XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘT BIẾN Ở CÁC GEN NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LEUKEMIA CẤP DÒNG TỦY BẰNG KỸ THUẬT RT PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HÀ MẠNH QUYẾT

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘT BIẾN Ở CÁC GEN
NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LEUKEMIA CẤP
DÒNG TỦY BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HÀ MẠNH QUYẾT

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘT BIẾN Ở CÁC GEN
NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LEUKEMIA CẤP
DÒNG TỦY BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
TS. Dương Quốc Chính

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này em xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, Trưởng Bộ môn Di truyền học, trường Đại học
Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN. Người thầy đã dìu dắt và chia sẻ cho em những kiến thức
khoa học quý giá ngay từ những ngày đầu trong quá trình học tập và nghiên cứu.
TS. Dương Quốc Chính, Trưởng Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện
Huyết học - Truyền máu Trung ương. Người thầy đã tận tâm hướng đẫn, chỉ bảo
cho em những kiến thức, kỹ năng và phương pháp nghiên cứu khoa học quý giá
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Sau đại học, Khoa Sinh
học, Bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN đã giúp
đỡ em tận tình trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thùy Trang, ThS. Nguyễn Lê Anh,
ThS. Trần Tuấn Anh cùng tập thể cán bộ Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện
Huyết học - Truyền máu Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em
trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện các kỹ thuật của đề tài nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Trung tâm Huyết học - Truyền máu, đơn vị
Xét nghiệm Huyết học - Trung tâm Xét Nghiệm, bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ đã
tạo điều kiện sắp xếp công việc thuận lợi cho em trong quá trình hoàn thành khóa học.
Sau cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình, bạn bè, những
người đã luôn theo sát, quan tâm, động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc để
em yên tâm học tập, công tác và hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, tháng 12 năm 2018
Hà Mạnh Quyết

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là nghiên cứu do em tham gia thực hiện tại Khoa Di
truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và đã được
cho phép sử dụng để làm luận văn. Các số liệu trong luận văn là có thật, do em thu
thập và thực hiện một cách khoa học và chính xác.
Kết quả nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào khác.
Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích khoa học, không nhằm mục đích riêng nào khác.


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AML
cDNA
CML
DNA
DEPC
dNTP
ddNTP
EB
FAB
FLT3
ITD
MDS
NC
NST
NPM1
POS
PAS

RNA
RT-PCR
TKD
WHO
Wt

Leukemia cấp (Acute myelogenlous leukemia)
-complementary Deoxyribonucleic Acid
Chronic myeloid leukemia
Deoxyribonucleic Acid
Diethylpyrocarbonate
Deoxynucleoside triphosphate
Dideoxynucleoside triphosphate
Elution buffer
French - American - British
FMS - like tyrosine kinase 3
Internal tandem duplication
Myelodysplastic Syndrome
Negative
Nhiễn sắc thể
Nucleophosmine 1
Positive
Periodic - Acid - Shiff
Ribonucleic Acid
Reverse Transcriptase - Polymerasa Chain Reaction
Tyrosin kinase domain
World Health Organization
Kiểu dại

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................
1.1. Leukemia cấp dòng tủy ................................................................................
1.2. Lịch sử phát hiện leukemia cấp ....................................................................
1.3. Cơ chế bệnh sinh leukemia cấp .....................................................................
1.3.1. Sinh máu bình thường và leukemia cấp .....................................................
1.3.2. Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư ..........................
1.3.3. Cơ chế tổn thương ở mức độ phân tử dẫn đến leukemia cấp ....................
1.3.4. Một số nguyên nhân khác liên quan đến bệnh leukemia cấp .....................
1.4. Các phương pháp chẩn đoán leukemia cấp ...................................................
1.4.1. Phương pháp Hình thái học .......................................................................
1.4.2. Phương pháp Miễn dịch học ......................................................................
1.4.3. Phương pháp Di truyền tế bào và Sinh học phân tử ..................................
1.5. Phân loại leukemia cấp .................................................................................
1.5.1. Phân loại theo FAB (Pháp - Mỹ - Anh) .....................................................
1.5.2. Phân loại theo WHO ..................................................................................
1.6. Các đột biến gen trong leukemia cấp ...........................................................
1.6.1. Đột biến gen NPM1 ...................................................................................
1.6.2. Đột biến gen FLT3 .....................................................................................
1.6.3. Các loại đột biến khác ................................................................................
1.7. Một số kỹ thuật để phát hiện các đột biến gen trong leukemia cấp ..............
1.7.1. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) ...............................................
1.7.2. Kỹ thuật RT - PCR .....................................................................................
1.7.3. Kỹ thuật Nested PCR .................................................................................
1.7.4. Giải trình tự Sanger ....................................................................................
1.7.4. Giải trình tự thế hệ hai NGS ......................................................................
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............
2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................
2.2. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................

2.2.1. Hóa chất sinh phẩn .....................................................................................
2.2.2. Trang thiết bị, máy móc .............................................................................
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................................
2.3.2. Cách chọn mẫu ...........................................................................................
2.3.3. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................

1
3
3
3
4
4
5
6
7
8
8
12
12
13
13
14
15
15
17
20
21
21
22

23
23
24
25
25
25
25
25
26
26
26
27

2.3.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu .....................................................
2.4. Xử lý số liệu ..................................................................................................
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ..........................................................
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................
3.1. Hoàn thiện quy trình phát hiện đột biến FLT3 và NPM1..............................
3.1.1. Tách chiết RNA từ mẫu máu ngoại vi và dịch tủy xương .........................

28
34
34
35
35
35


3.1.2. Nhân bản đoạn gen chứa đột biến FLT3 - ITD ..........................................
3.1.3. Nhân bản đoạn gen chứa đột biến FLT3 - TKD ........................................

3.1.4. Nhân bản đoạn gen chứa đột biến NPM1-mutA ........................................
3.2. Đặc điểm của đột biến FLT3 và NPM1-mutA ..............................................
3.2.1. Tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi .................................................................
3.2.2. Tỷ lệ mắc bệnh AML theo giới .................................................................
3.2.3. Đặc điểm người bệnh có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 TKD theo nhóm tuổi ............................................................................................
3.2.4. Tỷ lệ xuất hiện các loại đột biến NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 TKD .....................................................................................................................
3.2.5. Mối liên quan giữa đột biến NPM1-mutA và FLT3 .................................
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................
PHỤ LỤC

35
39
42
45
45
46
47
48
49
51
52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Phân loại AML theo FAB 1986 ..............................................................
Bảng 2. Phân loại AML theo WHO 2008 ............................................................

13
14

Bảng 3. Các loại đột biến NPM1 trong AML ......................................................

15

Bảng 4. Thể tích các thành phần tổng hợp cDNA ...............................................

30

Bảng 5. Thành phần và thể tích master mix của phản ứng RT - PCR nhân đoạn 31
gen FLT3-ITD ......................................................................................................
Bảng 6. Thành phần và thể tích master mix của phản ứng RT - PCR nhân đoạn 32
gen FLT3-TKD và cắt sản phẩm PCR với EcoRV...............................................
Bảng 7. Thành phần và thể tích master mix của phản ứng RT - PCR nhân đoạn
gen
NPM1mutA ...................................................................................................
Bảng 8. Tỷ lệ mắc AML theo tuổi .......................................................................
Bảng 9. Tỷ lệ người bệnh có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 TKD theo nhóm
tuổi .............................................................................................
Bảng 10. Tỷ lệ các loại đột biến NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 - TKD ...........

33
45
47
48


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Hình ảnh leukemia cấp trên tiêu bản nhuộm giemsa ..............................
Hình 2. Hình ảnh leukemia cấp dương tính với Peroxydase ...............................

Hình 3. Hình ảnh leukemia cấp dương tính với Sudan B ....................................
Hình 4. Hình ảnh leukemia cấp dương tính với PAS ..........................................
Hình 5. Hình ảnh nhuộm Esterase đặc hiệu và không đặc hiệu trong leukemia
cấp ........................................................................................................................
Hình 6. Vị trí của gen NPM1 trên NST ...............................................................
Hình 7. Vị trí của gen FLT3 trên NST .................................................................
Hình 8. Cấu trúc của gen FLT3 ............................................................................
Hình 9. Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................
Hình 10. Sản phẩm FLT3-ITD được điện di trên gel agarose .............................
Hình 11. Hình ảnh điện di sản phẩm FLT3-ITD sau khi thay đổi nhiệt độ và
nồng độ mồi .........................................................................................................
Hình 12. Hình ảnh so sánh trình tự NGS và trình tự kiểu dại .............................
Hình 13. Sản phẩm FLT3-TKD trước (A) và sau khi được ủ với EcoRV (B)......
Hình 14. Sản phẩm FLT3-TKD trước (A) và sau khi thay đổi nhiệt độ ủ với
EcoRV (B) ............................................................................................................
Hình 15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR chứa đột biến NPM1-mutA ...............
Hình 16. Hình ảnh tối ưu nhiệt độ Tm mồi NPM1-mutA ....................................
Hình 17. Tỷ lệ mắc bệnh AML theo giới ............................................................
Hình 18. Tỷ lệ xuất hiện đột biến kép .................................................................

8
9
10
10
11
15
17
17
27
36

37
38
40
41
43
44
46
49


ĐẶT VẤN ĐỀ
Leukemia cấp là bệnh thường gặp nhất trong các bệnh về máu, tỷ lệ tử vong
cao. Các phương pháp chẩn đoán cổ điển như hình thái học tế bào, hóa học tế bào là
tiêu chuẩn không thể thiếu trong chẩn đoán leukemia. Tuy nhiên, phương pháp này
còn có một số hạn chế trong các trường hợp khó chẩn đoán và trong việc theo dõi
tiến triển bệnh.
Từ năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới đã đề xuất phân loại leukemia cấp dòng tủy
dựa trên những biến đổi di truyền. Một số gen đã được nghiên cứu và ghi nhận có vai
trò quan trọng trong quá trình điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh hiệu quả hơn [27].
Trong các nghiên cứu trên thế giới, đã xác định được các biến đổi trong vật
chất di truyền ở bệnh leukemia là: đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen. Qua nuôi
cấy tế bào, làm tiêu bản và xác định NST đồ (Karyotype), các nhà khoa học đã phát
hiện khoảng 55% người bệnh có đột biến NST, còn 45% số người bệnh có bộ NST
bình thường. Vì vậy, việc xác định các đột biến gen trên là cần thiết [20, 23].
Hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ở người bệnh mắc leukemia cấp có bộ
NST bình thường xảy ra ở 3 gen Nuleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine kinase 3
(FLT3) và CCAAT - enhancer binding protein alpha (CEBPA) [40].
Trong thời gian qua, việc chẩn đoán leukemia cấp bằng sinh học phân tử đã
có nhiều bước tiến vượt bậc, có nhiều kỹ thuật đã được nghiên cứu và ứng dụng cho
kết quả đáng tin cậy như: RT-PCR, Real Time PCR, giải trình tự Sanger, NGS...

trong đó có phương pháp RT-PCR là phương pháp đơn giản, hiệu quả được áp dụng
ngày càng rộng rãi trên Thế giới cũng như ở Việt Nam. Phương pháp này bổ sung,
hỗ trợ cho phương pháp hình thái học như: tăng tính đặc hiệu trong chẩn đoán, điều
trị cũng như tiên lượng bệnh.
Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về đột biến gen NPM1 và FLT3 ở người
bệnh leukemia cấp được tiến hành dưới nhiều góc độ khác nhau: nghiên cứu về tỷ lệ

9


đột biến, mối liên quan giữa các đột biến với lâm sàng. Nên nghiên cứu áp dụng các
kỹ thuật mới cho chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh là rất cần thiết.
Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với các mục tiêu sau:
1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT - PCR để xác định đột biến ở các gen
NPM1-mutA và FLT3 trong leukemia cấp dòng tủy.
2. Khảo sát tỷ lệ đột biến NPM1-mutA và FLT3 ở người bệnh leukemia cấp
dòng tủy được thu thập tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương trong
thời gian từ tháng 8/2017 đến tháng 7/2018.

10


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Leukemia cấp dòng tủy
Leukemia cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia - AML) là một bệnh máu
ác tính, đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy các tế bào non ác tính trong tủy xương
và ở máu ngoại vi. Những tế bào này lấn át và ức chế quá trình trưởng thành và phát
triển của các tế bào bình thường trong tủy xương [8].
Tỷ lệ tế bào non trong tủy để chẩn đoán leukemia cấp dòng tủy là 30% (theo

FAB) hoặc 20% (theo WHO 2008). Một số trường hợp có các bất thường di truyền
đặc hiệu thì tỷ lệ tế bào non ác tính không cần đạt tiêu chuẩn trên (theo WHO 2008)
[21, 52].
1.2. Lịch sử phát hiện leukemia cấp
Năm 1872, bác sỹ Velpeau thông báo ca bệnh đầu tiên. Ông ghi nhận máu
của bệnh nhân này giống “như cháo”, ông tiên đoán hiện tượng này là bạch cầu
nhiều trong máu người bệnh [10].
Năm 1856, nhà sinh lý bệnh người Đức Rudolf Virchow đã dùng kính hiển vi
quang học để soi tiêu bản máu của người bệnh và ông đã thấy bạch cầu ở những
người bệnh này tăng rất cao làm máu trắng như sữa. Virchow gọi bệnh này là
“Leukemia” (theo tiếng Hy lạp là bệnh máu trắng) [10].
Năm 1877, Nhờ vào phương pháp nhuộm tiêu bản máu, Paul Ehrlich đã phát
hiện được những dạng khác nhau của bạch cầu [10].
Năm 1879, Mosler là người đầu tiên đưa kỹ thuật xét nghiệm tủy xương để chẩn
đoán cho những người bệnh có triệu chứng thiếu máu và xuất huyết [5].
Năm 1889, Ebstein đã dùng thuật ngữ “acute leukemia” (leukemia cấp) để
chỉ tình trạng bệnh tiến triển cấp tính [6].

11


Năm 1900, Naegeli đã chia leukemia cấp thành dòng tủy (AML) và dòng
Lympho (ALL) [10].
Năm 1913, Schilling đã phát hiện bệnh tổn thương đơn dòng mono [10].
Năm 1957, Gillestad đã mô tả bệnh leukemia cấp tiền tủy bào lần đầu tiên [10].
Năm 1976, FAB đã đưa ra phân loại AML dựa vào hình thái học và hóa học
tế bào [4].
Năm 1986, FAB đã đưa ra chẩn đoán leukemia cấp khi tế bào non ác tính ≥
30% tế bào có nhân trong tủy [38].
Năm 2001, WHO đưa ra phân loại leukemia cấp để chẩn đoán xác định khi tế

bào non ác tính ≥ 20% tế bào có nhân trong tủy [52].
Năm 2008, WHO đã đưa ra phân loại mới dựa trên tổn thương gen để chẩn
đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng của bệnh [52].
1.3. Cơ chế bệnh sinh leukemia
1.3.1. Sinh máu bình thường và leukemia
Bằng các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro, người
ta phát hiện ra rằng tạo máu là một quá trình tăng sinh và biệt hóa các tế bào máu,
bắt nguồn từ tế bào gốc vạn năng tạo ra tế bào máu đa năng rồi tới tế bào đầu dòng
cho từng dòng [3].
Tế bào gốc được biệt hóa theo dòng nào là do nhu cầu của cơ thể thông qua
cơ chế điều khiển ngược mà đích tác động cuối cùng là gen có vai trò trong biệt
hóa. Khi có rối loạn một khâu nào đó trong dây truyền này sẽ dẫn đến sự tăng sinh
không kiểm soát được của tế bào hoặc làm tế bào ngừng trưởng thành nhưng vẫn
phân chia và dẫn đến leukemia cấp [6].
1.3.2. Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư
Có hai hệ thống gen với các chức năng khác nhau cùng phối hợp để kiểm
soát sự tăng sinh ác tính, duy trì sự sinh máu bình thường của tế bào và cơ thể:

12


- Các gen tiền ung thư (proto - oncogene): là các gen có vai trò trong quá trình tăng
sinh và biệt hóa tế bào. Sự ổn định tương đối về cấu trúc và chức năng của các gen
này giúp tế bào phát triển bình thường. Ngược lại, khi có rối loạn cấu trúc đáng kể
thì nó sẽ chuyển thành gen ung thư (oncogene), làm tăng biểu hiện protein và làm
tăng sinh tế bào mất kiểm soát, dẫn đến ung thư khi làm mất kiểm soát quá trình
phân bào và tạo ra các đặc tính ác tính [6].
Hoffbrand đã phân loại các gen ung thư theo các cách tác động của các
protein sản phẩm như sau:
+ Sản phẩm của gen ung thư là yếu tố kích thích tăng sinh bên ngoài. Điển hình

loại này là gen C-SIS: mã hóa chuỗi β của yếu tố kích thích phân chia tiểu cầu PDGF.
+ Sản phẩm gen ung thư là các protein có hoạt tính tyrosine kinase trên màng
tế bào: gồm các vị trí tiếp nhận yếu tố kích thích tăng trưởng. Điển hình là gen Fms:
mã hóa protein cấu tạo vị trí tiếp nhận của yếu tố kích thích tạo cụm tế bào mono.
+ Sản phẩm gen ung thư là các chất truyền thông tin trong tế bào. Các gen
N-Ras, H-Ras, K-Ras mã hóa protien Ras. Khi protein này gắn với GTP trong bào
tương thì giải phóng GDP và truyền đạt kích thích tế bào phân chia [16].
- Các gen ức chế khối u (Anti - oncogene: tumor suppressor genes): có vai trò ức chế
sự phát triển của khối u. Sự đột biến, sắp xếp lại hoặc chuyển đoạn làm bất hoạt các
gen này, mất khả năng ức chế sự tăng sinh ác tính. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các
gen này thường đóng vai trò trong sự tiến triển của bệnh từ âm ỉ đến toàn phát [44].
Có 3 gen quan trọng nhất, có tương tác ở mức phân tử sản phẩm có khả năng
16INK4A
gây bệnh là: Rb, P53, P
.
Sự hoạt hóa gen tiền ung thư và bất hoạt gen ức chế khối u làm tế bào tăng
sinh dễ dàng và không bị mất kiểm soát, ngăn cản sự biệt hóa và ngăn cản quá trình

13


chết theo chương trình dẫn đến các bệnh ác tính. Trong cơ thể, gen ung thư và gen
bình thường có thể tồn tại song hành, trong đó gen sinh ung thư là gen trội [17].
- Bên cạnh đó còn có hệ thống các gen sửa chữa DNA: tế bào phân chia liên tục để
đảm bảo và duy trì sự sống. Mỗi phân tử tế bào có khoảng 6 tỷ cặp bazơ nitơ được
tổng hợp, nên sai sót rất lớn. Song cơ thể có hệ thống sửa chữa sai sót đó. Hoạt
động này giảm hoặc mất đi do di truyền hay mắc phải sẽ làm cho các sai sót không
được sửa chữa trong đó có các sai sót gây hoạt hóa gen ung thư hay bất hoạt gen ức
chế khối u và dẫn đến ung thư [18].
1.3.3. Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến leukemia cấp

* Tổn thương gen truyền tín hiệu sinh tế bào
Những gen này truyền tín hiệu kích thích tăng sinh tế bào thông qua receptor
tyrosin kinase kích hoạt phosphoryl hóa làm cho tế bào tăng sinh không kiểm soát.
Các gen hoạt động theo con đường này là BCR - ABL, FLT3, c-Kit.
* Tổn thương các gen hoạt hóa sự sao chép
Các gen Ig Lympho B và gen receptor Lympho T; khi các tế bào B và T chưa
trưởng thành, thường có hiện tượng xoắn hai chuỗi đơn của DNA lại để tạo ra các
protein đa dạng, có khả năng gắn với protein lạ. Quá trình này dễ bị sai lạc và nếu
sai lạc xảy ra ở các gen tiền ung thư thì có thể dẫn đến tăng sinh ác tính [17].
* Tổn thương gen liên quan đến quá trình chết theo chương trình
Nhiều loại tế bào được lập trình bởi các gen đặc biệt để biệt hóa rồi chết sau một
thời gian sống nhất định. Khi các gen này bị tổn thương, tế bào tiếp tục được sinh ra
nhưng không già và chết đi như bình thường gây mất cân bằng.
Hai gen tổng hợp protein tyrosine kinase và protein P53 tổng hợp theo cơ chế
này [17].
* Hoạt hóa gen ung thư ở leukemia cấp

14


Có nhiều mối liên quan rõ ràng giữa sự hoạt hóa các gen hoặc sự ung thư bất
hoạt các gen ức chế khối u với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Nếu chỉ có sự hoạt
hóa của một gen ung thư thì chưa đủ điều kiện dẫn đến chuyển dạng ác tính. Cần có
sự phối hợp của nhiều gen ung thư hoặc sự biến đổi gen ức chế khối u mới làm các
tế bào bình thường chuyển thành ác tính.
Có 4 cơ chế dẫn đến chuyển dạng ác tính gồm [37]:
- Chuyển đoạn và cấu trúc lại NST:
Chuyển một đoạn của NST này tới NST khác tạo nên sự sắp xếp mới, tạo ra
gen lai mới, phiên mã một protein mới có hoạt tính tăng sinh tế bào.
- Đột biến điểm:

Là bất thường do thay đổi thành phần hoặc số lượng nucleotide trên DNA gồm
các dạng thêm bớt, thay thế hay đảo vị trí của một hay vài cặp nucleotide trên gen [38].
- Nhân lặp gen:
Có nhiều nghiên cứu cho thấy thừa NST số 8 sẽ thừa gen MYC và gây
leukemia cấp.
- Virus RNA, DNA gây ung thư:
Virus gây ung thư tìm cách gắn bộ gen vào vị trí các gen ung thư làm cho các
gen này hoạt động đẫn đến kích thích tế bào tăng sinh.
1.3.4. Một số nguyên nhân khác liên quan đến bệnh leukemia cấp
* Yếu tố di truyền
Yếu tố gia đình: Nghiên cứu của Phạm Quang Vinh cho thấy người bệnh và
con của người bệnh cùng mang một loại đột biến NST. Khả năng mắc bệnh của
những gia đình có người mắc ung thư cao gấp 3 lần so với gia đình không có người
bị bệnh [16].
Yếu tố di truyền: một số bệnh di truyền bẩn sinh như hội chứng Down,
Klinfelter... làm tăng nguy cơ mắc leukemia.

15


* Yếu tố môi trường
Tiếp xúc với hóa chất độc hại như thuốc trừ sâu, benzen, ethidium bromide
và các nguồn phóng xạ... làm tăng nguy cơ mắc leukemia.
* Virus
Một số virus gây ung thư ở người nhưng chưa rõ ràng như EBV gây ung thư
vòng họng, HPV gây ung thư tử cung, HTLV 1, 2 gây leukemia tế bào lympho T [45].
1.4. Các phương pháp chẩn đoán leukemia cấp
1.4.1. Phương pháp Hình thái học
* Phân loại leukemia cấp theo phương pháp hình thái học
Bằng phương pháp nhuộn giemsa tiêu bản máu ngoại vi và dịch tủy xương

sau đó dựa vào hình thái tế bào để xác định các loại tế bào trong đó có các tế bào
non ác tính.
Phương pháp hình thái học là phương pháp đầu tiên và căn bản nhất để chẩn
đoán và phân loại leukemia cấp nói chung và leukemia cấp dòng tủy nói riêng từ
nhiều thập kỷ nay.

Hình 1. Hình ảnh leukemia cấp trên tiêu bản nhuộm giemsa [10]

16


* Phân loại leukemia cấp theo phương pháp nhuộm hóa học tế bào
Phương pháp nhuộm hóa học tế bào đã từ lâu được sử dụng để hỗ trợ phương
pháp hình thái học trong chẩn đoán xác định nguồn gốc và giai đoạn leukemia cấp.
Một số phương pháp nhuộm hóa học tế bào chủ yếu được áp dụng trong thực
hành lâm sàng:
Nhuộm Peroxydase
Dựa trên nguyên lý là các tế bào dòng tủy và mono có chứa các men
Myeloperoxydase (MPO) có tác dụng oxy hóa các cơ chất như phenol, một số acid
thơm và amino acid. Phản ứng thường dương tính với các tế bào dòng hạt và mức độ
tăng lên tùy theo giai đoạn trưởng thành. Các tế bào dòng mono có thể dương tính ở
mức độ thấp hơn còn dòng lympho hay nguyên hồng cầu thì hoàn toàn âm tính [10].

Hình 2. Hình ảnh leukemia cấp dương tính với Peroxydase [10]
Nhuộm Sudan B

17


Sudan B là chất tan trong lipid, nhằm phát hiện các hạt lipid trong tế bào. Kết

quả nhuộm Sudan B dòng bạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương
tính ở các mức độ khác nhau còn dòng lympho thì âm tính. Trên cùng một tế bào thì
mức độ dương tính của Sudan B thường mạnh hơn MPO nên thường có sự kết hợp
giữa 2 phương pháp [10].

Hình 3. Hình ảnh leukemia cấp dương tính với Sudan B [10]
Nhuộm PAS
Phản ứng PAS dương tính chỉ ra sự có mặt của glycogen, các tế bào máu có sự
phân bố glycogen khác nhau trong bào tương. Nhuộm PAS thường cho kết quả âm
tính với các dòng tế bào hạt và mono và dương tính mạnh với dòng lympho [28].

18


Hình 4. Hình ảnh leukemia cấp dương tính với PAS [28]
Nhuộm Esterase
Esterase không đặc hiệu được sử dụng trong chẩn đoán leukemia cấp dòng
mono vì các tế bào dòng mono phản ứng mạnh và bị ức chế bởi NaF. Phương pháp
nhuộm Esterase đặc hiệu để phân biệt tế bào dòng mono và dòng bạch cầu hạt, dòng
bạch cầu hạt sẽ cho phản ứng dương tính. Phương pháp này cho phản ứng âm tính
với dòng mono [28].

Hình 5. Hình ảnh nhuộm Esterase đặc hiệu và không đặc hiệu trong
leukemia cấp [28]

19


1.4.2. Phương pháp Miễn dịch học
Phương pháp phân loại miễn dịch đã được nghiên cứu áp dụng trong

leukemia cấp từ năm 1970. Từ đó đến nay phương pháp này không ngừng được cải
tiến, từ phân loại miễn dịch trên kính hiển vi huỳnh quang đến phân loại bằng máy
đếm tế bào dòng chảy tự động [11].
Phương pháp hóa mô miễn dịch
Là một trong các phương pháp được áp dụng chủ yếu trong phân loại
leukemia cấp dòng tủy cũng như các bệnh lý ác tính huyết học khác. Phương pháp
này dựa trên cơ sở các kháng thể đơn dòng gắn chất nhuộm liên kết đặc hiệu với
kháng nguyên trên bề mặt tế bào để xác định nguồn gốc tế bào trên kính hiển vi
quang học [11].
Phân loại miễn dịch bằng kỹ thuật hiển vi huỳnh quang
Kỹ thuật này dựa trên phản ứng kháng nguyên - kháng thể để phát hiện các
kháng nguyên của dòng tế bào khi chúng kết hợp đặc hiệu với kháng thể đơn dòng
có gắn huỳnh quang. Mức độ phản ứng sẽ tương ứng với mức độ phát huỳnh quang
được đọc trên kính hiển vi huỳnh quang. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược
điểm là phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật, người đọc, phân tích đơn lẻ từng dấu ấn [12].
Phân loại miễn dịch bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy
Là phương pháp đo một số lượng lớn tế bào khi chúng đi qua một kênh đơn
(theo dòng) trong một cột chất lỏng và làm ngắt quãng chùm tia laser. Phương pháp
này vừa có thể định lượng và định tính với nhiều quần thể tế bào trong mẫu phân
tích [12].
1.4.3. Phương pháp Di truyền tế bào và Sinh học phân tử
Các tổn thương di truyền trong tế bào gốc tạo máu làm tăng sinh và tích tụ tế
bào non gây lấn át các dòng tế bào tạo máu bình thường gây bệnh leukemia cấp. Biểu
hiện bất thường di truyền trong leukemia cấp rất đa dạng gồm bất thường về cấu trúc

20


và số lượng phân tử. Những bất thường NST và bất thường gen đặc trưng rất có ý
nghĩa trong chẩn đoán thể bệnh, lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh.

Một số bất thường di truyền hay gặp trong leukemia cấp dòng tủy là t(15;17),
t(8;21), t(9;11), t(6;9), inv(16), del (7), đột biến gen NPM1, FLT3, CEBPA... [1,15].
Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán
leukemia cấp như: PCR, Real time PCR, giải trình tự Sanger, NGS...
Ngày nay, di truyền tế bào đang được áp dụng rất có hiệu quả trong việc tiên
lượng cũng như theo dõi bệnh tồn dư tối thiểu.
1.5. Phân loại leukemia cấp
1.5.1. Phân loại theo FAB
Từ nhiều năm nay, các nhà khoa học đã thống nhất đưa ra nhiều hệ thống
phân loại để giúp chẩn đoán chính xác các thể bệnh leukemia cấp, trong đó hệ thống
phân loại FAB (1976) được áp dụng rộng rãi hơn cả. Mặc dù sau này, có nhiều hệ
thống phân loại đã được cải tiến và phát triển thêm, nhưng hệ thống FAB (1976)
vẫn đóng vai trò quan trọng, bởi tính đơn giản, thuận tiện, dễ áp dụng rộng rãi ở
những khu vực có trình độ khoa học kỹ thuật còn đang phát triển như Việt Nam.
Tiêu chuẩn phân loại FAB (1976) tỷ lệ 30% tế bào non ác tính trong tủy xương
là giới hạn để xác định leukemia cấp, được chia thành 6 dưới nhóm (từ M1 đến M6).
Theo phân loại FAB cải tiến 1986, có 8 dưới nhóm AML (từ M0 đến M7). Các
nhóm này đại diện cho các mức độ biệt hóa khác nhau của tế bào ác tính dòng tủy.

21


Bảng 1. Phân loại AML theo FAB 1986 [21]
Thể
M0
M1
M2
M3
M3h
M3v

M4
M4eo
M5
M5a
M5b
M6
M6a
M6b
M7

Mức độ biệt hóa
Leukemia cấp dòng tủy biệt hóa tối thiểu
Leukemia cấp dòng tủy kém biệt hóa
Leukemia cấp dòng tủy có biệt hóa
Leukemia cấp tiền tủy bào
Leukemia cấp tiền tủy bào giầu hạt
Leukemia cấp tiền tủy bào vi hạt
Leukemia cấp dòng tủy - mono
Leukemia cấp dòng tủy - mono có tăng bạch cầu ưa acid
Leukemia cấp dòng mono
Leukemia cấp dòng mono kém biệt hóa
Leukemia cấp dòng mono có biệt hóa
Leukemia cấp dòng hồng cầu
Leukemia cấp dòng tủy có rối loạn sinh dòng hồng cầu
Leukemia cấp dòng hồng bạch cầu
Leukemia cấp dòng mẫu tiểu cầu

1.5.2. Phân loại theo WHO
Năm 2001, WHO đã đưa ra bảng xếp loại cho AML dựa vào đặc điểm tế bào,
miễn dịch và bất thường di truyền ở mức độ NST và gen.

Năm 2008, WHO đưa ra bảng phân loại mới về AML được cập nhật bổ sung,
trong đó một số gen được đưa vào để xác định AML.

Bảng 2. Phân loại AML theo WHO 2008 [52]
Leukemia cấp dòng tủy và các bất thường di truyền
Leukemia cấp dòng tủy với t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1
Leukemia cấp dòng tủy với inv(16)(p13.1q22) hoặc t(16;16)(p13.1;q22); CBFBMYH11
Leukemia cấp tiền tủy bào với t(15;17)(q22;q12); PML-RARA

22


Leukemia cấp dòng tủy với t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL
Leukemia cấp dòng tủy với t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214
Leukemia cấp dòng tủy với inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1
Leukemia cấp dòng tủy (mẫu tiểu cầu) với t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1
Leukemia cấp dòng tủy với đột biến gen NPM1
Leukemia cấp dòng tủy với đột biến gen CEBPA
WHO đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán AML với tỷ lệ 20% tế bào non ác tính
trong tủy xương.
1.6. Các đột biến gen trong leukemia cấp
1.6.1. Đột biến gen NPM1
a. Cấu trúc và chức năng
Gen NPM1 nằm trên NST số 5q35.1 bao gồm 12 exon mã hóa 259 acid amin.

Hình 6. Vị trí của gen NPM1 trên NST [58]
Đột biến NPM1 lần đầu tiên được báo cáo bởi Falini và cộng sự năm 2005,
chủ yếu bao gồm chèn nucleotide nhỏ/xóa. Gen NPM1 tham gia vào các quá trình
tăng sinh tế bào, lắp ráp histon, tổng hợp protein. Ở tế bào bình thường, NPM1 là 1
phosphoprotein trong nhân tế bào và hoạt động như một yếu tố điều hòa chu trình tế

bào và ức chế khối u P53 / TP53 và ARF [58].
Đột biến NPM1 được tìm thấy ở exon 12 tại đầu cuối COOH. Các đột biến
gen NPM1 tạo ra một protein không nằm trong nhân tế bào mà nằm trong tế bào
chất. Những đột biến này tham gia vào quá trình tạo bạch cầu và chiếm khoảng 35%
- 60% của các trường hợp AML có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường [24, 54].
Có sáu loại biến thể đột biến NPM1 đã được xác định (bảng 3):
Bảng 3. Các loại đột biến NPM1 trong AML [29]

23


Các loại đột biến
Đột biến A
Đột biến B
Đột biến D
Đột biến G
Đột biến I
Đột biến J
Đột biến K
Khác

Chèn Nucleotid
c.860_863dupTCTG
c.862_863insCATG
c.863_864insCCTG
c.863_864insTTTG
c.863_864inTAAG
c.863_864insCTTG
c.863_864insTATG

Tỷ lệ
(%)
~72
~12
~4
<1
<1
<1
<1
<1

Trong đó, đột biến NPM1-mutA (do sự lặp lại của 4 nucleotide TCTG) là
biến thể phổ biến nhất, gặp trong khoảng 72% của cả các biến đổi của NPM1 [29].
b. Ý nghĩa của đột biến gen NPM1-mutA trong lâm sàng
Cho đến nay, đột biến gen NPM1-mutA là biến đổi về di truyền được biết đến
nhiều nhất trong AML. Hơn thế nữa, những thay đổi này đã được chứng minh là có
tiên lượng tốt bởi vì người bệnh có các biến đổi này thường đáp ứng tốt hơn với hóa
trị. Việc xác định đột biến NPM1-mutA hiện nay được kiến nghị để đưa vào các đặc
điểm di truyền thường quy của AML [35].
Đột biến gen NPM1-mutA thường phối hợp với một số đột biến gen khác: gen
NPM1-mutA thường phối hợp với gen FLT3 trong khoảng 40% các trường hợp, khoảng
60% kèm đột biến FLT3 - ITD, có thể đi kèm với một số bất thường NST hay gặp
dub(4), del(Y), del (9q) và một số ít t(8,21), inv(16), t(15,17), rất hiếm xuất hiện cùng
gen CEBPA. Một số tác giả cho rằng nhóm người bệnh có đột biến gen NPM1-mutA có
tiên lượng tốt hơn khi không xuất hiện đột biến gen FLT3 - ITD [27].
Với tỷ lệ cao và ổn định trong quá trình từ khi chẩn đoán cho đến khi tái
phát, đột biến NPM1-mutA có thể được sử dụng như một chỉ thị phân tử lý tưởng
cho việc theo dõi và đánh giá tồn dư tối thiểu (MRD), đặc biệt là cho người bệnh
AML có bộ NST bình thường [35].
Nhiều nghiên cứu đã báo cáo tiên lượng ý nghĩa của trạng thái đột biến

NPM1-mutA trong AML [21, 32, 42, 51].

24


1.6.2. Đột biến gen FLT3
a. Cấu trúc và chức năng
Gen FLT3 nằm trên NST số 13q12 có 24 exon mã hóa tổng hợp protein
màng tế bào gồm 993 acid amin gồm 2 phần: phần glycosyl hóa có khối lượng phân
tử 158 - 160 kd, phần bị glycosyl hóa với khối lượng phân tử 130 - 143 kd [32].

Hình 7. Vị trí của gen FLT3 trên NST [32]
Gen FLT3 mã hóa cho protein Fms-Like Tyrosine kinase-3, thuộc thụ thể
Tyrosine kinase phân lớp thứ 3, có trọng lượng khoảng 160 Da. Phân tử protein FLT3
gồm 5 thành phần cấu trúc: globulin miễn dịch ngoại bào (EC), cấu trúc xuyên màng
(TM), cấu trúc cận màng (JM), 2 cấu trúc tyrosine kinase (TK/TKD), phần liên kết
với đoạn chèn tyrosine-kinase (TKI) (hình 1.8).

Hình 8. Cấu trúc của gen FLT3 [32]
Bình thường FLT3 ở dạng đơn phân, khi phân tử ligand của FLT3 liên kết với
thụ thể làm cho protein này hoạt động tạo nên dimer hóa thụ thể. Sự dimer hóa này
dẫn đến sự phosphoryl hóa vùng tyrosine-kinase, lúc này thụ thể hoạt hóa sẽ kích
thích con đường truyền tín hiệu trong tế bào, từ đó điều khiển quá trình sinh học
khác liên quan đến sự tăng trưởng và phân chia của tế bào [32, 33]. Các đột biến

25