Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu của enzyme lasparaginase tái tổ hợp từ erwinia chrysanthemi

r VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--------------------------------

NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG

BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH
ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ MÁU CỦA
ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP
TỪ Erwinia chrysanthemi

LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc

Hµ néi - 2019


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--------------------------------

NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG

BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH
ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ MÁU CỦA
ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TỪ
Erwinia chrysanthemi
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. ĐỖ THỊ TUYÊN
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS.TS. QUYỀN ĐÌNH THI
Viện Công nghệ sinh học

Hµ néi - 2019


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng
Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ thường xuyên trong mọi giai đoạn của quá trình nghiên cứu, sửa chữa luận án,
bài báo và tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, kinh phí, thời gian để tôi hoàn
thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, kính trọng tới cố PGS. TS. Quyền
Đình Thi nguyên Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, nguyên Phó Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tận tình hướng dẫn cũng như định hướng nghiên cứu bước đầu cho luận án.
Luận án được thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu qui trình sản xuất L-asparaginase tái tổ
hợp, thử nghiệm diệt các dòng tế bào ung thư và định hướng dùng hỗ trợ điều trị
bệnh ung thư máu” do cố PGS. TS. Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới nhóm nghiên cứu của PGS. TS Đỗ Thị Thảo,
nhóm nghiên cứu của TS. Lã Thị Huyền_Viện Công nghệ sinh học, nhóm nghiên
cứu của PGS. TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và
nhóm nghiên cứu của TS Đỗ Minh Trung- Học Viện Quân y đã cùng phối hợp
nghiên cứu cũng như tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận án
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học,
Phòng Quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, các cán bộ

tại cơ sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ
Việt Nam đã tạo mọi điều kiện về thời gian, trang thiết bị và giúp đỡ các thủ tục
hành chính để luận án được hoàn thành.
Để hoàn thành luận án tôi cũng nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và
nhiệt tình của tập thể cán bộ của Phòng Công nghệ sinh học Enzyme,Viện Công
nghệ sinh học, đã động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người
thân đã luôn động viên tinh thần và giúp đỡ vật chất trong suốt quá trình thực hiện
luận án
Hà nội, ngày tháng

năm 2019

Nguyễn Thị Hiền Trang
i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Hiền Trang

ii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết
tắt

Tên đầy đủ

Giải nghĩa

ALL

Acute lymphoid leukemia

Ung thư bạch cầu cấp dòng lympho

AML

Acute myeloid leukemia

Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy

aspg

Gene mã hóa L-asparaginase

maspg

Gene mã hóa L-asparaginase hoàn
chỉnh cắt signal peptide

rASPG

L-asparaginase tái tổ hợp

CML

Chronic myeloid leukemia

Ung thư bạch cầu mãn dòng tủy

CCR

Children’s Cancer Group

Nhóm ung thư trẻ em

CR

Complete remission

Thuyên giảm hoàn toàn

DEAE

Diethylaminoethyl

DNA

Deoxiribonucleic acid

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DFCI

Dana-Fraber Cancer institute

Viện ung thư Dana-Fraber

DFS

Disease-free survival

Sống sót mà không mang bệnh

DTT

Dithiothreito

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EFS

Event-free survival

Sống sót mà không bị biến chứng

Human leucocyte antigen

Kháng nguyên kháng bạch cầu

HLA

người

LB

Lysogeny broth

Môi trường biểu hiện

IPTG

Isopropyl thio-β-D-galactoside

Chất cảm ứng

OD

Optical density

Mật độ quang

PEG

Polyethylen glycol

POG

Pediatric Oncology Group

Nhóm ung thư thanh thiếu niên

SRB

Sulforhodamine B

Chất nhuộm tế bào

TCA

Trichloroacetic acid

iii


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT --------------------------------------------------------------- iii
MỤC LỤC --------------------------------------------------------------------------------------------- iv

DANH MỤC HÌNH --------------------------------------------------------------------------------- vii
DANH MỤC BẢNG ---------------------------------------------------------------------------------- x
MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ----------------------------------------------------------- 4
1.1.

Tổng quan về L-asparaginase……………………………………………………..4

1.1.1. Định nghĩa -------------------------------------------------------------------------------------- 4
1.1.2. Phân loại ---------------------------------------------------------------------------------------- 4
1.1.3. Cấu trúc L-asparaginase ---------------------------------------------------------------------- 6
1.1.4. Cơ chế phản ứng của L-asparaginase ------------------------------------------------------- 7
1.1.5. Các nguồn của L-asparaginase -------------------------------------------------------------- 8
1.1.6. Ứng dụng --------------------------------------------------------------------------------------- 9
1.2.

L-asparaginase trong điều trị ung thƣ máu…………………………………….11

1.2.1. Tổng quan về bệnh ung thư máu ---------------------------------------------------------- 11
1.2.2. Cơ chế hoạt động của L-asparaginase trong điều trị ung thư ------------------------- 14
1.2.3. Ứng dụng L-asparaginase trong điều trị bệnh nhân bị ung thư bạch cầu ------------ 17
1.2.4. Các dạng asparaginase hiện tại sử dụng trong điều trị --------------------------------- 19
1.2.5. Các vấn đề liên quan đến ứng dụng lâm sàng của asparaginase từ vi khuẩn ------- 20
1.2.6. Mẫn cảm với asparaginase từ Escherichia coli và duy trì hiệu quả điều trị sau khi
thay thế bằng Erwinia-asparaginase ------------------------------------------------------ 22
1.3.

Tình hình nghiên cứu L-asparaginase………………………………………….23

1.3.1. Trên thế giới ---------------------------------------------------------------------------------- 23

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam -------------------------------------------------------- 35
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ---------------------------------------------- 37
2.1.

Vật liệu…………………………………………………………………………….37

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ----------------------------------------------------------------------- 37
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ------------------------------------------------------------------------ 37
2.1.3. Các plasmid và mồi ------------------------------------------------------------------------- 37

iv


2.1.4. Các chủng vi khuẩn và tế bào -------------------------------------------------------------- 38
2.1.5. Môi trường nuôi cấy ------------------------------------------------------------------------ 39
2.1.6. Hóa chất chính ------------------------------------------------------------------------------- 39
2.1.7. Thiết bị thí nghiệm -------------------------------------------------------------------------- 41
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu…................................................................................. 41

2.2.1. Thiết kế plasmid biểu hiện ----------------------------------------------------------------- 41
2.2.2. Nuôi biểu hiện-------------------------------------------------------------------------------- 44
2.2.3. Xác định hoạt tính L-asparaginase -------------------------------------------------------- 45
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố đơn lẻ tới sinh tổng hợp enzyme -------------- 46
2.2.5. Tối ưu bằng phương pháp đáp ứng bề mặt----------------------------------------------- 48
2.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp ---------------------------------------------------------------- 49
2.2.7. Nhận dạng protein tái tổ hợp bằng phương pháp MALDI -TOF --------------------- 51
2.2.8. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme ---------------------------------------------------- 52
2.2.9. Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng với các dòng tế bào ung thư ----------------- 53

2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu ------------------------------------------------------------------ 56
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ------------------------------------------------------- 58
3.1.

Nghiên cứu biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi

58

3.1.1. Tối ưu trình tự gene ------------------------------------------------------------------------- 58
3.1.2. Thiết kế plasmid pE22aspg và biểu hiện trong E. coli --------------------------------- 61
3.1.3. Thiết kế plasmid pE21maspg và biểu hiện trong E. coli ------------------------------- 64
3.1.4. Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis và biểu hiện trong E. coli ---------------------- 67
3.2.

Tối ƣu điều kiện biểu hiện cho sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp…… 70

3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG --------------------------------- 71
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tiếp giống-------------------------------------------------- 71
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ampicillin trước khi cảm ứng --------------------- 72
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường biểu hiện ---------------------- 73
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung----------------------------------------- 74
3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của ion khoáng bổ sung -------------------------------------------- 74
3.2.7. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện rASPG tái tổ hợp bằng phương pháp đáp ứng bề
mặt ---------------------------------------------------------------------------------------------.75
3.3.

Đánh giá tính chất lý hóa của rASPG không có 6xHis ………………………..79

v

3.3.1. Tinh sạch rASPG từ E. coli/pE21maspg-nonhis ---------------------------------------- 79
3.3.2. Nhận diện enzyme tái tổ hợp bằng phân tích khối phổ MALDI-TOF --------------- 81
3.3.3. Động học enzyme --------------------------------------------------------------------------- 84
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH phản ứng tới hoạt độ rASPG ------------------------- 84
3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới độ bền của rASPG --------------------------------- 86
3.3.6. Ảnh hưởng của EDTA và một số ion kim loại lên hoạt tính của rASPG ------------ 87
3.3.7. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính rASPG -------------------------- 87
3.3.8. Ảnh hưởng của Dithiothreitol tới hoạt tính rASPG------------------------------------- 88
3.4.

Nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ của rASPG…………………….. 88

3.4.1. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388 ----------- 89
3.4.2. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 --------------------- 90
3.4.3. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột SP2/0-Ag14 ------------------- 91
3.4.4. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy mãn người K562 --------------------- 92
3.4.5. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người HL60 ------- 93
3.4.6. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư máu lympho của người Jurkat ---------- 95
3.4.7. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư thanh quản của người Hep2 ------------- 97
3.4.8. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào thường ------------------------------------------------ 98
4.

CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ----------------------------- 99
A

DK

A

LP

DK

N

LP

IV

N

IL

IV

AT

IL

G

AT

GT

G

IA

GT

G

IA

SA

G

AT

SA

1

AT

GT

Q

GT

TT

Q

GY

TT

2

AV

PE

V

KK

LA

NV

K

GE

QF

S

NM

AS

AR

DD

V

DG

VV

IT

H

GT

DT

LH

TT

R

SV

FD

VR

G

LT

SL

V

M

EE

RP

M

M

TG

YF

1

AT

SA

A

1

RY

KV

P

DE

EL

PG

L

VS

DS

P

DE

EL

PG

L

VS

DS

VK

L

LY

GI

NP

L

Q

2

YA

AR

AH

FH

AL

3

AL

AR

T

Y

AS

KS

M

D

0

A

1

7

3

4
E
I

1

0

0
r

w

A

0

1

AM
AL

4

RG

RG

8

RG

RG

V

5

V

II

GN

R

II

GN

R

EK

GV

V

MV

MV

9

VL

0

VI

IY

YQ

IY

YQ

VI
VM

RS

3

N

6

N

0

N

0

DR

r
I

0

0

7

1

0

0

0

E
D

RT

2

0

0

0

0

0

0

0

0

n

a

s

G

e

n

a

n

G

w

o

s
n

a

i

n

e
o

s
n

n

h

n

e
o

a

e
o

a

s

i

h

s

i

h

s

i

s

e

o

n

h

i

s

i

s

e

o

n

s
n

n

h

e
o

h

i

n

s

h

i

s

i

s

e

n

n
G

n

s

n

s
n

n
G

a

i
P

s

n

n

G

a

i
P

n

G

w
S

a

G

i

P

n
G

w
S

i

P

r
A

P

w

S

i
P

r

A

w

S

E
r

S

r

A

w
S

0

0

E
r
G

r

A

n
G

i
P

A

0

0

r
D

8

T

r

r
I

RI

RI

4

0

0

i
P

0

w
S

E
I

DR

0

N

0

r
A

6

E
I

KV

P

w
S

2

r
A

QS

QS

GV

GV

K

2

MR

3
KV

i

S

0

r
A

K

K

L

L

E
r
H

2

AG

9

0

0

E
r
A

GY

GY

IQ

5

P

P

GD

GD

2

2

A

GI

SD

SD

0

r
I

E
r
L

1

EE

EE

1

R

RT

RT

VA

VA

AN

AN

DA

2

T

T

VA

3

VR

K

R

2

LY

SV

AL

AL

8

NE

F

VR

A

TF

TF

Y

SV

ML

ML

TL

TL

0

0

VV

1

LE

LD

LD

PE

G

3

V

KP

LE

NL

T

T

DD

GA

LL

LL

D

QR

D

NL

M

1

AS

YQ

GM

I

I

GV

GV

LS

1

1

GP

TN

TN

G

2

V

AH

NP

EY

K

TV

GP

AD

TK

TK

2

DI

2

VP

VP

G

VL

HL

AD

IS

I

I

2

P

G

GI

GI

7

DV

L

IS

A

RY

SA

1

SA

AT

RP

G

G

N

N

G

KA

6

EN

9

L

K

KA

GY

5

N

o

a

n

s
n

h

e
o

i

n

s

h

4.1.

Nghiên cứu lựa chọn hệ vector biểu hiện L-asparaginase…………………… 99

4.2.

Nghiên cứu tối ƣu điều kiện sự sinh tổng hợp rASPG ………………………103

4.3.

Đánh giá tính chất của enzyme ………………………………………………..108

4.4.

Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của rASPG trên một số dòng tế bào ung thƣ.. 114

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------- 118
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
……………………………………………………………………………………120
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ------------------------------------------------- 121
TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------------------ 131
PHẦN PHỤ LỤC---------------------------------------------------------------------------------------

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Phản ứng xúc tác của enzyme L-asparaginase ................................................................
4

Hình 1.2.

5
Phân loại L-asparaginase ................................................................................................

Hình 1.3.

Cấu trúc tetramer (A) và mononer (B) của L-asparaginase ................................
7

Hình 1.4.

Cơ chế phản ứng chung được xúc tác bởi L-asparaginase…...

Hình 1.5.

Tế bào máu bình thường và tế bào máu ung thư ................................................................
12

Hình 1.6.

Cơ chế kháng tế bào ung thư của L-asparaginase ................................15

Hình 1.7.

Một số biệt dược L-asparaginase đang được sử dụng ................................
20

Hình 2.1.

Đường chuẩn NH3 ................................................................................................
45

Hình 2.2.

51
Đường chuẩn BSA ................................................................................................

Hình 2.3.

Đồ thị về sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

8

theo Lineweaver-Burk. ................................................................................................
52

Hình 2.4.

Sơ đồ quy trình nghiên cứu ................................................................................................
58

Hình 3.1.

Biểu đồ một số thông số của gene sau tối ưu ................................................................
59

Hình 3.2.

So sánh trình tự trước (X12746) và sau tối ưu codon (aspg) bằng

thuật toán OptimumGeneTM ...............................................................................................
60

Hình 3.3.

Trình tự amino acid suy diễn của L-asparaginase ................................ 61

Hình 3.4.

Thiết kế plasmid pE22aspg ................................................................................................
62

Hình 3.5.

Cấu trúc biểu hiện của pE22aspg ................................................................
63

Hình 3.6.

Biểu hiện pE22aspg trong E. coli BL21(DE3) ................................................................
63

Hình 3.7.

Thiết kế plasmid pE21maspg ................................................................64

Hình 3.8.

Cấu trúc biểu hiện pE21maspg ................................................................

65

Hình 3.9.

SDS-PAGE protein tổng số của E. coli tái tổ hợp mang plasmid
pE21maspg ................................................................................................
66

Hình 3.10.

Tinh sạch rASPG từ E. coli/pE21maspg bằng cột ProBond Nikel ................................
66

Hình 3.11.

Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis ................................................................
68

Hình 3.12.

Cấu trúc biểu hiện pE21maspg-nonhis ................................................................
68

vii


Hình 3.13.

Biểu hiện pE21maspg-nonhis trong E. coli BL21(DE3) ................................
69

Hình 3.14.

Điện di SDS_PAGE đánh giá mức độ biểu hiện dạng tan của
rASPG…… ................................................................................................
70

Hình 3.15.

Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sự tổng hợp rASPG ................................
71

Hình 3.16.

Ảnh hưởng của nồng độ tiếp giống đến sự tổng hợp rASPG ................................
72

Hình 3.17.

73
Ảnh hưởng của nồng độ ampicillin đến sự tổng hợp rASPG ................................

Hình 3.18.

Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự tổng hợp enzyme ................................
73

Hình 3.19.

Ảnh hưởng của một số nguồn Carbon đến sự tổng hợp rASPG ................................

74

Hình 3.20.

Ảnh hưởng của một số ion tới sự tổng hợp rASPG................................74

Hình 3.21.

Biểu đồ đường đông mức thể hiện sự tương tác giữa các tham số

Hình 3.22.

SDS-PAGE mẫu biểu hiện tại điểm tối ưu ................................................................
78

Hình 3.23.

SDS_PAGE mẫu rASPG qua cột Sephacryl S-20............................

Hình 3.24.

SDS-PAGE của rASPG qua cột DEAE-Sepharose........................... 81

Hình 3.25.

Phổ khối của các ion phân đoạn peptide ................................................................
82

Hình 3.26.

So sánh độ tương đồng giữa trình tự của ba đoạn peptide thu được

77
79

(peptide) với L-asparaginase từ GenBank (WP-039108651) ................................
83

Hình 3.27.

Đồ thị biến thiên vận tốc phản ứng của rASPG theo nồng độ cơ
chất L-asparagine ................................................................................................
84

Hình 3.28.

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme ................................................................
85

Hình 3.29.

85
Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzyme ................................................................

Hình 3.30.

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền enzyme ................................................................
86

Hình 3.31.

Ảnh hưởng của pH tới độ bền enzyme ................................................................
86

Hình 3.32.

Ảnh hưởng của ion kim loại tới hoạt độ enzyme ...............................................................
87

Hình 3.33.

Mối tương quan giữa nồng độ rASPG thử nghiệm và % tế bào ung
thư bạch cầu lympho chuột P388 còn sống sót sau 72 giờ ................................
90

Hình 3.34.

Mối tương quan giữa nồng độ rASPG thử nghiệm và % tế bào ung
thư tủy P3X63Ag8 còn sống sót sau 72 giờ ................................................................
90

Hình 3.35.

Mối tương quan giữa nồng độ rASPG thử nghiệm và % tế bào ung
thư tủy SP2/0-Ag14 còn sống sót sau 72 giờ ................................................................
91

viii

Hình 3.36.

Mối tương quan giữa nồng độ rASPG thử nghiệm và % tế bào ung
thư nguyên bào tủy mãn của người K562 còn sống sót sau 72 giờ ................................
92

Hình 3.37.

Hình ảnh tế bào K562 ở các nồng độ thử nghiệm rASPG sau 72h ................................
93

Hình 3.38.

Hình ảnh tế bào HL60 ở các nồng độ thử nghiệm rASPG................

Hình 3.39.

Mối tương quan giữa nồng độ rASPG và ONCOGINASE thử
nghiệm với % tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp của người HL60

94
95

còn sống sót sau 72 giờ …........................................................................

Hình 3.40.

Mối tương quan giữa nồng độ rASPG và ONCOGINASE thử

95

nghiệm với % tế bào ung thư máu Jurkat còn sống sót sau 72 giờ ................................

Hình 3.41.

Hình ảnh tế bào Jurkat ở các nồng độ thử nghiệm rASPG................................
96

Hình 3.42.

Hình ảnh tế bào Hep2 ở các nồng độ thử nghiệm rASPG ………

Hình 4.1.

So sánh trình tự amino acid của rASPG và sản phẩm thương mại

97

EWINASE ................................................................................................
102

Hình 4.2.

So sánh trình tự ở 4 vị trí amino acid khác nhau giữa rASPG,
ERWINASE với một số trình tự trên Genbank ................................................................
103

ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Những mốc sự kiện trong quá trình phát triển L-asparaginase thành
thuốc chữa ALL................................................................................................
18

Bảng 1.2.

Dược lý lâm sàng của asparaginase và liều thường dùng ................................
19

Bảng 2.1.

Các vector sử dụng trong nghiên cứu ................................................................
38

Bảng 2.2.

Các mồi sử dụng trong nghiên cứu................................................................
38

Bảng 2.3.

Thành phần các loại đệm và dung dịch. ................................................................
40

Bảng 2.4.

Nồng độ ba yếu tố dùng trong RSM-CCD ................................................................

48

Bảng 2.5.

Kế hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hóa sinh tổng hợp
L-asparaginase có hoạt tính cao........................................................... 48

Bảng 2.6.

Thành phần gel co và gel tách……………………………………….

Bảng 3.1.

Tinh sạch rASPG qua cột ProBond Nikel-Chelating Resin ................................
67

Bảng 3.2.

Kết quả phân tích phương sai mô hình đa thức bậc hai ................................
76

Bảng 3.3.

Hàm lượng protein và hoạt độ của các phân đoạn thu được qua cột
Sephacryl S-200 ................................................................................................
80

Bảng 3.4.

Hoạt độ và hàm lượng protein của phân đoạn 16-17 qua cột DEAESepharose................................................................................................ 80

Bảng 3.5

Tinh sạch rASPG qua cột Sephacryl S-200 và DEAE-Sepharose ................................
81

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt độ enzyme ................................
88

Bảng 3.7.

Ảnh hưởng của DTT tới hoạt độ rASPG ................................................................
88

Bảng 3.8.

Các dòng tế bào ung thư được tiến hành thử nghiệm hoạt tính
89
rASPG…. ................................................................................................

Bảng 3.9.

Giá trị IC50 của rASPG với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm ................................
98

Bảng 3.10.

Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào thường ................................................................

98

49

x


1

MỞ ĐẦU
L-asparaginase (EC.3.5.1.1; L-asparagine amino-hydrolase) là enzyme phân
hủy L-asparagine - một chất dinh dưỡng quan trọng của tế bào ung thư. Thuốc Lasparaginase đã chứng minh hiệu quả lâm sàng trong bệnh bạch cầu cấp đặc biệt là
bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, u lympho ác tính và sarcoma lympho. Lasparaginase thủy phân nguồn asparagine ở bên ngoài tế bào buộc các tế bào dựa
hoàn toàn vào những gì chúng có thể tự tổng hợp được. Tế bào bình thường gần như
không cần nhiều asparagine để tồn tại và có thể tự tổng hợp được asparagine nhờ
asparagine synthetase do đó bị ảnh hưởng ít hơn. Trong khi đó tế bào ung thư nhất
là ung thư máu không có asparagine synthetase để tổng hợp asparagine, hơn nữa
chúng lại cần rất nhiều asparagine cho sự phát triển khổng lồ của chúng do đó
chúng dễ dàng bị tiêu diệt khi điều trị bằng L-asparaginase.
Với tốc độ tăng nhanh, ung thư đang là gánh nặng toàn cầu, phòng ngừa và
chữa trị ung thư là một trong những thách thức sức khỏe cộng đồng quan trọng nhất
của thế kỷ 21. Năm 2018, ước tính có khoảng 18 triệu trường hợp ung thư trên toàn
thế giới trong đó bệnh ung thư máu chiếm khoảng 581 nghìn người. Ung thư máu là
một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở trẻ em với ba phần tư trường hợp
bệnh là ở loại bạch cầu lympho cấp. L-asparaginase là một trong những ứng viên
hàng đầu trong điều trị ung thư máu ở người. Hiện tại L-asparaginase là thuốc
không thể thiếu trong phác đồ hóa trị liệu bạch cầu cấp dòng lympho cho trẻ em
cũng như người lớn.
L-asparaginase có trong vi khuẩn, nấm, thực vật và cả trong mô động vật
nhưng không tìm thấy ở người. Hiện tại chỉ có ba chế phẩm L-asparaginase được sử

dụng trong điều trị ung thư: một là L-asparaginase từ Escherichia coli, hai là dạng
enzyme này được gắn thêm polyethylene glycol, ba là L-asparaginase từ Erwinia
chrysanthemi (Dickeya chrysanthemi). E. coli sản xuất ra hai loại L-asparaginase I
và L-asparaginase II. Loại I được tìm thấy trong tế bào chất trong khi loại II tồn tại
trong khoang chu chất (periplasmic) của màng tế bào vi khuẩn và có ái lực với L-


2
asparagine cao hơn. Chỉ có L-asparaginase II được sử dụng trong ứng dụng lâm
sàng. L-asparaginase II từ E. coli và từ Erw. chrysanthemi có cùng một cơ chế
chống lại các tế bào khối u, tuy nhiên dược động học, ái lực với cơ chất và mức độ
nhạy cảm với bộ máy miễn dịch là khác nhau. Do đó, L-asparaginase từ Erw.
chrysanthemi là một lựa chọn quan trọng cho những bệnh nhân có đáp ứng dị ứng
với L-asparaginase từ E. coli.
Tuy nhiên việc sử dụng L-asparaginase vẫn còn phải đối mặt với một số
thách thức như có một số loại phản ứng dị ứng xảy ra do tính miễn dịch cao cũng
như do độc tính lâm sàng; đời sống enzyme ngắn; sản lượng L-asparaginase thấp do
gene biểu hiện thấp dẫn đến chi phí của thuốc kháng u này khá cao. Sử dụng công
nghệ tái tổ hợp trong sản xuất L-asparaginase đang ngày càng được quan tâm bởi đã
biết rõ về đặc tính sinh học, ít gây tác dụng phụ, ái lực cao với cơ chất và độc tính
thấp. Bên cạnh đó sử dụng công nghệ tái tổ hợp còn giúp tăng năng suất sản lượng
enzyme làm giảm chi phí sản xuất sản phẩm cuối cùng để chúng ta có có thể tiếp
cận với nguyên liệu L-asparaginase tốt hơn trong điều trị.
Chính vì thế đề tài “Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung
thƣ máu của enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi” được
chúng tôi tiến hành thực hiện với mục tiêu.
Biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp từ Erw. chrysanthemi có hoạt tính ức chế
sinh trưởng với tế bào ung thư máu trong hệ biểu hiện E. coli với năng suất cao.
Nội dung nghiên cứu đƣợc đặt ra
1)

Thiết kế hệ biểu hiện gene aspg mã hóa L-asparaginase II từ Erw.
chrysanthemi trong E. coli có hoạt tính enzyme cao;

2)

Tối ưu điều kiện biểu hiện và thành phần môi trường để năng suất sinh
tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp đạt cao nhất;

3)

Tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp; nhận diện enzyme tái tổ hợp bằng
MALDI_TOF


3
Xác định động học enzyme, nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt, độ bền pH,

4)

ảnh hưởng của ion kim loại, chất hữu cơ chất tẩy rửa đến hoạt tính
enzyme;
Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng của L-asparaginase tái tổ hợp trên

5)

một số dòng tế bào ung thư máu và ung thư rắn của người và chuột.
Đánh giá ảnh hưởng của L-asparaginase tái tổ hợp tới tế bào thường.

6)

Những đóng góp mới của luận án đạt đƣợc
(1)

Đã thiết kế, biểu hiện và thu nhận thành công trong E. coli L-asparaginase
tái tổ hợp có hoạt độ cao đạt 354 IU/mg dựa trên trình tự gene gốc có mã
số X12746 trên GenBank mã hóa cho L-asparaginase II từ Erw.
chrysanthemi.

(2)

L-asparaginase tái tổ hợp thu được có khả năng ức chế sinh trưởng của sáu
dòng tế bào ung thư máu nghiên cứu. Trong đó dòng tế bào ung thư tủy
xương chuột SP2/0-Ag14, P3X63Ag8 và tế bào ung thư bạch huyết P388
giá trị IC50 đạt xấp xỉ 50 µg/ml. Nhạy cảm nhất với dòng tế bào ung thư
nguyên bào tủy cấp của người HL60 với IC 50 đạt 1,14 µg/ml mạnh hơn
chế phẩm thương mại ONCOGINASE. Với dòng ung thư bạch cầu
lympho người Jurkat enzyme cũng thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng
tương đương với chế phẩm thương mại ONCOGINASE.


4

1. CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về L-asparaginase
1.1.1. Định nghĩa
L-asparaginase (EC.3.5.1.1; L-asparagine amino-hydrolase) là enzyme xúc
tác cho phản ứng thủy phân L-asparagine thành aspartic acid (Hình1.1).

L-asparaginase

L-asparagine

L-aspartic acid

Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của enzyme L-asparaginase
(Nguồn: Zuo et al., 2015) (Zuo et al., 2015)

L-asparaginase có nguồn gốc từ sinh vật khác nhau có khối lượng phân tử
khác nhau dao động trong khoảng 140 – 150 kDa (Wikman et al., 2005).
Khối lượng phân tử của L-asparaginase từ vi khuẩn E. coli là 133 – 144 kDa:
được cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị có khối lượng phân tử khoảng 35,6
kDa (Marlborough et al., 1975), hằng số Michaelis-Menten Km= 1,25 x 10-5 điểm
đẳng điện ở pH 4,9 (Wriston et al., 1973), L-asparaginase tinh sạch luôn có khoảng
2- 4% hoạt tính glutaminase và 5% hoạt tính D- asparaginase. 5-diazon-4-oxo-Lnorvalin-chất tương tự cơ chất L-asparagine của enzyme là chất ức chế enzyme hoạt
động (Jackson et al., 1970).
1.1.2. Phân loại
Dựa trên tính chất hóa học và tinh thể, L-asparaginase được chia thành 3 họ:
L-asparaginase vi khuẩn, L-asparaginase thực vật và L-asparaginase tương tự như
L-asparaginase Rhizobium etli asparaginase. Enzyme được phân loại dựa vào số


5
phản ứng xúc tác kể cả phản ứng trong quá trình sinh tổng hợp protein (Oinonen et
al., 1995) (Hình 1.2).

L-asparaginase

L-asparaginase từ

thực vật

Aspartyglucosaminidase

L-asparaginase từ
Rhizobium etli

L-asparaginase
thực vật

Lysophospholipase

L-asparaginase từ
vi khuẩn

Loại I

Loại II

Tiểu đơn vị Glu-Adt α

Hình 1.2. Phân loại L-asparaginase
(Nguồn: Borek et al., 2001) (Borek et al., 2001)

Hai isozyme của L-asparaginase trong đó xúc tác thủy phân L-asparagine
thành L-aspartate và ammonia, được sản xuất bởi E. coli là: L-asparaginase I (EcAI)
và L-asparaginase II (EcAII). Mặc dù hai enzyme này xúc tác cho một phản ứng
giống nhau, nhưng chúng có thể được phân biệt bởi tính tan trong dung dịch amoni
sulfat và độ nhạy cảm với nhiệt độ kích hoạt. EcAI có ở trong tế bào chất và xúc tác
quá trình thủy phân cả L-asparagine và L-glutamine. Trong khi EcAII tồn tại trong

điều kiện yếm khí trong khoang chu chất (periplasmic) của màng tế bào vi khuẩn và
có tính đặc hiệu cao cho sự thủy phân của L-asparaginase (Cedar et al., 1968).
EcAII khác với EcAI do có dải pH tối ưu rộng hơn và EcAII có ái lực với
asparagine (Km= 11, 5 µM) cao hơn nhiều EcAI (Km = 5 mM). EcAI thường dễ bị
loại trong quá trình tinh sạch. Trình tự amino acid của L-asparaginase dạng I và


6
dạng II về căn bản khác nhau nhưng hầu hết những trình tự amino acid quanh trung
tâm hoạt động đều bảo thủ (Bonthron et al., 1997). Sự khác nhau ở cấu trúc 3D của
L-asparaginase giải thích tại sao dạng I có ái lực với asparagine thấp hơn so với
dạng II (Sanches et al., 2007).
1.1.3. Cấu trúc L-asparaginase
Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu để làm sáng tỏ cấu trúc của
L-asparaginase ở cấp độ phân tử. Thông thường, L-asparaginase tồn tại như một
tetramer nhưng dạng hexamer, dimer và monomer cũng được tìm thấy khi phân lập
ở những nguồn khác. Phần lớn L-asparaginase từ vi khuẩn tồn tại ở dạng tetramer.
Cấu trúc của L-asparaginase từ E. coli và Erwinia sp. đã được các nhà khoa học làm
sáng tỏ, cả hai có cấu trúc ba chiều tương tự nhau.
L-asparaginase từ Erw. carotovora bao gồm hai tetramer (ABCD và EFGH)
tạo thành tám monomer giống hệt nhau (A đến H). Mỗi monomer gồm 327 amino
acid với 14 chuỗi alpha, 8 xoắn beta (Kozak et al., 2000) và hai domain, một
domain lớn đầu N và một domain nhỏ đầu C (Aghaiypour et al., 2001). Vị trí hoạt
động được đặt ở giữa hai monomer cạnh nhau (A và C; B và D). Các tetramer bao
gồm bốn tiểu đơn vị giống hệt nhau. Toàn bộ phân tử được coi là một dimer của
dimer (Jaskolski et al., 2001; Sanches et al., 2003). Mỗi vị trí hoạt động được định
hình bởi chỗ nối chuyển các amino acid trong hai monomer liền kề. Các amino acid
sau tạo thành vị trí hoạt động: Thr15, Tyr29, Ser62, Glu63, Thr95, Asp 96, Ala120,
và Lys168, trong đó chỉ có một amino acid Ser254 trong monomer liền kề (Ramya
et al., 2011; Sanches et al., 2003). Thr15 và Thr95 chịu trách nhiệm cho các hoạt

động xúc tác của enzyme.
L-asparaginase tách từ E. coli hoạt động như một tetramer của 4 tiểu đơn vị
giống hệt nhau, gồm 222 đối xứng và có 4 vị trí hoạt động. Mỗi đơn vị có khối
lượng phân tử khoảng 35,6 kDa, chứa hai miền α/β nối với nhau bởi một trình tự
191-212 (Swain et al., 1993). Cơ chế hoạt động của enzyme liên quan đến hai bộ
ba. Bộ ba đầu tiên Thr12-Tyr25-Glu283 hoạt động trong bước acyl hóa tạo ra liên


7
kết hóa trị với enzyme. Bộ ba thứ hai, Thr89-Lys162-Asp90, hoạt động bằng cách
kích hoạt một phân tử nước tạo ra các sản phẩm thông qua phản ứng với ái nhân thứ
hai (Sanches et al., 2007) (Hình 1.3).
Thr12-Tyr25
Tiểu đơn vị A

Tiểu đơn vị C

Tiểu đơn vị B

Tiểu đơn vị D
Đầu C

A

Đầu N

B

Hình 1.3. Cấu trúc tetramer (A) và mononer (B) của L-asparaginase
(Nguồn: Sanches, 2007)

1.1.4. Cơ chế phản ứng của L-asparaginase
Cơ chế hoạt động của L-asparaginase được so sánh với lớp serine-protease,
trung tâm hoạt động là bộ ba amino acid truyền thống Ser-His-Asp được gọi là bộ
ba xúc tác. Bộ ba này bao gồm một nhân serine (Ser), một bazo histidine (His) và
một acid asparagine (Asp) được liên kết với nhau bởi liên kết hydro, nhóm -OH của
gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt
động xúc tác của enzyme, các enzyme này thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm
tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng, thông qua hai bước chính
(Hình 1.4).
Bước 1: Acyl hóa: ban đầu, nhóm –OH của enzyme hoạt động như một tác
nhân nucleophin tấn công nguyên tử carbon trong nhóm carbonyl của cơ chất
L-asparagine. Sau khi tấn công nguyên tử carbon trên bề mặt cơ chất dẫn đến hình
thành một acyl-enzyme trung gian thông qua một trạng thái chuyển tiếp. Sự ổn định


8
điện tích âm tạo ra trên nguyên tử O trong trạng thái chuyển tiếp thông qua liên kết
hydro giữa nguyên tử O còn trống mang điện tích âm và nhóm N-H liền kề.
Bước 2: Khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O
theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của
gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme.

Hình 1.4. Cơ chế phản ứng chung được xúc tác bởi L-asparaginase
(Nguồn: Batool et al., 2016) (Batool et al., 2016))

1.1.5. Các nguồn của L-asparaginase
L-asparaginase hiện diện nhiều trong mô động vật, vi khuẩn, thực vật, và
trong huyết thanh của một số động vật gặm nhấm, nhưng không có trong người.
L-asparaginase đã được tách chiết và tinh sạch từ nhiều nguồn khác nhau.

Từ vi khuẩn: L-asparaginase từ vi khuẩn là vấn đề được quan tâm lớn trong
y tế. Sản xuất L-asparaginase từ Pseudomonas flourescens AG đã được báo cáo bởi
Mardashev và cộng sự (1975) (Mardashev et al., 1975). Mycobacterium phlei cũng đã
được tìm thấy là một nguồn L-asparaginase tốt bởi Pastuszak năm 1976. Lasparaginase trong Tetrahymena pyriformis đã được tìm thấy trong lưới nội chất và
chủ yếu ở pha tĩnh (Triantafillou et al., 1988). L-asparaginase từ Thermus
thermophilus không thủy phân L-glutamine đã được công bố bởi Pritsa và Kyriakidis


9
(2001) (Pritsa et al., 2001). L-asparaginase từ Erwinia sp., đã được công bố bởi
Borkotaky và Bezbaruah và cộng sự (Sahu et al., 2007).
Từ nấm: Nấm là nguồn sản xuất L-asparaginase lớn thứ hai, dự kiến sẽ vượt
qua vi khuẩn. Các chi Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Helminthosporium,
Scophulariopsis, Paecilomyces và Pestalotiopsis đã được báo cáo là nguồn Lasparaginase tốt (Chandra, 2014).
Từ nấm men: Sản xuất L-asparaginase từ Rhodotorula sp. (nấm men bất toàn
đỏ), đã được nghiên cứu bởi Foda và cộng sự (1980) (Foda et al., 1980). Một
homodimer L-asparaginase từ Rhodosporidium toruloides cũng được nghiên cứu
bởi Ramakrishnan và cộng sự (1996) (Ramakrishnan et al., 1996). L-asparaginase II
từ chủng Saccharomyces cerevisiae cũng đã được công bố (Ferrara et al., 2006).
Từ xạ khuẩn: Gunasekaran và cộng sự (1995) đã sản xuất L-asparaginase
bởi Nocardia sp. (Gunasekaran et al., 1995). Sản xuất L-asparaginase nội bào và ngoại
bào từ Streptomyces longsporusflavus (F-15) đã được mô tả bởi Fattah và cộng sự
(1998)(Abdel-Fattah et al., 2007). Streptomyces sp. phân lập từ ruột cá Therampon
jarbua và Villorita cyprinoids có hoạt tính L-asparaginase.
Từ thực vật: L-asparaginase đã được sản xuất từ cây thuộc họ đậu Lupin
araboreus và Lupin artgustiplius. Hoạt tính của L-asparaginase cũng đã được tìm thấy
ở trong đất, rễ của cây thông Pinus pinaster và Pinus radiata (Devey et al., 2004).
Từ tảo: L-asparaginase từ tảo biển Chlamydomonas sp. Đã được tinh sạch
năm 1982 (Paul, 1982) tuy nhiên kết quả thử nghiệm trong in vivo cho thấy hoạt
tính kháng u kém hơn so với L-asparaginase từ nhân sơ và nhân chuẩn.

1.1.6. Ứng dụng
Trong dược phẩm: Ứng dụng quan trọng nhất của L-asparaginase là dùng
làm thuốc để điều trị ung thư bạch cầu. Các tế bào bình thường thì có thể tự tổng
hợp asparagine bằng cách sử dụng enzyme transaminase chuyển đổi oxaloacetate
thành aspartate trung gian, sau đó chuyển một nhóm amino từ glutamate tới
oxaloacetate tạo thành α-ketoglutarate và aspartate. Cuối cùng, trong tế bào khỏe


10
mạnh aspatate được chuyển thành asparagine bởi enzyme asparagine synthetase.
Trong khi các tế bào ung thư không thể tự tổng hợp được amino acid này do thiếu
enzyme asparagine synthetase nên phải sử dụng asparagine từ bên ngoài.
L-asparaginase xúc tác chuyển đổi L-asparagine thành aspartic acid và ammonia.
Điều này gây tổn thất cho tế bào bạch cầu ung thư dẫn đến chết tế bào (Broome,
1968). Chỉ có L-asparaginase dạng II mới có hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Do đó
L-asparaginase II được nghiên cứu rộng rãi hơn.
Ứng dụng trong thực phẩm: Bên cạnh ứng dụng chính dùng làm thuốc chống
ung thư, L-asparaginase còn được sử dụng rộng rãi trong quy trình chế biến thực
phẩm. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm tồn tại một loại tinh thể rắn không
màu không mùi là acrylamide (2-propenamide), là sản phẩm của phản ứng Milard
khi tinh bột được chiên hoặc nướng ở 120°C (Lingnert et al., 2002). Acryamide là
một chất độc thần kinh và được xếp vào một loại chất gây ung thư cho con người.
Trong ngành công nghiệp thực phẩm, acrylamide chủ yếu bắt nguồn từ phản ứng
nhiệt giữa các nhóm α-amino của asparagine và cacbonyl nhóm amino acid tự do
của đường khử như glucose trong quá trình nướng và chiên (Friedman, 2003). Do
khả năng chuyển đổi L-asparagine thành L-aspartate, L-asparaginase hứa hẹn là một
cách để làm giảm tiền chất cho phản ứng Millard bằng cách xử lý các loại thực
phẩm giàu tinh bột (khoai tây và bánh mì bột) với L-asparaginase, do đó làm giảm
nguy cơ hình thành acrylamide (Pedreschi et al., 2008). Tuy nhiên, loại bỏ hoàn
toàn acrylamide là không thể do có asparagine khác hình thành độc lập (Dhanam et

al., 2013).
Trong một số nghiên cứu xử lý L-asparaginase với thực phẩm khoai tây và
ngũ cốc đạt được hàm lượng acrylamide cuối cùng giảm 30-97% (Ciesarová et al.,
2006; Kumar et al., 2014; Pedreschi et al., 2008). Năm 2011, Pedreschi và cộng sự
báo cáo rằng xử lý truyền thống kết hợp với xử lý bằng L-asparaginase có thể làm
giảm 90% lượng acrylamide trong khoai tây chiên (Pedreschi et al., 2011). Mức độ
giảm acrylamide không làm thay đổi vị giác điển hình của các sản phẩm này
(Hendriksen et al., 2009; Kornbrust et al., 2010).


11
Ngoài ra, L-asparaginase cũng sử dụng cho phát triển của biosensor để phân
tích mức độ asparagine cả trong ung thư máu và trong công nghiệp thực phẩm
(Verma et al., 2012).
1.2. L-asparaginase trong điều trị ung thƣ máu
1.2.1. Tổng quan về bệnh ung thư máu
Ung thư máu hay ung thư bạch cầu xuất hiện khi quá trình tạo tế bào máu
trong tủy xương bị biến đổi, tạo ra các tế bào bạch cầu bất thường, đó là các tế bào
bạch cầu ác tính. Không giống các tế bào máu bình thường, các tế bào máu ác tính
không chết đi mà có thể tăng sinh phát triển vô độ, lấn át các dòng tế bào máu bình
thường khác, làm cho chúng không được thực hiện chức năng bình thường (Hình
1.5).
Bệnh bạch cầu được phân chia thành các nhóm khác nhau dựa trên dòng
bạch cầu bị ảnh hưởng trong cơ thể như: các tế bào dòng tủy hoặc dòng lympho và
tiến triển của mỗi dòng đó:
-

Bệnh bạch cầu lympho mạn tính (CLL): Các tế bào lympho bị ảnh hưởng và
thường tiến triển chậm. Tuổi thường mắc bệnh là trên 55 tuổi. Hầu như
không gặp ở trẻ em.

-

Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML): Các tế bào dòng tủy bị ảnh hưởng
và giai đoạn đầu thường tiến triển chậm. Phần lớn gặp ở người lớn.

-

Bệnh bạch cầu lympho cấp tính (ALL): Là thể phát triển ác tính của các tế
bào dòng lympho và tiến triển rất nhanh. Đây là thể bệnh bạch cầu thường
gặp nhất ở trẻ em, người lớn đôi khi cũng có thể bị mắc.

-

Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML): Các tế bào dòng tủy bị ảnh hưởng
và tiến triển nhanh. Có thể xảy ra ở cả người lớn và trẻ em.


12

Bình thường

Ung thư
Tiểu cầu
Hồng cầu
Bạch cầu

Huyết tương
Tế bào ác tính

TẾ BÀO MÁU
Hình 1.5. Tế bào máu bình thường và tế bào máu ung thư
(Nguồn: )

Triệu chứng của bệnh ung thư máu: Triệu chứng của bệnh bạch cầu phụ
thuộc nhiều vào số lượng các tế bào bạch cầu ác tính có trong máu và phụ thuộc cả
vào vị trí các tế bào này gây ảnh hưởng tới cơ thể. Khi tế bào dạng bạch cầu ung thư
phát triển nhanh trong tủy sẽ gây đau nhức xương. Đồng thời chúng chiếm chỗ và
làm giảm sự phát triển những tế bào máu bình thường khác. Lúc đó bệnh nhân có
thể có những chứng sau: sốt, đau đầu, đau khớp do sự chèn ép trong tủy; mệt mỏi,
yếu sức, da đổi thành màu trắng nhợt do thiếu hồng cầu; hay bị nhiễm trùng do bạch
cầu không thực hiện được chức năng chống nhiễm khuẩn; chảy máu chân/nướu
răng, dễ bầm tím do giảm khả năng làm đông máu; biếng ăn, sút cân; ra mồ hôi về
ban đêm ở bệnh nhân là nữ; sưng nề bụng hoặc cảm giác khó chịu ở bụng (Clarke et
al., 2016).
Một số các phương pháp chủ yếu được sử dụng để điều trị bệnh bạch cầu có
thể kể tới như là:


13
Phương pháp hóa trị: Là phương pháp điều trị hóa chất giúp tiêu diệt tế bào
ung thư trong cơ thể bệnh nhân. Tùy thuộc từng thể bệnh mà bác sỹ cho người bệnh
dùng đơn hóa chất hoặc phối hợp đa hóa chất.
Phương pháp điều trị đích: Điều trị đích ngăn chặn sự phát triển của tế bào
ác tính thông qua ức chế hoạt động protein bất thường làm kích thích sự phát triển
của tế bào ung thư.
Phương pháp điều trị sinh học: Giúp kích thích sự miễn dịch tự nhiên của
cơ thể chống lại tế bào ung thư. Có nhiều biện pháp điều trị sinh học khác nhau:
một số gắn kết với tế bào bạch cầu ác tính, một số vận chuyển các chất gây độc tế
bào, một số khác giúp cải thiện hệ thống miễn dịch kích thích cơ thể chống lại tế

bào ung thư.
Phương pháp ghép tế bào gốc
Ghép tế bào gốc từ tủy tự thân: Tế bào gốc được lấy từ tủy xương của chính
người bệnh. Phương pháp này có bất lợi là có thể bị nhiễm tế bào ung thư. tế bào
gốc cũng có thể có trong máu ngoại vi.
Ghép tế bào gốc khác gene đồng loài: Ghép tế bào gốc tạo máu từ tủy xương
hoặc từ máu ngoại vi hoặc cuống rốn. Để ghép tế bào gốc khác gene đồng loài tạo
máu bệnh nhân cần có người cho tế bào gốc tương thích về miễn dịch, gọi là phù
hợp HLA. Để ghép thành công, bệnh nhân phải được điều trị hóa chất liều cao. Quá
trình điều trị này có rất nhiều biến chứng. Vì vậy hiện nay người ta đã áp dụng một
phương pháp mới với những bệnh nhân cao tuổi và khả năng chịu đựng hóa chất
kém là phương pháp ghép không diệt tủy. Ghép không diệt tủy còn giúp tiêu diệt tế
bào ung thư bạch cầu thông qua hiệu ứng “mảnh ghép chống ung thư bạch cầu”.
Hiện nay phương pháp điều trị bệnh ung thư máu chủ yếu vẫn là thay tủy
xương của người bệnh bằng tủy xương của một người hiến phù hợp để thay thế
phần tủy xương đã bị hư hỏng và kích thích sinh ra hồng cầu cũng như kìm hãm sự
gia tăng đột biến của bạch cầu. Tuy nhiên, khả năng thành công rất thấp, chỉ khoảng
10% và khả năng bệnh tái phát cũng rất lớn (khoảng từ 3 đến 5 năm).