Ứng dụng kỹ thuật lamp (loop mediated isothermal amplification) trong phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM THỊ HUYỀN TRANG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED
ISOTHERMAL AMPLIFICATION) TRONG PHÁT HIỆN
NHANH VIRUS WSSV VÀ IHHNV GÂY BỆNH TRÊN TÔM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2019


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tấn Trung

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày
.................tháng .... năm................
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1..............................................................
2..............................................................
3 ...........................................................

4 ...........................................................
5 ...........................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau
khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Phạm Thị Huyền Trang

MSHV: 7140871

Ngày, tháng, năm sinh: 04/07/1988

Nơi sinh: Nghệ An

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201
I. TÊN ĐỀ TÀI: ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)

trong phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng được phương pháp phát hiện nhanh virus
WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal
amplification)
- Thiết kế primer và tối ưu hóa phương pháp LAMP
- Khảo sát độ nhạy của phương pháp
- Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp và so sánh với phương pháp PCR
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/01/2018
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/12/2018
V.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. Nguyễn Tấn Trung
Tp. HCM, ngày .... tháng .. . . năm 2018
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. Nguyễn Tấn Trung

PGS.TS. Lê Thị Thủy Tiên

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN


Tôi xin trân trọng cảm ơn:
-

TS Nguyễn Tấn Trung đã hướng dẫn tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian

nghiên cứu luận văn Thạc sĩ.

-

Các thầy cô trong Khoa Kỹ Thuật Hóa học, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sau
đại học trường Đại học Bách Khoa TPHCM

-

Các anh chị và các bạn tại phòng xét nghiêm thuộc Viện Sinh học phân Tử Loci
đã tạo những điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp.

-

Đặc biệt, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến gia đình đã động
viên, hỗ trợ về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt nghiên cứu này.


TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng được một
phương pháp phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm bằng kỹ
thuật LAMP, giúp cho các phòng thí nghiêm với trang thiết bị đơn giản có thể thực
hiện được các xét nghiệm bệnh trên tôm. Trong nghiêm cứu này chúng tôi đã tiến hành
thiết kế 4 cặp mồi cho mỗi phản ứng LAMP phát hiện các tác nhân WSSV và IHHNV.
Tối ưu hóa nồng độ betaine cho vào phản ứng đối với LAMP-WSSV là IM và đối với
LAMP-IHHNV là 0.8M. xác định độ nhạy của phản ứng LAMP là 25 copy DNA của
virus. Đồng thời với bộ mồi thiết kế cho phản ứng LAMP WSSV và IHHNV theo
khảo sát của chúng tôi trên một số mẫu thực nghiệm có độ đặc hiệu là 100%, tương
đồng với kết quả PCR.
We conducted this study in order to develop a rapid detection method for wssv

and IHHNV by LAMP technique, enabling simple laboratory equipment to perform
Disease testing on shrimp. In this study we have designed 4 pahs of primers for each
LAMP reaction to detect wssv and IHHNV. Optimization of betaine concentration in
LAMP-WSSV reaction was IM and for LAMP-IHHNV was 0.8M. The sensitivity of
the LAMP reaction is 25 copies of the DNA virus. Simultaneously with the primer
design for LAMP wssv and IHHNV reactions according to our survey in some
specimens has a specificity of 100%, similar to the PCR results.


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Các
số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng
quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận văn do tôi tự tìm hiểu, phân tích một
cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết quả này
chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác.
Học viên

Phạm Thị Huyền Trang


MỤC LỤC
MỞ ĐẰU...................................................................................................................1
Mục tiêu đề tài.................................................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LỆU........................................................................3
1.1. Khái quát về thực trạng nghề nuôi tôm ở Việt Nam........................................3
1.1.1.

Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam................................................................3

1.1.2.

Tình hình dịch bệnh trên tôm....................................................................5

1.2. Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm (WSSV)...................................................6
1.2.1.

Phân loại và cấu tạo Virus.........................................................................7

1.2.2.

Dấu hiệu bệnh lý.....................................................................................11

1.2.3.

Cơ chế gây nhiễm và Kiểu lan truyền.....................................................12

1.3. Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô.................................14
1.3.1.

Phân loại và cấu trúc virus.....................................................................15

1.3.2.

Dấu hiện bệnh lý.....................................................................................16

1.3.3.

Phân bố và lan truyền.............................................................................17

1.4. Các phương pháp phát hiện............................................................................18

1.4.1.

Phương pháp mô học:.............................................................................18

1.4.2.

Phương pháp lai phân tử.........................................................................19

1.4.3.

Phương pháp PCR (PolymeraseChain Reaction)...................................20

1.4.4.

Phương pháp DNA Real time PCR.........................................................21

1.4.5.

Phương pháp LAMP...............................................................................22

1.4.5.1.

Nguyên tắc của phương pháp..........................................................22

1.4.5.2.

Cơ chế phản ứng LAMP..................................................................23

1.4.5.3.

Hiển thị kết quả LAMP...................................................................28

1.4.5.4.

Ưu điểm của phương pháp LAMP..................................................30

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGIÊN CỨU.................................33
2.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................33
2.1.1.

Mẩu thí nghiệm.......................................................................................33

2.1.2.

Máy móc, hang thiết bị...........................................................................33

2.1.3.

Hóa chất, vật tư dùng cho thí nghiệm:....................................................34

2.2.

Phương pháp nghiên cứu..............................................................................35


2.2.1.

Thiết kế primer (thiết kế mồi).................................................................36

2.2.2.

Tối ưu hóa phản ứng LAMP...................................................................36

2.2.3..................................................................................................................... Tiế
n hành kiểm tra độ nhạy của phản ứng LAMP PCR..................................................38
2.2.4.

Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp LAMP.....................39

2.2.4.1.

Thu nhận và xử lý mẫu....................................................................39

2.2.4.2.

Tách chiết DNA tổng số..................................................................40

2.2.4.3.

Thực hiện phản ứng LAMP trên tất cả các mẫu thực nghiêm........41

2.2.4.4.

Thực hiện phản ứng PCR kiểm chứng kết quả của phản ứng LAMP
41

2.2.4.5.

Đối chiếu kết quả LAMP và kết quả PCR......................................43

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN................................................................44
3.1.

Thiết kế primer.............................................................................................44

3.2 Kết quả tối ưu hóa phản ứng LAMP..................................................................48
3.2.1. Kết quả tối ưu hóa nồng độ betaine.........................................................48
3.2.2. Xác định thời gian phản ứng LAMP........................................................52
3.2.

Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP.............................................................56

3.3.

Khảo sát độ đặc hiệu và độ chọn lọc của phương pháp LAMP..................59

3.3.1.

Thực hiện phản ứng LAMP trên các mẫu thực nghiệm.........................59

3.3.2. Ket quả chạy các mẫu thực nghiệm bằng phương pháp PCR.................65
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................70
4.1.

Kết luận........................................................................................................71

4.2.

Kiến nghị......................................................................................................72

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
LAMP
wssv

Loop-mediated isothermal amplification
White spot syndrome virus

IHHNV

Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

EMS

Early Mortality Syndrome

MBV

Monodon Baculovirus

PCR
ISH

Polymerase Chain Reaction
In-situ hybdridization

NHB

Hydroxy Naphthol blue Disodium

VASEP

Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers

DNA

DeoxyriboNucleic Acid


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng thông kê dịch bênh tôm từ năm 2014-2016......................................5
Bảng 1.2. Thống kê dịch bệnh WSSV từ năm 2014-2016.......................................6
Bảng 1.3.. Những ưu nhược điểm của các phương pháp phát hiện..........................31
Bảng 2.1. Kích thước mẫu thí nghiêm......................................................................33
Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng LAMP WSSV và IHHNV..............................37
Bảng 2.3. công thức pha mix PCR phát hiện WSSV................................................42
Bảng 2.4. công thức pha mix PCR phát hiện IHHNV..............................................42
Bảng 3.1. Thông tin bộ gene các chủng virus WSSV và virus IHHNV...................45
Bảng 3.2. Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát hiện WSSV...........................48
Bảng 3.3. Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát hiện IHHNV.........................48
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng LAMP-WSSV......................................................53
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng LAMP-IHNV........................................................54
Bảng 3.6. Thành phần hóa chất phản ứng LAMP cho chứng nội tại DECA............59
Bảng 3.7. Phân tích kết quả LAMP..........................................................................60


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Biểu đồ thống kê diện tích nuôi trồng tôm nước lợ từ năm 2013-2016.4 Hình
1.2. Biểu đồ thống kê tổng sản lượng tôm nước lợ từ năm 2013-2016.....................4
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc virion của wssV..........................................................8

Hình 1.4. Cấu trúc bộ gen wssV.............................................................................11
Hình 1.5. Tôm sú bị bệnh đốm trắng.......................................................................12
Hình 1.6. Cơ chế gây nhiễm của WSSV.................................................................13
Hình 1.7 . Cấu trúc di truyền bộ gen của IHHNV chủng Ấn Độ............................16
Hình 1.8. A,B - tôm chân trắng bị bệnh IHHNV....................................................17
Hình 1.9. Một lát cắt mô học trên tôm sú nhiễm IHHNV.......................................19
Hình 1.10. Sơ đồ các bước phản ứng chuỗi polymerase.........................................20
Hình 1.11. Bộ mồi phản ứng LAMP........................................................................23
Hình 1.12. Primer FTP bắt cặp với sợi DNA đơn và tổng hợp mạch bổ sung........25
Hình 1.13. Mồi F3 bám vào vị trí bắt cặp tổng hợp mạch DNA mới giải phóng mạch
DNA chứa mồi FIP..................................................................................................25
Hình 1.14 Các bước tạo thành mạch DNA đơn có cấu trúc vòng............................25
Hình 1.15. Tái bản và kéo dài chuỗi DNA...............................................................27
Hình 1.16. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di gel..........................................28
Hình 1.17. Các phương pháp hiển thị hoá phản ứng LAMP đã xảy ra....................30
Hình 2.1. Màu sắc của ống phản ứng ban đầu và khi xẩy ra phản ứng LAMP dương
tính...........................................................................................................................38
Hình 2.2. Mẩu tôm nhiễm bệnh thực nghiệm thu nhận...........................................40
Hình 3.1. Trình tự sắp gióng cột chọn vùng gen tương đồng để thiết kế primer giữa các
chủng WSSV............................................................................................................46
Hình 3.2. Trình tự sắp gióng cột chọn vùng gen tương đồng để thiết kế primer giữa các
chủng IHHNV..............................................................................................................47
Hình 3.3. Kết quả LAMP-WSSV ở các nồng độ betaine khác nhau.......................49
Hình 3.4. Kết quả LAMP-IHHNV ở các nồng độ betaine khác nhau.....................50
Hình 3.5. Ket quả điện di trên các ống phản ứng tối ưu hóa betaine.......................51


Hình 3.6. Các ống phản ứng LAMP với các nồng độ DNA khác nhau chạy trong 60
phút..........................................................................................................................54
Hình 3.7. Các ống phản ứng LAMP với các nồng độ DNA khác nhau chạy trong

80 phút....................................................................................................................55
Hình 3.8. Các ống phản ứng LAMP với các nồng độ DNA khác nhau chạy trong
100 phút..................................................................................................................55
Hình 3.9. Kết quả điện di các ống phản ứng LAMP với các nồng độ DNA khác nhau ở
80 phút.....................................................................................................................56
Hình 3.10. Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP - WSSV.........................................57
Hình 3.11. Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP - IHHNV........................................58
Hình 3.12. Kết quả LAMP chạy chứng nội tại DECA mẫu tôm nhiễm WSSV... 61
Hình 3.13. Kết quả LAMP 10 mẫu tôm dương tính WSSV....................................61
Hình 3.14. Kết quả điện di kết quả LAMP mẫu dương tính WSSV........................62
Hình 3.15. Kết quả điện di LAMP chứng nội tại của 10 mẫu tôm nhiễm WSSV.62
Hình 3.16. Kết quả khảo sát phản ứng LAMP-WSSV trên các mẫu tôm nhiễm
bệnh khác.................................................................................................................63
Hình 3.17. Kết quả LAMP 10 mẫu tôm dương tính IHHNV..................................64
Hình 3.18. Kết quả khảo sát phản ứng LAMP-IHHNV trên các mẫu tôm nhiễm
bệnh khác.................................................................................................................65
Hình 3.19. Kết quả PCR 10 mẫu WSSV dương tính..............................................66
Hình 3.20. Kết quả PCR-WSSV trên các mẫu tôm nhiễm tác nhân khác..............67
Hình 3.21. Kết quả chạy PCR 10 mẫu IHHNV dương tính.....................................68
Hình 3.22. Kết quả PCR -IHHNV trên các mẫu tôm dương tính với tác nhân
Khác.........................................................................................................................68


MỞĐẰU
Ngành nuôi hồng thuỷ sản ở nước ta đang phát triển mạnh theo hướng công
nghiệp hoá. Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu
thủy sản mà còn có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện
đời sống cho người nuôi thủy sản. Hiện nay để tăng sản lượng nuôi tôm, việc áp dụng
kỹ thuật tiên tiến như nuôi thâm canh năng suất cao và tăng diện tích nuôi đã có nhiều
tác động đến môi trường sinh thái gây ô nhiễm môi trường và sự bùng phát dịch bệnh.

Virus gây bệnh trên tôm là đối tượng gây thiệt hại đáng kể nhất cho người nuôi
tôm, trong đó virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) và virus gây bệnh hoại tử cơ quan
tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) là hai bệnh phổ biến trên tôm tại Việt Nam.
Do đó, việc phát hiện sớm các virus gây bệnh này, cũng như phân biệt các triệu chứng
mắc bệnh trên tôm do virus gây ra hay do tác động từ yếu tố môi trường, hay vi khuẩn
gây bệnh, có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong phòng chống kịp thời giảm thiểu sự lây
lan của dịch bệnh. Hiện nay chỉ có phương pháp PCR, realtime PCR và phương pháp
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) có thể giúp chẩn đoán nhanh, phát
hiện sớm virus gây bệnh trên tôm trong thời kỳ ủ bệnh. Tuy nhiên phương pháp PCR,
realtime PCR đòi hỏi phải trang bị hệ thống thiết bị hiện đại và đắt tiền, nên phương
pháp này chủ yếu sử dụng tại những phòng thí nghiệm đã được trang bị đầy đủ các
máy móc thiết bị cần thiết cũng như được đào tạo về nguồn nhân lực. Trên thực tế tất
cả các phòng thí nghiệm đều nằm ở thành phố, trong khi các vùng nuôi tôm chủ yếu ở
các vùng nông thôn hay ngoại ô, việc vận chuyển mẫu xét nghiệm và chờ đợi kết quả
tốn nhiều thời gian, dịch bệnh do virus lại bùng phát rất nhanh. Phương pháp LAMP
(Loop-mediated isothermal amplification) là một phương pháp đơn giản, có độ nhạy
cao, dễ dàng thực hiện và chi phí thấp đã được nghiên cứu và áp dựng thực tiễn tại
nhiều phòng thí nghiệm trong việc phát hiện các bệnh gây ra bởi vi khuẩn hay virus.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “
ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) trong phát
hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm” giúp chẩn đoán nhanh
virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) và virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ
quan lập biểu mô (IHHNV), đồng thời có thể áp dụng rộng rãi tại tất cả các phòng thí
1


nghiệm cơ bản, cũng như người nuôi tôm có thể thực hiện được tại các trại tôm giống
tại địa phương.

Mục tiêu đề tài

•

Thực hiện thành công phương pháp LAMP nhằm phát hiện WSSV và IHHNV.

•

Tôi ưu hóa phương pháp LAMP để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với
phương pháp PCR.

•

Phát hiện được WSSV và IHHNV có trong mẫu bệnh phẩm.

•

Xây dựng được quy trình chẩn đoán dựa trên những thiết bị đơn giản nhất.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Khái quát về thực trạng nghề nuôi tôm ở Việt Nam.

1.1.1. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam.
Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát
triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Ngành nuôi tôm nước lợ chiếm vị trí
đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế ngành thủy sản Việt Nam hơn
10 năm qua. Cùng với quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi và chuyển đổi

đất nông nghiệp, đất làm muối năng suất thấp chuyển sang nuôi tôm ở các tỉnh ven
biển, nhờ vậy mà ngành tôm có sự tăng trưởng vượt bậc cả về diện tích, sản lượng và
giá trị xuất khẩu.
Năm 2017, diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước đạt 721,1 nghìn ha; tăng 3,8%
so với năm 2016 trong đó diện tích tôm sú là 622,4 nghìn ha; tăng 3,7% và diện tích
tôm chân trắng là 98,7 nghìn ha; tăng 4,7% so với năm 2016 (hình 1.1). Sản lượng tôm
nước lợ năm 2017 đạt 683,4 nghìn tấn, tăng 4% so với năm 2016 trong đó sản lượng
tôm sú 256,4 nghìn tấn; giảm 2,8% nhưng sản lượng tôm chân trắng đạt 427 nghìn tấn,
tăng 8,5% so với năm 2016 (Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017). Tình
hình xuất khẩu tôm 5 tháng đầu năm 2017 của nước ta đạt kim ngạch 3,86 tỷ USD,
tăng 22% so với năm 2016 (Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản 2017). Có thể thấy,
tôm nước lợ là mặt hàng xuất khẩu chủ lực hàng đầu của ngành thủy sản Việt Nam với
hai sản phẩm chính là tôm Sú và tôm Thẻ chân trắng [44],


Tổng diện tích nuôi tôm nước lợ hàng năm

■ Diện tích nuôi tôm nước lợ (ha)

Hình 1.1. Biểu đồ thống kê diện tích nuôi tôm nước lợ từ năm 2013-2017
(Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017).

Tổng sản lượng tôm hàng năm từ
2013-2017

■ Tổng sàn lượng tôm (Tấn)

Hình 1.2. Biểu đồ thống kê tổng sản lượng tôm nước lợ từ năm 2013-2017
(Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017).
I. 1.2. Tình hình dịch bệnh trên tôm.

Theo thống kê từ cục thủy sản, trong năm 2016 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ
bị thiệt hại là 66.140,79 ha (tăng 16,99% so với cùng kỳ năm 2015 với tổng diện tích bị
thiệt hại là 56.534,91 ha) chiếm 9,66% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước (bảng 1.1).
Trong đó, diện tích nuôi thâm canh, bán thâm canh bị thiệt hại là 18.012,3 ha; diện tích
nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến là 35.921,06 ha; còn lại các hình thức nuôi khác là


12.207,43 ha. Nếu thống kê dựa vào các tác nhân gây bệnh, tổng diện tích nuôi tôm bị
thiệt hại do các bệnh là 10.662,26 ha (giảm 40,54% so với cùng kỳ năm 2015 có tổng
diện tích bị bệnh là 17.930,44 ha) chiếm 1,56% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước;
không xác định nguyên nhân 13.116,54 ha, còn lại là do biến đổi môi trường, thời tiết là
42.361,99 ha (Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017).
Trong 6 tháng đầu năm 2017 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại là
II. 430 ha, chiếm 1,89% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước. Trong đó, tổng diện tích
tôm nuôi do các tác nhân sinh học gây bệnh là 4.165,78 ha, chiếm 36.4%. Trong đó, các
bệnh trên tôm nuôi bao gồm bệnh đốm trắng chiếm 14%, bệnh hoại tử gan tụy cấp
chiếm 14%, bệnh hoại tử cơ quan tạo máu, còi, phân trắng chiếm 8% trên tổng diện tích
bị thiệt hại. Diện tích tôm nuôi bị bệnh không xác định nguyên nhân là 4.745 ha, chiếm
41,5,8%, và do biến đổi môi trường, thời tiết là 2.519 ha, chiếm 22,0 % (Theo báo cáo
của Tổng cục thủy sản năm 2017).
Bảng 1.1. Bảng thông kê dịch bệnh trên tôm từ năm 2014-2016 (Theo báo cáo
của Tổng cục thủy sản năm 2016).
Năm

2104

2015

2016

Diện tích tôm bị thiệt hại

59.579 ha

56.534 ha

66.140 ha

Diện tích tôm bị thiệt hại do bệnh

31.514 ha

16.278 ha

10.662 ha

Ghi nhận báo cáo dịch bệnh đốm trắng do virus gây bệnh đốm trắng (White spot
syndrome virus - WSSV) trong nững năm gần đây, nhờ công tác phòng chống dịch bệnh
được đẩy mạnh, nên tổng diện tích tôm bị nhiễm bệnh có dấu hiệu giảm, tuy nhiên diện
tích nuôi trồng tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng vẫn còn rất lớn (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Thống kê dịch bệnh đốm trắng từ năm 2014-2016 (Theo báo cáo của
Tổng cục thủy sản năm 2016).
Năm

Năm 2014

Năm 2015

Năm 2016

Số tỉnh có dịch

23

23

25

Tổng diện tích bị bệnh (ha)

23.872,78

5.337,64

3.643,91


Mặc dù công tác phòng chống dịch bệnh được tăng cường nên qua những năm
gần đây diện tích tôm bị thiệt hại do dịch bệnh có dấu hiệu giảm, tuy nhiên với tình hình
nuôi tôm theo hướng công nghiệp hóa và các vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng tăng
thì những thiệt hại do bệnh trên tôm nuôi do virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) còn lớn,
đặt ra cho các nhà khoa học, nhà quản lý, các doanh nghiệp và nông dân cần phải có
những giải pháp cụ thể khác nhau để phòng, trị và giảm dần thiệt hại bệnh do virus gây
ra trên tôm.
1.2.

Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm (White spot syndrome virus WSSV).

Năm 1993, virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV) lần
đầu tiên được phân lập và xác định là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm ở Đài Loan.

Từ đó, virus này đã được phát hiện phân bố rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau trên thế
giới, bệnh đốm trắng vẫn là một trong các bệnh thường gặp do virus gây ra và nguy
hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay [4],


1.2.1.

Phân loại và cấu tạo virus

Virus gây bệnh đốm trắng hên tôm (White
spot syndrome virus - WSSV) có dạng hình trứng,
hình elipse, hay hình dạng như vi khuẩn bacillus.
Hình dạng virus thường đối xứng, đường kính 60 X
167 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, và tổng chiều
dài là 210 X 420 nm.

White spot syndrome virus [45]
Phân loại virus

,
.
Ẵ V Nhóm: I (DNA bộ gene mạch đôi)
Á
Câu trúc của virus WSSV bao gôm: màng
.
Ấ Họ: Nỉmavỉrỉdae
bao (envelope) và nucleocapsid chứa vật chât di
1
Giông: Whispovirus
truyền.

Loài: White soot syndrome virus

• Màng bao: Màng bao của virus WSSV bao gồm ít nhất 35 protein khác nhau,
trong đó VP28 và VP26 là hai protein phổ biến nhất, chiếm khoảng 60% màng
bao. VP28, được mã hóa bằng khung đọc mở ORF 421 (wsv421), là protein
màng bao chính. Một số nghiên cứu cho rằng VP28 có vai trò quan trọng trong
các bước xâm nhiễm ban đầu của WSSV vào tế bào. VP28 có vai trò như một
protein tạo vị trí bám cho virus vào các tế bào tôm, và giúp virus thâm nhập vào
tế bào chất [39]. VP26 là một sản phẩm protein được mã hóa bởi gen wsv311,
lần đầu tiên được xác định là có liên quan đến nucleocapsid. Sau đó, VP26 được
phát hiện có thể được mã hoá bởi một ORF khác là gene p22 do một phân tích so
sánh trinh tự bộ gene cho thấy gene p22 mã hoá protein có trình tự tương đồng
với protein VP26. Protein VP26 nằm trong khoảng uống giữa màng bao và
nucleocapsid, hoạt động như một protein liên kết. VP26 có thể giúp WSSV di
chuyển về phía nhân tế bào, nơi có nhiều hoạt đông phiên mã và sao chép diễn
ra, bằng cách tương tác với actin hoặc protein liên kết với actin của tế bào [39].
Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng cả VP28 và VP26 tự nhiên có thể
hình thành dạng trimer trong vỏ virus và có vai trò quan họng đối với sự tương
tác giữa màng virus và các thụ thể tế bào chủ [39].
• Nucleocapsid: nằm bên trong màng bao, có cấu trúc bao gồm các protein tiểu đơn
vị hình cầu VP15 xếp chồng lên nhau thành 14, 15 vòng dọc theo hai trục. Kích


thước của nucleocapsid có chiều dài từ 180-420 nm và đường kính 54- 85 nm,
khoảng cách giữa màng bao và nucleocapsid thay đổi từ 2 - 7.5 nm chứng tỏ bộ
gene của virus được nén rất chặt trong nucleocapsid. Bên trong màng bao mặc
dù nucleocapsid được nén chặt nhưng khi được giải phóng khỏi màng bao kích
thước của nucleocapsid sẽ tăng lên [39].
Các protein cấu thành nucleocapsid của WSSV ít được hiểu rõ hơn so với những
protein được tìm thấy trên màng bao virus. VP15 là sản phẩm protein được mã

hóa bởi WSV214, là một trong những protein cấu trúc chính nằm ở
nucleocapsid. Công trình nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng VP15 mã hóa một
peptid 80 aa, bao gồm một lượng đáng kể các amino acid có tính base (44,2%)
và serine (24,6%), một đặc tính quan trọng trong những protein có thể liên kết
với DNA. Bằng chứng thực nghiệm cho thấy VP15 có khả năng gắn kết chặt chẽ
với DNA mạch đôi theo cách không đặc hiệu, cho thấy vai trò quan trọng của
VP15 trong việc đóng gói bộ gene của WSSV trong nucleocapsid và protein
VP15 có khả năng tương tác với chính nó để có thể tham gia vào quá trình lắp
ráp nucleocapsid [40].
Một trong những tính năng đặc biệt nhất của bộ gene WSSV là sự xuất hiện của
WSV360. Đó là một chuỗi trình tự DNA khổng lồ gồm 18234 nucleotide mã hóa
cho một protein 6077 aa, được gọi là VP664, nằm trong nucleocapsid. Protein
này có vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp và tạo hình thái của virion. Bên
cạnh chức năng này, VP664 biểu hiện một tính năng đặc hiệu giữa các protein
cấu trúc virus: nó là protein lớn nhất từng được tìm thấy trong virus [39],
Đã có báo cáo cho rang VP51 và VP76 được mã hoá bởi WSV308 và WSV220
nằm ở phần màng bao của virus. Tuy nhiên, gần đây VP51 và VP76 được báo
cáo là những thành phần cấu trúc nhỏ liên kết với nucleocapsids của virus [41],
và chức năng của những protein này vẫn chưa biết.


Màng bao (envelope)

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc virion của WSSV [39]. Kích thước và đường
kính của WSSV được chú thích trên hình.
• Vật chất di truyền: Bộ gene của virus đốm trắng là phân tử DNA mạch đôi, siêu
xoắn, dạng vòng với hàm lượng A+T khoảng 59% phân bố đồng nhất. Các khu
vực phân lập WSSV khác nhau thì bộ gene sẽ có kích thước khác nhau. Ba
chủng virus đốm trắng có kích thước bộ gene khác nhau được phân lập ở ba
vùng khác nhau là Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan: WSSV phân lập tại Trung

Quốc (WSSV-Cn) có kích thước 305kb (Genbank Acceession No. AF332093),
WSSV phân lập tại Thái Lan (WSSV-T11) có kích thước 293kb (GenBank
Accession No. AF369029), WSSV phân lập tại Đài Loan (WSSV- Tw) có kích
thước 307kb (GenBank Accession No. AF440570) [3] [32],
Các báo cáo ban đầu sử dụng phương pháp RFLP để kiểm tra các biến thể
di truyền giữa ba chủng WSSV, cho thấy các chủng phân lập có liên quan chặt
chẽ với nhau. Tuy nhiên, việc công bố các trình tự bộ gen hoàn chỉnh của các


chủng phân lập đã cho phép xác định các biến thể bằng phương pháp phân tích
tin sinh học. Sự khác biệt chính giữa các bộ gen WSSV được phân lập từ ba vùng
như sau [39]:
- Một đoạn trình tự lớn 13.2 kb ở vùng liên gen (intergenic region) biến
mất trong bộ gen WSSV-Th khi được so sánh với bộ gene WSSV-Cn và WSSVTw.
- Một đoạn 1337 bp được chèn trong bộ gene WSSV-Tw có độ tương
đồng 100% với các gene nhảy có nguồn gốc từ prokaryote và eukaryote
- Số lượng các trình tự lặp trong các vùng tương đồng và những vùng lặp
giữa các bộ gene WSSV có sự khác nhau.
- Các đột biến nucleotide đơn lẻ bao gồm SNP và mấtíthêm nucleotide
được phân bố ngẫu nhiên trên những bộ gen wss V. Ngoại trừ bộ gene WSSVTw, gần 25% các đột biến này xảy ra ở các vùng mã hóa của ORF24, ORF25,
ORF30, ORF38 và ORF84.
Do đó, các biến thể bộ gene của WSSV cho thấy sự lan truyền về mặt địa
lý từ một tổ tiên chung WSSV ở eo biển Đài Loan đến Thái Lan từ năm 1992 và
1995, cũng tương tự như vậy cho giữa chủng WSSV-Tw và chủng WSSV-Cn
được phân lập từ Trung Quốc. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng chủng phân
lập từ Việt Nam (WSSV-Vn) [22] cũng có đoạn trình tự bị mất có chiều dài từ
11,5 - 12,2 kb và chủng phân lập từ Ấn Độ (WSSV-In) có đoạn trình tự bị mất có
chiều dài từ 10,9 kb. Đặc điểm của các chủng này hỗ trợ giả thuyết về nguồn gốc
tổ tiên chung, sau đó được phân tán khắp thế giới. Cuối cùng, các chuỗi trình tự
hoàn chỉnh của ba chủng phân lập có độ tương đồng tới 99,32% khi bỏ qua

những vùng mất đoạn lớn, các vùng trình tự biến đổi và trình tự gen nhảy [39].
ma


Hình 1.4. Cấu trúc bộ gen WSSV phân lập tại Thái Lan [33]. Chiều mũi tên chỉ
ra hướng phiên mã của các gene. Các tên trên gene chỉ ra các sản phẩm protein được mã
hoá bởi gene.
1.2.2.

Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh đốm trắng bùng phát thường được đặc trưng bồi việc tôm bị bệnh chết
nhiều và nhanh sau khi cố biểu hiện lâm sàng. Tôm nhiễm bệnh hoạt động yếu, bed lờ
đờ và dạt vào bờ, đang ăn nhiều đột ngột bỏ ăn. Dấu hiệu đặc trưng là xuất hiện các
đốm trắng tròn dưới lớp vỏ, nhất là vùng giáp đầu ngực, đốt bụng thứ 5 - thứ 6 và cố thể
lan toàn thân. Những đốm này ở trong lớp vỏ và không thể loại bỏ bằng việc chà sát
(hình 1.5). Tôm sắp chết cũng có thể biến màu từ hồng sang đò. Khi các đốm trắng xuất
hiện, sau 3-10 ngày tôm chết hàng loạt với tỉ lệ cao [1].


Hình 1.5. Tôm sú bị bệnh đốm trắng cỗ dấu hiệu đỏ thân (mũi tên đỏ) cổ các
đốm trắng dưới vỏ (mũi tên trắng) [1].
1.23. Cơ chế gây nhiễm và kiểu lan truyền
Một virion WSSV lây nhiễm vào một tế bào qua trung gian thụ thể. Đầu tiên,
VP28 ửên bề mặt của virus sẽ gắn trực tiếp lên các receptor chuyên biệt cho WSSV làm
cầu nối cho hạt virion của WSSV đi vào trong tế bào (hình 1.6). Lớp màng bao của
virus WSSV có thể dung hợp với màng của tế bào tôm bằng quá trình endosome, sau đó
nucleocapsid được vận chuyển đến nhân tế bào vật chủ. Nucleocapsid của WSSV không
có màng gắn vào màng nhân tế bào vật chủ nên bộ gen của WSSV được giải phống trực
tiếp vào nhân. Bộ gen của WSSV bắt đầu sao chép. Trong tế bào chất của tế bào vật chủ,

ty thể bắt đầu thoái hóa. Trong nhân, nhiễm sắc thể của tế bào tích tự gần màng nhân và
lưới nội chất thô trở nên mở rộng và hoạt động mạnh. Các protein của virus bắt đầu tạo
thành các túi và sau đỗ hình thành các màng bao virus. Cấu trúc nucleosome của virus
được hình thành chứa các protein trong nucleocapsỉd và bộ gene của virus sau khi được
sao chép. Các màng bao trống được lắp ráp vào các nucleocapsid tạo thành các hạt
virion WSSV mới trong nhan. Trong tế bào chất, các bào quan bị phân rã, màng tế bào
và màng nhân bị tiêu hủy. Các virus


WSSV mới được hình thành hoàn toàn và sẵn sàng được giải phống khỏi tế bào bị tiêu
hủy để bắt đàu chu trình mới trong các tế bào khác [42],

Hình 1.6. Cơ chế gây nhiễm của WSSV [6]. Bước 1 gồm các virion WSSV tự do,
bước 2 bám dính của WSSV vào màng tế bào, bước 3 xâm nhập vào tế bào bằng quá
trình endosome, bước 4 WSSV di chuyển trong tế bào chất của tế bào đến nhân, bước 5
nưcleocapsỉd của WSSV gắn lên màng nhân và bước 6 phóng thích trực tiếp bộ gene
của WSSV vào nhân tế bào. Bước 7 và 8, tổng hợp mới các protein cho WSSV và sao
chép DNA bộ gene của WSSV. Bước 9 lắp ráp hoàn chỉnh virion của WSSV, ly giải
màng nhân. Bước 10, ly giải tế bào chủ và phóng thích virion của WSSV cho quá trình
xâm nhiễm mới.
Bệnh đốm trắng lây truyền ngang là chính. Virus lây từ các giáp xác khác (tôm
cua, chân chèo) đã nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc
ngay trong ao nuôi tôm. Khỉ các cá thề tôm bị bệnh đốm trắng trong ao bị yếu hoặc chết,
các con tôm khoẻ sẽ ăn chúng dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn. Trong nguồn nước
hay môi trường có các tác nhân mang mầm bệnh có thể làm lây lan dịch bệnh từ nơi này