PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH TRONG MỘT SỐ CÂY THUỐC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRONG MỘT SỐ CÂY THUỐC

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học
(Chương trình đào tạo tài năng)

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRONG MỘT SỐ CÂY THUỐC

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học
(Chương trình đào tạo tài năng)

Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS
Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện và tận
tình chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Đồng thời em cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các anh chị, bạn
bè trong trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội đã ủng hộ, giúp đỡ để em hoàn thành tốt được đề tài;
các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm huyết để giảng dạy, trang bị kiến thức
cho chúng em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Viện Ứng dụng Công nghệ;
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học; Viện Hóa học Các hợp chất Thiên
nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Việt Nam; phòng Thí nghiệm Phân
tích Môi trường, Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới toàn thể
người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm, lo lắng, chăm sóc cho
em trong suốt thời gian thực tập. Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, song do thời
gian và kiến thức còn hạn hẹp nên bài viết của em không thể tránh được những
thiếu sót. Em rất mong sẽ nhận được sự đóng góp ý kiến từ phía thầy giáo, cô
giáo cùng toàn thể các bạn để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cám ơn!
Hà Nội, ngày 5 tháng Sáu năm 2019
SINH VIÊN


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

TỔNG QUAN........................................................................... 2
1.1. Tổng quan về kháng sinh ...................................................................... 2
1.1.1. Lược sử về kháng sinh....................................................................... 2
1.1.2. Cơ chế tác động của kháng sinh ........................................................ 3
1.1.3. Nguồn gốc và phương pháp sản xuất kháng sinh.............................. 3
1.2. Tổng quan về kháng kháng sinh ........................................................... 4
1.2.1. Giới thiệu về kháng kháng sinh ......................................................... 4
1.2.2. Lược sử về hiện tượng kháng kháng sinh ......................................... 4
1.2.3. Nguyên nhân và hậu quả của hiện tượng kháng kháng sinh ............. 6
1.3. Tổng quan về xạ khuẩn......................................................................... 7
1.3.1. Giới thiệu chung ................................................................................ 7
1.3.2. Hình thái đặc trưng ............................................................................ 7
1.3.3. Ứng dụng của xạ khuẩn ..................................................................... 9
1.3.4. Khả năng gây bệnh của xạ khuẩn .................................................... 10
1.4. Giới thiệu về VSV nội sinh và xạ khuẩn nội sinh .............................. 10
1.4.1. Giới thiệu chung về VSV nội sinh .................................................. 10
1.4.2. Phân lập VSV nội sinh .................................................................... 11
1.4.3. Giới thiệu xạ khuẩn nội sinh ........................................................... 11
1.5. Thực trạng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh .......................................... 12
VẬT TƯ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 13
2.1. Thời gian và đối tượng: ...................................................................... 13
2.2. Vật tư: ................................................................................................. 13


2.2.1. Chủng VSV: .................................................................................... 13
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất: ............................................................. 14
2.2.3. Môi trường:...................................................................................... 15
2.2.3.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn nội sinh: ......................................... 15
2.2.3.2. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: ............................................ 15
2.2.3.3. Các môi trường làm giàu xạ khuẩn: ................................................ 16

2.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................. 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 17
2.4.1. Thu mẫu và tiền xử lý...................................................................... 17
2.4.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh .............................................................. 17
2.4.3. Sàng lọc xạ khuẩn có hoạt tính........................................................ 18
2.4.4. Định danh chủng xạ khuẩn có hoạt tính .......................................... 18
2.4.5. Khảo sát các đặc tính hình thái, sinh hóa ........................................ 19
2.4.5.1. Mô tả hình thái xạ khuẩn ................................................................ 19
2.4.5.2. Nhuộm Gram................................................................................... 19
2.4.5.3. Quan sát cuống sinh bào tử ............................................................. 19
2.4.5.4. Quan sát khả năng hình thành melanin ........................................... 20
2.4.5.5. Thử hoạt tính Catalase .................................................................... 20
2.4.5.6. Thử khả năng chịu muối ................................................................. 20
2.4.5.7. Thử khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................ 20
2.4.5.8. Khảo sát khả năng kháng kháng sinh.............................................. 21
2.4.6. Lựa chọn điều kiện làm giàu thích hợp ........................................... 21
2.4.7. Khảo sát khả năng ức chế các chủng kháng kháng sinh của các chủng
xạ khuẩn ....................................................................................................... 22
2.4.8. Khảo sát độ bền nhiệt của hoạt chất kháng sinh của các chủng xạ
khuẩn… ........................................................................................................ 22


2.4.9. Tách chiết và tinh sạch hoạt chất kháng sinh từ xạ khuẩn .............. 22
2.4.9.1. Tách chiết hoạt chất kháng sinh ...................................................... 22
2.4.9.2. Tinh sạch hoạt chất kháng sinh ....................................................... 23
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................... 24
3.1. So sánh các phương pháp phân lập xạ khuẩn ..................................... 24
3.2. Kết quả phân lập xạ khuẩn ................................................................. 24
3.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính sơ bộ ........................................................ 28
3.4. Kết quả định danh các chủng có hoạt tính.......................................... 28

3.5. Kết quả khảo sát các đặc tính hình thái, sinh hóa .............................. 29
3.5.1. Mô tả hình thái các chủng xạ khuẩn................................................ 29
3.5.2. Kết quả nhuộm Gram ...................................................................... 32
3.5.3. Hình ảnh cuống sinh bào tử các chủng xạ khuẩn ............................ 33
3.5.4. Khảo sát khả năng hình thành melanin ........................................... 34
3.5.5. Khảo sát hoạt tính catalase .............................................................. 34
3.5.6. Khảo sát khả năng chịu muối .......................................................... 34
3.5.7. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ..................................... 34
3.6. Kết quả lựa chọn điều kiện làm giàu thích hợp .................................. 35
3.7. Kết quả khả năng ức chế các chủng kháng kháng sinh của các chủng xạ
khuẩn ............................................................................................................ 36
3.8. Kết quả hoạt tính kháng VSV của chủng S. cyaneogriseus SĐ14 ..... 37
3.9. Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của chủng S. cyaneogriseus
SD14............................................................................................................. 39
3.10. Khảo sát độ bền nhiệt của hoạt chất kháng sinh từ chủng S.
cyaneogriseus SĐ14..................................................................................... 39
3.11.

Tách chiết hoạt chất kháng sinh từ chủng S. cyaneogriseus SD14 . 39

3.12.

Bàn luận kết quả .............................................................................. 41


3.12.1.

Lựa chọn đối tượng thu mẫu ........................................................ 41

3.12.2.

Cải tiến quy trình phân lập xạ khuẩn nội sinh.............................. 41

3.12.3.

Phân lập xạ khuẩn nội sinh........................................................... 42

3.12.4.

Khảo sát hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn ............... 43

3.12.5.

Nghiên cứu và tách chiết hoạt chất kháng sinh ............................ 44

3.12.6.

Kết luận ........................................................................................ 45

3.12.7.

Dự định và kiến nghị .................................................................... 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 46
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 51


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Cụm từ đầy đủ

ATCC

American Type Culture Collection

BHI

Brain Heart Infusion

CRAB

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

EtOAct

Ethyl acetate

HBUM

Heibei University Microorganism Collection

ICTA

The Imperial College of Tropical Agriculture
Collection

ISP4/5/6

International Streptomyces Project
Medium No.4/No.5/No.6

JCM

Japan Collection of Microorganisms

LB

Luria Bertani Broth

MDR/XDR/PDR

Đa kháng thuốc/Đa kháng thuốc phổ rộng/Siêu
kháng thuốc

MRSA

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

NB1

Nutrient Broth No.1

NBRC

NITE Biological Resource Center

SCB

Starch Casein Broth

VSV

Vi sinh vật

YIM 312

Yunnan Institute of Microbiology
Medium No.312


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Những diễn biến chính của hiện tượng kháng kháng sinh.................. 5
Hình 2: Một số hình thái cuống bào tử và bào tử xạ khuẩn điển hình ............ 8
Hình 3: Ảnh các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây thương lục ....................... 25
Hình 4: Ảnh các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây ngọc trai.......................... 25
Hình 5: Ảnh các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây củ ráy .............................. 26
Hình 6: Ảnh các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây khôi đốm ......................... 26
Hình 7: Ảnh các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây chặc chìu ......................... 27
Hình 8: Ảnh các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây bán hạ ............................. 27
Hình 9: Ảnh các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây húng chanh ..................... 27
Hình 10: Hình ảnh xạ khuẩn khi nuôi lắc với môi trường Gauze-1 lỏng ...... 31
Hình 11: Hình ảnh khuẩn lạc trên thạch Gauze-1 của các chủng xạ khuẩn . 31
Hình 12: Ảnh nhuộm Gram của các chủng xạ khuẩn được chọn .................. 32
Hình 13: Ảnh chụp hiển vi cuống bào tử của ba chủng xạ khuẩn ................. 33
Hình 14: Ảnh SEM cuống bào tử của các chủng xạ khuẩn ........................... 33
Hình 15: Hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi lắc các chủng xạ khuẩn với các
môi trường và khoảng thời gian khác nhau .................................................... 36
Hình 16: Ảnh khả năng kháng các chủng vi khuẩn kháng carbapenem của

chủng SD14 ..................................................................................................... 38
Hình 17: Phổ UV-Vis của mẫu đông khô dịch nuôi lắc chủng SD14 ............ 40


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các môi trường làm giàu xạ khuẩn được sử dụng trong đề tài........ 16
Bảng 2: So sánh sơ bộ số chủng VSV nội sinh phân lập được từ các phương
pháp ................................................................................................................. 24
Bảng 3: Kết quả sàng lọc của 6 chủng xạ khuẩn có hoạt tính phân lập từ các
mẫu cây thuốc.................................................................................................. 28
Bảng 4: Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn có hoạt tính........................ 29
Bảng 5: Kết quả đăng ký trên NCBI Genbank trình tự các chủng có hoạt tính
......................................................................................................................... 29
Bảng 6: Hình thái khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn được quan tâm.......... 30
Bảng 7: Khả năng chịu muối của các chủng xạ khuẩn .................................. 34
Bảng 8: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn ............. 35
Bảng 9: Đường kính vòng kháng các chủng CRAB và MRSA của các chủng xạ
khuẩn ............................................................................................................... 37
Bảng 10: Đường kính vòng kháng của chủng SĐ14 với nhiều VSV gây bệnh
......................................................................................................................... 37
Bảng 11: Khả năng kháng năm loại kháng sinh của chủng SD14 ................. 39
Bảng 12: Độ bền nhiệt của hoạt chất kháng sinh ở các nhiệt độ khác nhau . 39
Bảng 13: Khả năng tách chiết hoạt chất kháng sinh bằng các dung môi ...... 39
Bảng 14: Khả năng hòa tan của hoạt chất trong một số dung môi ............... 40


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

MỞ ĐẦU
Hiện nay, kháng kháng sinh được coi là một trong những vấn đề toàn

cầu, ảnh hưởng nghiêm trọng tới công tác điều trị các bệnh nhiễm trùng cho
con người, cây trồng và vật nuôi. Lạm dụng và sử dụng sai cách kháng sinh
trên người và động vật là nguyên nhân chính cho sự xuất hiện và gia tăng nhanh
chóng các chủng VSV kháng kháng sinh và đa kháng kháng sinh. Trong khi
đó, quá trình phát hiện các hợp chất kháng sinh đã bị chững lại suốt nhiều năm
qua và hiện đang không thể bắt kịp tốc độ phát triển của VSV kháng thuốc.
Trong bối cảnh đó, việc tìm kiếm các hoạt chất mới có hoạt tính kháng
khuẩn đang trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết. Đến nay đa số các hợp chất có
hoạt tính sinh học nói chung và chất kháng sinh nói riêng đã được tìm ra có
nguồn gốc từ tự nhiên, trong số đó phải kể đến các sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp của VSV. Đặc biệt, phần lớn các nhóm hợp chất kháng sinh được tìm ra
cho tới nay đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn, trong đó chủ yếu bởi chi
Streptomyces. Bên cạnh các nguồn phân lập xạ khuẩn truyền thống như lòng
đất, hải dương, thực vật nói chung và cây thuốc nói riêng sở hữu hệ sinh thái
VSV nội sinh rất đa dạng. Như một hệ quả của sự chung sống dài giữa các xạ
khuẩn nội sinh và các cây thuốc, cũng là nguồn của nhiều hoạt chất sinh học
quý, các xạ khuẩn nội sinh trong cây thuốc là nguồn hoạt chất kháng sinh mới
đầy tiềm năng và có thể trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng.
Xuất phát từ yêu cầu cấp bách và những lợi thế trên, tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Phân lập và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ
khuẩn nội sinh trong một số cây thuốc”. Mục tiêu của đề tài là:
- Sàng lọc được các chủng xạ khuẩn nội sinh trong một số cây thuốc
truyền thống của Việt Nam có hoạt tính kháng sinh đặc biệt có khả
năng chống lại một số chủng vi khuẩn đã kháng thuốc.
- Nghiên cứu được một số đặc điểm sinh học, đặc điểm phân loại và
khả năng kháng kháng sinh của các chủng đã tuyển chọn

1

Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về kháng sinh

1.1.1. Lược sử về kháng sinh
Theo WHO, kháng sinh là những loại thuốc được sử dụng để phòng ngừa
và điều trị sự xâm nhiễm của vi khuẩn [3]. Về bản chất, kháng sinh là chất được
chiết xuất từ VSV hoặc được tổng hợp hóa học, với liều rất nhỏ có tác dụng ức
chế hoặc giết chết VSV, có thể dùng tại chỗ hoặc toàn thân, ít độc hoặc không
độc cho cơ thể.
Thuật ngữ “kháng sinh” (antibiotics) được sử dụng lần đầu bởi Selman
Waksman trong một bài báo vào năm 1941 [51], tuy nhiên lịch sử của kháng
sinh lại bắt đầu từ trước đó vài thập kỷ. Đầu thế kỷ XX, Paul Ehrlich để cập tới
việc sử dụng “viên đạn thần” có thể nhắm đặc hiệu vào những VSV gây bệnh
mà không ảnh hưởng tới vật chủ. Năm 1910, ông phát hiện ra một chất hóa học
gọi là arsphenamine có thể điều trị hiệu quả bệnh giang mai. Đó được coi là
chất kháng sinh hiện đại đầu tiên được phát hiện [13].
“Thời đại kháng sinh” thực sự bắt đầu vào ngày 3/9/1928, khi Alexander
Fleming phát hiện ra loại nấm mốc Penicillium notatum có thể ức chế sinh
trưởng của một loại Staphylococcus, hoạt chất từ nấm mốc đó được công bố
vào năm 1929 với tên Penicillin [14]. Phương pháp tinh sạch lượng lớn
penicillin được công bố năm 1940 [9]. Penicillin đã được sử dụng rộng rãi từ
năm 1944 để điều trị nhiễm trùng trong Thế chiến II, và được gọi là “phương
thuốc kỳ diệu”.
Thập niên 50 được coi là thời hoàng kim của kháng sinh với hơn một
nửa các chất kháng sinh sử dụng rộng rãi ngày nay được phát hiện trong khoảng
thời gian này [11], song song với đó là sự ra đời hoàn thiện của các công nghệ

lên men sản xuất kháng sinh. Tốc độ phát hiện các nhóm kháng sinh mới giảm
dần từ nửa sau thập niên 60, chấm dứt thời hoàng kim của kháng sinh. Nhóm
kháng sinh cuối cùng, lipopeptides, được phát hiện vào năm 1987; và kể từ đó
cho tới hiện tại, thế giới vẫn chưa có thêm được một nhóm kháng sinh mới nào
khác.

2


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

1.1.2. Cơ chế tác động của kháng sinh
Hoạt tính kháng khuẩn của hầu hết các loại kháng sinh đều nhắm tới các
yếu tố đặc thù trong cấu trúc hay chức năng sống của vi khuẩn. Cơ chế tác động
của kháng sinh gồm có:
- Ức chế tổng hợp thành tế bào (nhóm glycopeptide, nhóm β-lactam).
- Phá vỡ cấu trúc hoặc chức năng của màng tế bào (daptomycin, nhóm
polymyxin).
- Ức chế tổng hợp RNA hoặc DNA (rifampicin, trimethoprim, nhóm
quinolone, nhóm nitroimidazole, nhóm sulfoamide).
- Ức chế tổng hợp protein (streptogramin, lincosamide, macrolide,
tetracycline, aminoside, fusidic acid, phenicol).
1.1.3. Nguồn gốc và phương pháp sản xuất kháng sinh
Phần lớn các chất kháng sinh đã được phát hiện đều có nguồn gốc tự
nhiên từ các VSV. Các VSV sinh kháng sinh từng biết bao gồm nấm
(Penicillium, Trichoderma, Cephalosporium, Tolypocladium), xạ khuẩn
(Streptomyces, Amycolatopsis, Micromonosporaceae) và một số vi khuẩn khác
(Bacillus, Pseudomonas).
Những kháng sinh tự nhiên là một phần trong những sản phẩm chuyển
hóa thứ cấp được VSV sản sinh ra để ức chế của những VSV khác, ví dụ như

penicillin, cephalosporin C, streptomycin. Kháng sinh tự nhiên được sản xuất
công nghiệp bằng cách lên men, trong đó VSV sản xuất được nuôi trong các
bình chứa lớn (từ 100,000 đến 150,000 lít hoặc hơn) chứa môi trường lỏng [30].
Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, oxy, dinh dưỡng, mật độ tế bào được
kiểm soát nhằm đạt năng suất cao nhất. Kháng sinh sau đó sẽ được tách chiết,
tinh sạch và kết tinh thành thành phẩm. Các chủng VSV sản xuất thường đã
được biến đổi, khuếch đại gen để tăng sản lượng.
Các kháng sinh bán tổng hợp giống với kháng sinh tự nhiên ở các cấu
trúc lõi nhưng có biến đối ở một số nhóm chức để tăng hiệu quả kháng và phổ
kháng. Bán tổng hợp là phương pháp sản xuất kháng sinh công nghiệp phổ biến
hiện nay. Trong phương pháp này, chất kháng sinh sau khi được tách chiết từ
3


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

quá trình lên men sẽ trải qua các bước biến đổi hóa học để tạo thành kháng sinh
thành phẩm. Đa số kháng sinh thế hệ mới được sản xuất theo phương pháp này.
Điển hình như các kháng sinh nhóm celphalosporin được bán tổng hợp từ 7aminocephalosporanic acid, thu được từ thủy phân celphalosporin C.
Cùng với tiến bộ trong y học, một số ít kháng sinh đã được tìm ra có
nguồn gốc hoàn toàn từ tổng hợp như quinolone, sulfonamides, linezolid cho
hiệu quả kháng sinh cao.
Tuy vậy, trong số rất nhiều chất kháng sinh đã được biết, chỉ khoảng 1%
trong số có có giá trị thực tiễn về dược học và thương mại.
1.2.

Tổng quan về kháng kháng sinh

1.2.1. Giới thiệu về kháng kháng sinh
Kháng kháng sinh là khả năng của VSV có thể tự bảo vệ khỏi tác động

của kháng sinh. Khi có mặt kháng sinh, chỉ những vi khuẩn kháng kháng sinh
có thể sinh tồn, hoặc phân chia nhanh hơn các vi khuẩn còn lại, từ đó làm tăng
tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trong quần thể.
Vi khuẩn có hai cách để hình thành những tính trạng kháng kháng sinh:
Các đột biến ngẫu nhiên trong vật chất di truyền, hoặc chuyển gen kháng kháng
sinh chiều ngang giữa các vi khuẩn với nhau.
Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể bao gồm: Phá hủy hoặc bất
hoạt chất kháng sinh, giảm tính thấm của kháng sinh, tăng khả năng đẩy kháng
sinh khỏi màng, biến đổi đích tác động của kháng sinh hoặc thích ứng tổng thể
tế bào. Một vi khuẩn có thể sở hữu nhiều cơ chế kháng sinh khác nhau.
Dưới góc độ y học, kháng kháng sinh nghĩa là vi khuẩn có thể sinh trưởng
ở nồng độ kháng sinh dùng trong các pháp đồ điều trị tiêu chuẩn. Hậu quả là sử
dụng cùng loại kháng sinh để điều trị bệnh nhiễm khuẩn đó sẽ không còn hiệu
quả. Một số chủng vi khuẩn có thể kháng được nhiều loại kháng sinh kháng
nhau (vi khuẩn đa kháng).
1.2.2. Lược sử về hiện tượng kháng kháng sinh
Người đầu tiên đưa ra lời cảnh báo về hiện tượng kháng kháng sinh chính
là Alexander Fleming vào năm 1945 sau khi giành được giải Nobel nhờ công
4


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

Cuối cùng, vào năm 2015, nhiều thập kỷ sau khi bệnh nhân đầu tiên được
điều trị bằng kháng sinh, nhiễm khuẩn một lần nữa đã trở thành một mối họa
toàn cầu [47], khi hầu hết các nhóm kháng sinh đang lưu hành đều xuất hiện
các chủng vi khuẩn kháng lại.
1.2.3. Nguyên nhân và hậu quả của hiện tượng kháng kháng sinh
Việc sử dụng kháng sinh, ngay cả khi hợp lý và có kiểm soát, cũng sẽ
tạo ra áp lực chọn lọc tự nhiên có lợi cho các chủng kháng kháng sinh. Tuy

nhiên có các tác nhân xã hội làm gia tăng sự xuất hiện và lan rộng của các chủng
kháng kháng sinh, bao gồm:
- Lạm dụng thuốc kháng sinh trong kê đơn và tự điều trị
- Sử dụng thuốc kháng sinh không đủ hoặc vượt quá liệu trình
- Lạm dụng thuốc kháng sinh trong cây trồng, vật nuôi
- Kiểm soát vệ sinh kém ở các cơ sở y tế và trong cộng đồng
- Thiếu vắng các loại kháng sinh mới
Kháng kháng sinh gây cản trở nghiêm trọng khả năng điều trị các bệnh
nhiễm khuẩn. Phẫu thuật hoặc hóa trị ung thư cũng trở nên rủi ro hơn. Không
có kháng sinh hiệu quả, xã hội phải sử dụng những kỹ thuật kiểm soát nhiễm
trùng truyền thống như sát trùng, cắt bỏ, cách ly, đồng nghĩa với việc quá trình
điều trị sẽ dài hơn, kém hiệu quả và nhiều tác dụng phụ hơn, kéo theo đó là sự
leo thang của chi phí điều trị.
Tác động lên kinh tế của sự gia tăng những bệnh nhiễm khuẩn không thể
điều trị sẽ ngày càng nghiêm trọng do các bệnh nhân bị loại bỏ khỏi lực lượng
lao động, kèm theo đó là gánh nặng lên y tế và những người chăm sóc người
bệnh. Sự suy giảm lực lượng lao động sẽ làm suy yếu các quốc gia trên thế giới
và gây nên một loạt hậu quả kéo theo khác về kinh tế, xã hội và văn hóa [45].
Nguy cơ lớn nhất từ hiện tượng kháng kháng sinh là khả năng xuất hiện
chủng vi khuẩn với độc lực, khả năng gây nhiễm, tỉ lệ tử vong cao và không
thể điều trị. Một đại dịch như vậy sẽ có tác động tương đương hoặc lớn hơn

6


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

nhiều Cái chết Đen, đại dịch xảy ra vào thế kỷ 14 với 50 triệu người chết chỉ
riêng ở Châu Âu với tác nhân được cho là Yersinia pestis [36].
Trước sự nguy cấp của hiện tượng kháng kháng sinh, việc tìm ra các

kháng sinh mới đang trở nên vô cùng cấp thiết, đặc biệt là tập trung vào 12
chủng trong danh sách cấp bách của WHO [55].
1.3.

Tổng quan về xạ khuẩn

1.3.1. Giới thiệu chung
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn gram-dương với tỉ lệ G + C trong DNA
hơn 55%, cao hơn các nhóm vi khuẩn khác. Xạ khuẩn phát triển dạng hệ sợi
khuẩn phân nhánh không vách ngăn, sinh trưởng ở đỉnh sợi, có thể sinh sản
bằng bào tử. Khuẩn lạc bao gồm khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất.
Xạ khuẩn bao gồm những dạng sống trong đất, nước ngọt và đại dương
cơ bản nhất. Chúng phân bố đặc biệt rộng rãi trong đất nhưng nhạy cảm với đất
chua và pH thấp. Tuy vậy, một số loài xạ khuẩn (ví dụ như Microbacterium
radiodurans, Acidothermus) có thể sinh trưởng trong các môi trường cực đoan
mà nấm mốc và phần lớn vi khuẩn không thể phát triển. Chúng có nhiều vai trò
quan trọng, bao gồm phân giải nhiều loại chất hữu cơ như cellulose, đường đa,
acid hữu cơ,… Xạ khuẩn phân giải mùn và tạo ra mùi đất ẩm đặc trưng [39].
Sự đa dạng trong chuyển hóa của nhóm xạ khuẩn một phần nhờ vào hệ
gen đặc biệt lớn chứa hàng trăm yếu tố phiên mã điều hòa gen giúp chúng đáp
lại những nhu cầu đặc thù [49]. Chính vì vậy, xạ khuẩn là nguồn hoạt chất vô
cùng tiềm năng. 45% các hoạt chất được phát hiện từ VSV là các chất chuyển
hóa thử cấp từ xạ khuẩn.
Về phân loại, xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, gồm 15 bộ, 45 họ, 202
chi với hơn 1000 loài hiện đã được mô tả [29]. Trong đó riêng chi Streptomyces
có hơn 500 loài, những loài còn lại được gọi là xạ khuẩn hiếm.
1.3.2. Hình thái đặc trưng
Dù có cấu trúc tế bào điển hình của vi khuẩn, khác biệt hoàn toàn với
nấm, xạ khuẩn thể hiện sự phân hóa hình thái đặc trưng rất rõ rệt với khuẩn ty

7


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

cơ chất, khuẩn ty khí sinh và cuống bào tử. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường nhỏ,
rắn; dạng hình nón đáy tròn; viền gợn sóng hoặc phóng xạ; bề mặt khô, sần.
Khuẩn ty cơ chất, còn gọi là khuẩn ty sơ cấp của xạ khuẩn, ăn sâu hoặc
mọc lan trên môi trường, phân nhánh mạnh, chức năng chính là hấp thụ dinh
dưỡng. Màu sắc của khuẩn ty cơ chất rất đa dạng; một số loài có thể sinh sắc
tố. Đây là yếu tố quan trọng để phân loại và định danh xạ khuẩn.
Khuẩn ty khí sinh là hệ sợi sinh trưởng từ khuẩn ty cơ chất khi tới một
giai đoạn nhất định và phát triển lên không khí. Sợi khuẩn khí sinh thường dày,
sần, ít phân nhánh và đặc trưng bởi lớp vỏ xơ bên ngoài [28]. Sự hình thành và
hình thái khuẩn ty cơ chất phụ thuộc vào loài, các điều kiện dinh dưỡng và môi
trường. Khuẩn ty khí sinh của nhiều loài có thể hình thành chuỗi bào tử, là sự
biệt hóa của ngọn sợi nấm khí sinh.
Chuỗi bào tử xuất hiện ở hầu hết các chi xạ khuẩn, một chuỗi bào tử có
thể là chứa một bào tử (Micromonospora, Thermoactinomyces), hai
(Microbispora) hoặc nhiều bào tử (Streptomyces, Nocardia). Bào tử xạ khuẩn
có có thành hai lớp và sở hữu mọi tính chất cơ bản của một nội bào tử vi khuẩn
như quá trình hình thành, cấu trúc và đặc điểm sinh hóa [28]. Chuỗi bào tử và
bào tử xạ khuẩn có sự đa dạng rất lớn về hình thái nhưng đặc thù theo từng chi,
từng loài, chính vì vậy chúng là những tiêu chí vô cùng quan trọng để phân loại
xạ khuẩn. Một số ít loài có bào tử có roi nên có thể chuyển động trong nước.

Hình 2: Một số hình thái cuống bào tử và bào tử xạ khuẩn điển hình [6, 28]
8

Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

Thành phần thành tế bào xạ khuẩn có sự khác biệt lớn giữa những nhóm
khác nhau nhưng không đặc thù theo taxon. Có thể chia thành tế bào xạ khuẩn
thành 9 loại dựa vào sự hiện diện của các đồng phân 2,6-diaminopimelic acid,
cùng một số aminoacid và đường khác [6].
1.3.3. Ứng dụng của xạ khuẩn
45% trong tổng số khoảng 23,000 hoạt chất từ VSV có nguồn gốc từ xạ
khuẩn, trong đó khoảng 7,600 chất được sản xuất bởi Streptomyces [7]. Các
hoạt chất đó khiến xạ khuẩn có nhiều ứng dụng như sản xuất kháng sinh,
enzymes, vitamin, probiotic, hoạt chất bề mặt, sắc tố, hạt nano; kiểm soát cây
hại, vật hại; kích thích tăng trưởng thực vật; xử lý môi trường.
➢ Kháng sinh
Đây là ứng dụng quan trọng nhất của xạ khuẩn. Chỉ riêng Streptomyces
là nguồn gốc của 80% các loại kháng sinh từng được phát hiện, ngoài ra còn từ
các chi Micromonospora và Actinomadura. Xạ khuẩn sản sinh nhiều loại kháng
sinh lưu hành rộng rãi nhất như nystatin, chloramphenicol, gentamycin,
erythromycin, vancomycin, tetracycline, novobiocin, neomycin [43, 54].
Xạ khuẩn vẫn là đối tượng tiềm năng nhất để tìm kiếm các loại kháng
sinh mới để đối phó với hiện tượng kháng kháng sinh hiện nay.
➢ Enzyme
Xạ khuẩn có thể sản xuất một lượng rất đa dạng các loại enzyme. Một số
ví dụ điển hình như amylase, cellulases, lipase dùng trong công nghiệm thực
phẩm, lên men. Xạ khuẩn là nguồn sản xuất L-asparaginase rất tốt. Những
enzyme khác như catalase, chitinase, urease và đặc biệt là keratinase cũng được
sản xuất bởi xạ khuẩn.
➢ Kiểm soát cây hại, vật hại
Một số loại Streptomyces có thể sản xuất ra anisomycin, coformycin,
hydantocidin bialaphos, phthoxazolin, hydantocidin và homoalanosin những
chất có thể ức chế hiệu quả nhiều loại cỏ dại [39]. Khả năng kháng nhiều loại

nấm như Candida, A. niger, M. gypseum, Trichophyton của xạ khuẩn cũng đã
được kiểm chứng.
9


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

➢ Kích thích sinh trưởng thực vật và sản xuất hormone thực vật
Từng có nghiên cứu cho thấy khả năng kích sinh tăng trưởng lúa mỳ của
Streptomyces [2]. Streptomyces griseus từng được sử dụng để xử lý hạt giống
đại mạch, yến mạch, lúa mỳ và cà rốt để kích thích tăng trưởng [32].
1.3.4. Khả năng gây bệnh của xạ khuẩn
Đa số xạ khuẩn không có khả năng gây bệnh. Một ngoại lệ đặc biệt là
chi Mycobacterium gây nhiều bệnh nghiêm trọng ở động vật có vú, bao gồm
bệnh lao và phong ở người. Ngoài ra còn chi Norcadia với nhiều loài gây
nocardiosis; một số loài khác có thể gây actinomycosis.
1.4.

Giới thiệu về VSV nội sinh và xạ khuẩn nội sinh

1.4.1. Giới thiệu chung về VSV nội sinh
Sinh vật nội sinh là những VSV (có thể là vi khuẩn, cổ khuẩn hoặc nấm)
sống bên trong các mô sống của thực vật trong ít nhất một phần vòng đời mà
không gây bất kỳ triệu chứng bệnh rõ rệt nào cho vật chủ [56]. Chúng có thể là
nội sinh bắt buộc, tùy tiện hoặc cơ hội. Sinh vật nội sinh đã được phát hiện ở
nhiều cây thuốc, cây cảnh, cây ăn quả quan trọng cả ngoài tự nhiên và trong
nuôi trồng. Theo một nghiên cứu, tỉ lệ phân lập sinh vật nội sinh cao nhất ở cây
thuốc và thấp nhất ở cây cảnh, tỉ lệ vi khuẩn phân lập được cao hơn nấm [38].
Vi khuẩn và nấm nội sinh đã được tìm ra ở hầu hết mọi loại được vật
từng được nghiên cứu [34]. Nhiều nghiên cứu cho thấy rễ cây có thể tiết các tín

hiệu hóa học để thu hút VSV nội sinh. Chúng xâm nhập vào cây chủ chủ yếu
qua vùng rễ, ngoài ra có thể qua khí khổng và các vết hở khác trên cây. Sau khi
xâm nhập, chúng có thể di cư khắp cơ thể cây chủ, sống trong tế bào, khoảng
gian bào hoặc hệ mạch của cây. Nhiều loài VSV nội sinh có thể di truyền cho
các thế hệ thực vật sau nhờ khả năng di chuyển vào các cơ quan sinh sản [16,
19]. Một loài VSV có thể sống trong nhiều loài thực vật và nhiều loài vi sinh
có thể cùng nội sinh trong một cây. Ước tính có hơn một triệu loài nấm nội
sinh, gấp 4 – 5 lần số loài thực vật có hạt [48]. Vi khuẩn nội sinh bao gồm 200
chi đã được xác định nằm trong 12 ngành, trong đó chủ yếu là Actinobacteria,
Proteobacteria và Firmicutes [31, 42, 48].

10


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

VSV nội sinh đem lại nhiều lợi ích cho cây chủ, bao gồm hạn chế động
vật ăn cỏ, khởi tạo đáp ứng phòng vệ, kích thích hệ miễn dịch, giảm thiểu tác
động của stress, khử độc kim loại nặng và gốc oxy hóa tự do [24]; từ đó làm
tăng khả năng thích nghi và phát triển của cây chủ ở nhiều điều kiện môi trường.
VSV nội sinh trải qua quá trình tiến hóa song hành với cây chủ trong thời
gian dài và có những tương tác đặc thù [17], chúng có tiềm năng sản xuất những
hoạt chất tương tự với của cây chủ [40]. Một số hoạt chất tiêu biểu từ VSV nội
sinh là cycloterapeptide, podophyllotoxin, taxol, azadirachtin, camptothecin
[4]. Cũng nhờ những tác động tích cực tới cây chủ, VSV nội sinh được sử dụng
để kích thích tăng trưởng cây trồng, ngăn chặn bệnh hại và cải tạo đất, từ đó
tạo ra một nền nông nghiệp bền vững.
1.4.2. Phân lập VSV nội sinh
Tiêu chí để tiến hành phân lập VSV nội sinh liên quan mật thiết tới việc
phân lập những hoạt chất sinh học, ví dụ như tầm quan trọng, độ đặc hữu của

loại thực vật cũng như độ hiếm của hoạt chất đó [23]. Thông thường, VSV nội
sinh được phân lập từ những mô thực vật dã được tiệt trùng bề mặt và nuôi cấy
trên môi trường tổng hợp, có thể có hoặc không có thành phần dịch chết từ cây
chủ. Tuy vậy, các VSV nội sinh bắt buộc thường không thể sinh trường trên
những môi trường nuôi cấy đó. VSV nội sinh đã được phân lập từ gần như mọi
bộ phận của cây bao gồm hạt, quả, lá, vảy, rễ, thân, ống dẫn nhựa cây và cả mô
phân sinh.
1.4.3. Giới thiệu xạ khuẩn nội sinh
Ước tính 20% số vi sinh vật nội sinh là thuộc nhóm xạ khuẩn. Trong số
các xạ khuẩn nội sinh, chi Streptomyces chiếm đa số các chủng phân lập được,
ngoài ra còn có các chi Micromonospora, Actinopolyspora, Nocardia,
Saccharopolyspora cùng nhiều xạ khuẩn hiếm khác. Xạ khuẩn nội sinh được
phân lập nhiều nhất ở rễ và thấp nhất có thể ở thân hoặc lá [20, 37].
Nội sinh quyển trong thực vật có độ đa dạng VSV nội sinh rất lớn và do
đó, có những vi hệ sinh thái vô cùng phức tạp. Với tiềm năng di truyền sẵn có
của mình, đồng thời với sự tương tác đặc thù lâu dài với câu chủ, xạ khuẩn nội
sinh có thể tạo ra đa dạng những sản phẩm chuyển hóa thứ cấp mới lạ với hoạt
11


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

tính sinh học cao, điều dó đặc biệt đúng với những xạ khuẩn nội sinh trong cây
thuốc. Các nhóm hoạt chất được phát hiện từ xạ khuẩn nội sinh phải kể đến
taxol, cycloterapeptide, polyketide, cedarmycin, benzopyrone.
1.5.

Thực trạng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh

Tính đến ngày 20/5/2019, tra cứu từ khóa “plant extract” trên NCBI

PubMed cho ra 185067 kết quả, trong khi đó từ khóa “endophyte” chỉ cho ra
730 kết quả. Điều đó cho thấy nghiên cứu dịch chiết thực vật để xác định và
khám phá các hoạt chất sinh học từ lâu đã là chủ để được nhiều quan tâm. So
với đó, những nghiên cứu tương đương về VSV nội sinh vẫn còn rất ít. Trong
những năm trở lại đây, vi sinh vật nội sinh nói chung và xạ khuẩn nội sinh nói
riêng đã nhận được nhiều sự quan tâm những vẫn chưa tương xứng với tiềm
năng của nhóm sinh vật này.

12


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

VẬT TƯ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Thời gian và đối tượng
- Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 7/2018 đến tháng 5/2019.
- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu
cây thuốc truyền thống của Việt Nam.
- Đối tượng thu mẫu:
Các cây thuốc truyền thống ở Việt Nam với công dụng kháng viêm,
tiêu sưng, tăng cường sức khỏe (ảnh các cây lấy mẫu có ở Phụ lục
11):
• Cây chạc chìu (Tetracera scandens (L.) Merr. 1917)
• Cây húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng)
• Cây thương lục (Phytolacca acinosa Roxb.)
• Cây củ ráy (Alocasia macrorrhizos (L.) G. Don)
• Cây bán hạ (Typhonium sp.)
• Cây khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f.)

• Cây ngọc trai (Tradescantia spathacea)

2.2.

Vật tư

2.2.1. Chủng VSV
- Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập từ mẫu rễ, thân, lá của cây thuốc.
- Bộ VSV kiểm định của phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh môi
trường – Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trường Đại học
Khoa học tự nhiên:
• Escherichia coli ATCC 25922
• Enterococcus faecalis ATCC 33186
• Proteus mirabillis ATCC 12453
• Klebsiella pneumoniae ATCC 70063

13


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

• Staphylococcus aureus ATCC 25923
• Shigella flexneri ATCC 12022
• Salmonella typhimurium ATCC 14028
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
• Haemophilus influenzae ATCC 49247
• Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
• Vibrio parahaemolyticus NBRC12711
• Bacillus cereus ATCC 14579
• Bacillus subtilis ATCC

• Moraxella catarrhalis ATCC
• Serratia marcescens DT3
- Các chủng nấm Candida albicans và Aspergillus niger từ phòng
Genomics, phòng thí nghiệm KLEPT, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên.
- Các chủng CRE được cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ương: V8-01556, V8-01568, VĐ-2090 (loài Klebsiella
pneumoniae); VĐ50, XP1793 (loài Escherichia coli)
- Chủng tụ cầu khuẩn MRSA(+): MRSA(+) 1801378 và MRSA(+)
1801262 được cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương.
- Chủng Acinedobacter baumannii kháng Carbapenem từ khoa Xét
nghiệm, bệnh viện Nhiệt đới TW.
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
- Thiết bị: Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (Esco, Pháp), máy ly tâm lạnh
(Eppendorf, Đức), kính hiển vi quang học Olympus (Nhật), bộ pipet
cầm tay (Eppendorf, Đức), cân điện tử, máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf,

14


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

Đức), tủ nuôi vi sinh (Innova 44, Nhật), máy nexus GSX1 PCR
(Eppendorf, Đức).
- Dụng cụ: Đĩa Petri Ø9 và Ø12, ống falcol, pipet, que cấy, bình tam
giác các thể tích, ống đong các thể tích, ống nghiệm, phễu chiết,…
- Một số dụng cụ, thiết bị, hóa chất cơ bản tiêu chuẩn khác.
2.2.3. Môi trường
2.2.3.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn nội sinh

Trong đề tài này, môi trường được sử dụng để phân lập xạ khuẩn nội sinh
là môi trường Gauze 1 [52] thạch đã cải biến gồm các thành phần: 20g tinh bột
tan; 1g KNO3; 0,5g K2HPO4; 0,5g MgSO4; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; 0.5g
CaCO3; 16g thạch; 1L nước máy.

Môi trường được chuẩn pH đến 7,2 – 7,4 bằng NaOH 6N, sau đó
được khử trùng ướt ở 121°C, 1 atm trong 15 phút.
Sau khi khử trùng, môi trường được bổ sung Streptomycin 50 mg/L
và Nystatin 100mg/L để ức chế phát triển của nấm và vi khuẩn Gram âm,
từ đó gia tăng hiệu quả phân lập.
2.2.3.2. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Môi trường BHI (pha sẵn của Merck, Đức) dùng để nuôi cấy các chủng:
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, MRSA(+) 1801378,
MRSA(+) 1801262 và Acinedobacter baumannii kháng Carbapenem.
- Thành phần môi trường theo nhà sản xuất: Dịch chiết não bò khử
nước 12,5g; dịch chiết tim bò khử nước 5g; peptone A 10g; DGlucose 2g; NaCl 5g; Na2HPO4 2,5g; Nước máy 1L
Môi trường LB 0,5% dùng để nuôi cấy các VSV kiểm định còn lại.
- Thành phần môi trường: 10g peptone; 5g cao nấm men; 5g NaCl, 1L
nước máy
Các môi trường được chuẩn pH tới 7 - 7,2 bằng KOH 6N và được khử
trùng ướt ở 121°C trong 15 phút.

15


Lê Phụng Hiển – K60 Sinh học Tài năng

2.2.3.3. Các môi trường làm giàu xạ khuẩn
Bảng 1: Các môi trường làm giàu xạ khuẩn được sử dụng trong đề tài
Môi

trường

Thành phần

Nguồn
tham khảo

10g tinh bột tan, 4g cao nấm men; 5 g NaCl; 2g
ISP4 NH4SO4; 2g MgSO4.7H2O; 1g K2HPO4; 1g CaCO3;
cải biến 0.010g FeSO4.7H2O; 0.001g ZnSO4.7H2O; 100μl
dung dịch khoáng; 1L nước cất, pH 7,2

[22, 44]

20g tinh bột tan; 1g KNO3; 0,5g K2HPO4; 0,5g
Gauze 1 MgSO4; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; 0,5g CaCO3; 1L
nước máy, pH 7,2

[52]

1g L-Asparagine; 1g K2HPO4; 15ml Glycerol; NaCl
ISP5
5g; 0,5g CaCO3; 100μl dung dịch khoáng HO-LE; 1L
cải biến
nước cất, pH 7,2

[8, 44]

NB1

15g Peptone; 3g cao nấm men; 6g NaCl; 1g DGlucose; 1g CaCO3; 1L nước cất; pH 7,2 chuẩn độ
bằng KOH 6N

70122
SigmaAldrich

YIM
312

10g D-Glucose; 10g glycerol; 2,5g bột dốc ngô; 5g
peptone; 10g tinh bột tan; 2g cao nấm men; 3g CaCO3;
1g NaCl; 1L nước máy, pH 7,2

[21]

SCB

10g tinh bột tan; 0,3g casein; 2g KNO3; 4,6g NaCl; 2g
K2HPO4; 0,05g MgSO4.7H2O; 0,5g CaCO3, 0,01g
FeSO4.7H2O; 0.001g ZnSO4.7H2O; 1L nước máy; pH
7,2

[22]

Dung
dịch
khoáng
HO-LE

1,360g FeSO4.7H2O; 1,800g MnCl2.7H2O; 0.020g

ZnCl; 0.027g CuCl2.2H2O; 0.040g CoCl2.6H2O,
0.025g Na2MoO4.2H2O; 2.850g H2BO3; 1.770g
sodium tartarate, 100ml nước cất.

[5]

16