Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR để phát hiện Vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016

Nghiên cứu Y học

XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR
ĐỂ PHÁT HIỆN VIBRIO CHOLERAE TRONG MẪU THỦY HẢI SẢN
Nguyễn Đỗ Phúc*

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Vibrio Cholerae là một trong những tác nhân gây bệnh tiêu chảy nguy hiểm lây truyền qua
đường nước và thực phẩm. Việc xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử, phương pháp PCR, là cần thiết nhằm
đáp ứng nhanh cho công tác phát hiện sớm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, giúp phát hiện kịp thời bệnh tiêu
chảy do Vibrio cholerae gây ra thông qua thực phẩm.
Mục tiêu nghiên cứu: Xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR phát hiện Vibrio choleare trong thủy
hải sản.
Phương pháp: Khảo sát độ chọn lọc và độ đặc hiệu của phương pháp PCR. Đánh giá các thông số kỹ thuật
của phương pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương đối, tỷ
lệ dương tính giả và âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009).
Kết quả: Giới hạn phát hiện 50% (LOD50) của phương pháp PCR trên các nền mẫu (nghêu: 1-3
CFU/25g, sò: 0-1 CFU/25g và hến: 4- 6 CFU/25g). Riêng mẫu hàu chưa đạt yêu cầu (>9 CFU/25g). Các
thông số kỹ thuật của phương pháp PCR: Độ chính xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ chọn lọc (SE) trên 3 nền
mẫu nghêu, sò và hến với tỷ lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN) đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn
ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009).
Kết luận: Phương pháp PCR có thể ứng dụng để phát hiện Vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản với nền
mẫu nghêu, sò và hến.
Từ khóa: PCR, Vibrio cholerae, thủy hải sản

ABSTRACT
VALIDATION OF PCR METHOD FOR DETECTION OF VIBRIO CHOLERAE IN SEAFOOD
Nguyen Do Phuc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 369 - 373
Background: Vibrio cholerae is one of the dangerous diarrheal pathogen transmitted through water and food.

Applying a molecular method, polymerase chain reaction (PCR), is necessary for early detection of Vibrio cholerae
infection through foods.
Objectives: To assess validation of PCR method for detection of Vibrio cholera in seafood.
Methods: Identify selectivity and validation of PCR method for detection of Vibrio cholerae in seafood with
parameters: Limit detection 50 (LOD50), Sensitivity (SE), Specificity (SP), Accuracy (AC) False Positive (FP)
and False Negative (FN) according to ISO/TS 16140 (2003) and NordVal (2009).
Results: Limit of detection 50 (LOD50) were for clam (1-3 CFU/25 g), mussel (0-1 CFU/25g), baby clam (46 CFU/25g), but oyster did not meet the requirement (>9 CFU/25g). Technical parameters: Accuracy (AC);
Specificity (SP); Sensitivity (SE) False Positive (FP) and False Negative (FN) of PCR method on the three
samples met the standard requirements.
Conclusion: PCR is an applicable method for detection of Vibrio cholerae in seafood, especially in clam,
mussel and baby clam.
* Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đỗ Phúc ĐT: 0907669008

Chuyên Đề Y Tế Công Cộng

Email:

369


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016

Key words: PCR, Vibrio cholerae, seafood.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tả là một bệnh truyền nhiễm cấp tính
đường tiêu hoá do phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae)

gây nên. Bệnh thường biểu hiện với những triệu
chứng lâm sàng đột ngột, nhanh và nặng. Nếu
không được điều trị kịp thời sẽ dẫn tới tử vong
trong vài giờ và được xếp vào loại bệnh “cực kỳ
nguy hiểm”.
Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới
(WHO), hiện nay vẫn còn khoảng hơn 30 nước
có bệnh tả đang lưu hành, chủ yếu là ở Châu Á
và Châu Phi. Mỗi năm ước tính trung bình có
một triệu trường hợp mắc bệnh tả, số tử vong
khoảng 200.000 ở Châu Phi và 100.000 ở Châu Á,
trong đó 1/3 là trẻ em dưới 5 tuổi và 1/4 là trẻ em
từ 5-14 tuổi, số còn lại là người lớn (2).
Ở Việt Nam, bệnh tả do V. cholerae O1 ElTor
xuất hiện năm 1964, ước tính có hàng trăm
ngàn người mắc bệnh. Dịch tả lưu hành chủ yếu
ở miền Nam, miền Trung, còn miền Bắc thì lẻ tẻ
do du nhập từ miền Nam ra. Từ những năm sau
đó, vẫn có các ca lẻ tẻ xảy ra nhưng không bùng
phát thành dịch lớn.
Cuối năm 2007 và đầu năm 2008, dịch tả đã
quay trở lại nước ta và xuất hiện ở nhiều tỉnh
thành trong cả nước. Những năm sau đó cho
đến nay, hàng năm nước ta vẫn phải đối mặt với
các vụ dịch tả lẻ tẻ xuất hiện trên cả nước và xảy
ra ở nhiều tỉnh thành. Việc phòng và chống bệnh
tả trong nước luôn được tuyên truyền rộng rãi
trên các phương tiện thông tin đại chúng.
Gần đây các vụ dịch tả đã xảy ra ở nhiều nơi
trên thế giới. Việt Nam cũng là một quốc gia chịu

ảnh hưởng lớn bởi dịch tả với nhiều vụ dịch đã
xảy ra đặc biệt là ở các vùng nông thôn và vùng
sông nước. Do vậy việc giám sát dịch tễ học vi
khuẩn V. cholerae là vấn đề hết sức quan trọng và
cần thiết nhằm phát hiện và xử lý dịch kịp thời.
Việc áp dụng phương pháp nhanh và dễ áp
dụng để phát hiện V.cholerae, đặc biệt là trong
nước và thực phẩm là hết sức cần thiết. Phương
pháp nuôi cấy truyền thống hiện nay đang được

370

áp dụng tại nhiều phòng thí nghiệm như AOAC
988-20:2010, FDA (chương 9), TCVN 7905-1:2008
[ISO 21872-1:2007(E)]. Tuy nhiên, phương pháp
nuôi cấy đòi hỏi nhiều ngày, chưa đáp ứng
nhanh cho công tác tìm nguyên nhân tiêu chảy
do tả.
PCR là phương pháp được lựa chọn để
phát hiện nhanh V. cholerae trên cơ sở phát
hiện đoạn gen ctxAB gây ra bệnh tả với thời
gian nhanh trong vòng 24 giờ. Để có cơ sở
chứng minh được năng lực của phòng thí
nghiệm có thể áp dụng phương pháp PCR
phát hiện V. cholerae hay không, việc xác nhận
giá trị sử dụng phương pháp là yêu cầu bắt
buộc hiện nay theo ISO 17025. Do đó đề tài
tiến hành với các mục tiêu sau (1,3).

Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng chủng chuẩn Vibrio cholerae để kiểm
chứng qui trình nuôi cấy theo TCVN 7905-1:2008
[ISO 21872-1:2007(E)] (4).
Đánh giá các thông số của phương pháp
PCR phát hiện V. cholerae và nuôi cấy phát hiện
V. cholerae theo BAM-FDA, chương 28 so với
phương pháp nuôi cấy truyền thống theo TCVN
7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007 (E)], gồm các
thông số sau: LOD50, Độ chọn lọc, Độ nhạy, Độ
đặc hiệu, Tỷ lệ dương tính giả, Tỷ lệ âm tính giả
và Độ chính xác.

ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn
Chủng chứng dương (chủng đích):
Vibrio choleraee - Ogawa ATCC 17803; Inaba
ATCC 17804
Chủng chứng âm (chủng không đích):
Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, E. coli
ATCC 25923, Salmonella paratyphi ATCC 9150,
Shigella sonnei ATCC 9290, Proteus ATCC 17258,
Klebsiella ATCC 27489.

Chuyên Đề Y Tế Công Cộng


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016
Thực phẩm
Nghêu, sò, hến và hàu.

Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp PCR
Theo FDA, chương 18 (5)
Quy trình PCR: ly trích DNA bằng nhiệt
100 C/10 phút, làm lạnh ngay sau khi đun trong
một khay có đá trong 10 phút. Ly tâm 15.000
vòng/5 phút, hút 1µl dịch chiết DNA cho vào
24µl master mix PCR và khuếch đại DNA theo
chu kỳ nhiệt. Chu kỳ nhiệt: biến tính ban đầu
95oC/15 phút và lặp lại 35 chu kỳ: 95oC/1 phút, 55
oC/1 phút, và kết thúc kéo dài 72oC/10 phút. Sản
phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel
agarose 2,5% có bổ sung Gelred. Điện di trong 30
phút. Sau đó quan sát kết quả trên máy chụp
hình điện di bằng tia UV có bước sóng 312nm.
Kết quả kích thước sản phẩm PCR là 777bp.
0

Phương pháp khảo sát giá trị sử dụng phương
pháp
Theo ISO/TS 16140 (2003) và NordVal
(2009) (1,3).
Khảo sát độ chọn lọc của phương pháp PCR
dùng cho phát hiện các gene ctx của Vibrio
cholerae bằng các chủng vi khuẩn không đích
Chủng Vibrio cholerae được tăng sinh trên
peptone kiềm và các chủng không đích khác
tăng sinh trên BHI ở 37oC/20 giờ sau đó tách
chiết DNA để thực hiện PCR.

Khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình
PCR
Giới hạn phát hiện (LOD50), mức chấp nhận ≤
9 CFU/25g thực phẩm: Chủng Vibrio cholerae
được tăng sinh trên peptone kiềm ở 37oC/20 giờ,
pha loãng chủng về các nồng độ để đạt yêu cầu
≤9 CFU/25 g mẫu thực phẩm và gây nhiễm vào
các nền mẫu và tăng sinh trên peptone kiềm
(khoảng 3 nồng độ, các nồng độ pha loãng được
xác nhận số vi khuẩn thực tế được kiểm tra trên
TSA 1% muối). Ủ ở 37oC/20 giờ, tách chiết DNA
và chạy PCR.

Chuyên Đề Y Tế Công Cộng

Nghiên cứu Y học

Khảo sát độ nhạy tương đối (Se), độ đặc hiệu
tương đối (Sp), độ chính xác tương đối (AC), tỷ
lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN). Trên
các nền mẫu: nghêu, sò và hến, mỗi nền mẫu
chọn 60 mẫu, trong đó 30 mẫu nhiễm chủng
Vibrio cholerae với mật độ vi khuẩn bằng
10xLOD50 và 30 mẫu không nhiễm chủng. Các
mẫu được đánh số theo thứ tự, mù mẫu và cho
các kiểm nghiệm viên thực hiện trên một mẫu
với cả hai phương pháp PCR và nuôi cấy. Kết
quả được tổng hợp và xử lý số liệu theo ISO/TS
16140 (2003) và NordVal (2009).

Phương pháp nuôi cấy
Theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 218721:2007(E)] (4)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp
multiplex- PCR
Các chủng đích Vibrio cholera Ogawa và
Inaba tăng sinh trên peptone kiềm và các chủng
không đích (Vibrio parahaemolyticus, E. coli,
Salmonella paratyphi, Shigella sonnei, Proteus,
Klebsiella) được tăng sinh trên canh thang BHI, ủ
37oC/24h. Chủng đích được trộn chung để sử
dụng làm chứng dương. Từ canh khuẩn này,
tách chiết DNA và tiến hành thực hiện phản ứng
PCR với chủng chứng dương, chứng âm là
Nuclease – free H2O và DNA của các chủng
không đích, sau đó tiến hành điện di.
Kết quả điện di được trình bày trong hình 1,
cho thấy duy nhất ở giếng với các chủng
chứng dương mới xuất hiện các vạch tương
ứng với kích thước của các gene ctx gây bệnh
của Vibrio cholerae, còn tất cả các giếng còn lại
(các vi khuẩn không đích) đều không xuất
hiện vạch đặc trưng với chứng dương. Điều
đó thể hiện khả năng đặc hiệu của phương
pháp PCR đối với các gene ctx cho Vibrio
choleare.
Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương
pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương
đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương

371


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016

Nghiên cứu Y học

đối, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả theo
ISO/TS 16140 (2003).

nghiệm 1 lần; còn 3 mức nhiễm khác La1, La2, La3
được thực hiện 6 lần. Kết quả PCR được thể hiện
ở bảng 1.
Bảng 1: Giới hạn phát hiện của phương pháp PCR
trên các nền mẫu
Nền mẫu Vibrio cholerae Ogawa Vibrio cholerae Inaba
1-3 CFU/25g
1-3 CFU/25g
Nghêu
0-1 CFU/25g
0-1 CFU/25g
Sò
4-6 CFU/25g
4-6 CFU/25g
Hến
> 9 CFU/25g
> 9 CFU/25g
Hàu

1

2

3

4 5 6 7

8 9 10

Hình 1: Kết quả khảo sát tính chọn lọc của phương
pháp PCR
Chú thích: Giếng 10. MK: Thang DNA chuẩn 100bp; 9, (-):
chứng âm; 8. (+): Chứng dương V. cholerae Inaba (777bp);
7. (+): Chứng dương V. cholerae Ogawa; 6: Salmonella; 5:
Shigella; 4: Klebsiella, 3: E. coli; 2: Proteus, 1: Vibrio
paraheamolyticus

Giới hạn phát hiện (LOD50)
Khảo sát giới hạn phát hiện của phương
pháp PCR bằng việc sử dụng các chủng đích với
5 mức gây nhiễm khác nhau: Lo- Không gây
nhiễm; La1, La2, La3- có mức nhiễm dưới 10
CFU/25g và mức nhiễm L50 với khoảng 10-50
CFU/25g. Các mức gây nhiễm này được nhiễm
vào các nền mẫu thực phẩm (nghêu, sò, hến và
hàu) được tăng sinh trong canh thang peptone
kiềm, ủ 37oC/20h. Tiến hành thử nghiệm phản
ứng PCR, với mức nhiễm Lo và L50 được thử

Các mẫu nghêu, sò và hến đạt yêu cầu về
giới hạn phát hiện. Riêng mẫu hàu LOD50 là: >
9 CFU/25g vẫn chưa đáp ứng được về giới hạn
phát hiện theo ISO/TS 16140 (2003). Do đó
mẫu hàu không tiếp tục khảo sát các thông số
tiếp theo.

Xác định độ đúng (accuracy-AC), độ đặc
hiệu (specificity-SP), độ nhạy (sensitivitySE) theo ISO/TS 16140 (2003)
Tiến hành thử nghiệm với 60 mẫu đối với
mỗi nền mẫu (nghêu, sò và hến), trong đó 30
mẫu được gây nhiễm với nồng độ 10xLOD50 và
30 mẫu không gây nhiễm. Sau khi gây nhiễm,
tăng sinh trong pepton kiềm, tiến hành thực hiện
phản ứng multiplex-PCR, và thu được kết quả
theo bảng 2. Từ kết quả ở bảng 2, tiến hành tính
toán và thu được các giá trị thông số của phương
pháp PCR (bảng 3).

Bảng 2: Kết quả xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy
Kết quả của phương pháp
PCR(FDA-Chương 18)
Dương tính (+)
Âm tính (-)

Kết quả phương pháp nuôi cấy (TCVN 7905-1:2008)
Nghêu
Sò
Hến
Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-)

28/29
1/30
28/30
0/30
27/29
2/30
1/29
29/30
2/30
30/30
2/29
28/30

Bảng 3: Kết quả xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên 3 nền mẫu khảo sát
Nền mẫu
Nghêu
Sò
Hến
Tiêu chí

372

Tỷ lệ âm tính giả ND Tỷ lệ dương tính giả Độ chính xác tương Độ nhạy tương đối
(%)
PD (%)
đối AC (%)
SE (%)
3,45
3,33
96,6

96,55
6,67
0
96,67
93,33
6,9
6,67
93,22
93,1
≤ 10
≤ 10
≥ 90%
≥ 90%

Độ đặc hiệu tương
đối SP (%)
96,67
100
93,33
≥ 90%

Chuyên Đề Y Tế Công Cộng


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016

Nghiên cứu Y học

Giá trị sử dụng phương pháp PCR phát hiện
Vibrio cholerae với các thông số: độ chính xác

(AC), độ đặc hiệu (SP), độ chính xác (SE), tỷ lệ
dương tính giả (FP) và tỷ lệ âm tính giả (FN) đều
đạt theo qui định ISO/TS 16140 (2003) trên 3 nền
mẫu nghêu, sò và hến.

các giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên 3
nền mẫu (nghêu, sò và hến) đều đạt theo qui
định ISO/TS 16140 (2003).

KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tính chọn lọc của phương pháp PCR bằng
các chủng không đích: Phương pháp PCR đặc
hiệu đối với gene ctx của Vibrio choleare.

1.

Giới hạn phát hiện (LOD50) của phương
pháp PCR trên các nền mẫu (nghêu, sò và hến):
Nghêu: vào khoảng 0-3 CFU/25g.
Sò: vào khoảng 0-1 CFU/25g.
Hến: vào khoảng 4-6 CFU/25g.
Mẫu hàu không đạt được LOD50 theo quy
định: tiếp tục nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng
của nền mẫu hàu lên phản ứng PCR.
Giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên
các nền mẫu nghêu, sò và hến đều đạt các tiêu
chí về độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ

dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả.Kết quả của

Chuyên Đề Y Tế Công Cộng

Áp dụng phương pháp PCR phát hiện Vibrio
cholerae để khảo sát tiếp tục trên các nền mẫu hải
sản để có số liệu thực tế.

2.

3.
4.
5.

International Standard (2003). ISO/TS 16140- Microbiology of
food and animal feeding stuffs –Protocol for the validation of
alternative methods, pp. 1-64.
Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers
for Disease Control and Prevention (2004) - Detection of
Cholera Toxin, pp. 64-88.
NordVal (2009). Protocol for validation of alternative
microbiological methods, pp 1-16.
TCVN 7905-1(2008) [ISO 21872-1:2007(E)]. Phương pháp phát
hiện Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus, trang 1-13.
Walter HK, William LP, Thomas AC (2001). Chapter 28:
Detection of Enterotoxigenic Vibrio cholerae in Foods by the
Polymerase Chain Reaction. Bacteriological Analytical Manual,
FDA, pp 1-6.

Ngày nhận bài báo:

22/4/2016

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

19/7/2016

Ngày bài báo được đăng:

05/10/2016

373