Nhân nhanh cây bìm bịp (clinacanthus nutans (burm f ) lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
------------***------------

PHÙNG THỊ THANH HẰNG

NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP
(CLINACANTHUS NUTANS (BURM. F.)
LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Hà Nội, tháng 05 năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
------------***------------

PHÙNG THỊ THANH HẰNG

NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP
(CLINACANTHUS NUTANS (BURM. F.)
LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

TS. LA VIỆT HỒNG

Hà Nội, tháng 05 năm 2019


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
TS. La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2,
Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật,
khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm hoàn thành khóa luận
của mình.
Vì chưa có nhiều cơ hội tham gia nghiên cứu khoa học nên tôi còn
nhiều bỡ ngỡ cũng như kinh nghiệm còn nhiều hạn chế do đó không tránh
khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý, xây dựng của các
thầy cô và các bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện
hơn nữa. Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Sinh viên

PHÙNG THỊ THANH HẰNG


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện. Các số liệu và kết
quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và không trùng
lặp với những kết quả đã công bố.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Sinh viên

PHÙNG THỊ THANH HẰNG


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích của đề tài: ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................... 3
NỘI DUNG ................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4
1.1. Giới thiệu về cây Bìm bịp ........................................................................ 4
1.1.1. Phân loại và phân bố ...................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học........................................................................... 5
1.1.3. Giá trị dược liệu.............................................................................. 6
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................. 7
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................... 9
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................... 11
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2. Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu................................................. 11
2.2.1 Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 11
2.2.2. Dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 11

2.2.3. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................... 11
2.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 11
2.4. Điều kiện nuôi cấy................................................................................. 11
2.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 12
2.5.1.Tạo vật liệu khởi đầu. ...................................................................... 12


2.5.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro. ............................................... 13
2.5.3. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh............................................................. 14
2.5.4. Rèn luyện cây con in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên............ 15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 17
3.1. Hoàn thiện giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu ............................................ 19
3.2. Hoàn thiện giai đoạn tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm
bịp ................................................................................................................ 20
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in
vitro) ......................................................................................................... 20
3.2.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh
chồi in vitro) ............................................................................................. 22
3.3. Hoàn thiện giai đoạn ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh ......................... 25
3.4. Hoàn thiện giai đoạn Rèn luyện cây con in vitro thích nghi với điều
kiện tự nhiên ................................................................................................ 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 30


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP

6-benzyl amino purin

Ca(OCl)2

Calcium hypochlorite

HgCl2

Mercuric chloride

H2O2

Hydro peroxid

IAA

Acid β – indol axetic

IBA

Indol butyric acid

KTNN

Kĩ Thuật Nông Nghiệp

LSD0,05

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0,05

MS

Murashige và Skoog

NAA
NaClO

-napthalene axetic acid
Natri hypochlorite


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các công thức tạo vật liệu khởi đầu mẫu cây Bìm bịp ................. 12
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP đến khả năng
tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro .............................................. 13
Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP kết hợp với
NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro ............... 14
Bảng 2.4. Các công thức thí nghiệm tạo cây in vitro hoàn chỉnh .................. 15
Bảng 2.5. Các công thức thí nghiệm rèn luyện cây con in vitro .................... 15
Bảng 3.1. Hiệu quả tạo vật liệu khởi đầu mẫu cây Bìm bịp ......................... 17
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP (Benzyl Adenin Purin) đến khả năng tái
sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp (sau 8 tuần nuôi
cấy)............................................................................................... 20
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tái sinh
và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp (sau 8 tuần nuôi cấy) ..... 23
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IAA đến sự ra rễ của cây Bìm bịp in vitro (sau
4 tuần) .......................................................................................... 25
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống sót của cây Bìm bịp in
vitro .............................................................................................. 27

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây Bìm bịp bịp (Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau,
1894) ............................................................................................ 4
Hình 3.1: Quy trình tạo vật liệu khởi đầu giống cây Bìm bịp bằng
phương pháp in vitro .................................................................. 19
Hình 3.2: Mẫu cây Bìm bịp in vitro sau 1 tháng nuôi cấy trên19 môi trường
MS0 cơ bản ....................................................................................... 19
Hình 3.3: Chồi in vitro của cây Bìm bịp sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường
MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng .................................... 22
Hình 3.4: Chồi in vitro của cây Bìm bịp sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường
MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng .................................... 24
Hình 3.5: Rễ cây Bìm bịp in vitro sau 4 tuần nuôi cấy..................................... 26
Hình 3.6: Cây Bìm bịp in vitro sau 2 tuần đưa ra môi trường tự nhiên ........... 28


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây cỏ thảo dược từ lâu luôn là những loại thuốc có nhiều công dụng tốt
được sử dụng rộng rãi trong nền y học cổ truyền với những bài thuốc dân gian
dưới tác dụng của các loài cây dược liệu. Họ Ô rô (Acanthaceae) là một
họ lớn của thực vật hai lá mầm trong Lớp thực vật có hoa, chứa khoảng 214 250 chi (tùy hệ thống phân loại) và khoảng 2 500 – 4 000 loài. Ở Việt Nam có
khoảng 55 chi, khoảng 195 loài. Cây Bìm bịp tùy theo địa phương còn gọi là
cây Mảnh cộng hay cây Xương khỉ có tên khoa học Clinacanthus nutans
(Burm. f.) Lindau, 1894 là cây cỏ thảo dược lâu năm có khá nhiều công dụng
trong y học [1, 2, 6].
Đông y cho rằng, mảnh cộng có vị ngọt, tính bình, có tác dụng mát gan,
lợi đảm (tăng tiết mật), tiêu thũng (giảm phù nề), chống đau, hạ sốt, chống
viêm, điều kinh, lá thân tươi của cây giã nát đắp vết thương, cầm máu, bong

gân, gãy xương kín,… Được sử dụng để hỗ trợ điều trị viêm gan vàng da,
giảm tiết mật, đau nhức do phong thấp, gãy xương. Bộ phận dùng làm thuốc
là toàn cây thu hái quanh năm, dùng tươi hoặc phơi khô để dành [6].
Nghiên cứu trong y học hiện đại chỉ ra rằng thành phần chiết xuất cây
Bìm bịp hoạt động như một chất chống oxy hóa. Tám hợp chất đó là 132 –
hydroxyl - (132 - S) - chlorophyll B, 132 – hydroxyl - (132 - R) - chlorophyll
B, 132 –hydroxy - (132 - S) - phaeophytin B, 132 - hydroxy- (132 - R) phaeophytin B, 132 - hydroxy - (132 - S) - phaeophytin A, 132 – hydroxyl (132 - R) - phaeophytin A, purpurin 18 phytyl ester và phaeophorbide A được
phát hiện trong chiết xuất từ thân và lá cây [14]. Thí nghiệm dược lý đã chứng
minh rằng các loại chiết xuất và hợp chất tinh khiết từ loài này thể hiện một
loạt các đặc tính sinh học như chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa và
chống các bệnh tiểu đường.
Cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau, 1894) cây nhỏ,
mọc tự nhiên, cho đến nay nguồn giống cây chủ yếu được nhân giống bằng
phương pháp giâm cành từ cây mẹ hay gieo hạt, tuy nhiên tần số gia tăng chồi
hình thành cây mới thấp và qua thời gian giống bị thoái hóa và nhiễm bệnh từ

1


cây mẹ để lại, thân lá kém phát triển. Bởi vậy, nguồn giống cây ngày càng ít
đi và khó tìm.
Nghiên cứu của Gunasekaran năm 2014 về nhân giống cây Bìm bịp, kết
quả đưa ra đã thành công trong việc tạo ra mô sẹo nhưng không có kết quả tái
sinh cây con, lý do có thể bao gồm không phù hợp điều kiện thí nghiệm,
chẳng hạn như nồng độ của chất điều hòa tăng trưởng [15]. Ở Trung Quốc,
nghiên cứu của Chen B và cộng sự (2015) cũng đã tiến hành thí nghiệm
nghiên cứu phương pháp nhân giống nhanh cho cây Bìm bịp. Kết quả cho
thấy môi trường tăng sinh tối ưu cho cây Bìm bịp là Murashige và Skoog
(MS) với 1,0 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAA cung cấp hệ số nhân nhanh là 3,9.
Môi trường tạo rễ bao gồm ½ MS + 0,25 mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ cây hình

thành 100%.
Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về tác dụng sinh học và hóa học
từ cây Bìm bịp, tiến hành phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất
tinh khiết cho thấy chiết xuất từ thân cây Bìm bịp mọc tại Việt Nam có hoạt
tính chống viêm. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào về nhân giống cây
Bìm bịp ở Việt Nam.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, công nghệ nhân
giống vô tính bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật rất có hiệu quả trong sản
xuất cây trồng và hạn chế được những trở ngại mà các phương pháp khác gặp
phải, từ đó tạo ra được những giống cây trồng được trẻ hóa, sạch bệnh và đảm
bảo chất lượng về mặt di truyền.
Từ thực tế nêu trên, góp phần vào việc tạo ra nguồn giống sạch và chất
lượng, vì vậy chúng tôi đã chọn nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh cây Bìm
bịp (Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy
mô”.
2. Mục đích của đề tài:
Xây dựng quy trình nhân nhanh giống cây Bìm bịp (Clinacanthus
nutans (Burm. f.) Lindau, 1894), nhằm góp phần tạo ra nguồn giống cây sạch,
chất lượng cao.
3. Nội dung nghiên cứu
2


- Tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro.
- Tái sinh và nhân nhanh cây Bìm bịp in vitro.
- Ra rễ - Tạo cây Bìm bịp in vitro hoàn chỉnh.
- Rèn luyện cây in vitro thích nghi với môi trường tự nhiên.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: Bổ sung nguồn tài liệu hoàn thiện quy trình nhân
giống cây Bìm bịp.

- Ý nghĩa thực tiễn: Hoàn thiện quy trình nhân giống cây Bìm bịp, ứng
dụng vào sản xuất để cung cấp nguồn giống chất lượng cho người trồng dược
liệu.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Bìm bịp
1.1.1. Phân loại và phân bố

Hình 1.1. Cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau, 1894)
(Nguồn: trungtamduoclieu.vn)

Thuộc:
Giới: Thực vật (Plantea)
Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp: Hai lá mầm (Magnoliopsida)
Bộ: Hoa Môi (bộ Bạc Hà) (Lamiales)
Họ: Ô rô (Acanthaceae)
Tên khoa học: Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau, 1894
Tên Việt Nam: Bìm bịp (Mảnh cộng hay Xương khỉ)

4


Cây Bìm bịp (cây Mảnh cộng hay Xương khỉ) có tên khoa học là
Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau, 1894 thuộc họ Ô rô (Acanthaceae).
Họ Ô rô (Acanthaceae) là một họ lớn chứa khoảng 214 - 250 chi (tùy hệ

thống phân loại) và khoảng 2500 – 4000 loài. Trong họ Ô rô - Acanthaceae
bao gồm bốn phân họ, cụ thể là Nelsonioideae, Acanthoideae,
Thunbergioideae và Avicennioideae [14]. Họ này chủ yếu bao gồm các loài
cây bụi, nửa bụi hoặc gỗ. Trong số các loài từ họ này, chỉ có một số ít được
phân bố ở vùng ôn đới và hầu hết các loài phân bố ở khu vực Đông Nam Á.
Cây Bìm bịp có nguồn gốc từ các nước châu Á nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao
gồm Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam và Trung Quốc. Ở Việt Nam,
từ lâu cây Bìm bịp đã được biết đến như một vị thuốc dân gian với nhiều công
dụng khác nhau trong y học cổ truyền, lá của cây Bìm bịp được tìm thấy giàu
axit amin, nguyên tố vi lượng và thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao
[2, 12, 15].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
- Thân:
Cây Bìm bịp thuộc dạng bụi trườn, cây nhỏ, mọc trườn, có chiều cao lên
đến 3m, thân có cấu trúc rỗng [2, 13].
- Lá:
Lá nguyên, mọc đối, có cuống lá ngắn, phiến hình mác hay thuôn, mặt lá
hơi nhăn, mép hơi quăn và có màu xanh thẫm, kích thước bề mặt lá trung bình
1,5 cm x 7 cm [2, 15].
- Hoa:
Hoa mọc thành chùm tại đỉnh chồi hoặc gần đỉnh chồi, bông rủ xuống ở
ngọn. Mỗi bông hoa có một đài hoa với kích thước 0,9 - 1,3 cm, tràng hoa dài
~ 3,5 cm đường kính ~ 3 mm, dần dần mở rộng đến ~ 6 mm khi nở. Tràng
hoa có 2 môi, môi ở dưới có 3 răng hướng lên trên. Lá bắc hẹp. Hoa đỏ hay
hồng, bên ngoài có chứa lông tuyến (hình 1.1) [2, 13].
- Quả:
Quả của cây Bìm bịp thuộc quả nang dài ~ 2 cm, quả có chứa 4 hạt, hạt có
đường kính ~ 2 mm [13].

5

1.1.3. Giá trị dược liệu
Việc sử dụng thực vật làm thảo dược vẫn rất phổ biến ở cả thành thị và
xã hội nông thôn. Khoảng 80% dân số ở khu vực châu Á và châu Phi các
quốc gia vẫn sử dụng rộng rãi thuốc thảo dược cho một số khía cạnh của
chăm sóc sức khỏe cơ bản theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (Edgar, Elias
và Adnan 2002). Cây Bìm bịp là một loại thảo mộc bản địa trong số các
nước Đông Nam Á đặc biệt là ở Thái Lan, phần phía nam của Trung Quốc,
Indonesia, Malaysia và cả Việt Nam.
Đông y cho rằng, mảnh cộng có vị ngọt, tính bình, có giá trị sử dụng cả
ở trạng tươi hay trạng thái khô. Y học dân gian của các nước đã ghi nhận,
Bìm bịp có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, độc tế bào, trị
côn trùng cắn, sốt, ban da, lỵ, đái tháo đường [9, 16].
Ở nước ta, hiện nay cây đang được rất nhiều người tìm kiếm trong điều
trị các bệnh về xương khớp, dạ dày, viêm gan, vàng da và hơn thế nữa nó còn
giúp hỗ trợ điều trị căn bệnh ung thư [5].
Ở Trung Quốc (Hải Nam), người ta dùng thân, lá làm thuốc trị thương
tích và chữa thiếu máu, hoàng đản, phong thấp. Thường dùng cành lá khô sắc
uống. Dùng ngoài lấy lá tươi giã đắp [2].
Ở Thái Lan, một chiết xuất cồn của lá tươi được dùng trị bỏng, sâu bọ
đốt, côn trùng cắn, kháng khuẩn, chống viêm và giảm đau, một số bệnh ngoài
da như dị ứng và mụn rộp [5].
Trong y học hiện đại ngày nay, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng chiết xuất lá
cây Bìm bịp chứa nhiều sinh tố, khoáng chất hoạt động như một chất chống
oxy hóa [18]. Theo nghiên cứu của Ruhaiyem Yahaya và cộng sự, đã chỉ ra
cây Bìm bịp chứa các hợp chất terpenoids, flavonoid, flavon C-glycosyl, lưu
huỳnh- có chứa glucosides và glycoglycerolipids góp phần vào các hoạt động
dược lý. Nghiên cứu dược lý chỉ ra rằng Cây Bìm bịp sở hữu thuốc kháng
virus, chống ung thư, chống oxy hóa, trị đái tháo đường, điều hòa miễn dịch,

chữa lành vết thương, hoạt động chống viêm và giảm đau [16]. Chiết xuất thô
từ lá cây Bìm bịp chứa hoạt chất có hoạt động gây độc tế bào chống lại các tế

6


bào u ác tính D24, chiết xuất có hoạt tính sinh học này được cho là một
phenolics flaconoid [14].
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Chiết xuất của cây Bìm bịp được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đánh
giá về giá trị hóa sinh, công dụng của các chất có trong thân và lá cây. Nghiên
cứu của Alam và cộng sự (2016) cho rằng đây là một trong những loài được
sử dụng làm thuốc thảo dược quan trọng ở châu Á nhiệt đới, các thành phần
khác nhau của các hợp chất hoạt tính sinh học từ loại cây này là flavonoid,
glycoside, glycolycerolipids, cerebroside và monoacylmonogalatosylglycerol.
Trong thí nghiệm dược lý đã chứng minh rằng các loại chiết xuất và hợp chất
tinh khiết từ loài này thể hiện một loạt các đặc tính sinh học như chống viêm,
chống virus, chống oxy hóa và chống tiểu đường [11].
Theo nghiên cứu của Sakdarat S và cộng sự năm 2006 thành phần của lá
cây Bìm bịp từ lâu đã được sử dụng truyền thống ở Thái Lan một loại thuốc
chống viêm, để điều trị côn trùng cắn, nhiễm herpes và phản ứng dị ứng [17].
Bộ Y tế công cộng Thái Lan đã coi lá cây này như là một phương thuốc chính
để điều trị viêm da và tổn thương do virus [17].
Các chiết xuất cây Bìm bịp có vai trò chống ung thư được phát hiện ở
Trung Quốc (Wang và cộng sự, 2013). Lá của cây Bìm bịp được tìm thấy giàu
axit amin, nguyên tố vi lượng và thành phần hóa học có hoạt tính sinh học.
Chiết xuất chloroform thô được tách bằng phương pháp sắc ký và hướng dẫn
sinh học kỹ thuật phân đoạn để đưa ra tám hợp chất tinh khiết. Cấu trúc làm
sáng tỏ các hợp chất cô lập được thực hiện trên cơ sở phân tích quang phổ,

bao gồm DEPT, COZY, NOESY, HMQC và HMBC. Tám hợp chất này có
liên quan đến chất diệp lục a và chất diệp lục b, tám hợp chất là 132 –
hydroxyl -(132 - S) - chlorophyll B (1), 132 – hydroxyl - (132 - R) chlorophyll B (2), 132 – hydroxyl - (132 - S) - phaeophytin B (3), 132 –
hydroxyl - (132 - R) –phaeophytin B (4), 132 – hydroxyl - (132 - S) phaeophytin A (5), 132 –hydroxy - (132 - R) - phaeophytin A (6), purpurin 18
phytyl ester (7) và phaeophorbide A (8). Năm trong số này (hợp chất 1, 2, 4,

7


5, 6) được xác định là hợp chất mới. Các hợp chất này chưa được báo cáo
trước đây [12, 17].
Tạp chí quốc tế về nghiên cứu Dược lí và Thực vật học, nghiên cứu của
Ruhaiyem Y và cộng sự (2015) cho rằng cây Bìm bịp là một cây thuốc hữu
ích của Đông Nam Á. Các chiết xuất thực vật được báo cáo sở hữu khả năng
chống ung thư, chống oxy hóa, chống đái tháo đường, điều hòa miễn dịch,
chữa lành vết thương, chống viêm và các hoạt động giảm đau. Ngoài ra
nghiên cứu về độc tính còn cho thấy rằng cây Bìm bịp không độc hại khi sử
dụng với liều lượng khuyến cáo [16].
Công trình nghiên cứu của Fong S năm 2015, Trường Đại học RMIT
đã thực hiện một số nghiên cứu về thành phần của lá cây Bìm bịp. Thí nghiệm
nghiên cứu ảnh hưởng của các vị trí thu gom với đặc điểm môi trường khác
nhau trên thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư có trên lá cây Bìm
bịp được thu ở ba địa điểm khác nhau là Thái Lan, Malaysia và Việt Nam.
Kết quả cho thấy rằng, thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của
lá cây Bìm bịp mọc ở độ cao cao hơn với nhiệt độ không khí thấp hơn - chiết
xuất lá cây Bìm bịp được trồng ở Chiang Dao, Chiang Mai, Thái Lan - có
hoạt động cao nhất (24 giờ EC50: 0,95 mg/ml và 72 giờ EC50: 0,77 mg/ml).
Nghiên cứu thứ hai về ảnh hưởng của các quá trình sau thu hoạch đến các
thành phần hóa học và chất chống ung thư có trong lá cây Bìm bịp. Kết thúc
thí nghiệm cho thấy rằng, chiết lạnh ở nhiệt độ 22°C là phương pháp tốt nhất

cho hàm lượng phenolics và flavonoid tối đa [13, 14].
Ở Malaysia, loài này có tên địa phương là cỏ rắn Sabah, nghiên cứu của
Gunasekaran (2014) về nhân giống cây Bìm bịp. Trong nghiên cứu này, hai
thí nghiệm được thực hiện, đó là tạo mô sẹo (callus) và tái sinh cây con. Thí
nghiệm tạo mô sẹo nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng và bóng tối,
ảnh hưởng của các loại cytokinin khác nhau đến khả năng cảm ứng callus của
cây Bìm bịp từ lá. Kết quả đưa ra cho thấy rằng, không có sự khác biệt về kết
quả cảm ứng callus ở điều kiện bóng tối so với điều kiện chiếu sáng, mô sẹo
hình thành trong môi trường chứa Dicamba nồng độ 3 mg/l có hiệu quả tốt
nhất so với các chất điều hòa sinh trưởng còn lại. Ở điều kiện ánh sáng, môi
trường chứa 3 mg/ l Dicamba cho hiệu quả cảm ứng callus tốt nhất là 8,3 ±
8


0,58%, còn ở điều kiện tối môi trường chứa Dicamba 3mg/ l cho hiệu quả
cảm ứng callus tốt nhất với giá trị trung bình là 8,0 ± 1,00%. Nghiên cứu này
đã thành công trong việc tạo ra mô sẹo nhưng lại không có kết quả tái sinh
cây con, lý do có thể bao gồm không phù hợp điều kiện thí nghiệm, chẳng hạn
như nồng độ của chất điều hòa tăng trưởng [15]. Ở Trung Quốc, Chen B và
cộng sự (2015) cũng đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phương pháp nhân
giống nhanh cho cây Bìm bịp. Kết quả cho thấy môi trường tăng sinh tối ưu
cho cây Bìm bịp là Murashige và Skoog (MS) với 1,0 mg/l BAP + 0,02 mg/l
NAA cung cấp hệ số nhân nhanh là 3,9. Môi trường tạo rễ bao gồm ½ MS +
0,25 mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ cây hình thành 100% [12].
Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu về các hợp chất có trên lá và thân
của cây Bìm bịp và công dụng của nó, tuy nhiên các nghiên cứu về nhân
giống cây Bìm bịp thì còn hạn chế. Các kết quả nghiên cứu có ý nghĩa vô
cùng quan trọng trong việc giúp các nhà nghiên cứu nước ta thừa kế những
kinh nghiệm để đem lại hiệu quả cao trong nhân nhanh nguồn giống và bảo
tồn được nguồn giống sạch bệnh.

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt Nam, những nghiên cứu sâu về tác dụng sinh học và hóa học từ
cây Bìm bịp còn ít và chưa có hiệu quả cao. Nguyên nhân chủ yếu là do cây
Bìm bịp mới chỉ biết đến với những bài thuốc truyền thống còn hạn chế trong
y học hiện đại sử dụng những chiết xuất từ thân và lá cây có hoạt tính sinh
học cao ứng dụng trong sản xuất dược liệu. Tuy vậy cũng có một số nghiên
cứu về cây Bìm bịp sau đây:
- Huỳnh Ngọc Thụy, Nguyễn Thị Trang Đài (2017) bước đầu phân lập và
xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết phân lập được từ thân cây
Bìm bịp mọc ở núi Cấm, Châu Đốc, tỉnh an Giang, Việt Nam. Với phương
pháp chiết xuất, phân lập: Chiết ngấm kiệt bằng ethanol 96%, phân lập bằng
sắc ký cột đã phát hiện bốn hợp chất isoflavonoid phân lập từ thân cây có cấu
trúc lần lượt: (+) – 4 – hydroxy – 3 – methoxy - 8,9 methylendioxypterocarpan (CN6T - 3), (-) – 3 – hydroxy – 4 – methoxy - 8,9

9


- methylendioxypterocarpan (CN6T - 4), 7 – hydroxy - 4´-methoxyisoflavon
(CN22 - 2), 3´,7 – dihydroxyl - 4´,8 - dimethoxylisoflavon (CN22 - 3) [9].
- Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm từ thân cây Bìm bịp Clinacanthus
nutans (Burm. f.) Lindau, Acanthaceae của Nguyễn Thị Trang Đài và cộng sự
năm 2017 đưa ra kết quả trên mô hình in vitro, xác định được cao ethanol
toàn phần 96% của thân có tác dụng kháng viêm mạnh hơn rễ và lá, cao phân
đoạn ethyl acetat có tác dụng kháng viêm mạnh hơn cao dichloromethan và
cao nước, phân đoạn 4 của cao ethyl acetat có tác dụng kháng viêm mạnh hơn
3 phân đoạn còn lại, còn trên in vivo, cao ethyl acetat liều 1000 và 2000
mg/kg cho hoạt tính kháng viêm, giảm phù vào ngày đầu điều trị. Tuy mức độ
tác dụng có kém so với diclofenac 10 mg/kg nhưng cũng chứng tỏ Bìm bịp có
tác dụng kháng viêm cấp và các chất có tác dụng kháng viêm cấp nằm nhiều ở
cao phân đoạn ethyl acetat [4].

- Nghiên cứu thực vật học và đa dạng di truyền của cây Bìm bịp tại Việt
Nam của Nguyễn Thị Trang Đài và cộng sự (2017), kết quả cho thấy qua hình
dạng bên ngoài của lá, qua phân tích kiểu hình và kiểu gen cho kết quả 17
mẫu cây Bìm bịp được thu hái ở 12 tỉnh thành tại Việt Nam được xếp thành 4
nhóm chính, trong đó mẫu cây Bìm bịp CN50 chính là loài Clinacanthus
nutans và 3 nhóm còn lại có thể là phân loài của Clinacanthus nutans, kết quả
này là cơ sở trong việc đánh giá đa dạng nguồn gen của các loài Bìm bịp [3].
Tuy nhiên, công trình nghiên cứu đề cập đến vấn đề nhân giống cây
Bìm bịp còn chưa có ở Việt Nam. Bởi vậy đề tài: “Nhân nhanh cây Bìm bịp
(Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy
mô” nhằm góp phần tạo ra giống cây Bìm bịp sạch bệnh, chất lượng tốt.

10


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 6/2018 đến tháng 4/2019 tại Phòng
thí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2.
2.2. Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu cây Bìm bịp được thu tại xã Ngọc Thanh - tỉnh Vĩnh Phúc.
2.2.2. Dụng cụ nghiên cứu
Các dụng cụ bao gồm: dao cấy, khay cấy, panh gắp, kéo, túi nilon, bình
cấy, đèn cồn, pipet, bình xịt cồn, giấy thấm.
2.2.3. Thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị sử dụng bao gồm: nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần,
máy đo pH, cân kĩ thuật, tủ lạnh, bếp hồng ngoại, buồng cấy vô trùng.

2.3. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS [11] + 30 g/l đường sacharose + 7 g/l
agar và chất điều hòa sinh trưởng chứa khoáng đa lượng, vi lượng, pH môi
trường là 5,8.
- Chất khử trùng: Javel
- Chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng: BAP (6-benzyl amino purin),
NAA ( -napthalene axetic acid), IAA (Acid β – indol axetic).
- Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở 117°C trong 15
phút.
2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy
Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo:
- Nhiệt độ nuôi cấy: 25°C - 27°C
- Độ ẩm trung bình: 60% - 70%
11


- Ánh sáng: Sử dụng đèn chiếu sáng Neon với cường độ chiếu sáng 3000
Lux
- Thời gian chiếu sáng: 12h/ ngày.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần
nhắc lại. Các mẫu cấy có kích thước như nhau (3 - 4cm).
2.5.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình
nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguồn mẫu vô
trùng dùng cho giai đoạn sau. Chúng tôi tiến hành cắt đoạn thân mang chồi
nách của cây Bìm bịp ngoài tự nhiên rửa sạch, được lắc trong nước xà phòng
loãng từ 15 - 20 phút và rửa kỹ dưới vòi nước chảy. Sau đó tiến hành khử
trùng mẫu bằng cồn 70° và dung dịch Javel ở các nồng độ và thời gian sau:
Bảng 2.1. Các công thức tạo vật liệu khởi đầu mẫu cây Bìm bịp

Công thức
CT1: (CT đối chứng)

Nồng độ và thời gian khử trùng
Xử lí sơ bộ bằng xà phòng, cồn và nước cất

CT2

Cồn 70% trong 2 phút, Javel 5% trong 10 phút

CT3

Cồn 70% trong 2 phút, Javel 5% trong 15 phút

CT4

Cồn 70% trong 5 phút, Javel 10% trong 10 phút

CT5

Cồn 70% trong 5 phút, Javel 10% trong 15 phút

CT6

Cồn 70% trong 10 phút, Javel 15% trong 10 phút

CT7

Cồn 70% trong 10 phút, Javel 15% trong 15 phút

12


Sau khi khử trùng mẫu cây được rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 - 3
lần và cây Bìm bịp được cắt đốt (3 – 4 cm) cấy lên môi trường cơ bản MS
chứa 30 g/l saccharose, 7 g/l agar và chuẩn độ ở pH = 5,8. Theo dõi và đánh
giá mẫu sau 10 ngày dựa theo các tỷ lệ:

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm =

+ Tỷ lệ mẫu chết =

∑

ẫ

∑

∑

+ Tỷ lệ mẫu sạch sống =

ị

ẫ

ẫ

ễ
ấ

ị

ế (

ặ

ẫ

ấ

∑

∑

ẫ
∑

(%)

à

ạ
ẫ

ố
ấ

à

ô

á

à

)

(%)

(%)

2.5.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
Tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của mô nuôi cấy và hệ số nhân
nhanh chồi in vitro. Môi trường nuôi cấy dinh dưỡng nhân tạo sẽ được bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng BAP hoặc BAP kết hợp với NAA theo 2
thí nghiệm như sau:
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh
chồi in vitro
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái
sinh và nhân nhanh chồi in vitro
Công thức

Nồng độ BAP (mg/l)

CT1: (CT đối chứng)

0

CT2

0,25

13


Công thức

Nồng độ BAP (mg/l)

CT3

0,5

CT4

0,75

CT5

1

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tái sinh
và nhân nhanh chồi in vitro
Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến
khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
Nồng độ (mg/l)
Công thức
BAP

NAA

CT1: (CT đối chứng)

0

0

CT2

0,25

0,05

CT3

0,5

0,05

CT4

0,75

0,05

CT5

1

0,05

Mẫu cho vào môi trường sau 8 tuần nuôi cấy, đánh giá thí nghiệm 1 và
2 dựa theo các chỉ tiêu:
+ Số chồi/mẫu (chồi)
+ Chiều cao của chồi (cm)
+ Số lá/chồi (lá)
+ Đặc điểm của chồi: Màu sắc lá, thân, rễ.
2.5.3. Ra rễ - Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Chồi in vitro thu được từ các thí nghiệm trên có chiều cao 2,5 - 3 cm
được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung IAA với nồng độ khác nhau
như sau:
14


Bảng 2.4. Các công thức thí nghiệm tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Công thức

Nồng độ IAA (mg/l)

CT đối chứng

0

CT1

0,1

CT2

0,2

CT3

0,3

CT4

0,4

CT5

0,5

Đánh giá thí nghiệm theo dõi dựa theo các chỉ tiêu sau 4 tuần nuôi cấy:
+ Tỷ lệ ra rễ (%)
+ Số rễ/chồi (rễ)
+ Chiều dài rễ (cm)
+ Chiều cao của cây con (cm)
+ Thời gian ra rễ (ngày)
2.5.4. Rèn luyện cây con in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
Cây Bìm bịp nuôi cấy mô hoàn chỉnh 3 - 4 rễ, cao 4 - 5 cm được đưa
vào rèn luyện thích nghi với điều kiện tự nhiên trên các giá thể sau:
Bảng 2.5. Các công thức thí nghiệm rèn luyện cây con in vitro
Công thức

Giá thể

CT1

100% cát sạch

CT2

cát sạch và đất (tỷ lệ 1:1)

CT3

trấu hun và đất (tỷ lệ 1:1)

CT4

100% đất

Đánh giá thí nghiệm theo dõi dựa theo các chỉ tiêu sau 2 tuần rèn luyện:
+ Tỷ lệ cây sống (%)

15


+ Chiều cao cây (cm)
+ Đặc điểm của cây: thân, màu sắc lá, chiều cao cây.
2.6. Phân tích thống kê số liệu
Các số liệu được phân tích theo các tham số thống kê gồm các giá trị
trung bình độ lệch chuẩn, giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD0,05 bằng chương
trình Excel [7].

16