ĐỀ TÀI TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP ELISA

L/O/G/O

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP
THỰC PHẨM TP.HCM


KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI : PHƯƠNG PHÁP ELISA

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ


www.themegallery.com

NỘI DUNG
ĐỊNH NGHĨA
MỘT SỐ KHÁI NIỆM

PHƯƠNG
PHÁP ELISA

NGUYÊN TẮC PHƯƠNG
PHÁP ELISA
CÁC PHƯƠNG PHÁP
ELISA
ỨNG DỤNG
VÍ DỤ THỰC TIỄN
L/O/G/O

www.themegallery.com

ĐỊNH NGHĨA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay )
Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzyme hay
EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa
để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu
xét nghiệm.

L/O/G/O


www.themegallery.com

ĐỊNH NGHĨA
- Ví

dụ:

Enzyme peroxidase phản ứng với một

số cơ chất nhất định như: Tetramethylbenzidine
hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sẽ
phát màu. Màu sinh ra từ các phản ứng này có thể
được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ
thị).

L/O/G/O

www.themegallery.com

MỘT SỐ KHÁI NIỆM
 Kháng nguyên: là những chất có khả năng huy
động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu, kháng
nguyên bao gồm: protein lạ, acid nucleic, một số
lipid và polysaccharide.
 Kháng thể: thành phần gramma globulin trong
các protein máu. Kháng thể là những protein hòa
tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng
với 1 kháng nguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu
với kháng nguyên .

L/O/G/O


www.themegallery.com

NGUYÊN TẮC
- Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên
và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một
enzyme.
- Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ lên bề mặt những
đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên trong
mẫu, kháng nguyên sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố
định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme tạo
thành 1 phức hợp kép.
L/O/G/O

www.themegallery.com

NGUYÊN TẮC
- Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu vào enzyme xúc
tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo thành các
sản phẩm có màu hay phát sáng.
- Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng
đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên và
thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ
kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
L/O/G/O


www.themegallery.com

NGUYÊN TẮC

L/O/G/O


www.themegallery.com

CÁC PHƯƠNG PHÁP ELISA
1

ELISA TRỰC TIẾP

2

ELISA GIÁN TIẾP

3

SANDWICH ELISA

4

ELISA CẠNH TRANH

L/O/G/O


www.themegallery.com

PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC TIẾP
- Đây là dạng đơn giản nhất của phương

pháp ELISA . Trong đó kháng nguyên cần
phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt
giá thể và sẽ được phát hiện bằng một
kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được
gắn với enzyme).
L/O/G/O


www.themegallery.com

PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC TIẾP

Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa
Bước 2: Đem ủ đĩa chứa kháng nguyên
Bước 3: Rửa đĩa
Bước 4: Thêm kháng thể có gắn với enzyme
Bước 5: Rửa
Bước 6: Ủ ở 37 0C
Bước 7: Thêm cơ chất
Bước 8: Ủ ở 370C
Bước 9: Đọc kết quả
L/O/G/O


www.themegallery.com

PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC
TIẾP

- Ưu điểm : đơn giản nhất.
- Nhược điểm :
Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng
nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình duyệt kháng
nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1
kháng thể gắn vào một epitope.
Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt
với từng đối tượng.

L/O/G/O


www.themegallery.com

PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
- Phương pháp này khác với ELISA trực

tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên
không được gắn với enzyme mà nó là mục
tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác
( kháng thể này mới là kháng thể được gắn
với enzyme).
L/O/G/O


www.themegallery.com

PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa
Bước 2: Đem ủ, rửa
Bước 3: Thêm kháng thể
Bước 4: Ủ, rửa
Bước 5: Bổ sung kháng thể có gắn enzyme
Bước 6: Ủ, rửa
Bước 7: Thêm cơ chất tạo màu
Bước 8: Ủ, đọc kết quả
L/O/G/O


www.themegallery.com

PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
- Ưu điểm : kháng thể gắn với enzyme có thể sử

dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên
tiện lợi và kinh tế hơn , dễ dàng thương mại hóa.
- Nhược điểm : độ đặc hiệu của từng kháng
huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến các kết
quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần
phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác
nhau để có kết quả có thể tin tưởng được
L/O/G/O


www.themegallery.com

SANDWICH ELISA
Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến
nhất trong thực tiễn do nó có phản ứng mạnh và
nhạy. kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua
sự kết hợp của hai loại kháng thể : kháng thể bắt
(capture antibodies) và kháng thể phát hiện
(detection antibodies) .
Kỹ thuật này chia làm 2 dạng: Sandwich Elisa
trực tiếp, Sandwich Elisa gián tiếp.

L/O/G/O


www.themegallery.com

SANDWICH ELISA
Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN
trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ

bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều
trường hợp):
Bước 1. Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT.
Bước 2.Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc
hiệu trên bề mặt.
Bước 3. Phủ mẫu chứa KN cần xác định đem ủ
L/O/G/O


www.themegallery.com

SANDWICH ELISA
Bước 4. Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết
sẽ bị rửa trôi.
Bước 5. Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần
chuẩn đoán đem ủ
Bước 6 .Thêm KT thứ cấp đã được gắn với
enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở
bước 5).
L/O/G/O


www.themegallery.com

SANDWICH ELISA
Bước 7 .Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa
trôi.
Bước 8 .Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ
chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện.
Bước 9 .Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳnh

quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có
mặt và hàm lượng KT.
L/O/G/O


www.themegallery.com

ELISA CẠNH TRANH

Bước 1 . "Ủ" Kháng Thể không được đánh dấu với
Kháng Nguyên.
Bước 2 .Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi
phiếm có chứa Kháng Nguyên.
Bước 3. Rửa đĩa, Kháng Thể không được gắn kết
sẽ bị rửa trôi. Lượng Kháng Nguyên càng lớn,
lượng Kháng Thể gắn thành công với Kháng
Nguyên trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".

L/O/G/O


www.themegallery.com

ELISA CẠNH TRANH
Bước 4 .Thêm Kháng Thể thứ cấp (Kháng
Thể của Kháng Thể ở bước 1). Kháng Thể
thứ cấp gắn với enzym.
Bước 5. Thêm cơ chất. Lượng enzym còn
dư sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay
tín hiệu màu.

L/O/G/O


www.themegallery.com

BẢNG SO SÁNH

Dạng Gián tiếp

Dạng Trực tiếp

Dạng cạnh tranh

Bổ sung một loại
enzyme chất nềnchất nhiễm sắc
thuần chủng là tác
nhân tạo ra màu
sắc để phát hiện

Bổ sung một loại
enzyme chất nền-nhiễm
sắc thuốc thử là tác
nhân tạo màu để phát
hiện

Bổ sung một loại
enzyme chất nềnnhiễm sắc thuốc thử
là tác nhân tạo màu
để phát hiện

Màu này là tỷ lệ Màu này tỷ lệ thuận với Màu này tỉ lệ nghịch
thuận
với
số số
lượng
kháng với số lượng mẫu
lượng mẫu kháng nguyên trong mẫu
kháng thể
thể cố định ban
đầu
L/O/G/O


L/O/G/O

Trực tiếp

Độ nhạy
Nét đặc trưng
Thời gian
thí nghiệm

Giá thành

Gián tiếp

Cạnh
tranh

www.themegallery.com

ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM
Ưu điểm
- Độ nhạy cao xác định kháng nguyên hoặc
kháng thể
 ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml)
- Rẻ tiền ít tốn sinh phẩm,hóa chất,số lượng
mẫu lớn
- Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu

L/O/G/O


www.themegallery.com

ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM
Nhược điểm
- Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h).
- Yêu cầu kỹ thuật phân tích cao.
- Trang bị kĩ thuật hiện đại chi phí lớn.

L/O/G/O