Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp từ Orientia tsutsugamushi trong Escherichia coli.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRỊNH VĂN TOÀN

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA
TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ CAO HỌC

Hà Nội - 2018

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

TRỊNH VĂN TOÀN

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA
TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 842010.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Phạm Bảo Yên
TS. Lê Thị Lan Anh

Hà Nội – Năm 2018

2


LỜI CẢM ƠN
ut
t

t

v

tr

v

t

TS. Lê Thị Lan Anh – P

s us

t

ộc h c và Các bệnh nhiệt đ i – Viện Y

sinh nhiệt đ i – Trung tâm nhiệt đ i Việt-Nga và TS. Phạm Bảo Yên – PTN tr ng
đ ểm công nghệ enzyme và protein – Khoa Sinh h c – Trư

nhiên –

HQG H Nội là nhữ

động viên và tạo m

ư i Cô kính m

đã

ại h c Khoa h c tự
t

úp đỡ, dạy b o,

đ ều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình h c tập,

nghiên cứu hoàn thành luậ vă tốt nghiệp.
t

Tôi

TS. Võ Viết Cường và các anh chị Phòng Độc

học và Các bệnh nhiệt đới – Viện Y sinh nhiệt đ

ư i luôn tận tình chỉ b o,

động viên và cho tôi những l i khuyên quý báu trong suốt th i gian thực tâp.
T

ũ

t

il ic

t i các cán bộ nghiên cứu, kỹ thuật

viên Viện Y sinh nhiệt đ i - Trung tâm nhiệt đ i Việt-Nga h
tôi hoàn thành luậ vă

ủa mình một cách thuận lợi.
đ

Ti p theo, t
Trư

ạ

oa

đã tạo đ ều kiệ để

tự

cá T

y C tro

Khoa sinh h c –

đã tận tình chỉ b o cho tôi trong suốt quá trình

tập tạ trư ng.
Cuố
đì

ù

ù
ạ

,t
è đã u

đượ

y tỏ

ỗ trợ độ

t
v

đ
uy

ữ

ư
t

tro

t

tro

suốt quá trì

tập.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 01 tháng 01 năm 2019
Học viên
Trịnh Văn Toàn

3

a


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Bệnh sốt mò ........................................................................................................3
1.1.1. Tác nhân gây bệnh .......................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò ..................................................................3
1.1.3. Đáp ứng miễn dịch của sốt mò ....................................................................4
1.1.4. Chẩn đoán bệnh sốt mò ................................................................................5

1.1.5. Điều trị .........................................................................................................7
1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh sốt mò trên thế giới và Việt Nam ...........................7
1.2.1. Trên thế giới .................................................................................................7
1.2.2. Tại Việt Nam ................................................................................................ 8
1.3. Cơ sở nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp .........................................10
1.3.1. Kháng nguyên màng 56 kDa .....................................................................10
1.3.2. Nghiên cứu tạo kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp trong chẩn đoán sốt mò ....12
1.3.3. Công nghệ protein tái tổ hợp.....................................................................13
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................17
2.1. Vật liệu .............................................................................................................17
2.1.1. Các chủng vi sinh vật và plasmid .............................................................. 17
2.1.2. Hóa chất .....................................................................................................17
2.1.3. Máy móc và thiết bị ...................................................................................20
2.1.4. Vật tƣ tiêu hao ............................................................................................20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................20
2.2.1. Nhân gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR............20
2.2.2. Điện di ADN trên gel agarose....................................................................21
2.2.3. Tạo dòng tế bào biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa ........22
2.2.4. Biểu hiện kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp trong tế bào E. coli Rosseta 122

4


2.2.5. Điện di SDS – PAGE .................................................................................24
2.2.6. Thẩm tách miễn dịch Western blot ............................................................24
2.2.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực .........................................25
2.2.8. Thẩm tách loại muối ..................................................................................26
2.3. Một số phần mềm sử dụng trong luận văn .......................................................27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................28
3.1. Tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa trong E. coli......28

3.1.1. Khuếch đại các đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR 28
3.1.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa. 29
3.1.3. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa trong vi khuẩn E. coli Rosseta
1………………….…………………………………………………………………30
3.1.4. Kiểm tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp với mẫu huyết thanh
bệnh nhân bằng kỹ thuật Western blot ......................................................................31
3.2. Lựa chọn một số điều kiện biểu hiện kháng nguyên 56 kDa ...........................33
3.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng ...............................................33
3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến quá trình tổng hợp kháng nguyên 56 kDa..34
3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thu mẫu đến sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa ..36
3.3. Tinh sạch kháng nguyên 56 kDa ......................................................................37
3.3.1. Xử lý tiền tinh chế......................................................................................37
3.3.2. Kết quả tinh sạch kháng nguyên 56 kDa sắc ký ái lực .............................. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................43

5


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Vi khuẩn O. tsutsugamushi và ấu trùng mò……………………………….3
Hình 2: Triệu chứng lâm sàng của bệnh sốt mò.........................................................4
Hình 3: Phân bố địa lý các kiểu gen của O. tsutsugamushi khu vực châu Á .............8
Hình 4: Số ca bệnh sốt mò thu thập tại các bệnh viện tại các tỉnh Yên Bái, Hà
Giang, Hà Nội ............................................................................................................9
Hình 5: Quan hệ phát sinh loài của O. tsutsugamushi .............................................11
Hình 6: Lựa chọn vùng mã hóa kháng nguyên 56 kDa…………..……………….13
Hình 7: Con đƣờng tạo thành protein tái tổ hợp ......................................................14
Hình 8: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .............................................................21
Hình 9: Cột sắc kí ái lực Hitrap................................................................................26

Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng
nguyên 56 kDa trên gel agarose 1% .........................................................................28
Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc Rosetta 1 sau biến nạp mang
plasmid tái tổ hợp. .....................................................................................................29
Hình 12: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp HT-09, HT-11, HT49 và YB-50 trong tế bào E. coli Rosetta 1 .............................................................. 31
Hình 13: Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp bằng
Western blot. .............................................................................................................32
Hình 14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng tổng hợp kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp. .. 33
Hình 15: Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng sinh trƣởng của E. coli tái tổ
hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp. ..........................................34
Hình 16: Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tổng hợp kháng nguyên
56 kDa tái tổ hợp trong tế bào E. o mang HT09, HT11, HT49 và YB50. ............35
Hình 17: Ảnh hƣởng của thời gian thu mẫu đến sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa. 37

6


Hình 18: Kết quả xử lý tiền tinh chế 4 kháng nguyên tái tổ hợp. ............................39
Hình 19: Kết quả tinh sạch 4 kháng nguyên tái tổ hợp. ...........................................40
Hình 20: Kiểm tra sự bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên và kháng thể bẳng phƣơng
pháp Western blot của protein tái tổ hợp HT-09 , HT-11, HT-49 và YB-50 sau tinh
sạch trong 6 M ure.....................................................................................................41

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các môi trƣờng sử dụng..............................................................................17
Bảng 2: Các dung dịch sử dụng trong điện di SDS-PAGE ......................................18
Bảng 3: Các dung dịch sử dụng trong tinh chế protein ............................................18
Bảng 4: Các dung dịch sử dụng trong Western Blot ................................................19
Bảng 5: Các dung dịch dùng trong điện di ADN trên gel agarose ...........................19
Bảng 6: Một số dung dịch trong lên men .................................................................19

Bảng 7: Thành phần của phản ứng PCR đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa ..21
Bảng 8: Thành phần phản ứng tạo plasmid tái tổ hợp ..............................................22
Bảng 9: Bảng thông số khảo sát riêng lẻ các yếu tổ ảnh hƣởng đến sự biểu hiện
kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp ...............................................................................23
Bảng 10: Thành phần gel cô, gel tách trong điện di SDS-PAGE .............................24

7


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tên đầy đủ

Nghĩa tiếng việt

AD

Antigenic determinant

Vùng quyết định kháng
nguyên

Amp

Ampicillin

Kháng sinh Ampicillin

ADN

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

ARN

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

APS

Ammonium persulfate

Ammonium persulfate

Bp

Base pair

Cặp bazơ-nitơ

ELISA

Enzyme-linked
immunosorbent assay

Kỹ thuật miễn dịch gắn
enzyme

IFA

Immunofluorescence Assay

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang

IgG

Immunoglobulin G

Immunoglobulin G

IgM

Immunoglobulin M

Immunoglobulin M

IPTG

Isopropyl-beta-Dthiogalactoside

Chất cảm ứng Isopropyl-betaD-thiogalactoside

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani

Môi trƣờng LB

dNTP

Nucleoside 5´-triphosphates

Nucleoside 5´-triphosphates

OD

Optical density

Mật độ quang học

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

pLATE_56 Plasmid tái tổ hợp mang gen mã
kDa
hóa kháng nguyên 56 kDa

Plasmid tái tổ hợp mang gen mã
hóa kháng nguyên 56 kDa

PVDF

Polyvinyl difluoride

Polyvinylidin difluorit

Rpm

Revolutions per minute

Vòng/phút

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Natri dodexin sunfat

SDSPAGE

Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel
electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamit
có chứ SDS

8

TAE

Tris-acetate-EDTA

Tris-acetate-EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

Tetramethylethylenediamine

VD

Variable domains

Vùng biến đổi kháng nguyên

PBS

Phosphate buffered saline

Phosphate buffer salin

9


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh sốt mò hay sốt bụi rậm (scrub typhus) là bệnh truyền nhiễm cấp tính,

lƣu hành và đe dọa sức khỏe con ngƣời khu vực ở Châu Á - Thái Bình Dƣơng. Theo
thống kê, hàng năm trên thế giới có khoảng 1 triệu ca bệnh và trên 1 tỷ ngƣời có
nguy cơ mắc bệnh [9, 26]. Bệnh sốt mò thuộc nhóm bệnh lây truyền từ động vật
sang ngƣời, tác nhân gây bệnh là Orientia tsutsugamushi (tên gọi trƣớc đây là
Rickettsia tsutsugamushi) - một loại vi khuẩn gram âm ký sinh nội bào bắt buộc,
truyền bệnh cho ngƣời và vật chủ trung gian qua vết đốt của ấu trùng mò [26]. Các
nghiên cứu dịch tễ học của bệnh sốt mò cho thấy khu vực lƣu hành của
O. tsutsugamushi trải rộng từ Pakistan, Afghanistan tới Trung Quốc, Hàn Quốc,
Nhật Bản, ph a đông của Liên bang Nga tới các quần ở khu vực Đông Nam Thái Bình
Dƣơng, ph a bắc của nƣớc c.
Bệnh sốt mò nếu đƣợc chẩn đoán và điều trị kịp thời bằng kháng sinh thích
hợp, bệnh có thể khỏi sau 3-5 ngày. Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng của sốt mò rất
đa dạng và dễ nhầm với các sốt khác nhƣ sốt rét, sốt xuất huyết,... Do vậy, phần lớn
bệnh nhân bị chẩn đoán sai dẫn đến tỷ lệ tử vong lên tới 30% [36]. Hiện nay, bên
cạnh dựa vào các triệu chứng lâm sàng của bệnh, tại các bệnh viện lớn đã áp dụng
nhiều phƣơng pháp chẩn đoán sinh học cho phát hiện nhiễm O. tsutsugamushi bao
gồm phân lập vi khuẩn, các xét nghiệm huyết thanh học nhƣ IFA, ELISA, các kỹ
thuật sinh học phân tử nhƣ PCR. Trong đó, phƣơng pháp ELISA dựa trên sự tƣơng
tác đặc hiệu giữa kháng nguyên của vi khuẩn và kháng thể do cơ thể sản xuất ra.
Sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ đƣợc phát hiện thông qua
phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang. Đây là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm
trong chẩn đoán sốt nhƣ nhƣ chẩn đoán nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá
thành xét nghiệm thấp, thích hợp sử dụng ở những vùng lƣu hành bệnh sốt mò.
Phân tích bằng Western blot ly giải toàn bộ tế bào O. tsutsugamushi phát
hiện thấy ít nhất 4 kháng nguyên protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt 22 kDa,
47 kDa, 56 kDa và 110 kDa [32]. Trong số các kháng nguyên trên thì kháng nguyên

1

56 kDa biểu hiện có nồng độ cao ngoài màng, chiếm 10-15% protein tổng số tế bào,
hầu hết huyết thanh bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng sốt mò đều nhận thấy kháng
nguyên 56 kDa với hiệu giá cao. Kháng nguyên 56 kDa mang t nh đặc hiệu cao và
không biểu hiện ở các nhóm Rickettsia gây bệnh sốt núi đá khác [22]. Bởi vậy, đây
là kháng nguyên đã đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong ứng dụng phân loại và chẩn
đoán bệnh sốt mò. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền,
kháng nguyên 56 kDa đã đƣợc sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp để làm
nguyên liệu phục vụ cho các xét nghiệm chẩn đoán miễn dịch O. tsutsugamushi.
Hiện nay, tại các bệnh viện tuyến lớn, số lƣợng các ca bệnh sốt không rõ
nguyên nhân ngày càng tăng cao, nhu cầu chẩn đoán nhanh và ch nh xác bệnh sốt
mò ngày càng lớn. Vì vậy, nghiên cứu chế tạo bộ kit cho phát hiện nhanh và chính
xác bệnh sốt mò đóng vai trò rất quan trọng. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên
chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
KHÁNG NGUYÊN 56 KDA TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG
Escherichia coli”, kết quả nghiên cứu của đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu sản xuất
bộ kit ELISA dùng trong chẩn đoán sốt mò.
Mục tiêu nghiên cứu:
-

Tách dòng và biểu hiện các đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên

56 kDa của O. tsutsugamushi trong tế bào E. coli Rosseta 1.
-

Tinh chế các kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1.

Bệnh sốt mò

1.1.1. Tác nhân gây bệnh
Sốt mò là bệnh sốt cấp tính do vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc Orientia
tsutsugamushi gây ra (hình 1). Orientia có t nh đa dạng cao (trên 30 chủng), có cấu
trúc kháng nguyên rất khác nhau [6]. Vi khuẩn O. tsutsugamushi thƣờng sống ký
sinh trong các loài mò, có ổ dịch trên các trảng bìa rừng, nơi đất ẩm nhiều cây con
bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nƣơng rẫy trong tự nhiên [26].
Sốt mò là bệnh động vật, chủ yếu trên các thú nhỏ. Ổ bệnh và trung gian
truyền bệnh là mò (Leptotrombidium.). Ở mò, vi khuẩn O. tsutsugamushi đƣợc
truyền qua các giai đoạn phát triển và các thế hệ. Ấu trùng (Trombiculid) là giai
đoạn hút máu và truyền bệnh duy nhất của mò. Khi nở, ấu trùng mò bò lên các ngọn
cỏ bám vào các vật chủ ký sinh nhƣ động vật gặm nhấm, mèo, chó… Các loài gặm
nhấm là vật chủ kí sinh chính truyền bệnh cho ngƣời. Sinh cảnh tự nhiên của mò là
những nơi đất ẩm nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nƣơng rẫy,
bìa rừng trong tự nhiên [26].

Hình 1: Vi khuẩn O. tsutsugamushi và ấu trùng mò [7]
1.1.2. Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò
Theo nghiên cứu, khoảng 50-70% số bệnh nhân sốt mò xuất hiện vết loét tại
vị trí ấu trùng mò đốt (hình 2) [25]. Bệnh thƣờng khởi phát đột ngột, sốt kéo dài từ

3


3-4 ngày và trên 3 tuần khi không điều trị đặc hiệu [37]. Đặc điểm lâm sàng bệnh
sốt mò gồm đột ngột bị sốt nhẹ kèm theo các triệu chứng nhức đầu, đau cơ, đổ mồ
hôi, xuất hiện hạch bạch huyết và rối loạn nhận thức. Bệnh nặng dẫn đến các tổn

thƣơng ở các cơ quan phủ tạng bao gồm gan to, tổn thƣơng phổi, rối loạn chức năng
thận, viêm màng não, giảm tiểu cầu. Bệnh nặng có thể gây đông máu hay xuất huyết
có thể xảy ra do hệ quả của cơ chế gây bệnh làm phá vỡ tế bào nội mạc mạch máu
của O. tsutsugamushi [25]. Bệnh nhân có tỷ lệ tử vong cao nếu không đƣợc chẩn
đoán ch nh xác và điều trị bằng kháng sinh phù hợp.

.
Hình 2: Triệu chứng lâm sàng của bệnh sốt mò [37]
Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào chủng O. tsutsugamushi lây
nhiễm. Những ngƣời đã đáp ứng miễn dịch với bệnh sốt mò có khả năng tái phát
bệnh thấp. Tuy nhiên, ngƣời nhiễm có thể bị tái phát khi nhiễm phải các chủng
O. tsutsugamushi có cấu trúc kháng nguyên khác với chủng đã nhiễm trƣớc đó. Các
vi khuẩn O. tsutsugamushi có thể tồn tại trong các hạch bạch huyết từ 1-2 năm sau
khi nhiễm trùng và không đƣợc điều trị [34].
1.1.3. Đáp ứng miễn dịch của sốt mò
Nhiễm O. tsutsugamushi ở ngƣời gây đáp ứng miễn dịch tế bào. Trong giai
đoạn phát bệnh, kháng thể IgM xuất hiện sớm và hiệu giá tăng nhanh trong 2-3
tuần, sau đó giảm nhanh trong khoảng 4-5 tuần. Kháng thể IgG xuất hiện và tăng
nhanh trong 2 tuần đầu tiên, đạt đỉnh vào tuần thứ 4 và sau đó giảm chậm đến tháng

4


thứ 18 [15]. Miễn dịch sau khi nhiễm sốt mò chỉ có tác dụng bảo vệ với chủng
O. tsutsugamushi gây bệnh mà không có tác dụng bảo vệ đối với chủng
O. tsutsugamushi khác.
Ở ngƣời nhiễm sốt mò, O. tsutsugamushi phát triển chủ yếu trong các mao
mạch, gây tổn thƣơng ở các cơ quan nhƣ phổi, gan, lách và thận.
1.1.4. Chẩn đoán bệnh sốt mò
Bệnh sốt mò nếu không đƣợc chẩn đoán và điều trị bằng kháng sinh phù hợp

dẫn đến tỷ lệ tử vong cao lên đến 30% [36]. Trƣớc đây, chẩn đoán sốt mò thƣờng
dựa trên triệu chứng lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân. Bệnh sốt mò có triệu chứng
giống với các sốt khác nhƣ sốt rét, sốt xuất huyết, sốt do Leptospira, vì vậy, việc
chẩn đoán dễ bị nhầm lẫn dẫn đến kết quả chẩn đoán sai, gây ảnh hƣởng đến quá
trình điều trị bệnh. Hiện nay, chẩn đoán sốt mò thƣờng kết hợp dựa trên triệu chứng
lâm sàng của bệnh và các kỹ thuật xét nghiệm hiện đại khác.
Phản ứng Wei -Felix: O. tsutsugamushi có chung một vài kháng nguyên với
vi khuẩn Proteus vulgaris dòng OX-K. Vì vậy, huyết thanh bệnh nhân sốt mò sẽ
ngƣng kết vi khuẩn Proteus vulgaris dòng OX-K (phản ứng Weil-Felix). Kỹ thuật
Weil-Felix có giá trị trong chẩn đoán sơ bộ bệnh sốt mò, sốt chuột, sốt núi đá.
Hiệu giá ngƣng kết sẽ đạt giá trị cao nhất vào cuối tuần thứ 3, thứ 4, sau đó giảm
nhanh, và thƣờng biến mất sau tuần thứ 5 hoặc thứ 6. Phản ứng có độ nhạy, độ đặc
hiệu thấp, tỷ lệ dƣơng t nh giả cao khoảng 20% [31].
Phản ứng kết hợp bổ thể với kháng nguyên O. tsutsugamushi: Nhằm định
lƣợng kháng thể kháng O. tsutsugamushi với hiệu giá huyết thanh thấp. Thực hiện
phản ứng này đòi hỏi phải có nhiều loại kháng nguyên khác nhau do cấu trúc kháng
nguyên O. tsutsugamushi khác nhau tùy theo từng địa phƣơng và không ngƣng kết
chéo [24]. Xét nghiệm này có độ nhạy thấp, chỉ đƣợc dùng trong điều tra dịch tễ
học về mức độ lƣu hành của bệnh tại một địa phƣơng.
Phân lập O. tsutsugamushi: O. tsutsugamushi đƣợc phân lập từ mẫu máu hay
vết loét hoại tử, mẫu sau đó đƣợc nghiền và tiêm vào phúc mạc của chuột nhắt

5


trắng. Chuột bị nhiễm bệnh có thể chết sau 10-18 ngày với các triệu chứng nhƣ
viêm màng bụng, gan và lách to. Trên tiêu bản hiển vi áp in tế bào lách hay tế bào
phúc mạc, sau khi đã đƣợc cố định bằng cồn methyl và nhuộm theo phƣơng pháp
Giemsa, cho thấy có song cầu trong tế bào và ở ngoại bào bắt màu t a [26]. Xét
nghiệm này cho kết quả chẩn đoán ch nh xác bệnh sốt mò. Tuy nhiên, thời gian

phân lập lâu, không phù hợp trong chẩn đoán bệnh sớm, gây khó khăn cho quá trình
điều trị.
K thuật inh học ph n t dựa trên khuếch đại ADN: Đây là phƣơng pháp
chẩn đoán hiện đại, cho kết quả xét nghiệm nhanh, có khả năng thực hiện tự động
với số lƣợng mẫu lớn; có thể sử dụng đa mồi, và trình tự dò. Bằng kĩ thuật sinh học
phân tử, số lƣợng vi khuẩn có trong mẫu đƣợc định lƣợng, điều này tạo điều kiện
thuận lợi cho theo dõi kết quả điều trị lâm sàng và tiên lƣợng bệnh, cũng nhƣ cho
các nghiên cứu thực hành. Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Đoàn Trọng Tuyên
và cộng sự (2010) đã xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật chẩn đoán bệnh sốt mò trên
máu bệnh nhân mắc bệnh bằng kỹ thuật Nested-PCR và Duplex-PCR. Phƣơng pháp
này có ƣu điểm là độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện sớm mầm bệnh.
Tuy nhiên phƣơng pháp này đòi hỏi các thiết bị chuyên dụng nhƣ máy khuếch đại
PCR; giá thành xét nghiệm cao, đòi hỏi ngƣời làm xét nghiệm phải đƣợc đào tạo
chuyên sâu. Do đó, phƣơng pháp sinh học phân tử chỉ đƣợc thực hiện ở các trung
tâm nghiên cứu hoặc các bệnh viện tuyến cuối.
X t nghiệ

iễn dịch huỳnh quang và miễn dịch gắn enzym (ELISA):

Kỹ thuật chẩn đoán kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) và kỹ thuật
chẩn đoán miễn dịch gắn enzyme peroxidase (ELISA) gián tiếp thƣờng đƣợc sử
dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết thanh học sốt mò. Hiện nay, nhiều nƣớc trên
thế giới đã cho ra đời bộ kit (thanh chẩn đoán nhanh) phát hiện kháng thể IgM, IgG,
IgA ngƣời kháng O. tsutsugamushi nhanh và chính xác. Trong các xét nghiệm trên,
xét nghiệm IFA đƣợc xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán O. tsutsugamushi
[14]. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là yêu cầu trang thiết bị chuyên
dụng nhƣ k nh hiển vi huỳnh quang và đòi hỏi cán bộ thực hiện có trình độ chuyên

6

môn cao. Vì vậy, chẩn đoán IFA thƣờng đƣợc sử dụng trong các viện nghiên cứu
lớn và thƣờng không đƣợc sử dụng trong các bệnh viện tuyến dƣới. Xét nghiệm
bằng test nhanh có ƣu điểm là thời gian phát hiện nhanh chỉ trong 15-20 phút, kết
quả chẩn đoán ch nh xác, giá thành rẻ chỉ khoảng 100.000 đồng/1 test. Tuy nhiên,
kết quả của test nhanh không phân biệt đƣợc bệnh nhân đang nhiễm, đã nhiễm hay
đã đƣợc tiêm vaccine. Xét nghiệm bằng ELISA cho phép phát hiện kháng thể IgM
hoặc IgG kháng O. tsutsugamushi cho phép phân biệt đƣợc bệnh nhân đang nhiễm
hay đã phơi nhiễm trong quá khứ.
Các phƣơng pháp IFA, ELISA và test nhanh này đều sử dụng hỗn hợp kháng
nguyên vỏ 56 kDa thuộc 3 nhóm nguyên thủy của O. tsutsugamushi là Karp, Kato
và Gilliam để phát hiện kháng thể kháng O. tsutsugamushi trong huyết thanh bệnh
nhân sốt mò. Trong 3 xét nghiệm trên, xét nghiệm ELISA dựa trên hỗn hợp các
kháng nguyên 56 kDa đƣợc đánh giá có độ nhạy và độ đặc hiệu tƣơng đƣơng IFA
và có thể thay thế xét nghiệm IFA trong chẩn đoán sốt mò [11].
1.1.5. Điều trị
Tetracycline, chloramphenicol và doxycycline là các kháng sinh đặc hiệu
dùng trong điều trị sốt mò [19]. Bệnh nhân thƣờng cắt sốt trong vòng 2 ngày sau
điều trị; bệnh nhân điều trị tetracyclines đƣợc thấy là có thời gian cắt sốt ngắn hơn
so với điều trị bằng chloramphenicol. Các chất kháng sinh gây ức chế sinh trƣởng
O. tsutsugamushi. Tốc độ khỏi bệnh của bệnh nhân tùy thuộc vào khả năng đào thải
của hệ thống miễn dịch [23]. Khi điều trị bằng kháng sinh, ngƣời bệnh vẫn bị tái
phát cần điều trị dự phòng thêm 3-5 kháng sinh/ngày. Ngoài ra, kháng sinh
penicillin không có hiệu quả trong điều trị sốt mò và sulfonamide bị chống chỉ định
trong điều trị sốt mò [8].
1.2.

Tình hình nghiên cứu bệnh sốt mò trên thế giới và Việt Nam

1.2.1. Trên thế giới

Tại châu Á, các nghiên cứu chỉ ra vi khuẩn O. tsutsugamushi khá thịnh hành
và gây ra 1 triệu ca nhiễm bệnh mỗi năm. Vi khuẩn O. tsutsugamushi đặc hữu trong

7


khu vực rộng 13.000.000 km2 diện tích vành đai châu Á - Thái Bình Dƣơng, kéo dài
từ Afghanistan sang Trung Quốc, Hàn Quốc, đảo thuộc phía tây nam Thái Bình
Dƣơng và miền bắc Australia [30].
Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự, trong tổng số 324 gen của vi khuẩn
O. tsutsugamushi cho thấy: số lƣợng các chủng phân lập nhóm Karp là lớn nhất
(175 gen), Gilliam (78 gen), nhóm TA763 và Kato hiếm khi xuất hiện ở Hàn Quốc
và Trung Quốc nhƣng xuất hiện nhiều ở Việt Nam. Kiểu gen Shimokoshi chỉ đặc
hữu ở Nhật Bản (hình 3) [16].

Hình 3: Phân bố địa lý các kiểu gen của O. tsutsugamushi khu vực châu Á [16]
1.2.2. Tại Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng lƣu hành của sốt mò. Tuy nhiên, từ những
năm 1960 đến 1990, sốt mò vẫn đƣợc coi là bệnh tƣơng đối hiếm, chỉ xảy ra ở
một số ổ dịch thiên nhiên và không gây ảnh hƣởng lớn tới cộng đồng. Nguyên
nhân là việc sử dụng quá nhiều tetracycline và chloramphenicol trong thực
hành y khoa và tình trạng thiếu các chẩn đoán đặc hiệu cho sốt mò. Từ giữa
những năm 1990, khi các kháng sinh này không còn đƣợc sử dụng rộng rãi, sốt

8


mò nổi lên nhƣ một căn nguyên gây sốt quan trọng [36]. Trong 5 năm qua, tỷ lệ
mắc bệnh sốt mò trong quân đội chiếm từ 0,4-0,7% số bệnh nhân mắc bệnh
truyền nhiễm. Bệnh lƣu hành trên địa bàn đóng quân của một số đơn vị nhƣ:

Quân khu 1, Quân khu 2, Quân khu 3 và đặc biệt là Quân khu 5 [4].
Bệnh sốt mò thƣờng xảy ra ở vùng rừng núi cùng với những nơi có bệnh
sốt rét lƣu hành, triệu chứng lâm sàng của sốt mò và sốt rét tƣơng đối giống
nhau vì vậy việc chẩn đoán phân biệt sốt mò với sốt rét còn gặp khó khăn.
Năm 2000-2002, tại bệnh viện Uông Bí (Quảng Ninh) đã tiếp nhận 449 bệnh
nhân sốt mò vào điều trị [2]. Từ năm 2001-2003, có 251 ca sốt mò đƣợc chẩn
đoán huyết thanh học tại bệnh viện Bạch Mai [3]. Tại tỉnh Yên Bái, từ tháng
4/2014 đến tháng 9/2014 đã có 78 bệnh nhân sốt mò đƣợc phát hiện, điều trị
trong đó có 2 trƣờng hợp tử vong. Nghiên cứu trên 100 bệnh nhân đƣợc chẩn
đoán là sốt mò điều trị tại Khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Quân y 87 (từ tháng
1/2008- 6/2010) cho thấy 65% bệnh nhân nhập viện từ tuần thứ 2 của bệnh, đặc
biệt tỷ lệ chẩn đoán nhầm với bệnh khác của tuyến trƣớc lên tới 81% [5]. Nhiều
trƣờng hợp khi chuyển lên tuyến trên đã chuyển sang các biến chứng nguy
hiểm, suy đa phủ tạng, gây khó khăn và tốn kém cho công tác điều trị.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Minh và cộng sự, khu vực miền Bắc
bệnh sốt mò thƣờng gặp chủ yếu vào mùa mƣa từ tháng 5 đến tháng 11 hằng
năm, đặc biệt là tháng 6-7. Tại miền Nam, bệnh sốt mò xuất hiện quanh năm,
nhiều nhất vào tháng 6-9 (hình 4) [1].
Ca bệnh 30
25
20

Tổng ca
bệnh
Dƣơng
tính

15
10
5

0

8

9 10 11 12

1 2

3

4

5

6

7

8

Tháng

Hình 4: Số ca bệnh sốt mò thu thập tại các bệnh viện tại các tỉnh Yên Bái, Hà Giang, Hà Nội [1]

9


Cho tới nay chƣa có nhiều công bố chính thức nào đề cập tới sự lƣu hành của
O. tsutsugamushi cũng nhƣ phân lập định loài Rickettsia đƣợc tiến hành có hệ thống
mà chủ yếu chỉ khẳng định có sự lƣu hành bệnh sốt mò tại Việt Nam thông qua

bệnh cảnh lâm sàng hoặc xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng O. tsutsugamushi
có trong huyết thanh bệnh nhân.
1.3.

Cơ ở nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp

1.3.1. Kháng nguyên màng 56 kDa
Sau khi li giải tế bào O. tsutsugamushi, kết quả Western blot cho thấy có ít
nhất 30 protein chính, bao gồm 110 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 56 kDa, 47 kDa và ~ 2225 kDa protein [8]. Trong đó, kháng nguyên 56 kDa mang t nh đặc hiệu cao và
không biểu hiện ở các Rickettsia khác. Protein 56 kDa biểu hiện trên bề mặt màng,
nồng độ chiếm 10-15% protein tổng số tế bào, kháng nguyên này có thể liên quan
đến sự xâm nhập vào các tế bào chủ, thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân
loại O. tsutsugamushi và các chủng khác [8]. Cây phả hệ dựa trên 271 trình tự gen
mã hóa kháng nguyên 56 kDa O. tsutsugamushi thu thập ở các nƣớc Đông Bắc Á,
Đông Nam Á và

c đã xác định các type huyết thanh gồm: Karp (chiếm khoảng

50%), Gilliam (25%), Kato (dƣới 10%), và Kawasaki. Các phƣơng pháp di truyền
cho thấy độ đa dạng phức tạp hơn nhiều so với những gì đã đƣợc mô tả trƣớc đây
(ví dụ, Gilliam đƣợc chia thành Gilliam và Japanese Gilliam type). Riêng ở các tỉnh
phía nam Hàn Quốc nhóm Boryong chiếm trên 70% các chủng phân lập đƣợc. Một
số chủng mới phân lập: TA678, TA686, TA716, TA763 và TH1817 cho phản ứng
chéo rất thấp với ba phân type đầu tiên gồm Gilliam, Karp và Kato. Tại Việt Nam,
Nguyễn Văn Minh và cộng sự đã phân lập và giải trình tự gen đặc hiệu 56 kDa của 33
chủng O. tsutsugamushi, kết quả cho thấy Karp, Kato, TA763 và Gilliam là các chủng
lƣu hành phổ biến nhất ở Việt Nam, chiếm lần lƣợt là 62,6%, 12,1%, 9.1% và 6.1%
[33].

10

Phân tích trình tự gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa từ nhiều chủng
O. tsutsugamushi cho thấy gen có k ch thƣớc khoảng 1550 - 1600 bp, mã hóa cho
520 – 534 ax t amin. Gen đƣợc chia làm 4 vùng bảo tồn và 4 vùng biến đổi (VDI,
VDII, VDIII và VDIV) [13]. Trong đó, vùng VDI và VDII là vùng có tần suất biến
đổi axít amin nhiều nhất. Đây là một trong những cấu trúc quan trọng trong nghiên
cứu phát triển vaccine phòng sốt mò. Bản đồ xác định vùng quyết định kháng
nguyên của protein 56 kDa từ chủng O. tsutsugamushi chỉ ra có 3 epitop của kháng
nguyên gồm ADI, ADII, và ADIII, các epitop chủ yếu nằm ở đầu amino của phân
tử.

Hình 5: Quan hệ phát sinh loài của O. tsutsugamushi
Hiện nay, nhu cầu sử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp sử dụng trong chẩn
đoán bệnh lý cũng nhƣ sản xuất vaccine rất cao. Tuy nhiên, O. tsutsugamashi là vi
khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, khó nuôi dƣỡng trên môi trƣờng ngoại bào. Cùng
với sự phát triển của kỹ thuật di truyền, các protein 56 kDa tái tổ hợp đã đƣợc
nghiên cứu và sử dụng làm nguyên liệu chế tạo bộ kit ELISA dung trong chẩn đoán
sốt mò có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên 90% [17].

11


1.3.2. Nghiên cứu tạo kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp trong chẩn đoán sốt mò
Kết quả các nghiên cứu cho thấy phần lớn sự bảo vệ chống lại
O. tsutsugamushi là kết quả của đáp ứng miễn dịch kháng lại kháng nguyên
56 kDa. Protein 56 kDa đƣợc xem là thành phần quyết định để tạo kit chẩn đoán
và vaccine dự phòng bệnh sốt mò. Trƣớc đây, để thu đƣợc kháng nguyên
O. tsutsugamushi sử dụng trong các xét nghiệm huyết thanh phải tiến hành nuôi
cấy vi khuẩn trên phôi gà hoặc tế bào động vật, sau đó thu nhận tế bào. Việc thu

nhận kháng nguyên bằng nuôi cấy vi khuẩn yêu cầu trang thiết bị chuyên dụng,
phôi gà sạch và quy trình kỹ thuật phức tạp, đặc biệt thí nghiệm phân lập
O. tsutsugamushi cần tiến hành ở phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp III. Bằng
công nghệ ADN tái tổ hợp, Kim và cộng sự đã biểu hiện thành công protein 56
kDa tái tổ hợp của O. tsutsugamushi nhóm Boryong dƣới dạng dung hợp với
protein liên kết maltose trong tế bào E. coli. Protein tái tổ hợp biểu hiện với hàm
lƣợng 15 mg/L đƣợc sử dụng để phát hiện kháng thể kháng O. tsutsugamushi
trong 100 mẫu huyết thanh bệnh sốt mò và 70 bệnh nhân sốt do các nguyên nhân
khác bằng kỹ thuật ELISA cho kết quả độ nhạy 95%, độ đặc hiệu 100% [17].
Ching và cộng sự đã biểu hiện đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên 56 kDa từ axit
amin thứ 80 đến axit amin 456 của chủng O. tsutsugamushi Karp, hàm lƣợng
protein tái tổ hợp thu đƣợc là 10 mg/L Protein sau khi tái cuộn gấp (refolding)
đƣợc sử dụng để phát hiện IgM, IgG bằng ELISA cho kết quả có độ nhạy, độ đặc
hiệu cao trên 93%. Kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp O. tsutsugamushi Shanxi
đƣợc biểu hiện với hàm lƣợng 20 mg/L trong hệ thống biểu hiện E. coli đƣợc sử
dụng làm xét nghiệm IFA cho kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu lần lƣợt là 96,36% và
88,38% [10].
Để nâng cao hiệu quả chẩn đoán sốt mò, các nhà nghiên cứu đã sử dụng hỗn
hợp protein 56 kDa tái tổ hợp từ các nhóm O. tsutsugamushi khác nhau. Tay và
cộng sự đã biểu hiện vùng quyết định kháng nguyên AD I - AD III kháng nguyên
56 kDa của chủng O. tsutsugamushi Gilliam và TA763. Việc loại bỏ vùng AD IV

12


đã làm k ch thƣớc gen biểu hiện giảm đáng kể, khả năng biểu hiện trong vật chủ
tốt hơn mà không làm thay đổi tính chất kháng nguyên (hình 6) [33].

Hình 6: Lựa chọn vùng mã hóa kháng nguyên 56 kDa [33].
Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm IgM, IgG kháng O. tsutsugamushi bằng kỹ

thuật ELISA và Dot blot đạt 98% khi sử dụng hỗn hợp kháng nguyên 21 kDa và
56 kDa. Nghiên cứu của Rodkvamtook và cộng sự (2015) sử dụng protein tái tổ
hợp từ các chủng Karp, Kato, Gilliam và TA763 tạo kit dot - ELISA chẩn đoán
bệnh sốt mò cho độ nhạy, độ đặc hiệu lần lƣợt là 98,5% và 96,3% [27]. Dựa trên
kết quả của các nghiên cứu trên, chúng tôi đã quyết định lựa chọn biểu hiện vùng
quyết định kháng nguyên từ AD I - AD III của kháng nguyên 56 kDa để nâng cao
hiệu quả biểu hiện. Đồng thời, trong quá trình sản xuất kháng nguyên 56 kDa tái
tổ hợp, việc lựa chọn hệ thống biểu hiện gen phù hợp là yếu tố then chốt quyết
định khả năng chế tạo thành công kháng nguyên tái tổ hợp.
1.3.3. Công nghệ protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp là những protein có bản chất tự nhiên nhƣng đƣợc sản
xuất theo con đƣờng sử dụng những tế bào tái tổ hợp. Các protein tái tổ hợp là một
công cụ quan trọng cho nghiên cứu các quá trình sinh học nhƣ: phân t ch điều hòa
biểu hiện gen, phân tích cấu trúc và chức năng của protein, phân t ch tƣơng tác
protein - protein, tạo kháng thể. Tổng hợp một protein tái tổ hợp yêu cầu sử dụng
một hệ thống biểu hiện phù hợp với cấu trúc và hoạt tính của protein tái tổ hợp.
Trong nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn chủng biểu hiện E. coli Rosetta 1 và vector
pLATE để tạo dòng tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa.
1.3.3.2. Chủng biểu hiện E. coli Rosetta 1

13


Lựa chọn hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp th ch hợp là yếu tố quan trọng
để đạt đƣợc năng suất và chất lƣợng mong muốn. Hiện nay, hệ biểu hiện phổ biến
nhất là hệ biểu hiện tế bào nhân sơ (vi khuẩn E. coli) do có nhiều thuận lợi nhƣ dễ
dàng thực hiện các thao tác gen, nuôi cấy dễ dàng, sinh trƣởng nhanh chóng, môi
trƣờng nuôi cấy đơn giản và chi ph thấp, hiệu suất tổng hợp protein cao và th ch
hợp để biểu hiện các protein nội bào [29].
Các protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong E. coli thƣờng đƣợc tiết trực tiếp

ra tế bào chất và bị các protease nội bào phân giải (hình 7) [28]. Hầu hết các protein
ở màng ngoài hoặc protein ở khoang chu chất đƣợc tổng hợp ở tế bào chất là các
protein chƣa hoàn chỉnh. Các protein này chứa các peptide tín hiệu ngắn khoảng 1030 axit amin cho phép protein xuất ra khỏi tế bào chất. Do vậy để tăng độ bền của
protein tái tổ hợp ngƣời ta thƣờng gắn thêm các đoạn peptide tín hiệu (pelB, OmpA,
OmpT, PhoA,…) để định hƣớng protein tiết ra khoang chu chất, loại bỏ methionin
đầu tận cùng N đồng thời giúp protein cuộn xoắn tốt hơn để tạo thành protein có
hoạt tính sinh học và cũng có độ tinh sạch cao hơn so với các protein nội bào.
Hơn nữa, để tăng độ bền cho protein tái tổ hợp cũng nhƣ tránh sự phân cắt protein
bởi các protease nội bào, các chủng biểu hiện đƣợc sử dụng thƣờng chứa các đột
biến mất khả năng tổng hợp các protease [35].

Hình 7: Con đƣờng tạo thành protein tái tổ hợp [28]

14


Các chủng Rossetta 1 mang đột biến mất gen lacY mã hóa cho lac permease
trong chủng khuyết protease BL21. Việc đột biến gen lac permease có tác dụng làm
cho tối ƣu khả năng tiếp nhận chất cảm ứng IPTG trong tất cả các tế bào trong quần
thể. Khi biểu hiện ở mức thấp, chủng Rosseta 1 có thể làm tăng cƣờng tính tan và
hoạt tính của các protein đ ch. Ngoài ra, chủng Rosetta 1 còn chứa plamid pRARE,
mã hóa tRNAs cho các codon động vật, đây là những codon rất hiếm gặp trong
E. coli, do vậy có thể làm tăng cƣờng tối đa sự biểu hiện. Plasmid pRARE đƣợc chọn
lọc trên chloramphenicol và có thể tƣơng hợp với toàn bộ các vector thuộc họ pET [21].
1.3.3.3. Vector biểu hiện pLATE
Vector biểu hiện pLATE trong E. coli bao gồm các yếu tố cơ bản sau:
promoter phiên mã, vị trí bám của ribosom (Ribosome Binding Site, RBS), điểm
khởi đầu dịch mã, marker chọn lọc, điểm khởi đầu tái bản, vị tr đa nhân dòng, vùng
kết thúc phiên mã.
Vector biểu hiện pLATE đƣợc thiết kế để sản xuất một lƣợng lớn protein khi

đƣợc kích hoạt bằng chất cảm ứng IPTG. Plasmid này chứa yếu tố quan trọng nhƣ
gen lacI mã hóa cho protein ức chế, promoter T7 đặc hiệu với T7 ARN polymerase
(không phải ARN polymerase của vi khuẩn), lac operator, vị tr đa nhân dòng, điểm
khởi đầu tái bản, gen kháng ampicillin. Gen của protein ngoại lai cần biểu hiện
đƣợc nhân dòng trong vector biểu hiện tại vị tr đa nhân dòng. Cả promoter T7 và
lac operator đƣợc định vị tại đầu 5’ của gen cần biểu hiện. Khi có mặt T7 ARN
polymerase, lac operator không bị ức chế, gen ngoại lai đƣợc phiên mã nhanh chóng
và protein ngoại lai sẽ đƣợc biểu hiện nhanh theo số lƣợng mARN của gen ngoại lai.
Một điểm quan trọng của vector biểu hiện đó là gen ngoại lai không đƣợc
biểu hiện nếu không có mặt enzyme T7 ARN polymerase. Tế bào sinh vật nhân sơ
không sản xuất ARN polymerase, do đó T7 polymerase phải đƣợc thêm vào. Thông
thƣờng, vật chủ để biểu hiện vector là vi khuẩn đƣợc cải biến di truyền có gen mã
hóa cho T7 ARN polymerase, lac promoter và lac operator trong genome của nó.

15


Khi có mặt lactose hoặc chất đồng hình của lactose trong tế bào, T7 ARN
polymerase sẽ đƣợc phiên mã [35].
Kiểm soát vector biểu hiện đƣợc thực hiện qua lac promoter và lac operator.
Trƣớc khi gen ngoại lai đƣợc phiên mã, T7 ARN polymerase phải có mặt. Gen mã
hóa cho T7 ARN polymerase trong hệ gen của vật chủ đặt dƣới sự điều khiển của
lac promoter cảm ứng đƣợc kích hoạt bởi IPTG. Phân tử IPTG sẽ gắn vào chất ức
chế và làm thay đổi cấu hình của chất ức chế làm cho nó không thể bám vào lac
operator. Khi đó IPTG k ch hoạt cả lac operator của gen mã hóa cho T7 ARN
polymerase và gen ngoại lai [35]. Bởi vậy, khi IPTG đƣợc thêm vào T7 ARN
polymerase đƣợc biểu hiện và nhanh chóng phiên mã gen ngoại lai sau đó dịch mã
để tổng hợp protein.
Ngoài ra, vector biểu hiện còn có đuôi pelB có độ dài 22 axit amin giúp định
hƣớng protein ngoại lai tiết ra khoang chu chất. Sau khi protein đi qua màng trong

thì peptide tín hiệu này bị cắt bởi một protease xác định. Vector biểu hiện còn có
đuôi His ở đầu N và điểm cắt loại bỏ đuôi His bằng enterokinase thuận lợi cho quá
trình tinh sạch protein ngoại lai.

16