Phát hiện các dạng đột biến gen G6PD ở người Việt Nam bằng kỹ thuật sinh học phân tử

1

T VN
Glucose - 6 - phosphat dehydrogenase (G6PD hay G6PDH) l mt
enzyme oxy húa kh, úng vai trũ then cht trong quỏ trỡnh chuyn húa
glucose theo con ng hexose monophosphat trong hng cu nhm to ra
mt cht kh vụ cựng quan trng l NADPH. Enzym ny cú vai trũ tham gia
vo quỏ trỡnh chng li cỏc tỏc nhõn oxy húa, giỳp bo v mng hng cu
c bn vng, bo v cu trỳc hemoglobin, cu trỳc cỏc enzyme cú trong
hng cu duy trỡ s sng cho t bo hng cu.
Vỡ vy, khi thiu ht enzyme ny, gõy nờn bnh thiu mỏu tan mỏu. õy l
bnh lý enzyme hng cu hay gp nht ngi. Trờn th gii khong 5%
ngi mc bnh ny, gp nhiu a Trung Hi, Chõu Phi v Chõu . T l
thiu ht G6PD cng nh cỏc dng t bin khỏc nhau gia cỏc vựng a lý v
cỏc dõn tc . Ti Vit Nam, bnh tng i ph bin, t l cỏc dõn tc 0,5
-21% ti cỏc dõn tc phớa Bc[2]: khong 26% ngi Mng Ba Vỡ [17];
ngi Kinh H Ni l 1,75% [5] v khong 5,5% cỏc tnh phớa Nam [14].
C s di truyn hc ca bnh l do t bin xy ra trờn gen mó húa
G6PD. Gen ny nm trờn nhỏnh di, vựng 2, bng 8 ca nhim sc th gii
tớnh X (Xq28). Khụng cú alen tng ng trờn nhim sc th Y nờn gp nhiu
nam, n thng l ngi mang gen bnh v di truyn cho con trai. Ngy
nay cùng với sự phát triển vợt bậc của công nghệ sinh học
phân tử trong nghiên cứu Y học, cơ sở gen học của bệnh
ngày càng sáng tỏ. Trờn th gii cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu phõn tớch
c s di truyn hc ca bnh thiu ht G6PD, ó cú hn 140 loi t bin c
cụng b trờn ton th gii vi nhiu dng bin th khỏc nhau[14]. Hu ht cỏc
t bin ny u l t bin im v u dn n s thay i acid amin trong
phõn t protein to enzyme G6PD. Cỏc nh khoa hc cú th phõn tớch DNA


2

của người bệnh để xác định chính xác các tổn thương gen gây bệnh thiếu me
G6PD, cũng như kiểm soát bệnh tốt hơn nhờ phát hiện người phụ nữ mang
gen bệnh và tư vấn di truyền cho gia đình, tăng hiệu quả trong việc phòng
ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe trong
cộng đồng.
Nằm trong khu vực có tỉ lệ mắc bệnh thiếu hụt G6PD cao, Việt Nam đã
có một số công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh
giá tỷ lệ mắc bệnh, các dạng đột biến trên một số nhóm dân tộc, địa lý…Tuy
nhiên cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu toàn diện về đột biến gen
G6PD ở người Việt Nam, tạo cơ sở dữ liệu để làm tiền đề cho việc xây
dựng bản đồ gen ở bệnh nhân thiếu hụt men G6PD ở Việt Nam.
Do vậy, đề tài này được thực hiện với hai mục tiêu:
1) Phát hiện các dạng đột biến gen G6PD ở người Việt Nam bằng kỹ
thuật sinh học phân tử.
2) Bước đầu xây dựng bản đồ đột biến gen G6PD ở người Việt Nam.


3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Những hiểu biết về G6PD
G6PD được Warburg và Christan phát hiện năm 1931 ở hồng cầu ngựa,
động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu người.
Năm 1936, G6PD đã được nghiên cứu và tiến hành chiết xuất làm sạch
nhưng phải 25 năm sau mới thành công. Năm 1966, Yoshida lần đầu tiên tách
triết được G6PD từ hồng cầu người. Từ đó các thông tin về cấu trúc ban đầu,
trọng lượng phân tử và các thông số động học của G6PD dần được thu thập.
Quá trình tách chiết enzym ra khỏi hồng cầu cũng ngày càng đạt được

độ tinh sạch cao hơn. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử các
dạng đột biến của G6PD ngày càng được phát hiện nhiều. Các phương
pháp phát hiện thiếu hụt từ định lượng, định tính, bán định lượng, test
nhanh ngày càng phát hiện chính xác hơn và ngày càng được áp dụng rộng
rãi trong cộng đồng.
1.1.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của G6PD
G6PD là một enzym rất đa dạng, có cấu trúc bậc 4 phức tạp , G6PD hồng
cầu người có hai đặc tính cơ bản là tính không đồng nhất và tính chuyển dạng
phân tử. Cấu trúc dimer và tetramer hay dimer và monomer có thể chuyển
dạng lẫn nhau trong in vitro, nhưng dường như dạng monomer không xuất
hiện trong điều kiện sinh lý, chỉ có dimer và tetramer là hai dạng hoạt động
của enzyme, trong hồng cầu người dạng dimer chiếm ưu thế.
Cấu trúc của enzyme bị ảnh hưởng bởi pH của môi trường: Ở môi trường
pH thấp, enzyme tồn tại chủ yếu dưới dạng tetramer; ở pH gần trung tính,


4
enzyme tồn tại dưới dạng dimer; ở môi trường pH trung tính thì dimer và
tetramer có tỷ lệ bằng nhau .

Hình 1.1. Cấu trúc G6PD dạng monomer
Một monomer gồm 515 acid amin, có trọng lượng phân tử khoảng
59.256 dalton [4], [5]. Sự trùng hợp các monomer thành dimer và các dạng
cao hơn (tetramer…) có hoạt tính xúc tác cần sự có mặt của NADP +. Như vậy,
NADP+ được gắn với enzyme vừa như một phức hợp cấu trúc, vừa như một
cơ chất của phản ứng. Mỗi dimer có hai vị trí gắn NADP + : Tại vị trí gắn
NADP+ xúc tác thì NADP+ gắn lỏng lẻo, dễ bị khử thành NADPH. Tại vị trí
gắn NADP+ chức năng thì NADP+ gắn chặt chẽ hơn và cần thiết để duy trì cấu
trúc oligo hoạt động của enzyme. Có bốn acid amin liên quan đến vị trí gắn
NADP+ cấu trúc là: Cys 385, Lys 386, Arg 387, Arg 393. Vị trí gắn NADP +

xúc tác là Lys 47. Ngoài ra còn hai vị trí gắn NADP + nữa là acid amin 242-248
và 38 - 44. NADP+ không chỉ là cơ chất cho enzyme mà còn ổn định G6PD
bằng việc ngăn cản sự chuyển enzyme ở dạng dimer thành dạng monomer
không hoạt động , , .
Km của G6PD với NADP+ rất thấp, khoảng 2-4 µmol/l và enzyme bị ức
chế cạnh tranh bởi NADPH. Do đó, tỷ lệ NADPH/NADP + trong hồng cầu tự
điều hoà tốc độ của phản ứng enzyme.


5

1.1.2. Vai trò của G6PD trong chuyển hoá hồng cầu
G6PD thuộc loại enzyme oxy hóa khử, xúc tác cho phản ứng oxy hóa
Glucose - 6 - Phosphat thành 6 - Phosphogluconolacton. G6PD là enzyme
then chốt mở đầu và điều khiển tốc độ con đường hexose monophosphat (hay
con đuờng pentose phosphate). Hexose monophosphat là con đường oxy hoá
glucose xảy ra ở các mô song song với con đường đường phân, song chiếm tỷ
lệ thấp hơn nhiều (7 - 10%). Con đường này tuy không cung cấp nhiều năng
lượng nhưng cung cấp nhiều NADPH, đồng thời cung cấp Ribose - 5 Phosphat sử dụng cho quá trình tổng hợp acid nucleic. Ở hồng cầu người và
một số mô khác, sự thoái hoá glucose theo con đường hexose monophosphat
lại chiếm ưu thế. Đặc biệt trước một tác nhân oxy hoá bất ngờ thì sự giáng hoá
glucose theo con đường này lại tăng lên gấp hai mươi đến ba mươi lần, thậm chí
cao hơn nữa. Trong con đường này, G6PD oxy hoá G - 6 - P thành 6
-Phosphogluconolacton, với Coenzyme là NADP+, chất nhận hydro và trở thành
NADPH.
NADPH là một Coenzyme khử, cần cho phản ứng của nhiều con đường
sinh tổng hợp khác nhau và liên quan mật thiết với một chuỗi phản ứng tiếp
theo để bảo vệ hồng cầu như: tái tạo glutathion dạng khử (GSH) từ glutathion
dạng oxy hoá (GSSG), khử MetHb thành Hb.
Hồng cầu có chức năng vận chuyển oxy. Do đó, cấu trúc của hồng cầu

thường xuyên có nguy cơ bị oxy hoá và rất dễ nhạy cảm với các quá trình oxy
hoá nên dễ dàng bị phá huỷ. Đặc biệt trong hồng cầu thiếu các con đường tổng
hợp NADPH khác nên khả năng sống sót của hồng cầu truớc sự công kích của
các tác nhân oxy hoá từ môi trường phụ thuộc vào hiệu quả hoạt động của con
đường Hexose monophosphat.


6

Hình 1.2: Vai trò của G6PD trong hồng cầu
NADPH hoạt động thông qua phản ứng chuyển GSSG thành GSH với
sự tham gia của enzyme glutathion reductase. GSH tạo thành sẽ ngăn cản quá
trình peroxide các cấu tử của hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu trước sự tấn
công của các tác nhân oxy hoá. Ngoài ra, để bảo vệ hồng cầu còn có các cơ
chế khác: quá trình khử MetHb cùng đồng thời diễn ra nhờ hệ thống enzyme
methemoglobin reductase (MetHbR) mà cần coenzyme là NADPH và NADH.
Khi NADPH bị oxy hoá, GSSG bị khử thành GSH, NADPH chuyển thành
NADP+ và G6PD trở nên hoạt động, khử NADP+ thành NADPH. Khi hồng
cầu thiếu G6PD, con đường hexose monophosphat bị ngừng trệ. NADPH sẽ
không được tạo thành, dẫn đến GSH không đủ. Kết quả là việc bảo vệ hồng
cầu không hiệu quả. Đặc biệt, khi hồng cầu bị tấn công bởi các tác nhân oxy
hoá, quá trình oxy hoá vốn xảy ra rất mạnh và có nguy cơ làm tăng quá trình
peroxid hoá các cấu tử của nó. GSH sẽ càng không đủ cho nhu cầu của quá
trình chuyển hoá, làm thay đổi chức năng màng hồng cầu và hemoglobin bị
biến tính. Hemoglobin bị oxy hoá thành một hợp chất không bền HbH 2O2 với
hàm lượng khá cao và rất độc cho hồng cầu. Kết quả cuối cùng là màng hồng
cầu bị tổn thương và hồng cầu bị vỡ.


7

Km của G6PD với NADP+ rất thấp, enzyme bị ức chế cạnh tranh bởi
NADPH. Vì vậy tỉ lệ NADPH/NADP + trong hồng cầu tự điều hòa tốc độ của
phản ứng enzyme. Trong thời kỳ trơ, tỉ lệ này rất cao và G6PD gần như bị ức
chế hoàn toàn.
1.2. Bệnh thiếu hụt G6PD
1.2.1. Dịch tễ học
1.2.1.1. Trên thế giới
Từ thời xa xưa người ta đã nhận thấy có một bệnh cảnh liên quan đến
thiếu hụt G6PD hồng cầu. Đầu tiên từ những nhà triết học Hy Lạp và nhà toán
học Pythagoras đã cảnh báo với những học trò của mình về mối nguy hiểm
khi ăn đậu fava. Tiếp sau đó có một nhóm các nhà y học miền nam Italia và
Sardinia đã phác hoạ hình ảnh lâm sàng của favism (tan máu xảy ra ở một số
người sau khi ăn đậu fava) . Vào khoảng những năm 1950, Ernest Beutler đã
đưa ra nhận xét về sự tan máu xảy ra sau khi dùng thuốc mà điển hình là
primaquine, một thuốc chống sốt rét , . Sau đó, 1956, Carson và cộng sự đã
khám phá ra rằng những người nhạy cảm với primaquine có hoạt độ của
enzyme G6PD hồng cầu rất thấp. Cho đến nay đã có những hiểu biết đáng kể
về enzyme G6PD và các hình thái lâm sàng cũng như cơ sở sinh học phân tử
liên quan đến thiếu hụt G6PD. Mỗi biến thể dẫn đến mức độ thiếu hụt enzyme
khác nhau và chúng liên quan đến mức độ nặng nhẹ của tan máu trên lâm
sang: thiếu máu tan máu mạn tính, thiếu máu tan máu cấp tính thứ phát sau
dung thuốc, hoặc hoàn toàn không có triệu chứng.
Năm 1996, trên tạp chí Blood, Ernest Beutler có viết: trên thế giới có
khoảng 400 triệu người thiếu hụt G6PD, bệnh gặp ở tất cả các dân tộc . Tần
suất thiếu hụt G6PD khác nhau rất nhiều theo từng vùng dân cư và vùng lãnh
thổ, nhưng cao nhất ở vùng Địa Trung Hải, châu Phi và Nam Á - khu vực nằm
trong vùng dịch tễ sốt rét. Tỉ lệ thiếu hụt G6PD ở châu Phi là 20%; ở châu


8

Mỹ: cao nhất là người da đen (17 - 27%) ; Venezuela 2 - 12%; người Do Thái
tỉ lệ này lên đến 70%.
Đông Nam châu Á, tỉ lệ này dao động từ 0 - 14% . Ở Lào 7,2%; Thái
Lan 11,5%; Indonesia 3,7%; Myanmar 4,4%; Taiwan và Nam Trung Quốc 2
- 16%.

Hình 1.3. Bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD (1995) trên thế giới
1.2.1.2. Việt Nam
Theo bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD của Lucio Luzzatto (1995)
Việt Nam nằm trong vùng có tỉ lệ này dao động 0,3 - 9%. Những nghiên cứu
đầu tiên ở Việt Nam về thiếu hụt G6PD phải kể đến các tác giả như: Ngô Gia
Thạch, Hoàng Văn Sơn. Tỉ lệ thiếu hụt G6PD ở Việt Nam cũng khác nhau tùy
từng vùng và từng dân tộc. Theo nghiên cứu của tác giả Đoàn Hạnh Nhân và
cộng sự : thiếu G6PD có tỉ lệ cao tại một số vùng sốt rét lưu hành như Kim
Bôi (34,1%); Mai Châu (20,4%); Như Xuân (19,7%); Mường La (17,8%) và
thấp tại một số vùng không có sốt rét lưu hành như Mèo Vạc (5,3%) và Nga
Sơn (0,5%). Theo nghiên cứu của Trần Thị Chính, Nguyến Thị Ngọc Dao và
cộng sự, ở người kinh Hà Nội và quanh Hà Nội là 1,75% ; ở các tỉnh phía


9
Nam theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Phượng tỉ lệ thiếu hụt G6PD là
5,5% .
1.2.2. Biểu hiện lâm sàng
Khác với các nguyên nhân gây thiếu máu tan máu khác, những người bị
thiếu hụt G6PD thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Chỉ khi tiếp
xúc với tác nhân oxy hoá, triệu chứng lâm sàng thường thể hiện chủ yếu là
những cơn tan máu . Tuỳ thuộc vào loại đột biến mà hoạt độ G6PD của người
bệnh khác nhau, cùng với tính chất của từng tác nhân oxi hóa và các bệnh di
truyền đồng thời khác mà các triệu chứng lâm sàng khác nhau.

Biểu hiện hay gặp nhất của thiếu hụt G6PD là thiếu máu tan máu mạn
tính. Tuy nhiên, ở trẻ em thì biểu hiện phổ biến và rất quan trọng lại là vàng
da sơ sinh. Thiếu máu tan máu mạn tính không có hồng cầu hình cầu là một
biểu hiện hiếm gặp của bệnh.
1.2.2.1. Vàng da sơ sinh
Vàng da sơ sinh là một triệu chứng của nhiều nguyên nhân khác nhau, là
do trong máu có sự gia tăng chất bilirubin, một sản phẩm dị hoá của
hemoglobin. Mức độ vàng da phụ thuộc vào mức độ tan máu.
Vàng da sơ sinh có hai loại là sinh lý và bệnh lý. Vàng da sinh lý thường
diễn ra trong ba ngày đầu và kết thúc tối đa là 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ.
Vàng da bệnh lý xuất hiện khi nồng độ bilirubin trong máu cao hơn 20mg/dl.
Hậu quả nghiêm trọng của bệnh lý này là vàng nhân não , , . Trẻ sơ sinh sẽ có
biểu hiện là những cơn tăng trương lực cơ, xoắn văn, mất các phản xạ sơ sinh,
ngừng thở tím tái và rất dễ tử vong. Nếu trẻ qua khỏi thì sẽ để lại những di
chứng nặng nề như rối loạn ngoại tháp (múa vờn, múa giật, rối loạn ngôn
ngữ…) hoặc bất thường thính lực, thị giác và thiểu sản phát triển răng. Vàng
da nhân não ảnh hưởng đến khả năng phát triển tinh thần và vận động của trẻ.
Thiếu G6PD như một yếu tố nguy cơ dẫn đến vàng da bệnh lý. Do đó


10
việc phát hiện thiếu hụt G6PD sẽ giúp cho quá trình phát hiện những triệu
chứng nặng giúp cho quá trình theo dõi tốt hơn tránh bỏ sót đáng tiếc.
1.2.2.2. Thiếu máu tan máu cấp tính
Ernet Beutler phát hiện ra hiện tượng tan máu lần đầu tiên sau khi nghiên
cứu một số bệnh nhân sử dụng thuốc chống sốt rét là Primaquin . Sau đó qua
nghiên cứu người ta đã khám phá ra rằng không chỉ Pnimaquin mà sau sử dụng
một số thuốc khác cũng gây nên hiện tượng tan máu: Aspirin (thuốc giảm đau),
Procainamide (thuốc điều trị bệnh tim mạch), DDS (thuốc diệt khuẩn)... Triệu
chứng tan máu dẫn đến vàng da thường xảy ra vào ngày thứ 2,3 sau khi dùng

thuốc.
Ngoài ra hiện tượng tan máu còn được biết đến sau khi bệnh nhân sử
dụng một số loại thức ăn có tính oxi hóa cao như long não, rượu vang đỏ, các
sản phẩm từ đậu tương, đậu nành và đặc biệt là các loại đậu Fava dẫn đến hội
chương Favism.
Hội chứng Favism: là bệnh lý thiếu máu tan máu đã được biết đến từ
thời Pythagoras. Người ta nhận thấy rằng sau khi ăn đậu Fava, thì một số
người 24 giờ sau có thể xuất hiện hiện tượng tan máu có khi rất dữ dội. Sau
đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng tình trạng này liên quan đến thiếu hụt
G6PD . Đa số các trường hợp xảy ra ở những cá thể thiếu G6PD nặng nhưng
đôi khi cũng thấy ở người có thiếu hụt nhẹ. Tuy nhiên cũng có trường hợp
thiếu mà không có bệnh sinh lý sau khi ăn đậu Fava. Trong đậu Fava thành
phần liên quan trực tiếp gây ra hiện tượng tan máu là glucosidevicine và
dividine. Aglycone của chúng được thay thế bởi prymidine đến tổn thương
oxi hóa cho xu hướng oxi hóa tự phát ở những bệnh nhân này thường thấy
Hemoglobin niệu trong vài ngày. Bệnh nhân có thiếu máu cấp: da xanh, niêm
mạc nhợt, nhịp tim nhanh, gan, lách có thể to. Trường hợp nặng có thể suy
tim, suy thận.
1.2.2.3. Thiếu máu tan máu mạn tính hồng cầu không hình cầu


11
Những bệnh nhân này có thiếu máu nhẹ, ít khi có thiếu máu nặng. Vàng
da, gan, lách to , .
1.2.3. Cận lâm sàng
- Hoạt độ enzyme G6PD giảm
- Bilirubin toàn phần, tự do tăng; Hb, hồng cầu giảm
- Hồng cầu lưới tăng
- Thiếu máu tan máu cấp: Hb niệu (+), thể Heinz (+)
- Thiếu máu tan máu mạn tính hồng cầu không hình cầu: MCV tăng,

hồng cầu không hình cầu
1.2.4. Phân loại
Dựa vào hoạt độ của enzyme trong hồng cầu và những biểu hiện lâm
sàng của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD thành 5 lớp.
Cho đến nay các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cũng áp dụng cách
chia này , .
Bảng 1.1. Phân loại thiếu hụt G6PD
Lớp

Lâm sàng

Hoạt độ của enzyme so
với bình thường (%)

Nặng, thiếu máu tan máu hồng cầu không
< 10%
hình cầu mạn tính
II Nặng, thiếu máu tan máu cấp tính, từng đợt
< 10%
Nhẹ và trung bình, có cơn tan máu cấp khi
III
10 - 60 %
tiếp xúc với các yếu tố oxi hóa
Thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu enzyme,
IV
60 - 100%
không có biểu hiện lâm sàng
Không có biểu hiện lâm sàng
V
> 110%

(Hiếm gặp)
Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn luôn rõ ràng.
I

1.2.5. Chẩn đoán
- Dịch tễ và tiền sử: vùng có tỉ lệ thiếu hụt G6PD, vùng có sốt rét lưu


12
hành; tiền sử vàng da, thiếu máu cấp hoặc mạn tính; các triệu chứng lâm sàng
xuất hiện sau khi dùng các thuốc hoặc các thực phẩm có tính oxi hóa mạnh.
- Lâm sàng: Ít có giá trị
- Cận lâm sàng
Để phát hiện thiếu G6PD người ta thường đo hoạt độ G6PD dựa trên
tốc độ tạo thành NADPH từ NADP+ khi có G6P làm cơ chất. Người thiếu hụt
là người có hoạt độ enzyme này dưới 200 U/1012 hồng cầu.
Có ý kiến cho rằng ngay khi tan máu, hồng cầu non và hồng cầu lưới
chiếm ưu thế. Những tế bào này có hoạt độ enzyme cao hơn tế bào già. Vì vậy
xét nghiệm này phải được trì hoãn vài tuần sau đợt tan máu đến khi mức
enzyme thấp xuống lại lúc đó mới nên xét nghiệm để chẩn đoán. Tuy nhiên
cũng có nghiên cứu cho thấy rằng trong quá trình tan máu do dùng
Primaquine mức G6PD tăng nhẹ song song với sự xuất hiện của hồng cầu lưới
nhưng thường không bao giờ đạt được đến mức bình thường.
Ngoài ra để đánh giá thiếu hụt G6PD còn có thể dùng các kỹ thuật định
tính và định lượng trong huyết thanh , , .
Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã dùng kỹ thuật phân tích gen để phát
hiện các đột biến gen thiếu hụt G6PD.
1.2.6. Điều trị và phòng bệnh
Chủ yếu là phòng bệnh để không xảy ra các triệu chứng.
Với những bệnh nhân đã biết trước là thiếu hụt G6PD thì trước khi ra

viện cần được tư vấn cho bệnh nhân và gia đình hiểu về bệnh thiếu hụt G6PD
và tính nguy hiểm của nó. Ngoài ra cần tránh những thực phẩm và thuốc có
tính oxy hóa.
Cần tránh những tình trạng sau có thể ảnh hưởng xấu tới sức khỏe bệnh
nhân bị thiếu hụt G6PD: mắc bệnh, kể cả những bệnh do nhiễm trùng hoặc
nhiễm virút; uống một số loại thuốc giảm đau, hạ sốt có chứa Aspirin hoặc
Phenacetin, các loại kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamide và Sulfone, các


13
thuốc kháng sốt rét như Quinine, Chloroquine, Primaquine, các loại thuốc
kháng sốt rét khác mà trong tên gọi có chữ “quine”, một số loại thuốc sử dụng
như vitamin K, xanh methylen dùng trong điều trị nhiễm trùng đường tiểu; ăn
một số thức ăn làm từ đậu tằm.
Đối với trường hợp bị thiếu men G6PD cần phải có chế độ chăm sóc đặc
biệt đối với trẻ: Không sử dụng các loại dược phẩm, thức ăn hoặc những chất
có thể gây tan huyết; thông báo cho nhân viên y tế về tình trạng thiếu men
G6PD của người bệnh; không sử dụng viên long não (băng phiến) để cho vào
tủ quần áo, chăn mềm, giường gối do có chứa naphthalen là một chất oxy hóa.
Cần cảnh giác với một số loại thuốc nam, thuốc đông y và các loại đậu vì có
thể chứa chất oxy hóa. Các bà mẹ cho con bú không được sử dụng những thức
ăn hoặc dược phẩm không được sử dụng ở người bị thiếu men G6PD vì
những chất này có thể đi vào cơ thể trẻ qua sữa mẹ. Các mẹ không nên tự ý
mua thuốc cho trẻ mà phải hỏi ý kiến của bác sĩ.
Với những bệnh nhân khi có chỉ định dùng những loại thuốc có tính oxy
hóa (Primaquine, Aspirin...) cần làm xét nghiệm G6PD trước khi dùng, cần
theo dõi tình trạng tan máu, các triệu chứng như: nước tiểu sẫm màu, vàng da,
thiếu máu... hoặc nên lựa chọn thuốc thay thế khác trong điều trị.
Cần sàng lọc trẻ sơ sinh để chẩn đoán thiếu hụt G6PD ngay sau sinh. Vì
đây cũng là một trong những nguyên nhân phỏ biến gây vàng da, tan máu ở

trẻ sơ sinh. Nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời có thể gây những
biến chứng thần kinh nặng nề, thậm chí tử vong.
Ngoài ra cần thực hiện tư vấn di truyền: thông báo và giải thích với gia
đình bệnh nhân về sự di truyền của bệnh và khuyên phụ nữ mang gen bệnh
không nên kết hôn với người nam bị bệnh.
Khi tan máu xảy ra cần ngưng dùng thuốc. Nếu tình trạng thiếu máu do
tan máu nặng cần được truyền máu, lưu ý không dùng loại máu thiếu G6PD.


14
Khi trẻ bị vàng da, tùy theo mức độ cần thiết phải chiếu đèn hoặc tiến hành
thay máu cho bệnh nhi sớm để phòng tình trạng vàng da nhân não.
1.2.7. Cơ sở di truyền học của bệnh thiếu hụt G6PD
1.2.7.1. Gen mã hóa cho G6PD
Gen mã hóa G6PD nằm trên nhánh dài, vùng 2, băng 8 của nhiễm sắc thể
giới tính X (Xq28). Vùng này gắn với rất nhiều gen khác như: hội chứng
nhiễm sắc thể X gãy, hemophilia A, nhìn màu....

Hình 1.4. Vị trí gen G6PD trên nhiễm sắc thể X
Gen G6PD dài khoảng 18 - 20 kb, gồm 13 exon và 12 intron gồm 25.861
nucleotid , khung đọc mở (open reading frame) dài 1545 nucleotid. Kích
thước của các exon mã hoá thay đổi rất nhiều, từ 38 - 236 bp. Hầu hết các
intron đều ngắn hơn 1 kb, chỉ có intron 2 dài hơn bình thường (khoảng 12 kb).
Exon 1 và đầu 5’ của exon 2 không mã hoá. Bộ ba mã hoá đầu tiên nằm trên
exon 2 . Chức năng của từng exon có sự khác nhau. Gen cấu trúc của G6PD
gồm 20014 bp, trong đó 1548 bp được mã hoá. mRNA của G6PD gồm 2269
nucleotid, tương ứng với 2,4 kb. mRNA của G6PD có một đầu 3’ không mã


15

hoá dài 655 bp và một đầu 5’ không mã hoá dài 696 bp.
Gen G6PD được coi là gen có sự điều hoà và kiểm soát (housekeeping) chặt
chẽ. Cùng một lúc G6PD được biểu lộ với mức độ rất khác nhau ở những loại tế
bào khác nhau. Sự biểu lộ đó được điều hoà bởi nhiều yếu tố và được cho là do
sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X.
1.2.7.2. Cơ chế bệnh sinh
Thiếu hụt G6PD là bệnh di truyền gen lặn liên kết với giới tính, nằm trên
nhiễm sắc thể X, không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. Vì vậy, nữ là
người mang gen bệnh và truyền cho con trai. Người nữ đồng hợp tử gen đột
biến hiếm gặp. Người nữ dị hợp tử mang gen đột biến sẽ có các kiểu hình bình
thường hoặc thiếu hụt G6PD từ nhẹ đến trung bình, hiếm khi thiếu hụt
enzyme nặng (trừ khi họ mang alen bị đột biến ở vùng có chức năng quan
trọng). Nguyên nhân là do sự bất hoạt nhiễm sắc thể X trong tế bào nữ từ giai
đoạn sớm của quá trình phát triển của phôi. Người nam chỉ cần mang một gen
đột biến là đã thể hiện sự thiếu hụt G6PD. Do đó, tỉ lệ trẻ nam được phát hiện
bệnh cao hơn trẻ nữ.

Hình 1.5. Sơ đồ di truyền bệnh thiếu hụt G6PD
Nếu đột biến xảy ra trên gen cấu trúc sẽ phá vỡ cấu trúc bình thuờng của


16
enzyme, gây thiếu G6PD về mặt chất lượng. Nếu đột biến xảy ra trên gen điều
hoà hoặc gen khởi động sẽ làm giảm số lượng enzyme G6PD. Sự thay đổi về
số lượng và chất lượng của G6PD đều dẫn đến sự thay đổi hoạt độ của
enzyme G6PD. Tuy nhiên hầu hết các enzyme bị đột biến luôn luôn có thành
phần bất thường. Điều này chứng tỏ những đột biến này xảy ra tại gen cấu
trúc - vùng mã hoá (coding region). Đến nay với sự phát triển của sinh học
phân tử, cơ sở gen học của bệnh thiếu hụt G6PD ngày càng sáng tỏ. Vào năm
1993 người ta đã tìm thấy 58 dạng đột biến, tương ứng với 97 biến thể. Năm

2002, con số này lên đến 140 đột biến hay phức hợp đột biến gen, tương ứng
với 442 biến thể . Điều này cho thấy rằng tốc độ phát triển những ứng dụng
sinh học phân tử trong lĩnh vực y học hiện nay rất nhanh chóng. Các dạng đột
biến khác nhau có thể gây nên các mức độ thiếu hụt G6PD khác nhau, từ đó
dẫn đến các hình thái lâm sàng khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ quan trọng
về chức năng của vùng đột biến.
Có rất nhiều dạng đột biến gây nên thiếu hụt G6PD nhưng chủ yếu là
đột biến điểm, tức là thay thế một nucleotid, dẫn đến thay thế acid amin này
bằng một acid amin kia và cuối cùng là thay đổi cấu trúc protein.
Tuy nhiên một số đột biến khác nhau có thể tạo ra enzyme biến dị giống
nhau , ví dụ G6PD Aachen đột biến nucleotid C1089G và Loma Linda
C1089A, hai đột biến này đều làm thay đổi acid amin 363 Asn → Lys .
Cũng có khi có đột biến giống nhau nhưng lại tạo ra enzyme có những
đặc tính sinh hoá không hoàn toàn giống nhau. Ví dụ như G6PD Morioka và
G6PD Santiago de Cuba có đột biến G1339A, dẫn đến thay 447 Gly → Arg,
nhưng G6PD Morika thì có tốc độ điện di bình thường, trong khi G6PD
Santiago de Cuba thì tốc độ điện di chậm lại [22].
Nếu những đột biến xảy ra ở những vùng không mã hoá (intron), hoặc


17
đột biến không làm thay đổi ý nghĩa của bộ ba thì sẽ không có biểu hiện bất
thuờng về enzyme , . Ví dụ G6PD Silent đột biến xảy ra ở exon 11, nucleotid
1311 chuyển C → T, tạo thành bộ ba mã hoá TAT thay cho TAC, cùng mã hoá
cho Tyr. Trong khi đó G6PD Sunderland mất đoạn 3 bp, sự thay đổi cấu trúc
gen này gây nên tính không ổn định của enzyme G6PD và dẫn đến tình trạng
lâm sàng với những đợt thiếu máu tan máu trường diễn xen với những đợt tan
máu cấp , .
Một số đột biến gen G6PD được tìm thấy tại Đông Nam Á .
Bảng 1.2. Một số dạng đột biến G6PD gặp ở Đông Nam Á

STT Dạng đột biến

Vị trí biến đổi
Exon

Nucleocid

Acid amin tương ứng

1

Gaohe

2

95 A → G

32 His → Arg

2

Viangchan

9

871 G → A

291 Val → Met

3

Chatham

9

1003 G → A

335 Ala → Thr

4

Chinese - 5

9

1024 C → T

342 Leu → Phe

5

Union

11

1360 C → T

454 Arg → Cys

6

Canton

12

1376 G → T

459 Arg → Leu

7

Kaiping

12

1388 G → A

463 Arg → His

8

Silent

11

1311 C → T

TAT→ TAC → Tyrosin

Cosenza

11-13 1367 G → C

9

Vanua Lava

338 T → C

10

Mahidon

487 G → A

11

Mediterranian

563 T → C

459 Arg → Pro

Cho đến nay, ở Việt Nam đã có 8 dạng đột biến được phát hiện ,
[2], , , , : Viangchan, Canton, Kaiping, Union thuộc lớp 2; Gaohe, Chatham
thuộc lớp 3; Chinese - 5 chưa phân lớp, Silent thuộc đột biến “câm”.
Nghiên cứu về điện di và động học của enzyme ở những người thiếu hụt
G6PD từ những dân cư khác nhau người ta thấy rằng thiếu hụt G6PD có sự khác

18
nhau giữa các khu vực trên thế giới. Trong 140 dạng đột biến gây thiếu G6PD
đại diện cho 442 biến thể khác nhau có tính chất đặc hiệu và có thể phân biệt
được với nhau bằng cách đo các chỉ số hoá sinh. Năm 1967 một hiệp hội của
WHO đề nghị đưa một quy trình chuẩn để mô tả các đặc điểm các biến thể sử
dụng các chỉ số như: hoạt độ enzyme, di chuyển điện di, hằng số Km cho G6PD
và NADP, sự sử dụng thay thế cơ chất, ổn định với nhiệt độ và pH tối ưu.
Thiếu G6PD là nguyên nhân dẫn đến thiếu Glutathion dạng khử.
Glutathion là chất chống oxi hoá có tác dụng bảo vệ màng hồng cầu chống lại
các tác nhân oxi hoá. Khi lượng Glutathion giảm, các enzyme và protein (bao
gồm cả Hemoglobin) sẽ bị hư hại do bị oxi hoá., dẫn đến mất cân bằng phản ứng
oxi hoá khử, xảy ra liên kết chéo, tích tụ protein trong màng tế bào hồng cầu, cuối
cùng tế bào hồng cầu bị vỡ.
1.3. Các phương pháp xác định đột biến gen G6PD
Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định đột biến gen G6PD. Bao
gồm: phân tích đường cong nóng chảy HRM (High Resolution Melt),
Phương pháp MPTP (PCR using multiplex Tandem forward Primer), phân
tích cấu trúc đa hình chuỗi đơn SSCP (Single - strand comformation
polymorphism analysis), sử dụng enzyme cắt giới hạn, hệ thống khuếch đại
các đột biến bền với nhiệt ARMS (Amplification Refractory Mutation
system), giải trình tự gen.
1.3.1. Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy (HRM)
Hiện nay trên thế giới đang ứng dụng rộng rãi phân tích đường cong
nóng chảy (melting curve) trong kỹ thuật realtime PCR giúp chẩn đoán các
đột biến điểm trên gen G6PD , . Hệ thống realtime PCR cho phép theo dõi
sự hình thành sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng. Đây là một kỹ


19
thuật “không đồng nhất” vì trong kỹ thuật này, một hỗn hợp sản phẩm PCR

được tạo ra chứ không phải từng thành phần sản phẩm PCR được phát hiện
như trong kỹ thuật điện di. Quy trình phản ứng đơn giản nhất là bổ sung
Ethidium Bromid vào hỗn hợp phản ứng. Khi Ethidium Bromid xen kẽ vào
trong cấu trúc chuỗi đôi của DNA, tín hiệu huỳnh quang sẽ được tạo ra,
mức độ tín hiệu này phụ thuộc vào lượng DNA chuỗi đôi được tạo ra trong
quá trình phản ứng. Trong kỹ thuật realtime PCR, người ta ứng dụng việc
phân tích đường cong nóng chảy Tm để xác định một vài loại đột biến gen.
Kỹ thuật này phát hiện đột biến dựa vào nhiệt độ nóng chảy Tm của sản
phẩm PCR chuỗi đôi. Ưu điểm của kỹ thuật này là sự phát hiện diễn ra
trong cùng một ống phản ứng khuyếch đại, sử dụng cùng một thiết bị. Điều
này giúp loại bỏ được thao tác bằng tay sau PCR và giúp kỹ thuật trở nên
nhanh hơn, rẻ tiền hơn các phương pháp sàng lọc khác.
1.3.2. Phương pháp MPTP (PCR using multiplex Tandem forward Primer)
Năm 1977, một nhóm tác giả Nhật Bản và Singapore đã triển khai
phương pháp phát hiện những đột biến của gen G6PD là MPTP . Nguyên
tắc của phản ứng này dựa trên nguyên lý của PCR.
Trước hết một vùng gen đích của G6PD được khuếch đại, sau đó sản
phẩm này được sử dụng làm khuôn mẫu để chạy MPTP. MPTP dựa trên cơ
sở một primer rất ngắn có khả năng nhận ra một nucleotid khác biệt trong
vùng trình tự đích, và như vậy việc lai sẽ không thực hiện được. Phản ứng
MPTP được tiến hành với nhiều primer xuôi chiều. Những primer xuôi
chiều nối đuôi nhau phủ toàn bộ vùng gen đích và một primer ngược thông
thường làm khuếch đại từng đoạn “theo bậc thang“. Sự thay đổi nucleotid
trong vùng “rà soát“ của primer dẫn đến việc thiếu một hay hai sản phẩm
khuếch đại. Lợi ích của kỹ thuật này là hầu hết trình tự đột biến trong vùng
đích của gen trên nhiễm sắc thể có thể được khu trú lại một vùng nhỏ và


20
được phát hiện sau hai bước PCR.

1.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn SSCP
(Single - strand comformation polymorphism analysis)
Năm 1985, Maniatis và cộng sự đã chứng minh rằng bằng cách sử
dụng gel polyacrylamid ở trạng thái biến tính có thể phát hiện được sự thay
thế một cặp base đơn độc trong bộ gen do sự khác nhau về khả năng di
chuyển, hậu quả của sự thay đổi cấu trúc .
Về nguyên tắc, phương pháp gồm hai bước: Bước 1: Khuếch đại đoạn
DNA đích nhờ PCR, Bước 2: Sau đó sản phẩm được biến tính và phân đoạn nhờ
điện di trên gel polyacrylamid ở điều kiện không biến tính. Sau khi bị biến tính
bởi nhiệt độ, khả năng di chuyển của các phân đoạn DNA khi điện di trên gel
polyacrylamid phụ thuộc vào kích thước và cấu trúc bậc 2 nội phân tử của chuỗi
đơn. Ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn.
1.3.4. Phương pháp ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
ARMS do Newton và cộng sự nghiên cứu năm 1989, sáu năm sau khi
PCR được phát minh . Ngày nay, phương pháp này đang được ứng dụng
rộng rãi trong viêc xác định các đột biến điểm đã được biết trước đó.
Nguyên tắc của ARMS dựa trên sự khác biệt về các nucleotid của
primer ở đầu 3’ thiết kế cho các alen khác nhau. Chính vì vậy ARMS còn
có một số tên gọi khác nữa căn cứ vào bản chất của kỹ thuật: PCR đặc hiệu
alen (allele specific PCR - ASP), khuếch đại PCR của các alen đặc hiệu
(PCR amplification of specification of specific alleles - PASA) hay khuếch
đại allele đặc hiệu (allele specific amplification - ASA)
Trong kỹ thuật ARMS, hai quy trình PCR được tiến hành với cùng
một khuôn DNA, một mồi giống nhau song khác nhau về mồi đặc hiệu
alen. Như vậy, trong cùng một phản ứng, một mồi sẽ khuếch đại một alen
trong khi mồi kia sẽ khuếch đại alen khác. Các mồi này chỉ đặc hiệu cho


21
một alen chính bởi sự khác biệt trình tự nucleotid ở đầu 3’, tương ứng với

vị trí mà có sự khác biệt về trình tự nucleotid giữa các alen.

Hình 1.6. Nguyên tắc phản ứng ARMS
Điều đặc biệt quan trọng ở đây là Taq hoặc các DNA polymerase trong
phản ứng PCR này phải không có chức năng sửa chữa 3’ → 5’. Nếu enzyme
này có hoạt tính sửa chữa thì nó sẽ tự sửa lại những cặp đôi nhầm ở đầu 3’
của mồi và sẽ làm thay đổi hoàn toàn sự khác biệt trong quá trình phân tích.
Thêm vào đó, enzyme này phải không có khả năng khởi đầu sự tổng hợp
DNA tại vị trí cặp đôi nhầm để đảm bảo không có quá trình khuếch đại và
kết quả là không có sản phẩm. Điều này hoàn toàn đối lập với trường hợp là
khi các mồi liên kết bổ sung phù hợp 100% với alen thì hiệu quả khuếch đại
sẽ tương ứng là 100%. Các sản phẩm tạo thành sẽ được phân tích bằng điện
di trên gel agarose.


22
Kỹ thuật ARMS được sử dụng trong trường hợp có nhiều cấu trúc đa
hình, dòng tế bào mầm, các đột biến ở tế bào soma, xác định tình trạng
mang gen, chẩn đoán trước sinh các bệnh di truyền và phát hiện các biểu
hiện bệnh trong quá trình điều trị ung thư.
Ưu điểm của phương pháp ARMS là đơn giản, dễ áp dụng, rẻ tiền mà
vẫn đảm bảo độ chính xác cao.
1.3.5. Giải trình tự gen
Giải trình tự gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid
trên phân tử DNA. Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được chứa
đựng trong phân tử có tên là ADN (acid deoxynucleic), đó là một chuỗi xoắn
kép gồm hai mạch đơn được tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm: A
(adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này sắp
xếp nối tiếp nhau theo một trình tự xác định, và trình tự này không những đặc
trưng ở từng loài mà còn khác nhau ở từng các thể trong cùng một loài. Giải

trình tự ADN là kỹ thuật giúp xác định sự sắp xếp của bốn loại nucleotide A,
T, C, G trên phân tử ADN, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức
độ sinh học phân tử.
Các phương pháp giải trình tự gen:
*) Phương pháp hóa học: Phương pháp hóa học của Maxam và Gilber
Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam và Walter
Gilbert đã phát minh ra một phương pháp hóa học có thể xác định được trình
tự các nucleotide trongchuỗi ADN. Theo phương pháp này, trước hết phân tử
ADN được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn
có thể phát hiện bằng hình ảnh phóng xạ. Sau đó các nucleotide trong phân tử
ADN được đánh dấu sẽ được xử lý hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt
phân tử ADN tại những vị trí nucleotide khác nhau. Bốn nhóm bị tác động
bao gồm: G, A+G, T+C, và C. Kết quả sẽ tạo thành những đoạn


23
oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1 base. Các đoạn này được điện di
trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy phóng xạ tự ghi. Từ kết quả
phóng xạ tự ghi của bốn nhóm trên có thể xác định được vị trí của bốn loại
nucleotide trong chuỗi ADN. Phương pháp hóa học xác định trình tự ADN
của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác
định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, trong đó khó nhất là phải xác
định được nồng độ giới hạn của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu ADN
thì trên mỗi đoạn ADN chỉ có một base bị biến đổi. Chính vì sự phức tạp này,
phương pháp Maxam-Gilber hiện nay gần như không còn sử dụng, mà thay
vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt
trội hơn.

Hình 1.7. Hình ảnh gel Polyacrylamide sau khi đã điện di
*) Phương pháp enzyme:

Phương pháp này được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hoạt động của enzyme
DNA-polymerase để tổng hợp mạch bổ sung của trình tự cần xác định. Phản
ứng có sự tham gia của các dideoxynucletide (ddNTP), ddNTP có cấu trúc


24
giống như dNTP nhưng bị mất nguyên tử oxy ở C3 khiến dNTP tiếp theo
không thể gắn vào làm quá trình tổng hợp bị dừng lại. Để thực hiện phương
pháp này, trước hết, các đoạn ADN cần xác định trình tự phải được tạo dòng
vào một vector để nhân thành nhiều bản sao trong tế bào được chuyển vào (ví
dụ: vi khuẩn) sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành
các vector tự do. Lượng ADN sau khi được tách chiết sẽ được phân vào bốn
ống nghiệm khác nhau để thực hiện phản ứng giải trình tự. Mỗi phản ứng bao
gồm: vector có gắn chèn đoạn ADN cần xác định trình tự, đoạn mồi bổ sung
đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn ADN, enzyme ADN
polymerase, bốn loại dNTP và 1% mỗi loại ddNTP (được đánh dấu bằng đồng
vị phóng xạ 32P hay 35S). Kết quả sẽ tạo những mạch ADN có chiều dài khác
nhau 1 nucleotide tương ứng với trình tự nucleotide trên đoạn ADN gốc. Sau
khi điện di trên gel polyacrylamide giống như phương pháp Maxam-Gilbert,
các vạch điện di này được hiển thị bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Từ các vạch
này có thể xác định được trình tự ADN.


25

Hình 1.8. Phương pháp enzyme sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger