BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN
MODULE 1

SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC 1
-

Lên men sinh tổng hợp acid lactic
Thu nhận acid lactic

CƠ SỞ LÝ THUYẾT:
1.1 Lên

men lactic:

Acid lactic là một loại acid hữu cơ tự nhiên được sử dingj nhiều trong công nghiệp hóa chất, dệt,
thực phẩm và dược phẩm. Acid lactic thương mại được sản xuất nhờ lên men carbohydrate bằng


vi khuẩn lactic. Lên men lactic là một trong những loại hình lên men phát triển
nhất trong tự nhiên.
Lên men lactic là quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP được hình
thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trưởng của vi sinh vật.
Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2, được vi khuẩn thải vào
môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường

lên men ngày càng tăng làm giảm pH môi trường và kéo theo các biến đổi hóa
lý khác.
Lên men lactic đồng hình: quá trình lên men mà lượng acid lactic tạo thành
chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ pyruvate được chuyển hóa thành acid
acetic, ethanol, CO2, acetoin.
Lên men lactic dị hình: chỉ có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic,
ngoài ra còn có các sản phẩm phụ tương rác với nhau tạo thành ester có mùi
thơm. Acid lactic tạo thành chiếm 40%, rượu ethylic 10%, các loại khí 20%...
1.2

Vi khuẩn lactic:

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn
Gram (+), không di động, thuộc nhóm yếm khí, không chứa cytochrome và
enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxidase rất mạnh.
Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng, gồm nhiều nhóm khác nhau, tế bào của
chúng có thể là hình cầu hoặc hình que.
1.3

Cơ chế quá trình lên men lactic:

Acid lactic được tạo thành qua quá trình lên men đồng hình như sau:

Glucose
Glucose – 6 - phosphate
Fructose – 6 - phosphate
2


Fructose – 1,6 - diphosphate

Phospho dioxyacetone

Phosphoglyceraldehyde
Acid – 1,3 - diphosphoglyceric
Acid pyruvic
Acid lactic

1.4

Nguyên liệu:

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều nguồn đường như lactose, glucose,
galactose, maltose, dextrin,…
Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng mật rỉ đường để lên men
vì rẻ tiền, dễ kiếm. Trước tiên, mật rỉ cần được xử lý để tẩy màu và tách các
chất keo trong mật rỉ. Mật rỉ cần được làm loãng theo tỷ lệ 1:3, sau đó cho chảy
qua cột than hoạt tính. Than hoạt tính sẽ hấp thụ các chất màu. Sau đó, làm
loãng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% và H2SO4 5% theo khối lượng dịch để
acid hóa môi trường. H2SO4 như một chất chuyển hóa đường saccharose thành
đường nghịch đảo giúp quá trình lên men sau này tốt hơn. Trong giai đoạn này
người ta đun dung dịch ở 90-95oC trong 6 giờ.
1.

CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ:

3


2.

-

DỤNG CỤ
STT Tên dụng cụ
Quy cách
1 Ống nghiệm
18mm
2 Hộp petri
100mm
3 Bình tam giác
500ml
4 Ống hút
10ml
5 HÓA
Quả CHẤT
bóp
VÀ VẬT LIỆU
6 Bình tia
500ml
Số
STT
7 Tên
Que hóa
cấy vòng
chất
lượng
8
Que
cấy
móc

1 Glucose
150 g
9
Lame
+
lamelle
2 MT MRS
100 g
10
Đèn nấm
cồn men
3 Cao
5g
11
Cốc thủy tinh
100ml
4 NaOH
30 g
12
Cốc thủy tinh
200ml
5 H2SO4
500 ml
13
Cốc
thủy
tinh
1000ml
6 Tím kết tinh
50 ml

14
Giá
ống
nghiệm
inox
7 Lugol
50 ml
15
Phễu
thủy
tinh
vừa
8 Nước cất
50 ml
16
Đũa
thủy
tinh
dài
9 Cồn
500 ml
17 Xanh
Buret methylene
10
15 ml
18 K2HPO4
Màng mỏng PVC
11
2g
19 MgSO4

Giấy báo
12
3g
20
Thung
buộc
13 ZnSO4.7H2O
1g
21
Ống
ly
tâm
nhựa
14 (NH4)2SO4
18 g
22
Eppendorf
1.5ml
15 Ca(OH)2
20 g
23 Bông
Đầu típ
16
không thấm nước 1ml
100 g
24 Bông
Đầu típ
0.1ml
17
thấm nước

50 g
THIẾT BỊ
Quy
STT
Tên thiết bị
cách
1 Nồi hấp tiệt trùng
2 Cân điện tử
QUY
Kính hiển vi quang
NGHỆ
3
học
3.1 Chuẩn bị 4 Tủ ấm
5 Tủ cấy
Giống
6 pH kế
acidophillus
7 Brix kế
10 - 30%
trong môi
8 Tủ lạnh
9 Máy lắc
>
10
Máy ly tâm
5000v/p
11 Fermenter
2 lít
12 Micropippet

1000ml
13 Micropippet
100ml

TRÌNH CÔNG
giống
Lactobacillus
được nhân giống
trường lỏng MRS

4


-

trước đó 12 giờ bằng cách cấy 1 ống giống hoặc 2 gói vi khuẩn đông khô
vào 150 ml MRS.
Giống được lấy từ: Men đông khô

-

3.2 Môi trường nuôi cấy
Pha môi trường MRS gồm các thành phần sau:
Tên chất
Proteose Peptone
Cao thịt bò
Cao nấm men
Dextrose
Polysorbate 80
Ammonium citrate

Natri acetate
MgSO4
MnSO4
K2HPO4
Agar
Nước

-

10 g
10 g
5g
20 g
1g
2g
5g
0,1 g
0,05 g
2g
15 g
1000 mL

Môi trường lên men acid lactic:
Tên chất
Glucose
(NH4)2SO4
MgSO4.7H20
ZnSO4.7H2O
KH2PO4
pH cuối 6.5

-

Hàm lượng

Hàm lượng
25 g
3g
0.3 g
0.05 g
0.2 g

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
+ Canh môi trường lên men đưa vào fermenter: 1000 mL
+ Môi trường MRS agar phân phối vào 30 ống nghiệm: 8 mL
+ Môi trường MRS lỏng phân phối vào 2 bình tam giác 250 mL: 100mL
+ Môi trường PDA: 10 ống thạch nghiêng và 18 đĩa petri

5


3.3 Quy trình nuôi cấy
- Sơ đồ quy trình nuôi cấy:

-

Thời gian nuôi cấy:

Ngày
30/10/2019

31/10/2019

Thời điểm xác định các thông số
8h
11h
14h
15h
8h
11h
14h
16h

6


Tổng thời gian nuôi cấy: 64h
Tổng thời gian xác định các thông số: 32h

3. CÁC
4.1
- Bước
-

BƯỚC THỰC HIỆN
Lập đường chuẩn acid lactic
1: Pha 1ml acid lactic chuẩn và 9ml nước cất để được stock nồng độ
120 g/l (khối lượng riêng acid lactic là 1,2 g/ml)
Bước 2: Pha loãng stock để được dãy nồng độ acid lactic gồm 0,1; 0,5; 1; 2;
5; 10 (g/l)

Bước 3: Hút 50µl dung dịch acid lactic nồng độ khác nhau cho vào mỗi ống
nghiệm
Bước 4: Cho thêm 2ml FeCl3 0,3% vào mỗi ống nghiệm trên
Bước 5: Lắc đều và đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% được dùng làm mẫu
trắng).
Bước 6: Vẽ đường tương quan giữa giá trị OD390 và nồng độ acid lactic
tương ứng.

4.2 Lên men thu nhận acid lactic
-

Bước 1: Pha chế môi trường nhân giống, môi trường lên men acid lactic và
dung dịch điều chỉnh pH
• Mỗi tổ pha :
+ 150 ml môi trường MRS lỏng phân phối vào 1 bình tam giác 250
+ 600 ml canh môi trường lên men phân phối vào 2 bình tam giác 500 ml
•

Mỗi lớp pha:

+ 1000 ml canh môi trường lên men đưa vào fermenter
+ 250 ml NaOH 2M
+ 250 ml H2SO4 2M
-

-

Bước 2: Bao gói giấy và bịt nắp dụng cụ và môi trường
+ Bao gói 2 pipet 10ml, dụng cụ chứa môi trường, đầu típ 100ml và
1000ml

Bước 3: Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy và dụng cụ ở 121oC, 20 phút.
Bước 4: Vệ sinh khu vực thao tác bằng cồn 70o và lấy môi trường để nguội
7


-

-

4.

Bước 5: Kiểm tra giống Lactobacillus acidophilus (kiểm tra trạng thái tế
bào, xác định mật độ bằng phương pháp đo độ đục)
Bước 6: Cấy giống Lactobacillus acidophilus từ môi trường MRS vào môi
trường lên men ở bình tam giác và fermenter với tỷ lệ 5%
Bước 7:
+ Đối với bình tam giác: nuôi trên máy lắc ở 35oC, tốc độ lắc 60 vòng/phút
+ Đối với fermenter: cài đặt nhiệt độ lên men ở 35oC, pH=6; Cài đặt tốc độ
bơm acid và base 0.5 m/s
Bước 8: Kiểm tra các thông số (2 giờ một lần, điểm cuối là 72 giờ): hút
20mL dịch lên men
+ Xác định nồng độ sinh khối ( Đo OD dịch lên men tại bước sóng 660
nm)
+ Xác định nồng độ đường (oBrix)
+ Đo pH
+ Xác định nồng độ acid lactic tạo thành theo phương pháp đô quang phổ
của Borshchevskaya và cộng sự (2016)
•
Xác định nồng độ acid lactic bằng phương pháp quang phổ
+ Cho 50l mẫu cần xác định nồng độ acid lactic vào ống nghiệm ( đối

với mẫu canh trường cần lọc bỏ sinh khối trước)
+ Bổ sung 2ml dung dịch FeCl3 0,3% vào ống nghiệm chứa mẫu , lắc
đều.
+ Đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% được dùng là trắng mẫu)
+ Dựa vào đường chuẩn tương quan giữa OD390 và nồng độ acid lactic
để xác định nồng độ acid lactic trong canh trường

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
8


5.1 Kết quả
Đường chuẩn acid lactic:

•

Ống thí nghiệm
Nồng độ acid lactic (g/L)
OD390

1
0.1
0.836

2
3
4
5
6
0.5

1
2
5
10
0.941 0.964 0.992 1.180 1.397

Lên men thu nhận acid lactic:

•

Ngày
30/10/2019

31/10/2019

Giờ
8h
11h
14h
16h
8h
11h
14h
16h

pH
3,5
3,5
5,21
5,31

5,05
5,04
5,7
5,06

o

Brix
2
3
2,5
2,4
2,8
2,5
2,4
2,3

OD600
1,024
1,06
0,981
1,32
1,771
1,798
1,319
1,398

OD390
1,178
1,673

1,999
1,999
1,999
1,999
1,999
1,999

Biểu đồ thể hiện sự thay đổi của các thông số khảo sát theo thời gian nuôi cấy
Nhận xét biểu đồ:
pH: tăng giảm không đồng đều theo thời gian lên men, pH tăng nhanh từ 3h đến
7h và giảm dần đến 28h, pH thấp nhất ở 3h và cao nhất ở 30h.
Độ Brix: tăng giảm không đồng đều theo thời gian lên men, cao nhất ở 3h và
thấp nhất ở thời điểm bắt đầu lên men, có xu hướng giảm dần trong khoảng 26
đến 32h.
Nồng độ acid lactic (OD 390): tăng dần trong 6h đầu, sau đó không thay đổi
trong suốt khoảng thời gian lên men.
Mật độ sinh khối (OD 600): tăng dần trong suốt khoảng thời gian lên men, cao
nhất ở 27h.


-

-

9


+

Quan sát hình thái vi khuẩn lactic (tiêu bản nhuộm gram)

Men đông khô:
Nhóm 1

+

Nhóm 2

+

Bình nhân giống
Nhóm 3

•

10


+

Nhóm 4

11


+

Nhóm 5

+

Dịch nuôi cấy trong fermenter
Nhóm 6

+

Nhóm 8

12



-


-

-

Nhận xét 3 loại tiêu bản:
Tiêu bản trên men đông khô: số lượng vi khuẩn rất ít, tế bào bắt màu hồng.
Tiêu bản trong bình nhân giống: số lượng vi khuẩn nhiều hơn trong dịch
men đông khô, một số tế bào bắt màu xanh tím, một số khác bắt màu hồng.
Tiêu bản trong bình lên men (fermenter): lượng vi khuẩn dày đặc trong dịch
mẫu, chủ yếu các tế bào bắt màu xanh tím.
Giải thích sự khác biệt giữa 3 loại tiêu bản:
Trong bình lên men, vi khuẩn được cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để sinh
trưởng và phát triển => nồng độ sinh khối tăng, mật độ tế bào nhiều. Tế bào
chủ yếu bắt màu xanh do Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn gram dương
có thành tế bào dày nên không bị ảnh hưởng bởi thuốc nhuộm.
Trong bình nhân giống: nguồn dinh dưỡng có thể chưa đủ để vi khuẩn phát

triển nên một số tế bào sẽ già và chết đi nhanh chóng, các tế bào già có thành
tế bào yếu và dễ bị phá vỡ bởi thuốc nhuộm nên sẽ dễ bắt màu hồng của
Saphain sau khi rửa trôi tím violet.

13


5.2 Thảo luận
1.

Giải thích sự biến động sinh khối vi khuẩn lactic, hàm lượng acid lactic,
nồng độ đường, pH theo thời gian nuôi cấy?

-

Trong 6h đầu lên men: nồng độ cơ chất giảm do vi khuẩn bắt đầu sử dụng
nguồn cơ chất cho nhu cầu sinh trưởng và ngừng sản xuất acid lactic dẫn đến
lượng acid lactic trong canh trường giảm (pH tăng). Vi khuẩn phát triển
nhanh làm tăng lượng sinh khối và giảm nồng độ cơ chất tương ứng.
Trong khoảng thời gian từ 6h đến 27h: sau khi cung cấp đủ lượng dinh
dưỡng cho nhu cầu sinh trưởng, vi khuẩn bắt đầu sản xuất acid lactic vào
môi trường khiến pH giảm dần và nồng độ acid lactic tăng đến cực đại.
Trong khoảng thời gian từ 27h đến 32h: khi vi khuẩn sử dụng gần hết lượng
cơ chất (nồng độ cơ chất giảm), quá trình sinh trưởng ngừng lại một số vi
khuẩn không đủ cơ chất để sử dụng sẽ chết đi dẫn đến nồng độ sinh khối
giảm dần, vi khuẩn ngừng sản xuất acid lactic => pH tăng, nồng độ acid
lactic không đổi.

-

-

2. Trình bày một số công nghệ thu nhận acid lactic được ứng dụng hiện nay.
Ứng dụng rộng rãi trong nhều lĩnh vực như: Nông nghiệp, công nghiệp và môi
trường, y dược và đặc biệt là trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm.

14