Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

44444

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

PHẠM THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
DICLOFENAC CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƢỜNG
NƢỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI - 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

PHẠM THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
DICLOFENAC CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƢỜNG
NƢỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

ThS. Phạm Thị Kim Dung

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu với đề tài:

, thầy cô và các bạn tại Trung tâm Hỗ trợ
nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2 đã hƣớng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều. Qua đây, em muốn đƣợc gửi lời
cảm ơn chân thành tới:
ThS. Phạm Thị Kim Dung – Ngƣời đã tận tình chỉ bảo và hƣớng dẫn
cho em để thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này.
Các thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn
Sinh lý ngƣời và động vật trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã luôn giúp đỡ
và tạo điều kiện cho em trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè và gia đình đã quan tâm,
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 04 năm 2018
Sinh viên

Phạm Thị Thu Trang

LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn.
2. Đề tài của tôi không trùng lặp với một đề tài nào khác.
3. Kết quả trong đề tài thu đƣợc do tự bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn
đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Thu Trang


MỤC LỤC`

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
5.

ngh a hoa học và ý ngh a thực tiễn.......................................................... 3

6. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE VI KHUẨN (CVK) ............................. 5
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum ............................................... 5
1.1.2. Đặc điểm của A. xylinum ....................................................................... 5
1.1.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum ............................ 6
1.1.4. Tính chất độc đáo của màng CVK .......................................................... 7

1.1.5. Sinh tổng hợp CVK ................................................................................. 8
1.1.6. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum ............................................................ 8
1.1.7. Các phƣơng pháp sản xuất CVK từ A. xylinum ..................................... 9
1.2. TỔNG QUAN VỀ THUỐC DICLOFENAC .......................................... 12
1.2.1. Công thức .............................................................................................. 12
1.2.2. Dƣợc động học ...................................................................................... 12
1.2.3. Phân bố - chuyển hoá ............................................................................ 12
1.2.4. Thải trừ .................................................................................................. 12
1.2.5. Tác dụng ................................................................................................ 13
1.2.6. Rủi ro và tác dụng phụ .......................................................................... 13
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15


2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 15
2.2.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 15
2.2.2. Chuẩn bị màng CVK ............................................................................. 15
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng ........................................................ 17
2.2.4. Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn .......................................................... 18
2.2.5. Chế tạo màng CVK nạp Diclofenac...................................................... 22
2.2.6. Chuẩn bị môi trƣờng đệm PBS ............................................................. 23
2.2.7. Xác định lƣợng thuốc giải phóng của màng CVK đã nạp thuốc
Diclofenac ....................................................................................................... 23
2.2.8. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả ................................................ 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 25
3.1. Kết quả tạo màng CVK từ môi trƣờng nƣớc vo gạo ................................ 25
3.2. Tinh chế màng CVK ................................................................................ 26
3.3. Màng CVK nạp thuốc Diclofenac ............................................................ 27
3.4. Xác định lƣợng thuốc Diclofenac giải phóng ra hỏi màng CVK. ......... 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng trong nƣớc vo gạo ..................................... 9
Bảng 2.2. Môi trƣờng lên men tạo màng CVK ............................................... 16
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bƣớc sóng 276nm ............. Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bƣớc sóng 278nm ............. Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bƣớc sóng 281nm ............. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1. Kết quả thu màng CVK tƣơi ........................................................... 25
Bảng 3.2. Mật độ quang hi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm hác
nhau trong các môi trƣờng pH hác nhau đối với màng chƣa ép... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.3. Mật độ quang hi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm hác
nhau trong các môi trƣờng pH hác nhau đối với màng ép 50% .......... 29
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chƣa ép ở các môi trƣờng pH
hác nhau trong các hoảng thời gian hác nhau (%) (n =3)................ 32
Bảng 3.5. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép 50% ở các môi trƣờng pH
hác nhau trong các hoảng thời gian hác nhau (%) (n=3) ................. 32


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac
Hình 2.3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Diclofenac ở bƣớc sóng 276nm.
Hình 2.4. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Diclofenac ở bƣớc sóng 278nm.
Hình 2.5. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Diclofenac ở bƣớc sóng 281nm.

Hình 3.1. Màng CVK khi lên men
Hình 3.2. Màng CVK thu đƣợc
Hình 3.3. Mẫu đƣợc rút ra để đo quang phổ lúc 6 giờ và 8 giờ
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lƣợng thuốc giải phóng ở màng
0,5cm và 1cm hông ép trong các môi trƣờng pH khác nhau (n = 3)
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lƣợng thuốc giải phóng ở màng
0,5cm và 1cm ép 50% trong các môi trƣờng pH khác nhau (n = 3)


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quá trình tạo màng CVK
Sơ đồ 2.2. Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
Sơ đồ 3.1. Chu trình tinh chế màng CVK


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong thời gian gần đây, theo nghiên cứu ngƣời ta đã chú ý đặc biệt về
việc sử dụng nguyên vật liệu sinh học trong các loại sản phẩm chăm sóc sức
khỏe nhờ khả năng tái tạo, phân hủy sinh học và tƣơng thích sinh học của
chúng. Một trong số đó có khả năng đáp ứng đƣợc những ƣu điểm trên và
đang dần phổ biến tới đó là cellulose. Vật liệu này vƣợt trội hơn so với các
polyme tự nhiên và tổng hợp khác [12]. Do đó, màng cellulose vi huẩn
(CVK) là đối tƣợng của các nhà khoa học trong nƣớc cũng nhƣ nƣớc ngoài về
nhiều nghiên cứu ứng dụng khoa học và công nghệ khác nhau. Đây là một
loại nguyên liệu mới, đƣợc áp dụng rất nhiều trong các l nh vực khác nhau.
Nổi bật là trong l nh vực y học, màng CVK đã đƣợc ứng dụng làm thuốc
chống viêm và giảm đau, thí dụ nhƣ hi bị phong thấp, bị thâm tím, căng bắp
thịt, đau thắt lƣng cấp và thoái hoá khớp. Nó còn đƣợc dùng để điều trị đau
bụng kinh. Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng màng CVK trong đòi

sống vẫn còn khá là mới mẻ.
Màng Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một số loài
vi khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Ngoài những đặc tính và cấu
trúc giống nhau giữa màng CVK và cellulose của thực vật thì giữa chúng vẫn
tồn tại một số điểm hác nhau nhƣ: cellulose vi khuẩn không chứa các hợp
chất cao phân tử nhƣ ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến cho nên giúp
chúng có một số đặc tính vƣợt trội về độ dẻo dai, bền chắc, khả năng hút nƣớc
cao và độ tinh khiết cao.
Diclofenac, dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh, đƣợc
điều trị khi bị phong thấp, căng bắp thịt, bị thâm tím, đau thắt lƣng cấp hay thoái
hoá khớp. Ngoài ra, nó còn đƣợc dùng để điều trị đau bụng kinh ở nữ giới.

1


Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do
đó làm giảm đáng

ể sự tạo thành chất trung gian của quá trình viêm

(prostaglandin, prostacyclin, thromboxane). Diclofenac điều hòa con đƣờng
lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của Diclofenac là
có thể gây ra bệnh tim đe dọa tính mạng hoặc các vấn đề lƣu thông nhƣ đột
quỵ hoặc các cơn đau tim, đặc biệt là khi sử dụng nó lâu dài. Không sử dụng
Diclofenac ngay trƣớc khi hoặc sau khi phẫu thuật tim (bắc cầu động mạch
vành hoặc CABG).
Nƣớc vo gạo là loại chất khá phổ biến và gần gũi trong cuộc sống hằng
ngày. Ngoài ra nƣớc vo gạo còn có giá thành rất rẻ và dễ tìm kiếm. Do vậy ta
nên sử dụng nƣớc vo gạo để làm môi trƣờng lên men những vi khuẩn cần

thiết cho quá trình nghiên cứu.
Với mục đích nghiên cứu thiết kế hệ thống gồm CVK nạp thuốc và khả
năng giải phóng thuốc giúp Diclofenac không bị phá huỷ trong môi trƣờng
acid, làm cho thuốc đƣợc giải phóng một cách éo dài, đồng thời làm giảm
bớt các tác dụng phụ của thuốc trong điều trị bệnh, tôi đã chọn và nghiên cứu
đề tài:
u kh

i phóng thu c Diclofenac c a màng

cellulose vi khu n lên men t

c vo g

.

2. Mục đích nghiên cứu
- Chế tạo đƣợc màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc
vo gạo.
- Thiết kế đƣợc hệ thống gồm cellulose vi khuẩn nạp thuốc và khả năng
giải phóng thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn đƣợc lên men từ
môi trƣờng nƣớc vo gạo với độ dày màng khác nhau trong các môi trƣờng pH
khác nhau mô phỏng đƣờng tiêu hóa.
- Nâng cao tối ƣu hoá quá trình giải phóng và kéo dài thuốc.

2


3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và xử lí màng CVK.

- Thiết kế, chế tạo màng CVK để giải phóng thuốc Diclofenac.
- Khảo sát khả năng giải phóng thuốc của màng CVK ở các độ dày
màng khác nhau trong môi trƣờng pH khác nhau.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ nƣớc vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
5.
5.1.

ngh a khoa học và ý ngh a th c ti n
ngh a khoa học:
+ Nghiên cứu tìm hiểu khả năng giải phóng để có những hiểu biết về

tiềm năng giải phóng của màng CVK.
+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
5.2.

ngh a th c ti n:
+

Thiết kế đƣợc quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter

xylinum lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
+ Từ màng CVK đã đƣợc tạo ra đƣợc dùng làm hệ thống giải phóng
thuốc có thể đƣa vào điều trị bệnh, kéo dài quá trình giải phóng, duy trì nồng
độ thuốc trong máu trong một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho ngƣời
bệnh, giảm các tác dụng phụ không mong muốn, nâng cao đƣợc khả năng sử

dụng thuốc.
+ Xây dựng đƣợc hệ thống vận tải thuốc diclofenac để khắc phục
những hạn chế không mong muốn của thuốc.

3


+ Từ các kết quả nghiên cứu ta có thể áp dụng vào trong thực tiễn.
6. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị màng CVK;
- Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn;
- Chuẩn bị bộ đệm;
- Chế tạo màng CVK nạp Diclofenac;
- Xác định lƣợng Diclofenac nạp vào màng CVK;
- Xác định lƣợng thuốc Diclofenac giải phóng của màng CVK;
- Phƣơng pháp xử lý thống kê.

4


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cellulose vi khuẩn(CVK)
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
Chủng Acetobacter xylinum này có nguồn gốc từ Philippin, A. xylinum
thuộc nhóm khuẩn Axetic. Theo phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.
xylium thuộc lớp Schizomycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonaceae
[5].
1.1.2. Đặc điểm của A. xylinum
* Đặc điểm hình thái:

A. xylinum là trực huẩn dạng hình que, thẳng hay hơi cong, ích thƣớc
ngang hoảng 0,6-0,8 µm, dài hoảng 2-3 µm, vi huẩn hông sinh bào tử,
hiếu hí bắt buộc, sắp xếp riêng rẽ đôi hi xếp thành chuỗi, có hả năng tạo
váng hemicellulose há dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H 2SO4. Tùy
điều iện nuôi cấy mà các vi huẩn này có thể sinh ra các tế bào có hình thái
hác biệt dạng éo dài hoặc phình to ra.[6]
A. xylinum thƣờng sống chung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi
là “thủy hoài sâm” [9].
A. xylinum sinh trƣởng ở điều iện pH <5, nhiệt độ hoảng 28-32°C và
có thể tích lũy 4-5% acid acetic, nhƣng hi nồng độ acid vƣợt quá mức cho
phép, chúng sẽ quay lại ức chế hoạt động của vi huẩn.
* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum:
A. xylinum là loài vi huẩn hiếu hí. Nhiệt độ tối ƣu cho vi huẩn phát
triển từ 28 – 320C. Ở nhiệt độ 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn.

5


A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đƣờng hác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lƣợng đƣờng có thể thay đổi, nhƣng đƣờng hay đƣợc sử dụng và
cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đƣờng cho
hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose.
Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi huẩn lạ, ngƣời ta thƣờng bổ
sung acid acetic vào môi trƣờng.
Trong môi trƣờng nuôi cấy lỏng, vi huẩn sử dụng đƣờng để chuyển
hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trƣờng. Sau 36 –
48h lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày.
1.1.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum
- Màng CVK đƣợc cấu tạo từ nhiều chuỗi polimer β-1,4-glucopyranose
không phân nhánh. Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc hóa học cơ

bản của CVK há tƣơng đồng với cellulose của thực vật nhƣng chúng lại khác
nhau về cấu trúc đại thể [10, 17].
- Theo AJ. Brown (1886), CVK có cấu tạo gồm nhiều sợi siêu nhỏ kết
hợp với nhau, bản chất những sợi này là hemicellulose, có đƣờng kính 1,5nm.
Những sợi này kết hợp với nhau thành từng bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi
dãy có chiều dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm.
- Đặc tính cấu trúc của CVK phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy:
+ Trong nuôi cấy t nh (S - BC: Static-Bacterial Cellulose): Màng CVK
thu đƣợc có đặc điểm dày, dẻo dai, màu trắng trong hơi ngả màu vàng. Do khi
nuôi cấy t nh thì A. xylinum sẽ tạo ra cellulose nhiều hơn tạo thành màng dày
trên bề mặt của môi trƣờng.
+ Trong nuôi cấy động (A - BC: Agitated-Bacterial Cellulose): Màng
CVK thu đƣợc có đặc điểm hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và hông đƣợc tự
do dao động trong môi trƣờng nuôi cấy. Do khi nuôi cấy động thì một số ít

6


cellulose hình thành theo dạng hyền phù phân tán trong đó chuỗi β-1,4-glucan
đƣợc xếp một cách ngẫu nhiên.
+ Lƣợng CVK thu đƣợc ở hai phƣơng pháp nuôi cấy động và nuôi cấy
t nh là khác nhau: khối lƣợng màng khô của phƣơng pháp nuôi cấy t nh lớn
hơn so với khối lƣợng màng khô của phƣơng pháp nuôi cấy động [5, 15].
1.1.4. Tính chất độc đáo của màng CVK
Màng CVK có một số tính chất độc đáo nhƣ: độ tinh khiết cao, độ bền
dai cơ học lớn, khả năng thấm hút nƣớc cao,...
- Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [18].
- Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,

trọng lƣợng nhẹ, độ bền đáng ể [7, 18].
- Khả năng hút nƣớc cao ở trạng thái ẩm: đó là khả năng giữ nƣớc tốt,
lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nƣớc rất lớn, nó có thể hút khoảng
200 lần trọng lƣợng của nó (Patel & Suresh 2008; Wippermann et al. 2009)
[19].
Do vậy, màng CVK đã đƣợc ứng dụng trong nhiều l nh vực công nghệ
khác nhau nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công
nghệ pin,... nổi bật nhất là trong l nh vực y học [7,12]. Trong y học, màng
CVK thu đƣợc từ quá trình nuôi cấy t nh đƣợc nghiên cứu và ứng dụng làm
da nhân tạo. Trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu
và ứng dụng màng CVK đƣợc tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng thực nghiệm
trên đối tƣợng là thỏ. Những kết quả ứng dụng trên đã chứng minh rằng màng
CVK có khả năng giúp vết thƣơng mau lành và ngăn hông nhiễm trùng [4].
Ngoài ra, CVK còn đƣợc ứng dụng để sản xuất màng băng vết thƣơng, sử
dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [2].

7


1.1.5. Sinh tổng hợp CVK
- Quá trình lên men: + Pha sinh trƣởng
+ Pha tích tụ sản phẩm
- Quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum
Cellulose đƣợc tổng hợp từ một số nhóm vi huẩn và đặc biệt là A.
xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dƣỡng cacbon, phụ thuộc vào
trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu
trình Krebs, ết hợp với quá trình tạo glucose. Ngày nay, quá trình tổng hợp
cellulose ở A. xylinum gồm nhiều bƣớc và thƣờng trải qua 2 giai đoạn chính là
giai đoạn polymer hóa và giai đoạn ết tinh.
Có 2 iểu nuôi cấy: lên men t nh và lên men động (có huấy đảo).

1.1.6. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum
Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng đƣợc tổng hợp từ các
nguồn dinh dƣỡng cần thiết nhƣ nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho,
các yếu tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng.
A. xylinum có nhu cầu sử dụng đƣờng rất lớn vì vậy có rất nhiều
nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công
nghiệp hác để làm nguyên liệu nuôi cấy A. xylinum nhƣ: rỉ đƣờng, chất thải
nhà máy sản xuất phomat, nƣớc dừa già, nƣớc mía, ...
Trong đó nƣớc vo gạo đƣợc coi là môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum rất
lý tƣởng.
Trong nƣớc vo gạo có rất nhiều thành phần dinh dƣỡng và vitamin nhƣ
cacbonhydrat, sắt, vitamin B, vitamin C,... Do vậy, môi trƣờng nƣớc vo gạo
rất thích hợp cho sự phát triển của A. xylinum, thành phần dinh dƣỡng của
nƣớc vo gạo đƣợc thể hiện ở bảng 1.1:

8


Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng trong nƣớc vo gạo
Hàm lƣợng

Thành phần
Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đƣờng

2%

Kháng chất

Fe ( 7% - 8%) , Zn ( 12% -13%)

Axitamin

leucine , valine , lysine

1.1.7. Các phƣơng pháp sản xuất CVK từ A. xylinum
Phƣơng pháp sản xuất CVK: lên men t nh và lên men động [5].
1.1.7.1. Lên men t nh
Để lên men A. xylinum thì môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc đặt vào các
khay có bề mặt rộng thoáng. Khi lên men để tạo độ thông thoáng với môi
trƣờng bên ngoài mà không xảy ra trƣờng hợp nhiễm khuẩn, các khay cần
đƣợc đậy giấy báo có độ xốp. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 28 30ᴼC. Sợi cellulose mới đƣợc tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt của môi
trƣờng nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm ở mặt phân cách giữa
không khí với môi trƣờng lỏng. Cellulose tiếp tục đƣợc tổng hợp bám lên
màng cellulose bên trên. Sau 7-10 ngày có thể thu đƣợc màng CVK [5, 15].
1.1.7.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thƣờng đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nuôi cấy
lắc.
Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa vào môi trƣờng nuôi
cấy đƣợc chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong máy lắc ổn

9

nhiệt ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút. CVK đƣợc tạo ra từ môi trƣờng lắc có
dạng hạt hình sao, hạt nhỏ và các sợi dài, chúng có đặc điểm là phân tán rất
tốt trong môi trƣờng. Lƣợng O2 hòa tan trong môi trƣờng tác động lớn đến sự
sinh trƣởng và khả năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá
trình lên men đạt hiệu quả cao, ngƣời ta thƣờng xuyên sử dụng các reactor có
sục hí để lên men [5, 15].
1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của màng CVK
1.1.8.1.Trên thế giới
Trên thế giới màng CVK đã đƣợc ứng dụng rất nhiều trong các l nh vực
công nghệ hác nhau. Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên
cứu ứng dụng CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã đƣợc báo cáo, trong
đó có 9 nghiên cứu với màng CVK tinh hiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến
đổi màng CVK và 7 với các vật liệu Nanocomposite. Nhƣ vậy, trong l nh vực
này cần tiếp tục đƣợc tiến hành nghiên cứu.
Tác giả Brown (1989), Jonas và Farad (1998) sử dụng màng nhƣ một
chất để biến đổi độ nhớt, tạo ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất
trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm, sản xuất giấy chất lƣợng
cao [3].
Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng hô CVK thu
đƣợc sau hi ngâm trong benzal onium chloride (một tác nhân háng huẩn;
Merc KGaA, Darmstadt, Đức) có hả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị
diện tích bề mặt đã đƣợc tìm thấy là 0,116 g/cm2, và tác dụng của thuốc éo
dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S.aureus và B.subtilis [11].
Luan J. et al. (2012), đã nghiên cứu màng CVK nạp sulfadiazine bạc,
một loại thuốc phổ biến đƣợc sử dụng trong điều trị vết thƣơng nhiễm huẩn
do bỏng.

10

1.1.8.2.Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK bắt đầu từ
những năm 2000. Những nghiên cứu trong nƣớc bƣớc đầu đã thành công
trong tuyển chọn chủng có đặc tính quý, sản xuất thử nghiệm màng CVK và
thử nghiệm ứng dụng trong sản xuất bao bì, gạc và mặt nạ.
Ngày nay, ở nƣớc ta việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi
khuẩn A. xylinum ngày càng đƣợc quan tâm. Năm 2012, Đinh Thị Kim
Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ Quỳnh [3] đã công bố công trình
nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial
cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, ết quả cho thấy màng CVK đƣợc
tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có các sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền cơ
học lớn, độ thấu hí cao, độ hút nƣớc tốt có triển vọng ứng dụng trong làm
màng trị bỏng.

11


1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac
1.2.1. Công thức
Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
Tên IUPAC hệ thống: 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid
Phân tử lƣợng: 296,148 g/mol
Công thức cấu tạo: Đƣợc mô tả ở hình 1.1

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac
1.2.2. Dƣợc động học
Diclofenac hấp thu dễ dàng qua đƣờng tiêu hoá sau khi uống, hấp thụ
sẽ tốt hơn nếu uống hi đói. Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tƣơng là
1,5mg/l xuất hiện hai giờ sau khi uống, nồng độ thuốc trong bao hoạt dịch đạt

mức cao nhất sau khi uống khoảng 4 đến 6 giờ. Tác dụng của thuốc xuất hiện
vào khoảng 30 – 60 phút sau hi đặt thuốc vào trực tràng, 20 – 30 phút sau
khi tiêm bắp, 60 – 120 phút sau khi uống [17].
1.2.3. Phân bố - chuyển hoá
Diclofenac gắn nhiều protein huyết tƣơng, chủ yếu là albumin (99%).
Khoảng 50% liều thuốc uống đƣợc chuyển hoá qua gan lần đầu, sinh khả
dụng của thuốc trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% so với liều tiêm t nh mạch
[17].
1.2.4. Thải trừ

12


Thời gian bán thải của thuốc trong huyết tƣơng vào khoảng 1 - 2 giờ.
Thời gian bán thải trong bao hoạt dịch là 3 - 6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng
đƣợc thải trừ qua thận dƣới dạng chất chuyển hoá còn một phần hoạt tính và
1% dƣới dạng thuốc nguyên vẹn, phần còn lại thải trừ qua mật và phân.
1.2.5. Tác dụng
Diclofenac dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid [14]. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh.
Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm
giảm đáng

ể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là

những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con
đƣờng lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu.
1.2.6. Rủi ro và tác dụng phụ
Giống nhƣ các thuốc chống viêm không steroid khác, Diclofenac gây
hại đƣờng tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin

(chất có tác dụng bảo vệ đƣờng tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tƣới
máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin
nên có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hƣ
đặc biệt ở những ngƣời bị bệnh thận hoặc suy tim mãn tính. Với những ngƣời
bệnh này, các thuốc chống viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp
và suy tim cấp [15] .
Không dùng thuốc chứa Diclofenac trong thời ì mang thai, đặc biệt là
3 tháng cuối thai kì.
* Các triệu chứng thƣờng gặp:
- Toàn thân: Nhức đầu, bồn chồn, ù tai.
- Tiêu hóa: Ðau vùng thƣợng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trƣớng bụng,
chán ăn, hó tiêu.
- Gan: Tăng các transaminase.

13


* Ít gặp:
- Toàn thân: Phù, dị ứng (đặc biệt co thắt phế quản ở ngƣời bệnh hen),
choáng phản vệ kể cả tụt huyết áp, viêm mũi, mày đay.
- Tiêu hóa: Ðau bụng, chảy máu đƣờng tiêu hóa, làm ổ loét tiến triển,
nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, kích ứng tại chỗ ( hi đặt thuốc vào trực
tràng).
- Hệ thần kinh: Buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu, khó chịu,
dễ bị kích thích.
- Da: Mày đay.
- Hô hấp: Co thắt phế quản.
- Mắt: Nhìn mờ, điểm tối thị giác, đau nhức mắt, nhìn đôi.
* Hiếm gặp:
- Toàn thân: Phù, phát ban, hội chứng Stevens - Johnson, rụng tóc.

- Hệ thần kinh: Viêm màng não vô khuẩn.
- Máu: Giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính, tăng
bạch cầu ái toan, giảm bạch cầu hạt, thiếu máu.
- Gan: Rối loạn co bóp túi mật, chức năng gan bất thƣờng, nhiễm độc
gan (vàng da, viêm gan).
- Tiết niệu: Viêm bàng quang, đái máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ, hội
chứng thận hƣ.

14


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Diclofenac đƣợc mua ở Trung Quốc.
- Dung môi: metanol đƣợc mua tại Việt Nam.
- NaOH, HCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 và một số hóa chất khác.
- Nguyên liệu tạo màng CVK: đƣờng glucose, nƣớc vo gạo, acid acetic,
axit citric, disodium phosphate, HCl, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Màng CVK (99% hàm lƣợng nƣớc) sản xuất từ vi khuẩn A. xylinum
lên men trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Máy đo quang phổ UV-2450 (Shimadzu-Nhật Bản); cân phân tích
(Sartorius-Thụy Sỹ); nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; buồng cấy vô
trùng (Haraeus); tủ sấy, tủ ấm (Binder-Đức); khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức),
và nhiều dụng cụ hóa sinh khác.
- Ống nghiệm, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có
nút xoáy, bình tam giác, gạc vô trùng, hộp nhựa, lọ penicilin, bình hút ẩm,
giấy lọc, giấy bạc, bình định mức loại 100ml, 500ml, 1000ml, pipet chính xác
1ml, 5ml, 10ml, thƣớc ẹp panme,... và nhiều dụng cụ hóa sinh hác.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Cho màng CVK nạp Diclofenac vào giải phóng thuốc ở
các điều kiện pH khác nhau rồi tính tốc độ giải phóng thuốc ở mỗi pH đó.
- Thí nghiệm 2: Trong cùng một pH cho màng CVK có độ dày khác
nhau đã nạp Diclfenac giải phóng thuốc rồi tính tốc độ giải phóng thuốc.
2.2.2. Chuẩn bị màng CVK
- Chuẩn bị màng CVK từ A. xylinum ở môi trƣờng nuôi cấy đƣợc thể
hiện ở bảng 2.2 [13]:

15


Bảng 2.2. Môi trƣờng lên men tạo màng CVK
Thành phần

Khối lƣợng

Nƣớc vo gạo

1000ml

Glucoze

20g

KH2PO4

2g

(NH4)2SO4

3g

Pepton

10g

Axit axetic

2%

- Từ các thành phần trong môi trƣờng lên men tạo ra màng CVK ở
bảng 2.2, quá trình tạo màng CVK đƣợc thể hiện ở sơ đồ 2.1:
Hóa chất

Nƣớc gạo
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, hòa tan
hóa chất
Đổ môi trƣờng vào các bình tam giác
Cho vào hấp ở 121°C, khoảng thời gian
là 20 phút
Đổ giống (10%)
Thêm 2% acid axetic
Lên men
Sơ đồ 2.1. Quá trình tạo màng CVK

16