Xác định methanol, ethanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong rượu và huyết tương người

TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ NGÂN

XÁC ĐỊNH METANOL, ETANOL
VÀ CÁC SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA CỦA CHÚNG
TRONG RƢỢU VÀ HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ NGÂN

XÁC ĐỊNH METANOL, ETANOL
VÀ CÁC SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA CỦA CHÚNG
TRONG RƢỢU VÀ HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
Mã số: 60440118

HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Tạ Thị Thảo

TS. Phạm Quang Trung

Hà Nội – 2018


LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin đƣợc thể hiện lòng biết ơn trân trọng nhất tới PGS.TS Tạ
Thị Thảo và TS. Phạm Quang Trung đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân
viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt là các anh chị và các
bạn đồng nghiệp tại Phòng xét nghiệm – Trung tâm Chống độc đã giúp đỡ và tạo
điều kiện cho tôi đƣợc học tập cũng nhƣ làm nghiên cứu trong suốt thời gian qua.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá
Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, đặc biệt là
các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cám ơn khoa Hóa Pháp – Viện Pháp y Quốc gia đã giúp
đỡ cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá
K27, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm hoá phân tích K27 đã giúp đỡ, chia sẻ
những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Hà Nội, ngày

tháng
Học viên

Nguyễn Thị Ngân

năm 201


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................8
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................10
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................12
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Tổng quan về metanol và etanol .......................................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung về metanol và etanol .......................................................3
1.1.2. Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể, cơ chế gây độc .....................5
1.1.2.1. Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể.........................................5
1.1.2.2. Cơ chế bệnh sinh ngộ độc metanol ......................................................7
1.1.3. Liều gây độc ...............................................................................................9
1.1.4. Triệu chứng ngộ độc metanol ...................................................................10
1.2. Các phƣơng pháp phân tích metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa ....11
1.2.1. Các phƣơng pháp phân tích phòng thí nghiệm.........................................11
1.2.2. Các phƣơng pháp xác định nhanh metanol ..............................................13
1.2.3. Phƣơng pháp 1H – NMR ..........................................................................19
1.2.3.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ..............19
1.2.3.2. Sơ đồ khối nguyên tắc hoạt động .......................................................20
1.2.3.3. Nguyên tắc khi định tính và định lƣợng bằng phổ 1H - NMR ...........20
1.2.3.4. Nghiên cứu loại tín hiệu của dung môi nƣớc .....................................21
1.2.3.5. Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp so với sắc ký ................................23
1.2.3.6. Một số nghiên cứu định lƣợng bằng phổ 1H- NMR ..........................23
1.3. Các kỹ thuật tủa protein trong xử lý mẫu sinh học .........................................25
1.4. Tổng kết chung phần tổng quan......................................................................26
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................28

2.1. Trang thiết bị và hoá chất ...............................................................................28
2.1.1. Hoá chất ....................................................................................................28


2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................31
2.2. Đối tƣợng phân tích ........................................................................................32
2.2.1. Chất phân tích ...........................................................................................32
2.2.2. Mẫu nghiên cứu ........................................................................................32
2.2.2.1. Loại mẫu ............................................................................................32
2.2.2.2. Chuẩn bị mẫu phân tích .....................................................................33
2.3. Phƣơng pháp phân tích ...................................................................................33
2.3.1. Phƣơng pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử .................................33
2.3.2. Phƣơng pháp thử nhanh metanol ..............................................................34
2.3.3. Phƣơng pháp định lƣợng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa
bằng 1H – NMR ..................................................................................................36
2.3.3.1. Quy trình đo mẫu triệt tiêu dung môi ................................................36
2.3.3.2. Phƣơng pháp định lƣợng theo công thức ...........................................36
2.3.3.3. Phƣơng pháp định lƣợng theo đƣờng chuẩn ......................................37
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................38
3.1. Nghiên cứu xác định nhanh methanol bằng phƣơng pháp (UV - Vis) ...........38
3.1.1. Khảo sát các điều kiện để thử nhanh metanol bằng phƣơng pháp quang 38
3.1.1.1. Lựa chọn thuốc thử tạo phức màu .....................................................38
3.1.1.2. Lựa chọn chất oxy hóa .......................................................................39
3.1.1.3. Xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại ..................................................40
3.1.1.4. Ảnh hƣởng của lƣợng dung dịch axit chromotropic 0,1% lên độ hấp
thụ quang .........................................................................................................41
3.1.1.5. Xác định thời gian oxi hóa metanol ...................................................42
3.1.1.6. Xác định thời gian tạo phức màu .......................................................42
3.1.2. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn xác định metanol bằng phƣơng pháp
đo quang trong phòng thí nghiệm.......................................................................43

3.2. Nghiên cứu chế tạo test kit thử nhanh metanol trong rƣợu ............................45
3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ etanol ................................................................45
3.2.2. Ảnh hƣởng của lƣợng chất oxy hóa KMnO4 – H3PO4 .............................46
3.2.3. Xây dựng thành phần kit thử metanol trong rƣợu ....................................47


3.2.3.1. Ảnh hƣởng của các chất độn ..............................................................47
3.2.3.2. Thành phần thuốc thử trong kit thử methanol trong rƣợu .................48
3.2.4. Ảnh hƣởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang cuả kít thử
metanol trong rƣợu .............................................................................................48
3.2.5. Khảo sát thời gian ổn định màu của phức khi sử dụng kit thử .................49
3.2.6. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng fomandehit trong rƣợu..................................50
3.2.7. Quy trình và khoảng hoạt động kít thử nhanh metanol trong rƣợu..........51
3.2.6.1. Chế tạo bộ kít thử metanol trong rƣợu ...............................................51
3.2.6.2. Quy trình thử metanol trong rƣợu ......................................................51
3.2.6.3. Khoảng hoạt động và bảng màu của kit thử metanol trong rƣợu ......52
3.2.7. Đánh giá độ chính xác khi dùng kit thử metanol trong rƣợu ...................55
3.3. Xây dựng test kit trong huyết tƣơng ...............................................................56
3.3.1. Ảnh hƣởng của protein trong huyết tƣơng ...............................................56
3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng KMnO4 30g/l khi lƣợng protein thay đổi
............................................................................................................................57
3.3.3. Khảo sát thời gian ổn định màu của phức khi sử dụng kit thử metanol
trong huyết tƣơng ngƣời .....................................................................................58
3.3.4. Quy trình xác định và khoảng hoạt động xác định metanol trong huyết
tƣơng ...................................................................................................................59
3.3.5.1. Chế tạo bộ kít thử metanol trong huyết tƣơng ...................................59
3.3.5.2. Quy trình thử metanol trong huyết tƣơng ..........................................60
3.3.5.3. Khoảng tuyến tính và bảng màu của kit thử metanol trong huyết
tƣơng ...............................................................................................................60
3.3.6. Đánh giá độ chính xác khi dùng kit thử metanol trong huyết tƣơng........62

3.4. Nghiên cứu định lƣợng etanol, metanol và các chất chuyển hóa bằng 1H–
NMR ......................................................................................................................64
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi ......................................................64
3.4.2. Nghiên cứu định lƣợng các chất ...............................................................65
3.4.2.1. Nhận dạng các chất qua phổ H1 – NMR ............................................65
3.4.3.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính xác định 5 chất bằng 1H - NMR
.........................................................................................................................67


3.4.4. Nghiên cứu định lƣợng etanol và metanol và các chất chuyển hóa trong
huyết tƣơng ngƣời ..............................................................................................71
3.4.4.1. Nhận dạng các chất trong huyết tƣơng không xử lý mẫu qua phổ H1 –
NMR................................................................................................................71
3.4.4.2. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu ......................................................72
3.4.4.3. Xây dựng đƣờng chuẩn các chất trên nền mẫu huyết tƣơng..............73
3.4.4.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp định lƣợng trong mẫu
huyết tƣơng .....................................................................................................78
3.5. Áp dụng phân tích mẫu thực tế .......................................................................79
3.5.1. Mẫu rƣợu ..................................................................................................79
3.5.2. Mẫu huyết tƣơng ngƣời ............................................................................80
KẾT LUẬN ...............................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................84
PHỤ LỤC 1 ...............................................................................................................90


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1: Độ hấp thụ quang của phức màu khi thời gian oxi hóa metanol thay đổi
...................................................................................................................................42
Bảng 3. 2 : Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ metanol .....................44
Bảng 3. 3: Ảnh hƣởng của thể tích KMnO4 khi thay đổi nồng độ etanol .................46

Bảng 3. 4: Độ hấp thụ quang của chất khi thêm các chất độn trong nền etanol .......47
Bảng 3. 5: Ảnh hƣởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang xác định ..49
Bảng 3. 6: Độ hấp thụ quang của metanol trong nền mẫu rƣợu ...............................53
Bảng 3. 7: Độ hấp thụ quang của mẫu trắng khi xác định metanol trong rƣợu ........54
Bảng 3. 8: Độ chụm của phƣơng pháp xác định metanol trong mẫu etanol .............55
Bảng 3. 9: Đánh giá độ tái lặp xác định metanol trong nền etanol 20% ...................55
Bảng 3. 10: Độ đúng của phƣơng pháp kit thử xác định nhanh methanol trong rƣợu
...................................................................................................................................56
Bảng 3. 11: Ảnh hƣởng của thể tích KMnO4 30 g/l khi thay đổi lƣợng huyết tƣơng
...................................................................................................................................58
Bảng 3. 12: Độ hấp thụ quang của metanol trong nền mẫu huyết tƣơng..................60
Bảng 3. 13: Độ lặp lại của phƣơng pháp xác định metanol trong mẫu huyết tƣơng 62
Bảng 3. 14: Đánh giá độ tái lặp xác định metanol trong mẫu huyết tƣơng ..............63
Bảng 3. 15: Độ đúng của kit thử xác định nhanh methanol trong huyết tƣơng ........63
Bảng 3. 16: Độ dịch chuyển hóa học của các chất ....................................................67
Bảng 3. 17: Tỉ lệ diện tích pic của các chất tại các nồng độ khác nhau....................67
Bảng 3. 18: Phƣơng trình hồi quy xác định các chất bằng 1H – NMR .....................68
Bảng 3. 19: LOD và LOQ của các chất ....................................................................69
Bảng 3. 20:Nồng độ của các chất tính theo công thức ..............................................69
Bảng 3. 21: Phƣơng trình tuyến tính nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức 70
Bảng 3. 22: Độ dịch chuyển hóa học tƣơng ứng của các chất trong nền huyết tƣơng
...................................................................................................................................73


Bảng 3. 23: Tỉ lệ diện tích pic tại các nồng độ khác nhau trong nền huyết tƣơng....74
Bảng 3. 24: Phƣơng trình hồi quy xác định các chất bằng 1H – NMR trong nền
huyết tƣơng................................................................................................................75
Bảng 3. 25: LOD và LOQ của các chất trong huyết tƣơng.......................................75
Bảng 3. 26:Nồng độ của các chất trong nền huyết tƣơng tính theo công thức .........76
Bảng 3. 27: Phƣơng trình tuyến tính nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức 77

Bảng 3. 28: Hiệu suất thu hồi của các chất trong nền mẫu huyết tƣơng...................78
Bảng 3. 29: Kết quả phân tích mẫu rƣợu của bệnh nhân ..........................................79
Bảng 3. 30:Kết quả phân tích mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ...............................81


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1: Chuyển hóa metanol trong cơ thể ngƣời ....................................................5
Hình 1. 2: Chuyển hóa etanol trong cơ thể ngƣời .......................................................7
Hình 1. 3: Quá trình nhận biết etanol và metanol .....................................................13
Hình 1. 4: Sơ đồ khối của máy NMR ........................................................................20
Hình 1. 5: Sơ đồ chƣơng trình xung ZGPR ..............................................................22
Hình 1. 6: Sơ đồ chƣơng trình xung NOESYPR1D .................................................23

Hình 3. 1: Sự thay đổi màu sắc của các dung dịch khi thêm thuốc thử ....................38
Hình 3. 2: Ảnh hƣởng của chất oxy hóa tới màu của dung dịch ...............................39
Hình 3. 3: Độ hấp thụ quang dung dịch phức màu tại các nồng độ metanol khác
nhau ...........................................................................................................................40
Hình 3. 4: Độ hấp thụ quang phụ thuộc vào thể tích thuốc thử axit chromotropic
0,1%...........................................................................................................................41
Hình 3. 5: Ảnh hƣởng của thời gian oxi hóa đến độ hấp thụ quang phức màu ........42
Hình 3. 6:Ảnh hƣởng của thời gian tới độ hấp thụ quang.........................................43
Hình 3. 7: Đƣờng chuẩn xác định metanol với thuốc thử axit chromotropic 0,1% ..44
Hình 3. 8: Ảnh hƣởng của nồng độ etanol ................................................................45
Hình 3. 9: Màu của methanol trong nền etanol 20% khi thay đổi chất độn..............48
Hình 3. 10: Độ ổn định màu của phức theo thời gian ...............................................50
Hình 3. 11: Ảnh hƣởng của nồng độ HCHO tới màu của dung dịch ........................50
Hình 3. 12: Kít thử methanol trong rƣợu ..................................................................51
Hình 3. 13: Quy trình xác định metanol trong rƣợu .................................................52
Hình 3. 14: Đƣờng chuẩn metanol trong nền mẫu rƣợu 20% ...................................53
Hình 3. 15: Bảng màu bán định lƣợng metanol trong rƣợu ......................................54

Hình 3. 16: Độ ổn định của phức màu trong huyết tƣơng theo thời gian .................59


Hình 3. 17: Kít thử metanol trong huyết tƣơng.........................................................59
Hình 3. 18: Q uy trình xác định metanol trong mẫu huyết tƣơng .............................60
Hình 3. 19: Đƣờng chuẩn metanol trong nền mẫu huyết tƣơng ...............................61
Hình 3. 20: Bảng màu bán định lƣợng metanol trong huyết tƣơng ..........................61
Hình 3. 21: Giản đồ 1H-NMR của etanol và metanol với dung môi H2O : D2O=9:1
...................................................................................................................................64
Hình 3. 22: Giản đồ 1H-NMR các chất trong nền huyết tƣơng với dung môi H2O :
D2O=9:1 ....................................................................................................................65
Hình 3. 23: Giản đồ 1H-NMR dùng TMS để hiệu chỉnh ..........................................66
Hình 3. 24: Giản đồ 1H-NMR thu đƣợc của hỗn hợp các chất .................................66
Hình 3. 25: Đƣờng chuẩn xác định các chất bằng 1H – NMR ..................................68
Hình 3. 26: Đƣờng tuyến tính giữa nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức ..70
Hình 3. 27: Giản đồ 1H – NMR của huyết tƣơng chƣa qua xử lý mẫu .....................71
Hình 3. 28: Giản đồ 1H – NMR của huyết tƣơng trắng (xanh )và huyết tƣơng thêm
chuẩn (đỏ) khi xử lý bằng TCA ................................................................................72
Hình 3. 29: Đƣờng chuẩn xác định các chất bằng 1H – NMR trong nền huyết tƣơng
...................................................................................................................................74
Hình 3. 30: Đƣờng tuyến tính giữa nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức ..77


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên tiếng anh

Tên Tiếng việt

% Relative standard
deviation

% Độ lệch chuẩn
tƣơng đối

Proton Nuclear Magnetic
Resonance

Cộng hƣởng từ hạt
nhân proton

ADH

Andehyde Dehydrogenase

Andehit
Dehydrogenase

FID

Free induction decay

Sự phân rã cảm ứng tự
do

GC – MS

Gas chromatography – Mass
Sắc ký khí khối phổ

spectrometry

HPLC

High performance
Chromatography

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lƣợng

NAD+

Nicotinamide Adenine
Dinucleotide

Nicotinamide Adenine
Dinucleotide

NADH

Nicotinamide Adenine

Dinucleotide

Nicotinamide Adenine
Dinucleotide

ppm

Parts per million

Phần triệu

% RSD
1

H - NMR

liquid Sắc ký lỏng hiệu năng
cao


ĐẶT VẤN ĐỀ
Metanol và Etanol là 2 ancol thƣờng gặp nhất và đƣợc ứng dụng nhiều trong
các ngành công nghiệp và đời sống. Mặc dù có nhóm chức rƣợu nhƣng metanol
không dùng để uống nhƣ rƣợu etanol. Phơi nhiễm metanol qua đƣờng uống, đƣờng
hít hoặc thậm chí tiếp xúc qua da, nếu số lƣợng đủ lớn có thể gây ra ngộ độc nặng nề.
Trong đó ngộ độc qua đƣờng tiêu hóa là hay gặp nhất [4].
Trên thế giới, báo cáo ca lâm sàng ngộ độc metanol đầu tiên từ năm 1855 bởi
MacFarlan, với triệu trứng nhƣ thở nhanh sâu, toan chuyển hóa, rối loạn ý thức
từ lú lẫn đến hôn mê, suy thận cấp và tụt huyết áp [5]. Sau đó, có rất nhiều báo
cáo về ngộ độc đƣợc công bố [4],[ 10],[ 16]. Tất cả đều để lại hậu quả nặng nề

với tỉ lệ tử vong rất cao: 18 –56,3 %. Nhiều trƣờng hợp sống sót thì di chứng
giảm hoặc mất thị lực và tử vong một thời gian sau do di chứng thần kinh tiến
triển nặng lên.
Ở Việt Nam, tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai, trong năm
2014 đã tiếp nhận và điều trị 16 ca, năm 2015 số ca ngộ độc là 33 ca và năm 2016
lên tới 46 ca ngộ độc metanol và trong 6 tháng đầu năm 2017 số ca ngộ độc đã tăng
lên tới 48 ca. Đáng báo động là một số vụ ngộ độc tập thể có tính chất nghiêm trọng
nhƣ tại Lai Châu vào tháng 2 năm 2017 với 40 ngƣời ngộ độc metanol sau khi uống
rƣợu tại 1 đám cƣới trong đó có 9 ngƣời đã tử vong do nồng độ metanol quá cao.
Tháng 3 năm 2017 tại Hà nội, 9 BN quê Gia Lai bị ngộ độc metanol do uống rƣợu
không rõ nguồn gốc.
Trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân uống có thể chứa etanol, metanol và các
andehit và axit tƣơng ứng. Tuy nhiên, BN ngộ độc chủ yếu do bởi metanol khi vào
cơ thể chuyển hóa thành axit fomic. Trong các phác đồ điều trị ngộ độc metanol,
etanol đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc giải độc nhằm hạn chế sự chuyển hóa của
metanol thành axit fomic, sau đó các chất độc này sẽ loại bỏ ra khỏi cơ thể nhờ
phƣơng pháp lọc máu hấp phụ. Do vậy, để tiên lƣợng mức độ nặng cũng nhƣ đƣa ra
phác đồ điều trị hợp lý cho bệnh nhân, cần phải xác định nhanh nồng độ của

1


metanol etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong huyết tƣơng BN ngay
khi nhập viện cũng nhƣ trong quá trình điều trị.
Để xác định nhanh BN nhiễm metanol, một số nƣớc trên thế giới, đã sản xuất
các test thử metanol trong rƣợu và máu, chủ yếu dựa trên phản ứng oxi hóa chọn lọc
metanol bằng chất oxi hóa khi có enzym đặc hiệu sau đó tạo phức màu với thuốc
thử hữu cơ thích hợp, có kết hợp với thang đo màu để bán định lƣợng. Tuy nhiên,
khi về Việt Nam giá thành của các bộ kit tăng lên đáng kể và khó đặt mua, đặc biệt
enzym rất dễ bị mất hoạt tính trong điều kiện phòng thí nghiệm. Ở Việt Nam cũng

đã có bộ kit thử nhanh phân tích metanol trong rƣợu của Bộ Công An nhƣng chƣa
đƣợc ứng dụng xác định metanol trong huyết tƣơng.
Để định lƣợng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng, trong
phòng thí nghiệm có thể sử dụng phƣơng pháp GC-MS, GC-FID, điện thế, pp điện
di mao quản. Các phƣơng pháp này có độ nhạy tốt, tuy nhiên việc xử lý mẫu lại
phức tạp và thời gian phân tích tƣơng đối dài. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
[1H-NMR] là một trong những phƣơng pháp tỏ ra rất tối ƣu để giải quyết cho vấn đề
này. Đây là phƣơng pháp phân tích hiện đại, mới đƣợc phát triển gần đây với độ
đúng cao, có thể phân tích đƣợc đồng thời các chất và tiết kiệm thời gian phân tích
do quá trình xử lí mẫu rất đơn giản.
Trƣớc tình hình ngộ độc metanol ngày càng diễn biến phức tạp và có xu
hƣớng gia tăng song cho đến nay tại Trung tâm Chống độc chƣa có quy trình xác
định nhanh metanol, etanol trong máu và rƣợu để kịp thời đáp ứng trong chẩn đoán
và điều trị bệnh. Đề tài: “Xác định metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa
của chúng trong rượu và huyết tương người” đƣợc tiến hành với mục tiêu:
1. Nghiên cứu chế tạo kit thử metanol trong rƣợu và máu để xác định
nhanh bệnh nhân ngộ độc metanol.
2. Nghiên cứu định lƣợng nhanh đồng thời metanol, etanol và một số sản
phẩm chuyển hóa của chúng trong rƣợu và huyết tƣơng bằng phƣơng pháp 1HNMR phục vụ tiên lƣợng BN và hỗ trợ điều trị.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về metanol và etanol
1.1.1. Giới thiệu chung về metanol và etanol
Metanol hay còn gọi là rƣợu metylic có công thức cấu tạo CH3OH đƣợc
ngƣời Hi Lạp cổ tình cờ phát hiện khi tiến hành thủy phân gỗ, tuy nhiên sản phẩm
metanol lúc đó tồn tại dƣới dạng tạp chất, lẫn với các chất khác. Đến nay metanol
đƣợc sản xuất trong công nghiệp bằng phản ứng hóa học với cơ chất sử dụng phổ

biến là cacbon monooxit (CO), cacbon dioxit (CO2) và khí hydro (H2) [11].
Etanol hay còn đƣợc biết đến với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ rƣợu, cồn
etylic, là phân tử rƣợu đơn giản gồm nhóm ankyl với 2 nguyên tử carbon liên kết
với nhóm hydroxyl. Công thức cấu tạo C2H5OH, thƣờng đƣợc viết tắt là EtOH.
Năm 1825, Michael Faraday đã tổng hợp đƣợc etanol từ etylen bằng cách hydrat
hóa với xúc tác axit, tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp etanol công nghiệp ngày nay.
Ngoài ra, trong công nghiệp, etanol còn đƣợc tổng hợp từ CO2 và lipit.
Metanol và etanol đều tồn tại trong tự nhiên. Metanol đƣợc sinh ra trong quá
trình chuyển hóa kỵ khí của một số loại vi khuẩn, tuy nhiên lƣợng này không nhiều
do metanol phản ứng với oxy chuyển hóa thành khí CO2 và H2O. Etanol là một sản
phẩm phụ của quá trình chuyển hóa đƣờng nhờ men. Etanol thƣờng đƣợc tìm thấy
trong quả chín. Nó cũng có thể tạo ra trong quá trình nảy mầm của nhiều loại cây
trồng do điều kiện khí hậu không thuận lợi.
Metanol, etanol là 2 phân tử đầu tiên trong dãy đồng đẳng, có khối lƣợng
phân tử lần lƣợt là 32 g/mol và 46,07 g/mol, nhiệt độ sôi là 64,7oC và 78oC. Cả

metanol và etanol đều là hợp chất không màu, dễ bay hơi, dễ cháy và tan vô hạn
trong nƣớc. Các đặc tính vật lý và hóa học của etanol chủ yếu do nhóm hydroxyl.
Các phản ứng hóa nhƣ phản ứng ete hóa, hay este hóa, phản ứng thế nhóm OH,
phản tứng oxy hóa tạo aldehyd…
Với các đặc tính hóa lý của nó, metanol và etanol đƣợc sử dụng rất rộng rãi
trong nhiều ngành nghề.

3


Trong phòng thí nghiệm, metanol là một dung môi phổ biến đƣợc sử dụng
rộng rãi và đặc biết hữu ích cho HPLC, quang phổ UV-Vis, LC-MS do bƣớc sóng
hấp thụ cực đại của metanol ngắn, độ hấp thụ quang thấp.
Trong công nghiệp hóa chất, metanol, etanol đều đƣợc sử dụng làm nguyên

liệu đầu vào để tổng hợp lên các hợp chất khác. Nhờ khả năng tan vô hạn trong
nƣớc và có thể hòa tan đƣợc các chất hữu cơ có độ phân cực thấp mà nó đƣợc dùng
nhƣ dung môi trong sơn, bút dánh dấu, bút mực, nƣớc rửa răng hay chất khử mùi.
Trong công nghiệp nhiên liệu, metanol và etanol đã và đang đƣợc nghiên cứu
sử dụng nhƣ một loại nguyên liệu thay thế hoặc là phụ gia nhiên liệu cho các loại
phƣơng tiện giao thông [4]. Trong đó, etanol đƣợc xem là nhiên liệu sinh học tái
sinh, do nó có thể đƣợc sản xuất từ các nguồn thức ăn chăn nuôi, hay từ các loại cây
nhƣ gai dầu, mía, sắn, ngô.
Trong ngành y tế, etanol đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ chất sát trùng, nó còn
đƣợc sử dụng nhƣ chất giải độc bằng cả đƣờng tiêm và đƣờng uống trong ngộ độc
metanol và etylen glycol [2]. Ngoài ra, etanol dùng để hòa tan nhiều loại thuốc
không tan trong nƣớc, hơn 700 chất lỏng dùng trong y khoa có chứa etanol bao gồm
acetaminophen, mannitol, phenobarbital… [25].
Đặc biệt, etanol đƣợc con ngƣời sử dụng nhƣ một lọai đồ uống giải trí. Từ
thế kỷ thứ 9, con ngƣời đã biết chƣng cất rƣợu [3],[ 22]. Tới nay, có hàng nghìn loại
rƣợu đƣợc sản xuất trên thế giới để phục vụ cho nhu cầu của con ngƣời. Metanol
mặc dù là rƣợu nhƣng không uống đƣợc do độc tính cao. Metanol có mùi tƣơng tự
etanol và có vị ngọt hơn nên dễ uống hơn. Một số ngƣời đã pha metanol cùng với
nƣớc hoặc rƣợu etanol để bán nhƣ rƣợu etanol nguyên chất. Đây có lẽ là nguyên
nhân gây ngộ độc thƣờng gặp ở Việt Nam.
Trong tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7043:2013 quy định hàm lƣợng metanol
trong rƣợu chƣng cất không vƣợt quá 2000 mg/l / 1000 etanol và với rƣợu pha chế
hàm lƣợng metanol không vƣợt quá 100 mg/l / 1000 etanol.

4


1.1.2. Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể, cơ chế gây độc
1.1.2.1. Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể
 Metanol

Khi vào cơ thể, metanol hấp thu nhanh và hoàn toàn qua đƣờng tiêu hóa với
nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng 30-90 phút sau khi uống. Một phần đƣợc thải
nguyên dạng qua đƣờng hô hấp nhƣng không đáng kể.
Trong cơ thể ngƣời, metanol đƣợc chuyển hóa tại gan thành fomandehit nhờ
xúc tác của men metalloenzyme ancol dehydrogenase, thƣờng gọi là ancol
dehydrogenase (ADH). Phản ứng này cần có mặt của NAD+ và sinh ra NADH bằng
cách chuyển sang một electron [62]. Fomandehit chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn,
chƣa đến 1 phút và ngay lập tức chuyển hóa thành axit fomic nhờ xúc tác của men
formandehyde dehydrogenase. Sau đó axit fomic cần kết hợp với tetrahydrofolate
hay còn gọi là axit folinic để chuyển hóa hoàn toàn thành khí cacbonic và nƣớc.
Thời gian bán thải tự nhiên của metanol trong cơ thể ngƣời trung bình từ 8 – 28 giờ
[28].

Hình 1. 1: Chuyển hóa metanol trong cơ thể người
Các phƣơng pháp xác định nhanh metanol trong dịch sinh học cho thấy nồng
độ metanol thấp nhất có thể xác định đƣợc trong máu là 5 mg/l [25], trong nƣớc bọt

5


là 10mg/l [14]. Trong nghiên cứu của Paasma và các cộng sự [18], nồng độ metanol
trong mẫu máu 147 bệnh nhân ngộ độc đƣợc xác định trong khoảng từ 50 mg/l –
7788 mg/l.
Định lƣợng nồng độ axit fomic trong máu cũng có ý nghĩa trong việc chẩn
đoán và điều trị. Với việc sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản, 2,8 mg/l là giới
hạn định lƣợng của fomat trong máu toàn phần, giới hạn này thấp hơn khi nền mẫu
là huyết thanh (2,3 mg/l) [54]. Sử dụng biosensor đo thế có thể nhận biết nồng độ
fomat 2,3 mg/l [32]. Phƣơng pháp sắc ký khí có thể xác định đƣợc đồng thời cả axit
fomic và axit axetic trong mẫu máu toàn phần với nồng độ có thể nhận biết 1 mg/l
[46].

 Etanol
Khi vào cơ thể, khoảng 20% etanol đƣợc hấp thu ở dạ dày và 80% hấp thu ở
ruột non. Rƣợu đƣợc hấp thu từ ruột sẽ theo tĩnh mạch cửa đến gan. Tại đây, 90%
etanol đƣợc chuyển hóa, một phần nhỏ đƣợc bài tiết nguyên dạng qua mồ hôi, hơi
thở và nƣớc tiểu.
Cũng giống nhƣ metanol, trong cơ thể ngƣời etanol cũng đƣợc chuyển hóa
thành axetandehit tại gan nhờ enzym ADH. Ngoài ra, Etanol còn đƣợc chuyển hóa
thành axetandehit theo còn đƣờng chuyển hóa khác đó là kết hợp với Cytochrome
P450 2E1 (CYP2E1), phản ứng này cần điều kiện hiếu khí, môi trƣờng giàu O2, mặt
khác cũng cần có mặt NADPH sinh ra NADP và 2 OH. Sau đó nhờ xúc tác của men
andehite dehydrogenase, axetadehid đƣợc chuyển hóa thành axit axetic. Sản phẩm
cuối cùng của dãy chuyển hóa này là CO2 và nƣớc.

6


Hình 1. 2: Chuyển hóa etanol trong cơ thể người
Tốc độ chuyển hóa của etanol nhanh hơn tốc độ chuyển hóa của metanol gấp
7 lần do đó nếu cùng tồn tại etanol và metanol trong máu, enzym ADH sẽ đƣợc ƣu
tiên sử dụng để chuyển hóa etanol trƣớc, sau đó mới chuyển hóa đến metanol [24].
Etanol và các chất chuyển hóa tuy có ảnh hƣởng tới cơ thể ngƣời nhƣng
không gây độc nhƣ metanol và chất chuyển hóa của nó. Trong đó, axit fomic đƣợc
cho là gây độc mạnh với cơ thể ngƣời, nó gây ra các triệu chứng ngộ độc ảnh hƣởng
trực tiếp tới các cơ quan trong cơ thể nhƣ mắt, não,… Do đó, chúng tôi chỉ xét tới
cơ chế gây ngộ độc ở metanol và các chất chuyển hóa.
1.1.2.2. Cơ chế bệnh sinh ngộ độc metanol
Bản thân metanol không có độc tính, fomandehit mặc dù độc với cơ thể
nhƣng chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn, độc tính của metanol chủ yếu do sản
phẩm chuyển hóa gần cuối cùng là axit fomic.
Axit fomic gây toan chuyển hóa, làm pH của máu thấp hơn 7,35. Axit fomic

có tính chất axit yếu, kết hợp với axit lactic đƣợc hình thành từ pyruvate nhờ sự có
mặt của NADH trong chu trình Kreb, gây tình trang toan hóa máu. Theo Smith và
cộng sự, khoảng 50% mức độ toan hóa máu trong ngộ độc metanol là do axit fomic,
còn lại hầu nhƣ là do axit lactic gây ra. [20]. Tình trang toan hóa máu dẫn đến hiện
tƣợng axit fomic chủ yếu tồn tại ở dạng không phân ly, có thể dễ dàng ngấm vào mô
và tạng đích nhƣ võng mạc, ti thể và hàng rào máu não.

7


Axit fomic có ái tính cao tại vị trí số 6 của phân tử sắt trong nhân Hem của
phân tử cytochrom oxydase, đặc biệt là cytochrom aa3 một enzym có chức năng
oxy hóa khử trong chuỗi vận chuyển điện tử và ức chế hoạt động của enzym này.
Kết quả là làm gián đoạn quá trình chuyển hóa trong hô hấp tế bào, nói cách khác là
ức chế hô hấp tế bào và gây độc tế bào
Khi pH máu càng giảm, axit fomic càng tồn tại nhiều ở trạng thái không
phân ly và càng có khả năng ngấm vào mô đích. Thêm nữa, mặt trong của màng ty
thể chỉ cho phép dạng không phân ly di chuyển qua do đó trong tình trạng toan hóa
máu sự ức chế hô hấp diễn ra thuận lợi, càng toan sự ức chế càng mạnh và dẫn đến
quá trình thƣơng tổn tế bào do không sinh đƣợc ATP (Adenosin Triphosphat) cho
tế bào.
Đối với thị thần kinh, axit fomic có thể gây tổn thƣơng bằng 2 con đƣờng là
trực tiếp từ máu có axit fomic hoặc ngấm từ dịch não tủy có axit fomic. Axit fomic
ức chế hô hấp tế bào thần kinh thị làm mất chức năng của các ty thể trong tế bào
thần kinh thị và tế bào võng mạc làm giảm sinh ATP, hậu quả giảm hoạt động
dẫn truyền của tế bào thần kinh thị. Hơn nữa, tế bào thần kinh thị bị ức chế hô
hấp dẫn đến thoái hóa myelin. Khi các bao myelin bị tổn thƣơng và thoái hóa, tế
bào thần kinh thị trở nên phù nề và càng chèn ép mạnh vào sợi thần kinh [1].
Song song với quá trình nói trên, axit fomic ức chế dòng vận chuyển tự nhiên
của các thành phần nhƣ ti thể, lipid, protein từ thân tế bào thị thần kinh đến sợi

trục dẫn đến hiện tƣợng thiểu dƣỡng và phù trong sợi trục và phù gai thị [12].
bệnh nhân có thể xuất hiện nhìn mờ 6 giờ sau khi uống. Nếu bệnh nhân có uống
kèm etanol thời gian xuất hiện toan chuyển hóa trì hoãn có thể đến 24 giờ do đó tổn
thƣơng thị giác cũng trì hoãn đến sau 24 giờ. Hậu quả có thể dẫn đến mất thị lực
một phần cho đến hoàn toàn và vĩnh viễn. Nghiên cứu loạt bệnh cho thấy tỉ lệ di
chứng về thị giác có thể lên tới 25-33% [19].
Ngoài ra, axit fomic còn gây ảnh hƣởng tới hệ thần kinh trung ƣơng. Cơ chế
gây tổn thƣơng của axit fomic lên hệ thần kinh trung ƣơng cũng tƣơng tự đối với thị

8


thần kinh là do hiện tƣợng ức chế hoạt động cytochrom oxydase trong ty thể của tế
bào thần kinh dẫn đến ức chế hoạt động của hệ Na – K – ATPase. Khi có hiện
tƣợng ức chế hô hấp tế bào, đây sẽ là khu vực chịu ảnh hƣởng nặng nề nhất [4].
Ở những bệnh nhân ngộ độc metanol, các tổn thƣơng não ghi nhận đƣợc
ngoài phù não và hoại tử hạch nền chảy máu ở nhân bèo sẫm và tổn thƣơng chất
trắng dƣới vỏ do ngộ độc với cơ chế tƣơng tự tổn thƣơng thị thần kinh. Tổn thƣơng
chất trắng dƣới vỏ thƣờng xảy ra ở những bệnh nhân đến muộn hoặc điều trị ban
đầu không phù hợp [7].
1.1.3. Liều gây độc
Hầu hết các chuyên gia đều thống nhất bắt đầu điều trị giải độc khi nồng độ
metanol máu từ 20 mg/dL vì đây là nồng độ bắt đầu có tổn thƣơng thị lực và toan
chuyển hóa [4]. Có thể tính toán lƣợng metanol uống dẫn tới liều độc căn cứ vào
công thức tính toán dƣợc động học nhƣ sau:
[C] = DxF/ Vd

(ct 1)

Trong đó: [C] là nồng độ metanol trong trong máu,

D là lƣợng metanol uống
F là sinh khả dụng đƣờng uống (100%)
Vd là thể tích phân bố (của methanaol là 0,6 L/Kg).
Từ đó có thể tính toán rằng: nếu uống một thể tích tƣơng đƣơng 0,25 ml/kg
dung dịch metanol nồng độ 100% về mặt lý thuyết có thể gây ra nồng độ 20 mg/dL
trong máu và bắt đầu có thể gây độc tính trên ngƣời.
Theo hƣớng dẫn của Hội các nhà Chống độc Mỹ năm 2002, nồng độ metanol
máu có thể gây tử vong ở ngƣời nếu không đƣợc điều trị tích cực là trên 50 mg/dL
[4]. Tuy nhiên với bệnh nhân đƣợc giải độc và điều trị đúng cách có thể cứu sống ở
nồng độ cao hơn rất nhiều [13],[8].

9


1.1.4. Triệu chứng ngộ độc metanol
Biểu hiện lâm sàng ngộ độc metanol là tổn thƣơng đa cơ quan và đều do một
nguyên nhân chung là axit fomic đƣợc sinh ra mà không đƣợc chuyển hóa thành
cacbonic và nƣớc gây ra toan chuyển hóa và độc tính trực tiếp trên mô [5].
Hai yếu tố ảnh hƣởng nhiều nhất đến biểu hiện lâm sàng là thời gian từ khi
ngộ độc đến khi nhập viện và tình trạng uống kèm theo etanol hay không [15]. Sau
khi uống metanol từ 0,5 – 4 giờ là pha yên tĩnh của ngộ độc, một số trƣờng hợp
uống kèm etanol triệu chứng thƣờng chỉ xuất hiện sau 12 – 24 giờ. Bệnh nhân có
thể lơ mơ kiểu ngộ độc etanol do vậy trong giai đoạn này bệnh nhân không biểu
hiện triệu chứng cũng không thể loại trừ ngộ độc metanol.
Sau giai đoạn yên lặng bệnh nhân bắt đầu có các biểu hiện ban đầu nhƣ đau
đầu, chóng mặt hoặc các biểu hiện trên tiêu hóa nhƣ buồn nôn, nôn và đau bụng.
Tổn thƣơng thị giác có thể biểu hiện trên lâm sàng nhƣ nhìn mờ, ám điểm
trung tâm, thị lực hình ống, nhìn đôi và sợ ánh sáng. Khám mắt có thể thấy đồng tử
giãn và giảm hoặc mất phản xạ với ánh sáng, đôi khi thấy rung giật nhãn cầu tuy
nhiên đây không phải triệu chứng phổ biến. Soi đáy mắt có thể thấy hình ảnh phù nề

võng mạc và phù gai thị, xung huyết đĩa thị cho đến viêm teo thị giác. Dấu hiệu
đồng tử giãn - cố định là dấu hiệu tiên lƣợng xấu [35].
Biểu hiện về thần kinh có thể là rối loạn ý thức từ mức nhẹ nhƣ rối loạn tập
trung, sững sờ và hôn mê. Rối loạn vận động kiểu ngoại tháp với biểu hiện xoắn
vặn, động tác chậm và cứng, khuôn mặt cứng nhƣ mặt nạ. Co giật có thể xuất hiện
trong các trƣờng hợp nặng. Biểu hiện ngoại tháp kiểu parkinson xảy ra ở những
ngƣời đến muộn. Các di chứng thần kinh khác có thể gặp nhƣ: giảm nhận thức,
viêm tủy cắt ngang, liệt kiểu hành não [4].
Suy tuần hoàn biểu hiện mạch ban đầu thƣờng nhanh, huyết áp thấp. Nặng có
thể thấy mạch chậm và huyết áp tụt không đáp ứng với vận mạch và nặng nhất là
ngừng tuần hoàn. Nhiều trƣờng hợp bệnh nhân ngừng tuần hoàn tại bệnh viện do trơ
với thuốc vận mạch do toan chuyển hóa nặng không hồi phục.

10


Trên tiêu hóa có thể gặp buồn nôn, nôn, đau bụng. Có thể gặp xuất huyết tiêu
hóa với biểu hiện nôn ra máu, đi ngoài phân đen và viêm tụy cấp với bụng chƣớng
và đau, xét nghiệm tăng men tụy nhƣ amylase, lipase, tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán
là CT scan ổ bụng. Biểu hiện ở tiêu hóa không phản ánh đƣợc mức độ nặng của
bệnh.
Thận – tiết niệu: có thể gặp suy thận với biểu hiện thiểu niệu, vô niệu, phù.
Myoglobin niệu là một biến chứng hiếm gặp nhƣng nếu có là dấu hiệu nặng của
bệnh.
1.2. Các phƣơng pháp phân tích metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa
1.2.1. Các phương pháp phân tích phòng thí nghiệm
Các kỹ thuật phòng xét nghiệm đƣợc sử dụng để định tính và định lƣợng
metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng. Trƣớc hết phải kể đến các
phƣơng pháp quang.
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) thƣờng đƣợc sử dụng để

định lƣợng metanol, etanol, fomandehit và andehit. Nhƣ đã nói ở trên, nguyên tắc
của phƣơng pháp quang là sử dụng thuốc thử thích hợp tác dụng với chất phân tích
cho sản phẩm là dung dịch có màu, dung dịch này đƣợc đem đo độ hấp thụ quang
tại bƣớc sóng thích hợp, Độ hấp thụ quang của chất tỷ lệ thuận với nồng độ chất
phân tích. Với fomandehit và axetandehit có thể tìm đƣợc thuốc thử để định lƣợng
trực tiếp [26],[ 45],[ 63],[ 64],[ 67], với việc định lƣợng metanol và etanol cần có
bƣớc oxy hóa trƣớc có thể sử dụng các chất oxy hóa nhƣ KMnO4, KIO4, NaIO4, các
men sinh học, sau đó tìm thuốc thử để nhận biết các sản phẩm trung gian thu đƣợc
[12],[ 21],[ 23],[ 44],[ 51]. Trong trƣờng hợp thuốc thử đƣợc chọn cho phản ứng
màu với nhiều chất cần sử dụng thuật toán đa biến để định lƣợng [45].
Phƣơng pháp quang phổ Raman [43] [61] đƣợc sử dụng để định lƣợng trực
tiếp đồng thời etanol và metanol trong mẫu rƣợu. Vạch phổ của metanol, etanol lần
lƣợt xuất hiện tại 1019 cm-1 và 879 cm-1. Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là
0,05%.

11


Ngoài các phƣơng pháp quang, phƣơng pháp điện hóa cũng hay đƣợc sử
dụng để phân tích đông thời metanol và etanol. Sousa và các cộng sự [57] sử dụng
phƣơng pháp vol – ampe vòng với điện cực làm việc Pt –Au xác định đồng thời
metanol và etanol trong nhiên liệu etanol. Theo đó, etanol đƣợc phát hiện chọn lọc
tại +0,9V, giới hạn phát hiện 0,028%, metanol phát hiện tại +1,2V, giới hạn phát
hiện 0,045%. Để tách metanol và etanol ra khỏi dầu diesel sinh học, Shihov và các
cộng sự sử dụng 1 module thấm hơi (VPM) với 1 màng polymer poly (phenylene
isophtalamide) (PA) chứa dung môi dƣ. Sau khi bốc hơi vào khoang VPM, metanol
và etanol đƣợc vận chuyển thông qua màng PA tới buồng trộn đƣợc trang bị một
detector đo thế. Giới hạn phát hiện với cả 2 chất là 0,02% [59].
Phƣơng pháp sắc ký khí(GC) kết hợp với detector ion hóa ngọn lửa FID cũng
đƣợc sử dụng để phân tích đồng thời metanol và etanol. Với mẫu khí [56], các ancol

này đƣợc tách ra từ mẫu khí bằng hệ 3 tấm lọc florisil nối tiếp, sau đó chúng đƣợc
rửa giải bằng nƣớc trƣớc khi bơm vào cột DB WAX. Phƣơng pháp này có thời gian
phân tích ngắn 5 phút, giới hạn phát hiện thấp có thể phân tích cỡ ppb. Với trầm
tích ở biển, chúng đƣợc tách ra nhờ kỹ thuật vi chiết pha rắn sử dụng sợi Carboxenpolydimethylsiloxane, giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đạt 5,2 µM với metanol,
với etanol là 0,4 µM. nếu sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu P&T(rửa và bẫy) giới hạn
phát hiện giảm xuống 100 lần [39].
Phƣơng pháp GC kết nối với detector khối phổ MS cũng hay đƣợc sử dụng
trong phân tích metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng. Với mẫu
trầm tích biển, có thể nhận biết metanol và etanol bằng cách bơm trực tiếp vào hệ
thống với giới hạn phát hiện lần lƣợt là 7,4 và 3,1 µM [39]. Trong mẫu rƣợu, Wang
và các cộng sự [50] đã sử dụng cột CP-Wax 58 CB, 30 m x 0.53 mm để định lƣợng
metanol koảng tuyến tính rộng 0,002 mg/ml – 20mg/ml. Savary và nhóm nghiên
cứu của mình [29] đã sử dụng kỹ thuật headspace vi chiết pha rắn, sợi chiết là
Carboxen-PDMS để tách metanol và axit axetic ra khỏi nền mẫu. Mảnh ion đƣợc
chọn để phân tích metanol là m/z 29 và axit axetic là m/z 43.

12


Kage và các cộng sự [58] nghiên cứu phân tích đồng thời fomat và axetat
trong máu toàn phần và nƣớc tiểu của ngƣời. Mẫu màu toàn phần không cần phải
loại protein, fomat và axetat đƣợc ankyl hóa với pentafluorobenzyl bromide trong
hỗn hợp aceton và đệm phosphat (pH 6.8). Giới hạn thấp nhất có thể phát hiện đƣợc
là 0,02 mM. Mảnh ion chọn để phân tích axetat là m/z 240 và fomat là m/z 226. Có
axetat, fomat trong máu có thể khẳng định đƣợc bệnh nhân có sử dụng etanol,
metanol.
Các phƣơng pháp phòng thí nghiệm phân tích metanol, etanol và các chất
chuyển hóa đểu cho giới hạn phát hiện thấp. Tuy nhiên, các thiết bị này đòi hỏi
trang thiết bị phức tạp, đắt tiền và thƣờng chỉ có ở những phòng thí nghiệm hiện
đại.

1.2.2. Các phương pháp xác định nhanh metanol
Nguyên tắc của các test thử xác định nhanh etanol và metanol bằng phƣơng
pháp quang dựa trên khả năng tạo phức màu dễ nhận biết của các chất cần xác định
và thuốc thử thích hợp. Tuy nhiên, cả etanol và metanol đều không có thuốc thử
thích hợp để xác định trực tiếp, chúng cần đƣợc chuyển thành dạng andehit sau đó,
các andehit sẽ phản ứng với thuốc thử tạo phức màu đặc trƣng. Quá trình này đƣợc
thể hiện trong hình 1.3.

Chất oxi hóa

Thuốc thử

Hình 1. 3: Quá trình nhận biết etanol và metanol
Quá trình xác định nhanh metanol và etanol gồm 2 giai đoạn, giai đoạn 1 là
quá trình oxy hóa các ancol, quá trình 2 là phản ứng nhận biết với thuốc thử. Trƣớc
tiên, metanol và etanol bị oxy hóa thành các andehit nhờ các tác nhân oxy hóa.

13