm màu


Phân loại khoa học

Giới (regnum):

Bacteria

Ngành (phylum):

Proteobactreia

Lớp (class):

Gamma proteobacteria

Bộ (ordo):

Vibrionales

Họ (familia):

Vibrionaceae

Chi (genus):

Vibrio

Loài (species):

V.cholerae


1

-

Giới thiệu về Vibrio Cholerae

Thuộc giống Vibrio

-

Phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả năng di dộng
V. cholerae gây bệnh dịch tả do vệ sinh kém, nguồn nước ô nhiễm, nhưng cũng có thể gây ngộ độc thực
0
Phát triển ở nhiệt độ 42 C, có thể tồn tại cả ở nước mặn và nước ngọt
phẩm.

-

Phát triển nhanh trong thực phẩm ở nhiệt độ thường và trong thực phẩm giữ lạnh - đông lạnh nhưng ở
Các chủng V.cholerae gây dịch chủ yếu thuộc 2 nhóm huyết thanh O1 và O139
điều kiện khô không sống quá 48h

-

Rất nhạy với nhiệt nên loại bỏ dễ dàng bằng đun nấu.


Cách thức sinh trưởng:

Cholerae lên men không sinh khí,
có khả năng làm dịch hóa gelatin

Có khả năng khử nitrat thành nitrit
và phân giải trytophan thành indol

Cách thức sinh
trưởng của Vibrio

Vibrio cholerae phát triển được ở
vùng có nồng độ muối cao 3%

Có khả năng lên men đường glucose,
sucrose,mannose, khử lysine

cholerae


2

Quy trình phân tích



Tiến hành phân tích

 

 Bước 1: Đồng nhất mẫu

Cân vô trùng 25g mẫu hải sản vào túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rời rồi thêm
225ml nước pepton kiềm APW trong túi, nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2 phút. Ủ mẫu ở hai chế độ

0
0
0
0
nhiệt là 37 C 1,0 C và 42 C ,2 C trong 6 – 24h


Tiến hành phân tích

 

 Bước 2: Tăng sinh
a. Đối với mẫu thông thường
0
0
Ủ các bình chứa đã chuẩn bị ở nhiệt độ 37 C 1,0 C trong 6 – 8h. Sau đó, phân lập như qui định, phần còn lại ủ
tiếp 16 – 24h rồi phân lập lại.
b. Đối với mẫu hàu
Ủ một dãy pha loãng 10
Ủ một dãy pha loãng 10

-1

-2
0
0
đến 10 ở nhiệt độ 37 C 1,0 C trong 6 – 8h và 16 – 24h.

-1

-2
0
0
đến 10 ở nhiệt độ 42 C ,2 C trong 6 – 8h.


Tiến hành phân tích

 

 Bước 3: Phân lập và đọc kết quả trên đĩa
- Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trên, không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề
0
0
mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch. Ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 37 C 1,0 C trong 18 – 24h.
- Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng (tròn, hơi dẹt, bóng vàng, ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh).
0
- cấy ria lên môi trường không chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ở 37 C để thu sinh khối cho các thử nghiệm
hóa sinh.

V. Cholerae trên TCBS


Bước 4
TN sinh hóa sơ bộ

Thử nghiệm sinh
TN sinh hóa khẳng định

hóa

Kháng huyết thanh

www.themegallery.com


TN sinh hóa sơ bộ

-

Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS để cấy sang môi trường không chọn lọc TSA
2% NaCl.

-

0
Ủ ở nhiệt độ 37 C trong 18 – 24h.

-

Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa.


TN sinh hóa sơ bộ

 TN trên môi trường TSI/KIA
 

Cấy khuẩn lạc từ môi trường

Nới lỏng các nắp ống

0
0
Ủ ở nhiệt độ 37 C 1,0 C trong

TSA vào ống thạch nghiêng

để tạo điều kiện hiếu

18 – 24h.

TSI (hoặc KIA).

khí

Kết quả
Trên môi trường TSI (phải), môi trường KIA (trái)


TN sinh hóa sơ bộ



TN với các canh thang trypton muối

Cấy khuẩn lạc từ TSA vào các ống canh thang muối trypton có dải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8
Cấy khuẩn lạc từ TSA vào các ống canh thang muối trypton có dải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8
và 10%.
và 10%.

 
 

0
0
Nuôi ủ ở nhiệt độ 037 C 1,0
0 C trong 18 – 24h, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 – 24h
Nuôi ủ ở nhiệt độ 37 C 1,0 C trong 18 – 24h, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 – 24h

V. cholera phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 1%, 3% và làm đục môi
V. cholera phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 1%, 3% và làm đục môi
trường.
trường.


TN sinh hóa sơ bộ



TN lên men – oxy hóa

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh – Leifson glucoza hoặc O/F glucoza.
0
Phủ khoảng 1 – 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống. Ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37 C trong 1 – 2
ngày.

V. cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh – Leifson từ
màu tím chuyển thành vàng
Môi trường O/F từ màu xanh thành vàng

TN sinh hóa sơ bộ



TN oxidaza

Đặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ 2 -3 giọt
thuốc thử oxidaza. Dùng que cấy vô trùng lấy các
khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ
thuốc thử oxidaza. V. cholera làm vết ria có màu tím
thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây.


TN sinh hóa sơ bộ



Nhuộm gram

V. Cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.


TN sinh hóa khẳng định



 

TN phát triển ở nhiệt độ
Mt đục

Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang
0
trypton 1% NaCL. Ủ ở nhiệt độ 42 C trong 18 –
0
24h. V. cholera phát triển được ở nhiệt độ 42 C
làm môi trường đục.

Mt đầu


TN sinh hóa khẳng định



TN cacbonhydrat

Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng,
âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.
V. Cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton,
mannoza dương tính và lactoza, cellobiza, arabinoza âm
tính.

Lên men đường manniton

(+) vàng hoặc vàng với bong bóng khí, (-) đỏ

TN sinh hóa khẳng định



TN decacboxylaza/ dehydrolaza

 

Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithine, lysine, arginine và ống đối chứng không có axit
0 0
amin. Mỗi ống được phủ 1 – 2 ml dầu khoáng vô trùng. Ủ các ống ở nhiệt độ 37 C C trong 18 – 24h

→ lysine (+), arginine (-), ornithine (+), control (-)


TN sinh hóa khẳng định



TN ure

 

0 0
Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang ure, ủ ở nhiệt độ 37 C C trong 18 – 24h. V. cholerae cho phản ứng âm tính
nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng


TN sinh hóa khẳng định



Thử nghiệm ONPG

Có thể dùng đĩa ONPQ thay cho thuốc thử ONPQ. Hòa tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml
nước muối sinh lý. Đặt đĩa ONPQ vào đáy ống rồi ủ ẩm và đọc kết quả như trên V. cholera cho phản ứng
ONPQ dương tính khi dung dịch có màu vàng

ủ qua đêm

o
37 C
Lactose agar
Màu vàng

Chủng VSV

2ml ONPG broth

Pứ (+)

Pứ (-)


Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm indole

(a)

+

(b)

+

Lên men Glucose

+

Lên men Frutose

+

Lên men Mannose

+

Lên men Lactose

-

Lên men Arabinose

-

H2S

-

Thử nghiệm Urease

(c)

-

Enzyme (Catalase, Lysine và Orithine decarboxylase)

+

Enzyme (Arginine dihydrolase)

-

ONPG

+


TN kháng huyết thanh

Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác
của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi
phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối.