Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN CÔNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI SINH KHỐI VI TẢO
Thalassiosira pseudonana ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM
THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN CÔNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI SINH KHỐI VI TẢO
Thalassiosira pseudonana ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM
THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. ĐỖ THỊ HOA VIÊN
2. PGS. TS. ĐẶNG DIỄM HỒNG

HÀ NỘI - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án
này là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này.

TM. Tập thể hướng dẫn

Hà Nội, ngày

PGS.TS. Đỗ Thị Hoa Viên

tháng

Nguyễn Văn Công

i

năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
PGS. TS. Đỗ Thị Hoa Viên - là người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án.

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng
Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - là người Thầy đã
giúp tôi định hướng nội dung, giúp đỡ về tinh thần, kiến thức chuyên môn,
cơ sở vật chất và chỉ bảo tận tình giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn để
hoàn thành Luận án trong suốt thời gian thực hiện.
Tôi xin tỏ lòng thành kính và biết ơn sâu sắc tới Cố PGS. TS. Nguyễn
Kim Đường - là người Thầy đã có những góp ý chân thành và hỗ trợ tôi
về tinh thần trong suốt chặng đường học tập và hoàn thành Luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Công ty Cổ phần Chăn nuôi
C.P Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi
hoàn thành những thí nghiệm trong quá trình hoàn thành Luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ của Phòng Công nghệ tảo, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam: TS. Lưu Thị
Tâm, TS. Ngô Thị Hoài Thu, NCS. Lê Thị Thơm, NCS. Nguyễn Cẩm Hà…đã tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện một phần nội dung nghiên cứu của Luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đoàn Lan Phương, Phòng Hóa sinh
hữu cơ, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi thực hiện phân tích lipít
và thành phần axít béo của Luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn giải phẫu sinh lý Bệnh, Học viện Quân
y, Bộ Quốc phòng đã giúp tôi trong thử nghiệm trên động vật thực nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý Thầy, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà
Nội đã giúp đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án.

Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, em trong Phòng Đào
tạo của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và
giúp đỡ tôi trong công việc tại phòng để tôi có thể hoàn thành Luận án.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân
đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất
cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án của mình.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả
Nguyễn Văn Công

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN....................................................................................................................................... ii
MỤC LỤC............................................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT............................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH.................................................................................................................. x
MỞ ĐẦU................................................................................................................................................ 1
1.
Tính cấp thiết của luận án.......................................................................................... 1
2.
Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................................... 2
3.
Nội dung nghiên cứu.................................................................................................... 2
4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án...................................................... 3
5.
Những điểm mới của luận án................................................................................... 3
6.
Cấu trúc của luận án..................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................................... 4
1.1.
Giới thiệu chung về vi tảo trong nuôi trồng thủy sản................................ 4
1.1.1. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo.................................................................................. 4
1.1.2. Sử dụng vi tảo trong ương nuôi ấu trùng động vật thân mềm............5
1.1.3. Sử dụng vi tảo trong nuôi luân trùng và artemia ......................................... 6
1.1.4. Sử dụng vi tảo trong sản xuất giống cá biển................................................. 6
1.1.5. Vi tảo sử dụng trong trại sản xuất giống tôm biển và tôm thẻ chân trắng. 6
1.2.
Giới thiệu về Thalassiosira pseudonana.......................................................... 9
1.2.1. Vị trí phân loại của Thalassiosira pseudonana ............................................. 9
1.2.2. Đặc điểm sinh học sinh sản của Thalassiosira pseudonana ................9
1.2.3. Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana.................................................. 10
1.2.3.1. Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana trên thế giới...................... 10
1.2.3.2. Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana ở Việt Nam......................... 14
1.2.4. Ứng dụng Thalassiosira pseudonana trong sản xuất giống tôm thẻ chân
trắng..................................................................................................................................... 18
1.2.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana..................................................................................................................... 19
1.3.
Tình hình nghiên cứu sản xuất giống và nuôi thương phẩm tôm thẻ chân
trắng trên thế giới và ở Việt Nam........................................................................ 22
1.3.1. Trên thế giới..................................................................................................................... 22
1.3.2. Ở Việt Nam........................................................................................................................ 26
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................... 30

2.1.
Vật liệu.............................................................................................................................. 30
iii


2.1.1.
2.1.2.
2.2
2.3
2.3.1.
2.3.2.
2.3.3.
2.3.4.

Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................. 30
Hóa chất và thiết bị.................................................................................................... 30
Các môi trường nuôi cấy........................................................................................ 31
Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 32
Phương pháp chụp ảnh hình thái tế bào....................................................... 32
Phương pháp sinh học phân tử......................................................................... 33
Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp Thalassiosira pseudonana ở quy

mô phòng thí nghiệm và pilot 34
Xác định các thông số sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana
38

2.3.5.

Phân tích thành phần sinh hóa trong sinh khối của Thalassiosira
pseudonana 39

Phương pháp phân tích hàm lượng lipít tổng............................................ 39

2.3.5.1
2.3.5.2. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo bão hòa
và không bão hòa đa nối đôi
40
2.3.5.3. Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng 40
2.3.6.
Nghiên cứu ứng dụng Thalassiosira pseudonana trong sản xuất giống
tôm thẻ chân trắng
40
2.3.6.1. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và hành
vi của động vật thực nghiệm sử dụng sinh khối Thalassiosira
pseudonana 40
2.3.6.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại thức ăn đến tăng trưởng
và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng
42
2.3.6.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi đến tăng
trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng
43
2.3.6.4. Phương pháp thử nghiệm nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng với
nguồn con giống được sản xuất bằng Thalassiosira pseudonana
45
2.3.7.
Xử lý số liệu nghiên cứu......................................................................................... 47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................. 48
3.1.
Đặc điểm sinh học của Thalassiosira pseudonana................................. 48
3.1.1.
Đặc điểm hình thái tế bào của Thalassiosira sp. ....................................... 48

3.1.2.
Định tên khoa học Thalassiosira sp. bằng kỹ thuật đọc và so sánh trình
tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA 50
3.1.3
Nghiên cứu lưu giữ, khả năng sinh sản và sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana 52
3.1.3.1. Lưu giữ Thalassiosira pseudonana ở nhiệt độ phòng ..........................53
3.1.3.2. Đặc điểm sinh học sinh sản của Thalassiosira pseudonana .............54
3.1.3.3. Sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana............................................... 54
3.2.
Điều kiện nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở các quy mô khác
nhau 55
iv


3.2.1.

Điều kiện thích hợp để nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy

mô phòng thí nghiệm............................................................................................... 56
3.2.1.1. Quy mô bình thủy tinh 0,25 L............................................................................... 56
3.2.1.2. Quy mô bình thuỷ tinh 1 L...................................................................................... 66
3.2.1.3. Quy mô bình thủy tinh 2 L...................................................................................... 75
3.2.2.
Điều kiện thích hợp để nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy
mô pilot............................................................................................................................ 84
3
3.2.2.1. Quy mô bể composite 0,2 m ............................................................................... 84
3

3.2.2.2. Quy mô bể composite 1 m ................................................................................... 89
3

3.2.2.3. Quy mô bể composite 3,5 m ............................................................................... 92
3.2.2.4. Quy trình công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí
nghiệm và pilot............................................................................................................ 96
3.2.3.
Thành phần hóa học của sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy mô
pilot.................................................................................................................................... 99
3.3.
Ứng dụng Thalassiosira pseudonana trong sản xuất giống tôm thẻ chân
trắng 105
3.3.1.
Đánh giá độ an toàn và tác dụng sinh dược của sinh khối Thalassiosira
pseudonana để làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng 105
3.3.1.1. Độc tính cấp của Thalassiosira pseudonana ............................................. 106
3.3.1.2. Độc tính bán trường diễn của Thalassiosira pseudonana .................107
3.3.1.3. Hành vi của chuột thực nghiệm sau khi sử dụng sinh khối Thalassiosira
pseudonana 111
3.3.2.
Sử dụng Thalassiosira pseudonana trong sản xuất giống tôm thẻ chân
trắng 111
3.3.2.1. Ảnh hưởng của loại thức ăn đến sinh trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng
tôm thẻ chân trắng
111
3.3.2.2. Ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu
trùng tôm thẻ chân trắng 117
3.3.2.3. Thử nghiệm nuôi thương phẩm với nguồn con giống được sản xuất bằng
Thalassiosira pseudonana
127

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................................... 135
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN.............................. 137
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................ 138
PHỤ LỤC............................................................................................................................................. 151

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng anh

Tiếng việt

ALT

Alanine aminotransferase

ANOVA

Analysis of variance

Phân tích phương sai

ARA

Arachidonic acid

Axít arachidonic

AST

Aspatate aminotransferase

CĐAS

Cường độ ánh sáng

CĐSK

Chế độ sục khí

CFU/g

Colony Forming unit per Đơn vị khuẩn lạc
gram

CHLB

Cộng hòa liên bang

C.P

Charoen pokphand

DHA

Docosahexaenoic acid

Axít docosahexaenoic

DLG

Daily length gain

Tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axít deoxiribonucleic

DPA

Docosapentaenoic acid

Axít docosapentaenoic

DWG

Daily weigh gain

Tăng trưởng tuyệt đối về khối lượng

ĐC

Đối chứng

EHP

Enterocytozoon
hepatopanaei

Bệnh vi bào tử trùng

EPA

Eicosapentaenoic acid

Axít eicosapentaenoic

FCR

Feed conversion ration

Tỉ lệ chuyển đổi thức ăn

HUFA

Highly
acid

IHHN

Infectious hypodermal and Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo
haematopoietic necrosis máu

unsaturated fatty Axít béo không bão hòa

virus
IMN

Infectious myonecrosis

Bệnh hoại tử cơ

KP

Khẩu phần

KPH

Không phát hiện

L

Lít

LD

Lethal dose

Liều gây chết động vật thí nghiệm

vi


LM

Light Microscope

Kính hiển vi quang học

M
MĐTB

Cubic metre

Mét khối

MUFA

Monounsaturated fatty acid Axít béo không bão hòa một nối đôi

NHP

Necrotising
hepatopancreatitis

3

Mật độ tế bào
Bệnh hoại tử gan tụy

NTTS

Nuôi trồng thủy sản

N/L

Nauplii/lít

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng PCR

PUFA

Polyunsaturated fatty acid

Axít béo không bão hòa đa nối đôi

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

RNA

Ribonucleic acid

Axít ribonucleic

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid ARN riboxom

SEM

Scanning
microscope

SFA

Saturated fatty acid

electron Kính hiển vi điện tử quét
Axít béo bão hòa

SKK

Sinh khối khô

TATH

Thức ăn tổng hợp

TB

Tế bào

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TFA

Total fatty acid

Axít béo tổng số

TN
TS

Thử nghiệm
Taura syndrome in Penaeus Hội chứng Taura
vannamei

TTCT
VASEP

Tôm thẻ chân trắng
Vietnam
seafood

association of Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy
exporters and sản Việt Nam

producers
VPA:
AHPND

Vibrio parahaemolyticus : Bệnh hoại tử gan - tụy cấp
Acute
hepatopancreatic
necrosis disease

VTDD

Vi tảo dị dưỡng

WSD

White spot syndrome virus

Bệnh đốm trắng

YHD

Yellow head disease

Bệnh đầu vàng
vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.
Bảng 1.2.

Một số loài vi tảo được sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm
biển và tôm thẻ chân trắng ...........................................................
7
Nhu cầu dinh dưỡng của ấu trùng tôm thẻ chân trắng ...................
26

Bảng 1.3.

Diện tích và sản lượng, giá trị xuất khẩu tôm nuôi nước lợ 2010

Bảng 2.1.

- 2017...........................................................................................
Thành phần dinh dưỡng các môi trường nuôi vi

Bảng 2.2.

Thalassiosira pseudonana ............................................................
Chế độ cho ăn ấu trùng tôm thẻ chân trắng ...................................

Bảng 2.3.

Chế độ siphon và thay nước trong bể ương ấu trùng tôm thẻ

Bảng 3.1.

chân trắng ....................................................................................
44
Đặc điểm hình thái tế bào của Thalassiosira sp. phân lập quan

Bảng 3.2.

sát dưới kính hiển vi LM và SEM ................................................
49
Tỉ lệ % độ tương đồng và khoảng cách di truyền của đoạn gen

Bảng 3.3.

18S rRNA giữa các loài thuộc chi Thalassiosira ..........................
51
Thành phần và hàm lượng các axít béo của sinh khối

27
tảo
32
44

Thalassiosira pseudonana nuôi trồng được ở bể composite 3,5
3
99
m ................................................................................................
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.

Thành phần hóa học của Thalassiosira pseudonana .....................
103
Kết quả theo dõi các biểu hiện bất thường sau khi uống

Bảng 3.6.

Thalassiosira pseudonana của chuột ............................................
106
Ảnh hưởng của Thalassiosira pseudonana đối với trọng lượng

Bảng 3.7.

cơ thể chuột .................................................................................
107

Ảnh hưởng của Thalassiosira pseudonana lên một số chỉ tiêu

Bảng 3.8.

huyết học của chuột .....................................................................
108
Ảnh hưởng của Thalassiosira pseudonana lên công thức bạch

Bảng 3.9.

cầu trong máu chuột .....................................................................
109
Đánh giá mức độ tổn thương tế bào và chức năng gan, thận của

chuột khi dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày .....................
109
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số khẩu phần thức ăn lên sinh trưởng của
ấu trùng tôm thẻ chân trắng .........................................................
112
Bảng 3.11. Tăng trưởng về khối lượng, tỉ lệ sống và thời gian biến thái của
ấu trùng tôm thẻ chân trắng được nuôi bằng các loại thức ăn
khác nhau .....................................................................................
112

viii


Bảng 3.12. Tăng trưởng về chiều dài thân của ấu trùng tôm thẻ chân trắng
nuôi bằng thức ăn khẩu phần 3 .....................................................
116

Bảng 3.13. Tăng trưởng về khối lượng, tỉ lệ sống và thời gian biến thái của
ấu trùng tôm thẻ chân trắng được nuôi bằng thức ăn khẩu phần
3...................................................................................................
116
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng về kích thước
của ấu trùng tôm thẻ chân trắng....................................................
118
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng về khối lượng
và thời gian biến thái của ấu trùng tôm thẻ chân trắng ..................
120
Bảng 3.16. Tăng trưởng về chiều dài của ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở mật
độ tôm nuôi thích hợp ..................................................................
122
Bảng 3.17. Tăng trưởng về khối lượng và thời gian biến thái của ấu trùng
tôm thẻ chân trắng ở mật độ tôm nuôi thích hợp ...........................
123
Bảng 3.18. Thành phần axít béo của tôm thẻ chân trắng giai đoạn
postlarvae 12 được nuôi bằng sinh khối Thalassiosira
3
125
pseudonana trong bể xi măng 30 m ............................................
Bảng 3.19 Hàm lượng kim loại và kháng sinh của giống tôm thẻ chân
trắng postlarvae 12 được nuôi bằng thức ăn Thalassiosira
3
126
pseudonana tươi sống ở các bể nuôi 30 m ...................................
Bảng 3.20. Kết quả tăng trưởng về chiều dài của tôm thẻ chân trắng nuôi
thương phẩm ................................................................................
128
Bảng 3.21. Tăng trưởng về khối lượng của tôm thẻ chân trắng nuôi thương

phẩm ............................................................................................
Bảng 3.22. Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng nuôi thương phẩm ...................

129
130

Bảng 3.23. Hàm lượng protein, kim loại và kháng sinh của tôm nguyên liệu
được nuôi từ mô hình thử nghiệm ................................................

ix

131


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.

Quy trình công nghệ sản xuất giống và nuôi thương phẩm tôm

Hình 2.1.

thẻ chân trắng
23
Quy trình chuẩn bị nguồn giống tảo Thalassiosira pseudonana
37

Hình 3.1.

Hình thái tế bào của Thalassiosira sp. chụp dưới kính hiển vi

Hình 3.2.

quang học 48
Hình thái tế bào của Thalassiosira sp. chụp dưới kính SEM
49

Hình 3.3.

ADN tổng số và nhân đoạn gen 18S r RNA của Thalassiosira

sp.
Hình 3.4.
Hình 3.5.
Hình 3.6.

51

Cây phát sinh chủng loại của Thalassiosira sp. dựa trên trình tự

gen 18S rRNA
52
Thalassiosira pseudonana trong môi trường lỏng...................53
Đĩa thạch và khuẩn lạc của Thalassiosira pseudonana trên môi

trường thạch agar 53
Hình 3.7.
Hình 3.8.

Bào tử sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana ở ống nghiệm .. 54

Đường cong sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana sau 14

ngày nuôi cấy ở bình thủy tinh 1 L
Hình 3.9.

55

Ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP lên sinh trưởng của

Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình

Hình 3.10.

Hình 3.11.

Hình 3.12.

Hình 3.13.

Hình 3.14.

thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy 57
Ảnh hưởng của môi trường khác nhau lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong
bình thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy
58
Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình
thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy 59
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của Thalassiosira

pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh
0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy
60
Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình
thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy 61
Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình thủy tinh 0,25 L

sau 6 ngày nuôi cấy

x

62


Hình 3.15. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh
0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy
63
Hình 3.16. Ảnh hưởng của độ kiềm lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình thủy tinh 0,25 L

sau 6 ngày nuôi cấy

64

Hình 3.17. Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của Thalassiosira

pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh

0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy
65
Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình
thủy tinh 1 L sau 6 ngày nuôi cấy
66
Hình 3.19. Ảnh hưởng của môi trường lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh 1

L sau 6 ngày nuôi cấy
67
Hình 3.20. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình
thủy tinh 1 L sau 6 ngày nuôi cấy
68
Hình 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh 1

L sau 6 ngày nuôi cấy
69
Hình 3.22. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình
thủy tinh 1 L sau 6 ngày nuôi cấy
70
Hình 3.23. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh 1

L sau 6 ngày nuôi cấy
71

Hình 3.24. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh 1

L sau 6 ngày nuôi cấy
72
Hình 3.25. Ảnh hưởng của độ kiềm lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình thủy tinh 1 L
sau 6 ngày nuôi cấy
73
Hình 3.26. Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của Thalassiosira

pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình thủy tinh 1 L

sau 6 ngày nuôi cấy
74
Hình 3.27. Ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP lên sinh trưởng của

xi


Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình

thủy tinh 2 L sau 6 ngày nuôi cấy
75
Hình 3.28. Ảnh hưởng của môi trường khác nhau lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong
bình thủy tinh 2 L sau 6 ngày nuôi cấy............................................ 76
Hình 3.29. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình
thủy tinh 2 L sau 6 ngày nuôi cấy

77
Hình 3.30. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh 2

L sau 7 ngày nuôi cấy
78
Hình 3.31. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong
bình thủy tinh 2 L sau 6 ngày nuôi cấy
79
Hình 3.32. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình thủy tinh 2 L
sau 6 ngày nuôi cấy................................................................................... 80
Hình 3.33. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bình thủy tinh 2

L sau 6 ngày nuôi cấy
81
Hình 3.34. Ảnh hưởng của độ kiềm lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình thủy tinh 2 L
sau 6 ngày nuôi cấy................................................................................... 82
Hình 3.35 Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bình thủy tinh 2 L
sau 6 ngày nuôi cấy................................................................................... 83
Hình 3.36. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bể
3

composite 0,2 m sau 6 ngày nuôi cấy
85

Hình 3.37. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bể
3

composite 0,2 m sau 6 ngày nuôi cấy
86
Hình 3.38. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bể
3

composite 0,2 m sau 6 ngày nuôi cấy
86
Hình 3.39. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bể composite 0,2

xii


3

m sau 6 ngày nuôi cấy............................................................................ 87
Hình 3.40. Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bể composite 0,2 m

3

sau 6 ngày nuôi cấy................................................................................... 88
Hình 3.41. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bể
3

composite 1 m sau 6 ngày nuôi cấy................................................ 89
Hình 3.42. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bể
3

composite 1 m sau 6 ngày nuôi cấy................................................ 90
Hình 3.43. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của Thalassiosira
pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bể composite 1
3

m sau 6 ngày nuôi cấy............................................................................ 91
Hình 3.44. Ảnh hưởng của chế độ sục khí khác nhau lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bể
3

composite 1 m sau 6 ngày nuôi cấy................................................ 92
Hình 3.45 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu khác nhau lên sinh trưởng
của Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bể
3

composite 3,5 m sau 6 ngày nuôi cấy............................................ 93
Hình 3.46. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng khác nhau lên sinh trưởng
của Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bể
3

composite 3,5 m sau 6 ngày nuôi cấy............................................ 93
Hình 3.47. Ảnh hưởng của độ mặn khác nhau lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại trong bể
3

composite 3,5 m sau 6 ngày nuôi cấy............................................ 94
Hình 3.48. Ảnh hưởng của chế độ sục khí khác nhau lên sinh trưởng của
Thalassiosira pseudonana có mật độ tế bào đạt cực đại ở bể
3

composite 3,5 m sau 6 ngày nuôi cấy............................................ 95
Hình 3.49 Quy trình công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana ở quy mô
phòng thí nghiệm và pilot....................................................................... 97
Hình 3.50. Ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn postlarvae 12 được nuôi

bằng thức ăn Thalassiosira pseudonana tươi sống
117
Hình 3.51. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở mật độ tôm nuôi
khác nhau 121
Hình 3.52. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở mật độ tôm nuôi
thích hợp 124

xiii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Trên thế giới, đã phát hiện được khoảng 40.000 loài tảo chiếm khoảng 11% số loài
thực có. Ở Việt Nam, số loài tảo đã phát hiện được là trên 2.000 loài [1]. Vi tảo là mắt
xích đầu tiên của chuỗi thức ăn quan trọng trong các thủy vực cho các đối tượng thủy
hải sản. Vi tảo giàu dinh dưỡng, chứa các axít béo, đặc biệt là các axít béo không no đa
nối đôi (PUFAs, polyunsaturated fatty acid); có kích thước phù hợp với cỡ miệng của
ấu trùng tôm, cá, nhuyễn thể và dễ tiêu hóa [2]; chúng có khả năng nuôi cấy nhanh với
chi phí thấp và có thể sản xuất ở quy mô lớn, năng suất sản xuất cao gấp 10 - 100 lần

so với thực vật [3]. Nhiều công bố về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, mật độ tế
bào (MĐTB) ban đầu, nhiệt độ, cường độ ánh sáng (CĐAS), pH môi trường nuôi, độ mặn
ảnh hưởng lên thành phần sinh hóa, năng suất sinh khối, tốc độ sinh trưởng, kích
thước tế bào, thời gian nuôi sinh khối vi tảo đã được ghi nhận [4], [5], [6], [7].
Hiện nay, trong trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng (TTCT) việc nuôi sinh khối vi tảo
gặp nhiều khó khăn như dễ bị nhiễm vi sinh vật và tảo tạp, nguồn giống ban đầu kém chất
lượng, môi trường dinh dưỡng dư thừa gây ô nhiễm môi trường nước nuôi, MĐTB đạt cực
đại thấp, tảo tàn lụi nhanh, tốc độ sinh trưởng đặc trưng thấp, kích thước tế bào không
đồng đều, tế bào bị dị dạng nhiều, sinh khối đạt thấp, chi phí cho nuôi trồng là cao. Giai
đoạn zoea của ấu trùng TTCT sử dụng vi tảo phải giàu dinh dưỡng, kích thước tế bào phải
vừa với cỡ miệng ấu trùng tôm.... Kích thước tế bào vi tảo càng nhỏ sẽ cho phép
sử dụng cho ấu trùng TTCT ở giai đoạn càng sớm. Cung cấp đủ thức ăn tươi sống có chất
lượng dinh dưỡng cao trong 15 ngày đầu của ấu trùng TTCT là bí quyết công nghệ ở các
trang trại nuôi trồng thủy sản (NTTS) hiện nay. Loài Thalassiosira pseudonana có kích
thước tế bào nhỏ hơn so với Thalassiosira weissflogii tuy nhiên nuôi trồng chúng lại khó
khăn hơn. Hiện nay, ở một số trang trại NTTS đã nuôi được loài T. weissflogii rất thành công
và ổn định nhưng kích thước của loài này lớn, giá trị dinh dưỡng thấp, MĐTB đạt cực đại
thấp, thời gian lưu giữ quần thể tảo là ngắn, trong khi đó ở các trang trại này lại chưa nuôi
được loài T. pseudonana. Loài T. pseudonana có kích thước tế bào từ 4 - 5 µm, rất vừa với
cỡ miệng của ấu trùng TTCT ở giai đoạn zoea (4 ngày nuôi đầu cho zoea 1, 2,
3) và mysis (3 ngày tiếp theo cho mysis 1, 2, 3), giai đoạn tiếp theo từ postlarvae 1 đến
postlarvae 12 (nếu có đủ sinh khối tươi sống để cung cấp thì cũng rất tốt). Giá trị dinh
dưỡng của T. pseudonana cao, hàm lượng lipít từ 20,60 - 24,67% sinh khối khô (SKK) trong
đó, axít béo bão hòa (SFAs, saturated fatty acid) chiếm 36,72% so với axít béo tổng số (TFA,
total fatty acid), axít béo không bão hòa một nối đối (MUFAs, monounsaturated fatty acid)
chiếm 44,67% so với TFA, axít béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs,

1

polyunsaturated fatty acid) chiếm 12,85% so với TFA và axít eicosapentaenoic (EPA,
eicosapentaenoic acid) chiếm 2,15% so với TFA [8]; hàm lượng protein đạt (18 - 30% SKK),
carbohydrate (17 - 26% SKK) [5]. Ngoài ra, sinh khối của vi tảo này còn giàu các chất
khoáng đa và vi lượng, giúp tôm tiêu thụ thức ăn tốt và giữ được năng lượng hiệu quả hơn,
từ đó giúp tôm tăng trưởng nhanh và ổn định, rút ngắn thời gian biến thái và có tỉ lệ sống
cao. Hơn thế nữa, vi tảo T. pseudonana có khả năng sinh trưởng và phát triển ổn định trong
6

hệ thống nuôi trồng, chúng có MĐTB đạt cực đại cao là 0,82 x 10 tb/mL

[5] và thời gian lưu giữ, cấy chuyển dài. Đây là ưu điểm nổi bật để có thể lưu giữ ổn
định trong thời gian kéo dài quần thể tảo. Thời gian lưu giữ ở nhiệt độ thường có thể
kéo dài từ 1 - 2 tháng sẽ giúp cho các trại sản xuất giống TTCT chủ động về nguồn
giống, thời gian cấy chuyển và sàng lọc lại giống dễ dàng, dễ bảo quản giống. Do vậy,
sản xuất sinh khối T. pseudonana làm thức ăn sống để cung cấp đủ dinh dưỡng cho ấu
trùng TTCT là yếu tố quyết định đến tỉ lệ sống, tăng trưởng, thời gian biến thái và nâng
cao chất lượng tôm giống. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng
ứng dụng T. pseudonana trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các kết quả nghiên cứu
nhìn chung chưa mang tính hệ thống. Nguồn giống chủ yếu là nhập ngoại; tảo chưa
được phân lập lại khi bị nhiễm tạp và vi sinh vật; việc lưu giữ tảo giống cũng như là
chưa nuôi trồng được T. pseudonana trên quy mô lớn và sử dụng loài này cho TTCT.
Việc chứng minh tính an toàn của sinh khối T. pseudonana nuôi trồng được và sử dụng
chúng cho sản xuất giống TTCT ở Việt Nam là hoàn toàn mới ở Việt Nam.

Chính vì vậy, trong trại sản xuất giống TTCT, việc phân lập lại tảo khi bị nhiễm vi
sinh vật và tảo tạp, lưu giữ giống, nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho nuôi sinh
khối T. pseudonana thành công cũng như nâng cao chất lượng sinh khối tươi sống
của chúng ở các hệ thống nuôi hở là rất quan trọng và cần thiết cho việc tạo nguồn
thức ăn để nâng cao năng suất và chất lượng giống TTCT ở điều kiện Việt Nam.
Xuất phát từ thực trạng nghiên cứu và tính cấp thiết nêu trên, chúng tôi đã tiến

hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira
pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được quy trình công nghệ thích hợp nuôi sinh khối
Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot trong điều
kiện trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng và thu sinh khối đủ tiêu chuẩn
làm nguyên liệu thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng.

3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập lại khi tảo bị nhiễm vi sinh vật và tảo tạp, lưu giữ, nghiên cứu đặc điểm sinh

học, thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana ở các quy mô
3

bình thủy tinh 0,25 - 2 L và bể composite 0,2 - 3,5 m .
2


- Xây dựng quy trình công nghệ tối ưu nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana
3

trong các quy mô bình thủy tinh 0,25 - 2 L và bể composite 0,2 - 3,5 m .
- Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn và tác dụng sinh

dược của sinh khối Thalassiosira pseudonana đạt tiêu chuẩn an toàn làm
thức ăn cho các loài động vật thủy sản.
- Nghiên cứu sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống nuôi trồng
được làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở các trang trại sản xuất giống.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
- Kết quả nghiên cứu thu được của Luận án đã cung cấp những cơ sở dữ liệu về đặc
điểm sinh học của Thalassiosira pseudonana cho tập đoàn giống vi tảo được nuôi trồng tại
Việt Nam; các số liệu khoa học thu được cho phép làm chủ quy trình nhân nuôi sinh

khối trong điều kiện phòng thí nghiệm, khả năng cung cấp sinh khối tươi
3

sống ổn định và mang tính bền vững ở quy mô bể composite 3,5 m .
- Các kết quả của Luận án có ý nghĩa thực tiễn cung cấp các dẫn liệu khoa học
giúp các cơ sở sản xuất sinh khối vi tảo làm chủ được quy trình nuôi, thu sinh khối
tươi sống đạt chất lượng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng.

5. Những điểm mới của luận án
- Luận án Tiến sĩ là công trình nghiên cứu đầu tiên có hệ thống về việc lưu giữ và nuôi

trồng được loài vi tảo biển Thalassiosira pseudonana từ phòng thí nghiệm
3

đến quy mô pilot 3,5 m trong điều kiện ở Việt Nam.
- Sinh khối thu được từ quy trình công nghệ nuôi trồng loài Thalassiosira
pseudonana này đã được đánh giá là an toàn, đạt tiêu chuẩn làm thức ăn
tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng.
- Đã sử dụng thành công sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống nuôi được
để làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng trong trại sản xuất giống ở Việt Nam.
Đã sử dụng nguồn tôm giống sản xuất được bằng sinh khối Thalassiosira pseudonana
tươi sống để nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng thành công ở Việt Nam.

6. Cấu trúc của luận án
Luận án bao gồm 150 trang với 29 bảng số liệu, 54 hình và ảnh liên quan,

và 147 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: Mở đầu (03 trang), Tổng
quan (26 trang), Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang), Kết quả và
Thảo luận (87 trang), Kết luận và Kiến nghị (02 trang), Danh mục công trình
công bố (01 trang), Tài liệu tham khảo (13 trang) và Phụ lục (40 trang).

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về vi tảo trong nuôi trồng thủy sản
1.1.1. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo
Ngày nay vi tảo là thức ăn không thể thiếu được ở giai đoạn ấu trùng của nhiều
loại thủy hải sản, được sử dụng làm thực phẩm bổ dưỡng/chức năng cho con
người và động vật nuôi, cung cấp các chất có hoạt tính sinh học được dùng làm
thuốc, mỹ phẩm, dược phẩm; có vai trò bảo vệ môi trường và cố định CO 2 giảm
phát thải khí nhà kính, làm nguồn phân bón và nhiên liệu sinh học [9], [10]. Hiện nay
sản xuất sinh khối vi tảo rất thấp ước đạt 20.000 tấn SKK/năm, giá SKK cao khoảng
1000 USD/tấn, trong khi đó nhu cầu thị trường ngày càng cao [11].
Vi tảo là nguồn cung cấp các vitamin quan trọng. Những loại vitamin chính gồm
thiamine (vitamin B1), riboflavin (B2), pyridoxine (B6), cyanocobalamin (B12), vitamin C,
pyridoxyl phosphate và các loại vitamin tan trong mỡ như vitamin A, D, E và K.
Thalassiosira pseudonana có hàm lượng vitamin C đạt 1,1 mg/g SKK và B 2 đạt 20 µg/g
SKK ở pha logarit [12]. Kết quả khảo sát của Brown và cộng sự (1996) ở 6 loài vi tảo
thuộc các lớp khác nhau cho thấy chúng chứa hàm lượng cao vitamin B 1 từ 48 đến 106
µg/g SKK và cao hơn nhu cầu của nhiều loài sinh vật biển [12]. Vi tảo sống rất giàu dinh
dưỡng và dễ tiêu hóa hơn nhiều so với các sản phẩm thay thế như bột đậu tương và
bột cá. Tảo đông khô và dạng paste được lựa chọn để thay thế vi tảo sống trong nuôi
trồng các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Bổ sung tảo đông khô hỗn hợp để thay thế một
phần sinh khối vi tảo sống đã nâng cao được tốc độ sinh trưởng và khả năng sống sót

của các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ như Hàu, Sò, Trai và Điệp [12].
Vi tảo rất giàu dinh dưỡng, là nguồn cung cấp protein, khoáng chất đa và vi lượng,
polysacarit, các axít béo mạch dài không bão hòa đa nối đôi (Long chain polyunsaturated
fatty acids - LCPUFAs), cung cấp các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao như sterols,
sắc tố, enzyme và một vài hợp chất khác… cho con người và động vật [13], [14], [15]. Sinh
khối vi tảo đã được bổ sung có hiệu quả tốt vào thành phần thức ăn cho các loài gia súc và
gia cầm, cho tằm và cá cảnh. Sinh khối Chlorella, Scenedesmus, Spirulina được bổ sung
vào khẩu phần thức ăn của gà với tỉ lệ 7,5 - 10% là giải pháp có lợi cho kinh tế. Loài
Thalassiosira sp. thuộc chi Thalassiosira có các điều kiện nuôi trồng khá tương đồng với
loài T. pseudonana. Thalassiosira sp. có hàm lượng dinh dưỡng cao như protein 18 - 30%
so với SKK, lipít 20,60 - 24,67% so với SKK, EPA (11,32 - 16,65% so với TFA), DHA (0,80 1,33% so với TFA) và các loại axít amin thiết yếu [2], [8]. Bổ sung 5% Spirulina trong thức ăn
của cá mè trắng, mè hoa, trắm cỏ, rô phi đã làm tăng tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng của
chúng. Bổ sung tảo tươi vào khẩu phần thức ăn của gà mái làm tăng tỉ lệ đẻ và hàm lượng
vitamin A trong trứng [16].

4


Nhu cầu sử dụng nguồn PUFAs được chiết xuất từ bột cá và dầu cá ngày càng tăng cao
hiện nay là một thách thức lớn trong phát triển NTTS [17]. Nguồn PUFAs cho thủy hải sản
được cung cấp chủ yếu thông qua chế độ ăn là các loài vi tảo như tảo silic. Đây là nguồn
cung cấp dồi dào và phong phú có tiềm năng cho sản xuất thương mại [15], [18] có thể thay
thế từng phần dầu cá trong tương lai [19]. DHA được sản xuất bởi vi tảo dị dưỡng (VTDD)
như Crypthecodinium cohnii, Schyzochytrium mangrovei [16], [20] và một số loài tảo đơn
bào khác [13] đã được thương mại hóa để sản xuất DHA ở quy mô công nghiệp [14], [21].
EPA và DHA là chất bổ dưỡng có lợi cho sức khỏe con người

[13]. Hiện nay, có nhiều loài tảo biển giàu EPA, DHA có tiềm năng trở thành nguồn cung
cấp các axít béo nêu trên [15], [18]. Các PUFAs như EPA và DHA có tác dụng cho hoạt
động của mắt, phụ nữ có thai, giảm các bệnh rối loạn nhịp tim, đột quỵ và huyết áp cao

[22], chống bệnh trầm cảm, viêm khớp dạng nhẹ và hen suyễn [23], hỗ trợ giảm ung thư
vú ở người. Tuy nhiên, trong cơ thể con người không thể tự tổng hợp DHA. Do đó,
chúng phải được cung cấp chủ yếu từ các nguồn thức ăn và liều sử dụng cho người
trưởng thành có thể từ 450 - 500 mg EPA và DHA/ngày [23] và 500 mg DHA/ngày [22].

VTDD có thể thay thế dầu cá trong việc cung cấp các ω - 3 PUFAs [24] với những
thuận lợi như nuôi trồng không cần ánh sáng, ít tạp nhiễm, có thể sản xuất quanh
năm, không phụ thuộc mùa hay khí hậu; dễ dàng kiểm soát được điều kiện nuôi
trồng, đảm bảo được chất lượng sản phẩm theo mong muốn; MĐTB tảo đạt cao, có
thể trên 100 g SKK/L; và có thể sử dụng các kỹ thuật lên men hiện đang được sử
dụng rộng rãi trong công nghệ vi sinh cho việc nuôi trồng các VTDD.
Mặc dù vậy, sản xuất ω - 3 PUFAs từ VTDD cũng có một số thách thức như: chỉ một
số ít các loài VTDD tích luỹ ω - 3 PUFAs có hàm lượng cao; do môi trường nuôi rất giàu
dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của tảo tương đối thấp nên dễ bị tạp nhiễm; cần phải
cân đối chi phí sản xuất với giá thị trường. Vi tảo là nguồn nguyên liệu tiềm năng có
khả năng thay thế biểu hiện protein, sản xuất thuốc và dược phẩm trong tương lai [10].
T. pseudonana là nguồn nguyên liệu thiết yếu giúp thể hiện kháng nguyên IbpA DR2
bảo vệ từ Histophilus somni để sản xuất vắc - xin chống lại bệnh hô hấp của bò và sản
xuất các loại protein tái tổ hợp cao có giá trị với chi phí thấp [3]. Ngoài ra, vi tảo nói trên
còn được sử dụng trong nghiên cứu quang bảo vệ ở mức tế bào nhằm xác định vai trò
của các protein như LI818 trong việc giảm stress hiệu quả [25].

1.1.2. Sử dụng vi tảo trong ương nuôi ấu trùng động vật thân mềm
Lượng vi tảo cần thiết để sản xuất giống và nuôi thương phẩm động vật thân mềm là rất
lớn. Chúng là nguồn thức ăn trong suốt vòng đời sống của nó. Năm 1997, ở Pháp, người ta
đã sản xuất 147.150 tấn hàu và lượng hậu ấu trùng cần cung cấp là khoảng 5 tỉ con, trong
đó 10% là giống sản xuất nhân tạo. Lượng vi tảo cần sản xuất để cho ra sản lượng trên là
khoảng 8 - 11 tấn SKK/năm. Ở Mỹ, Công ty Coast Seafood đã sản xuất khoảng 40.000 tấn
hàu và phải cần đến 20 tỉ ấu trùng điểm mắt. Lượng vi tảo đã sản xuất để phục vụ là khoảng
20 tấn SKK/năm [26]. Vi tảo còn được dùng để làm gia tăng giá trị

5


của sản phẩm thân mềm trước khi tiêu thụ. Ví dụ, ở Pháp hàu có màu xanh ở phần mang và
môi xúc tu thì có giá cao hơn 40% so với hàu bình thường. Để có thể thu hoạch hàu có màu
xanh đặc biệt này, người nuôi hàu đã áp dụng kỹ thuật “làm xanh hóa” hàu bằng cách cho
hàu ăn vi tảo silic Haslea ostrearia phân bố tự nhiên trong ao ở vùng duyên hải phía tây
nước Pháp hoặc nuôi thu sinh khối trong điều kiện nhân tạo [26].

1.1.3. Sử dụng vi tảo trong nuôi luân trùng và artemia
Một số loài thuộc các chi tảo Chaetoceros, Thalassiosira, Isochrysis, Nannochloropsis và
Tetraselmis được sử dụng phổ biến trong các trại giống thủy hải sản với mục đích nói trên.
Bên cạnh việc sử dụng vi tảo tươi để nuôi luân trùng, các dạng vi tảo khô (đơn bào) hay cô
đặc được xem là những tiến bộ trong kỹ thuật nuôi luân trùng bằng vi tảo. Ở Nhật Bản, sản
phẩm vi tảo Chlorella nước ngọt cô đặc chứa trong thùng 18 L với MĐTB khoảng 20 tỉ tế
bào (tb)/mL được dùng làm thức ăn nuôi luân trùng. Mật độ luân trùng khi nuôi bằng
Chlorella cô đặc cao hơn nhiều (5.000 - 8.000 cá thể/mL) so với nuôi bằng

vi tảo tươi (500 - 1.500 cá thể/mL) [26]. Thalassiosira weissflogii được nuôi
trồng và thu hoạch để làm thức ăn tươi cho luân trùng [27]. Theo Vartak và
Joshi (2002), Artemia phát triển khá tốt khi cho ăn bằng tảo Spirulina sp., đạt
chiều dài sau 12 ngày nuôi của Artemia (8 mm) cao hơn Artemia cho ăn bằng
tảo Tetraselmis sp. (7,7 mm) và Chaetoceros sp. (7,5 mm) [28].

1.1.4. Sử dụng vi tảo trong sản xuất giống cá biển
Ngoài nhu cầu dùng vi tảo để làm thức ăn và làm giàu thức ăn sống như luân trùng,
Artemia, vi tảo còn được đưa trực tiếp vào bể ương nuôi ấu trùng cá biển. Đây gọi là
“kỹ thuật nước xanh” thường áp dụng trong ương nuôi nhiều loài cá biển khác nhau.
Tác dụng của sự hiện diện của vi tảo trong bể ương nuôi ấu trùng góp phần ổn định

chất lượng nước trong các hệ thống nuôi nước tĩnh (loại thải các sản phẩm trao đổi
chất, tạo ôxy) [29], nguồn thức ăn trực tiếp do hoạt động bắt mồi của cá và lớp vỏ tế
bào vi tảo giàu polysaccharide có thể giúp tăng khả năng miễn dịch không đặc hiệu ở
cá [9], nguồn dinh dưỡng gián tiếp cho ấu trùng thông qua con đường thức ăn sống (vi
tảo giúp duy trì giá trị dinh dưỡng của thức ăn sống khi đưa vào bể ương nuôi ấu
trùng) [30], tăng khả năng bắt mồi cho cá nhờ tăng mức độ tương phản giữa vật mồi và
môi trường nước [31] và một số loài vi tảo có khả năng tiết các chất ức chế vi khuẩn và
điều chỉnh hệ vi sinh vật trong đường ruột của ấu trùng [32]. Các muối khoáng trong
môi trường dinh dưỡng cung cấp cho vi tảo có thể giúp cân bằng nhu cầu khoáng ở ấu
trùng cá biển thông qua chuỗi thức ăn [26].

1.1.5. Vi tảo sử dụng trong trại sản xuất giống tôm biển và tôm thẻ
chân trắng
Vi tảo có một số ưu điểm như có kích thước nhỏ phù hợp với cỡ miệng của ấu trùng
tôm, dễ tiêu hóa, giàu dinh dưỡng và ít gây ô nhiễm môi trường, có hàm lượng dinh dưỡng
cao, nhiều loài không có độc tố, là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và

6


có khả năng nuôi sinh khối lớn, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết
cho ấu trùng tôm biển và tôm thẻ chân trắng.
Hiện nay, có nhiều loài vi tảo được sử dụng trong các trại sản xuất giống tôm
biển và tôm thẻ chân trắng như Thalassiosira weissflogii, Thalassiosira
pseudonana, Spirulina platensis, Skeletonema costatum, Chaetoceros calcitrans,
Chaetoceros gracilis, Tetraselmis chuii, Tetraselmis suesica, Isochrysis galbana.
Trong đó, Thalassiosira pseudonana được xem là nguồn thức ăn sống rất quan
trọng cho ương nuôi ấu trùng tôm [33], [34], [35], [36], [37].

Các loài vi tảo hiện đang được sử dụng khá rộng rãi trong nuôi ấu trùng

tôm biển và tôm thẻ chân trắng được liệt kê ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số loài vi tảo được sử dụng làm thức ăn cho ấu
trùng tôm biển và tôm thẻ chân trắng

Loài tôm

Loài vi tảo

Fenneropeaeus T. weissflogii

Kết quả

Tác giả

Tỉ lệ sống từ N6 - PL1 đạt 95,8%.

Emmerson (1980)

indicus
Penaeus

[38]
Chaetoceros sp. Tỉ lệ sống Z3/Z1 đạt 70% và

merguiensis
Litopenaeus
vannamei

M3/M1 đạt 60%.
S. costatum

C. calcitrans
C. gracilis

Đoàn Văn Đẩu
(1996) [39]

Sinh trưởng và tỉ lệ sống tốt nhất Lodeiros và cộng sự
ở giai đoạn zoea đạt 76% với C.
(2002) [33]
gracilis.

T. chuii
I. galbana
T. pseudonana
L. vannamei

C. calcitrans

Tỉ lệ sống ở giai đoạn PL1 đạt Nguyễn Thanh Mai
76% và tốc độ tăng trưởng tốt ở và cộng sự (2009)
[34]
PL5 đạt 5,05 mm.

Penaeus

T. weissflogii

monodon

C. gracilis

Tỉ lệ sống của giai đoạn PL1 đạt
98% và thời gian biến thái ngắn
với T. weissflogii.

L. vannamei

C. calcitrans
T. suesica

Kiatmetha và cộng
sự (2010) [35]

Sinh trưởng và tỉ lệ sống tốt nhất Pérez - Morales và
ở giai đoạn zoea đạt 92% với T. cộng sự (2016) [37]
suesica.

7


Đào Văn Trí (2012) [40] đã công bố: sử dụng Chaetoceros sp., S. costatum để làm thức ăn
tươi kết hợp với thức ăn tổng hợp (Lansy và Frippak) cho ấu trùng TTCT và đã khẳng định
tỉ lệ sống của hậu ấu trùng (PL8) đạt 76,8%. Brown và cộng sự (1997) đã cho thấy ở một số
loài tảo đơn bào, hàm lượng protein dao động từ 6 - 52%, carbohydrate từ 5 - 23% và lipít 7 23% [41]. Ngoài ra, vi tảo rất giàu PUFAs đặc biệt là DHA, EPA, ARA (axít arachidonic), DPA
(axít docosapentaenoic) [13], điều này góp phần làm tăng khả năng thành thục của tôm bố
mẹ, tăng khả năng sống sót của ấu trùng tôm, rút ngắn được thời gian chuyển giai đoạn
của chúng [42]. T. pseudonana có giá trị dinh dưỡng cao như lipít 24,67% so với SKK, axít
béo bão hòa - SFAs 36,72% so với TFA, axít béo không bão hòa một nối đôi - MUFAs 44,67%
và axít béo không bão hòa đa nối đôi - PUFAs 12,85% [8]. T. pseudonana chứa thành phần
axít béo chiếm khoảng 10 - 20% so với TFA và EPA cao gấp 5 - 10 lần so với DHA [13]. Do

thức ăn ưa thích của ấu trùng tôm chuyển dần từ thực vật ở giai đoạn zoea sang động vật ở
giai đoạn mysis nên lượng vi tảo cho ăn giảm dần. Tuy nhiên, vẫn cần một lượng vi tảo nhất
định để cho vào bể nuôi ấu trùng tôm nhằm ổn định chất lượng nước. T. weissflogii làm
thức ăn tươi cho các trại sản xuất ấu trùng tôm he Ấn Độ (F. indicus) [38] và được chế biến
ở dạng đông khô để làm thức ăn bổ sung cho nuôi thương phẩm TTCT đạt tăng trưởng 0,57
- 0,64 g/tuần và tỉ lệ sống đạt 93,8 - 100% [43]. S. platensis được sử dụng thay thế 25% bột
cá trong khẩu phần ăn để giúp TTCT có thể kích thích hệ miễn dịch, tăng trưởng của chúng
[17].

Theo Nguyễn Thanh Mai và cộng sự (2009) [34]: nuôi sinh khối C. calcitrans ở
o

6

môi trường TT3, 30‰, 27 C, 3,7 klux, MĐTB ban đầu 0,6 x 10 tb/mL và chế độ sục
khí (CĐSK) 24/24 giờ để làm thức ăn cho ấu trùng TTCT đã cho thấy ấu trùng TTCT
có tốc độ tăng trưởng về chiều dài và tỉ lệ sống như sau ở giai đoạn N - Z 1 (1,47
mm, 95%), Z - M1 (2,98 mm, 88%), M - PL1 (3,83 mm, 76%) và PL5 (5,05 mm).
Theo kết quả nghiên cứu của Kiatmetha và cộng sự (2011) [35]: nuôi sinh khối T.
weissflogii để làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú cho thấy chúng có khả năng sinh
trưởng tốt, thời gian biến thái ngắn và tỉ lệ sống của giai đoạn PL 1 đạt 98%. Nghiên cứu
này cũng đã xác định được sinh khối tảo chứa protein tổng số chiếm 326,67 mg/g SKK,
axít béo tổng số - 39,32 mg/g SKK, protein - 1,59 ng/tb, axít béo tổng số - 45,67 pg/tb,
EPA - 11,57 pg/tb, DHA - 2,74 pg/tb, SFAs - 29,58%, MUFAs - 30,38% và PUFAs - 40,04%.
García và cộng sự (2012) [44] đã công bố: nuôi T. weissflogii trong bình thủy tinh 0,5 L
o

2

trên môi trường F/2 ở 20 ± 1 C, 500 µmol/m /s và 25 - 50‰ đạt đến pha tiềm ở ngày thứ

3, pha log - 5 ngày và pha cân bằng - 7 ngày. Kết quả cho thấy ở 25‰ và 30‰ MĐTB đạt
6

cực đại là (0,43 và 0,42) x 10 tb/mL, tốc độ sinh trưởng đặc trưng µ = 1,24 và µ =
3

1,12/ngày; kích thước tế bào 1594,3 và 1489,0 mµ ; protein tương ứng 3 pha nói trên đạt
lần lượt là 199, 238, 352 và 177, 226, 325 mg/g; carbohydrate 144, 235, 256 và 152, 240,
248 mg/g; lipít 249, 225, 219 và 247, 237, 214 mg/g. Độ mặn tối ưu cho sinh trưởng là
6

25‰. Ở 50‰ thì MĐTB đạt thấp (0,35 x 10 tb/mL), tốc độ sinh trưởng đặc trưng rất thấp
3

(µ = 0,81/ngày) và kích thước tế bào giảm rõ rệt chỉ còn 563,7 mµ . Protein,
carbohydrate, lipít đạt cao nhất ở 25‰ và 30‰ tại pha cân bằng. Còn Li và cộng sự
8


(2017) [45] đã công bố: nuôi T. weissflogii dưới điều kiện môi trường dinh
-

3-

dưỡng NO3 15 - 50 µmol/L, PO4 1,5 - 5 µmol/L và duy trì tỉ lệ N/P là 10:1, 200
2

o

µmol photons/m /s với chu kỳ sáng : tối 12 : 12 giờ và 20 C trong bình thủy

tinh 1 L cho thấy vi tảo nói trên có thể sinh trưởng trong môi trường dinh
dưỡng thấp với CĐAS hạn chế nhưng lại có sinh trưởng cao.
Ngoài vai trò làm thức ăn cung cấp dinh dưỡng cho động vật thủy sản, vi tảo còn có
tác dụng kích thích enzyme tiêu hóa của ấu trùng tôm (chủ yếu là trypsin) nâng cao tốc
độ tăng trưởng [46]. Ấu trùng tôm có nhu cầu về thức ăn bắt buộc phải là tảo trong một
giai đoạn vòng đời của tôm. Nhu cầu về axít béo khác nhau giữa các loài tôm là khác
nhau. Giai đoạn tôm giống và tôm trưởng thành không có khả năng tổng hợp đủ n - 3
PUFAs mạch dài để duy trì sinh trưởng tối đa. Vì vậy, trong khẩu phần thức ăn có hàm
lượng EPA và DHA khoảng 1% được xem là phù hợp đối với tôm [12], [46].
Vi tảo có vai trò rất quan trọng đối với hầu hết các đối tượng nuôi của ngành nuôi trồng
thủy sản, đặc biệt đối với nghề nuôi tôm biển trong đó có ấu trùng tôm thẻ chân trắng.
Không có trại sản xuất TTCT nào thành công mà không có sự hiện diện của vi tảo tươi
sống. Vì vậy, việc sàng lọc, lưu giữ và nuôi sinh khối vi tảo nói trên có giá trị dinh dưỡng
nhằm cung cấp giống, sinh khối tươi sống chủ động và ổn định phục vụ nhu cầu sản xuất
giống TTCT là việc làm cấp thiết và vô cùng có ý nghĩa cho ngành NTTS.

1.2. Giới thiệu về Thalassiosira pseudonana
1.2.1. Vị trí phân loại của Thalassiosira pseudonana
Loài Thalassiosira pseudonana thuộc chi Thalassiosira của bộ Thalassiosirales
được Cleve mô tả và phân loại lần đầu tiên vào năm 1873 [47], [48], [49], tế bào ở dạng
đơn bào, tảo silic trung tâm, tế bào có kích thước nhỏ 4 - 5 µm, tế bào hình trụ, vuông
hoặc hơi tròn, không có lông roi, màu nâu. Trục cao của tế bào thường ngắn hoặc dài
hơn trục dài. Màng tế bào có thể dễ dàng nhìn thấy cùng với thành tế bào có độ dày
biến đổi. Rất hiếm khi tìm thấy cấu trúc dạng sợi ở thành tế bào ngoài. T. pseudonana
được tìm thấy có tế bào dạng hình tròn hoặc hình bầu dục, chúng phân bố rộng rãi ở
các thủy vực nước ngọt của Hoa Kỳ và Cộng hòa Liên Bang Nga, nước lợ và nước mặn
thuộc cửa biển của Na Uy [47] và miền đông Nhật Bản, Úc và miền Đông nước Anh [48].

1.2.2. Đặc điểm sinh học sinh sản của Thalassiosira pseudonana
Với ưu điểm vượt trội là kích thước tế bào nhỏ, Thalassiosira pseudonana là một trong

những loài vi tảo được ưu tiên lựa chọn trong các trại sản xuất giống cá biển (làm thức ăn
cho copepoda), các trại sản xuất nhuyễn thể (giai đoạn nhuyễn thể có kích thước 200 µm
trở lên) và các trại sản xuất tôm giống (giai đoạn mysis đến postlarvae) [7], [50]. Chính vì
vậy, chúng được nuôi phổ biến ở vùng nhiệt đới để làm thức ăn sống cho các loài nhuyễn
thể hai mảnh vỏ và ấu trùng tôm. Tuy nhiên, việc nuôi sinh khối nói trên thường chịu ảnh
hưởng của các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn và pH, những thay đổi về thành

9


phần dinh dưỡng và các yếu tố hóa lý trong môi trường nuôi sẽ ảnh hưởng đến
khả năng tổng hợp EPA trong tế bào [19]. Việc tổng hợp axít béo có thể được kiểm
soát thông qua việc điều chỉnh thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi, nhiệt độ,
CĐAS và chất lượng tảo giống. Theo Trương Ngọc An (1993) [51], Poulsen và cộng
sự (2006) [52] đa số các loài tảo silic có hai hình thức sinh sản:
- Sinh sản phân cắt theo kiểu nắp hộp: hai mảnh vỏ tách rời nhau ra. Mỗi mảnh vỏ
đều chứa chất tế bào với nhân và thể màu. Bất cứ mảnh nào của tế bào mới được hình
thành thì sau đó chúng sẽ tự tạo nên mảnh vỏ dưới. Như vậy, sau một số lần phân chia
sẽ dẫn đến kích thước tế bào bị giảm dần (từ 1/2 đến 1/3 so với kích thước ban đầu).

- Sinh sản bằng bào tử trong điều kiện bất lợi: các hình thức sinh sản
bằng bào tử như bào tử nghỉ, bào tử phục hồi độ lớn (do quá trình phân cắt
kiểu nắp hộp dẫn đến giảm kích thước tế bào sau nhiều lần phân chia).
+ Sự hình thành bào tử sinh trưởng (auxospore): khi kích thước tế bào
giảm, tảo silic phải tiến hành phục hồi lại kích thước ban đầu bằng cách
phân chia đặc biệt hình thành bào tử sinh trưởng.
+ Bào tử ngủ (resting spore): các loài tảo gần bờ trong bộ tảo silic trung tâm
thường có hình thức sinh sản bằng bào tử ngủ như chi Thalassiosira. Hình
thành bào tử ngủ để duy trì sự sống trong điều kiện bất lợi của môi trường như
nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, muối dinh dưỡng thiếu, ánh sáng bị hạn chế…

Tảo đơn bào T. pseudonana là một nguồn tiềm năng cho sản xuất protein [3], [53]. Đây là
loài sống trong môi trường nước biển và nước lợ. Chúng đòi hỏi môi trường sống có thành
phần dinh dưỡng tương tự như nước biển. Ngoài cacbon, vi tảo này có nhu cầu bắt buộc
về N, P, và Si [54]. Theo Pratoomyot và cộng sự (2005) [2]: nuôi T. pseudonana
ở độ mặn 30‰ có kích thước tế bào từ 2 - 20 µm, trong khi đó kích thước tế bào bị giảm và
hình thái tế bào thay đổi rõ rệt khi tăng độ mặn của môi trường nuôi lên đến 50‰. Còn theo
Brown và cộng sự (1996) [12]: ngành tảo silic có MUFAs chiếm 20 - 40% và PUFAs chiếm 20
- 59%; PUFAs của 4 loài tảo silic C. calcitrans, C. gracilis, T. pseudonana và S. costatum
biến động từ 4,6 - 11,1% so với TFA. Vi tảo được coi là có giá trị dinh dưỡng tốt cho các đối
tượng nuôi nếu hàm lượng PUFAs nằm trong khoảng từ 1 - 20 mg/mL tế bào [55]. Tuy nhiên,
hàm lượng lipít và axít béo có trong sinh khối vi tảo nuôi trồng được lại phụ thuộc rất nhiều
vào điều kiện môi trường, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, dinh dưỡng, pH, độ mặn [5], [56],
[57], [58]. Trong NTTS, T. pseudonana được sử dụng làm thức ăn tươi sống trực tiếp cho ấu
trùng TTCT giúp ấu trùng phát triển nhanh, tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống cao, đạt các tiêu
chí kỹ thuật và chất lượng tôm giống sạch bệnh, chất lượng nước nuôi ổn định, an toàn cho
người dân nuôi trồng chúng.

1.2.3. Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana
1.2.3.1. Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana trên thế giới
Ngày nay công nghệ nuôi các loài vi tảo đang được duy trì ổn định và hiệu quả trong
các trại sản xuất giống tôm biển trên thế giới. Tuy nhiên, với xu hướng nghiên cứu cần
10